SK283058B6

SK283058B6 - Spôsob produkcie cieľovej látky použitím mikroorganizmov

Info

Publication number: SK283058B6
Application number: SK537-96A
Authority: SK
Inventors: Hiroyuki Kojima; Kazuhiko Totsuka
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 1993-10-28
Filing date: 1994-10-26
Publication date: 2003-02-04
Also published as: ES2166788T3; RU2182173C2; CN1082092C; JP2817400B2; PL314090A1; HUT74840A; US5830716A; HU9601085D0; CN1139956A; MY121990A; HU221120B1; PE30295A1; CA2175042C; DE69429452D1; DK0733712T3; EP0733712A4; CZ291499B6; DE69429452C5; PL185681B1; WO1995011985A1

Abstract

Je opísaný spôsob produkcie L-aminokyselín s použitím mikroorganizmu. Produktivita je zlepšená prostredníctvom zvýšenia produktivity redukovaného nikotínamidadeníndinukleotid fosfátu v bunke mikroorganizmu.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu produkcie cieľovej látky s použitím mikroorganizmu. Typické príklady mikroorganizmu, použitého podľa tohto vynálezu, zahrnujú mikroorganizmy, patriace k rodu Escherichia a koryneformé baktérie, ktoré sa bežne používajú na produkciu rôznych látok. Cieľové látky, ktoré sa takto produkujú, zahrnujú L-aminokyseliny, antibiotiká, vitamíny, rastové faktory, fyziologicky účinné látky, a iné látky, produkované mikroorganizmami. Táto prihláška opisuje spôsob, ktorý zlepšuje výťažnosť konečnej cieľovej látky v procese produkcie cieľovej látky s použitím mikroorganizmov.

Doterajší stav techniky

Fermentácia L-aminokyselín sa typicky považuje za dobre známy spôsob produkcie cieľovej látky s použitím mikroorganizmov. L-aminokyseliny sa nepoužívajú len do korenín a potravín, ale tiež ako zložky rôznych liečebných výživných zmesí, prísady do krmív pre zvieratá, činidlá vo farmaceutickom a chemickom priemysle, ďalej ako rastové faktory na produkciu L-aminokyselín, ako je L-lyzín a L-homoserín, s použitím mikroorganizmov. Koryneformné baktérie, mikroorganizmy, patriace k rodom Escherichia, Bacillus a Serratia, a podobne, sú známe ako mikroorganizmy, ktoré možno použiť na fermentačnú produkciu L-aminokyseliny.

Baktérie divého typu (kmene divého typu), auxotrofné kmene, indukované z kmeňov divého typu, metabolické regulačné mutanty indukované z kmeňov divého typu ako mutanty rezistentné proti rôznym liečivám, a kmene s vlastnosťami aj auxotrofných kmeňov, aj metabolických regulačných mutantov, možno použiť na fermentačnú produkciu L-aminokyselin. Látky potrebné pre auxotrofné kmene sa líšia od kmeňa ku kmeňu, a auxotrofné kmene, ktoré vyžadujú rovnakú látku, sa líšia v stupni tejto auxotrofie. Podobne sa od seba odlišujú metabolické regulačné mutanty získané ako mutanty rezistentné proti rôznym liečivám.

V súčasnosti sa na fermentáciu L-aminokyselín používa technológia rekombinantnej DNA. Teória tejto technológie sa zakladá na zlepšení biosyntetického systému L-aminokyseliny v hostiteľskom mikroorganizme obohatením o gén (gény) kódujúci L-aminokyselinový biosyntetický enzým (enzýmy). Podrobnosti takejto technológie sú opísané napríklad v „Amino Acid Fermentation, Society Press Japan (1986)“.

Ale mikroorganizmy, ktoré sa bežne používajú pri fermentačnej produkcii L-aminokyselín, majú biosyntetické dráhy, zahrnujúce biosyntetické dráhy L-aminokyselín a biosyntetické dráhy koenzýmov, ktoré sú identické s dráhami divých typov mikroorganizmov. Mikroorganizmy produkujúce L-aminokyseliny boli šľachtené prostredníctvom desenzibilizácie inhibície konečným produktom alebo podobne, ktorá existuje v L-aminokyselinovej biosyntetickej dráhe. Na účely dosiahnutia takéhoto vyšľachtenia sa aplikovalo napríklad poskytnutie auxotrofných vlastností alebo rezistencie proti liečivám bunke mikroorganizmu, alebo sa aplikovala amplifikácia génu (génov) kódujúceho biosyntetický enzým (enzýmy) pomocou technológie rekombinantnej DNA.

Fermentáciou použitím mikroorganizmov je možné produkovať mnoho látok iných, než sú L-aminokyseliny. Ako príklady takýchto látok uvádzame antibiotiká a vitamíny. Existujú rôzne druhy antibiotík a ako prekurzory biosyntéz takýchto antibiotík sa používajú rôzne materiály. Napríklad sa používajú sacharidy, aminokyseliny, kyselina octová, kyselina propiónová a kyselina mevalónová. Cieľové antibiotikum sa vytvára z takéhoto prekurzora konver ziou rôznych metabolitov, iných, než jc prekurzor. Ten istý mechanizmus sa pozoruje pri vitamínoch a iných biogénnych látkach.

Pri produkcii uvedených látok použitím mikroorganizmov sa každá látka vytvára v biosyntetíckej dráhe v bunke mikroorganizmu. Jedným z dôležitých koenzýmov, podstatných pre efektívnu činnosť zodpovedných enzýmov v biosyntetickom systéme, je redukovaný nikotinamidadeníndinukleotid fosfát (na ktorý budeme ďalej odkazovať ako na NADPH). Ale vzťah medzi NADPH a produkciou látok použitím mikroorganizmov nebol opísaný.

Nikotínamiddinukleotidtranshydrogenáza (na ktorú budeme ďalej odkazovať jednoducho ako na „transhydrogenázu“) je známa ako jeden z enzýmov, zodpovených za produkciu NADPH. Je známe, že tento enzým je prítomný v rôznych mikroorganizmoch, vrátane tých, ktoré patria k rodu Escherichia. V Escherichia coli, typickom mikroorganizme, patriacom k rodu Escherichia, sa uskutočnili čistenie transhydrogenázy (Dávid M. Čiarke a Philip D. Bragg, Eur. J. Biochem. 149, 517 až 523, 1985), klonovanie génu, ktorý ju kóduje (Dávid M. Čiarke a Philip D. Bragg, J. Bacteriology 162, 367 až 373, 1985), a stanovenie nukleotidovej sekvencie uvedeného génu (Dávid M. Čiarke, Tip W. Loo, Shirley Gillam a Philip D. Bragg, Eur. J. Biochem. 158, 647 až 653, 1986), ako aj preukázanie existencie tohto enzýmu. Ale fyziologická funkcia tohto enzýmu je stále takmer neznáma. To typicky ukazuje skutočnosť, že varianty majúce tento enzým defektný sa fenotypicky neprejavujú.

Podstata vynálezu

Cieľom tohto vynálezu je spôsob zlepšenia produktivity cieľovej látky použitím mikroorganizmu, zahrnujúci kroky kultivácie mikroorganizmu v kultivačnom médiu umožňujúce, aby sa cieľová látka produkovala a zhromažďovala v kultivačnom médiu, a izolovanie cieľovej látky z kultivačného média.

Produktivita cieľovej látky sa bežne zlepšovala prostredníctvom desenzibilizácie regulácie syntézy konečným(i) produktom(ami) alebo podobne, ktoré sú produkované biosyntetickou dráhou cieľovej látky, a ktoré potrebujú koenzým na syntézu cieľovej látky, ktorý existuje v bunkách mikroorganizmov. Konkrétnym cieľom tohto vynálezu je poskytnúť prostriedky na zlepšenie produktivity' cieľovej látky v súlade s úplne novou teóriou, ktorá je iná než uvedená.

Pri biosyntézach látok, ako sú L-aminokyseliny, v živých organizmoch, prebiehajú viaceré redukčné reakcie. V mnohých prípadoch sa koenzým NADPH fyziologicky používa ako intravitálna redukčná látka. Napríklad glutamátdehydrogenáza vyžaduje NADPH ako koenzým v biosyntctickej dráhe kyseliny L-glutámovej. Aspartátsemialdehyddehydrogenáza, dihydrodipikolátreduktáza vyžadujú NADPH ako koenzým v biosyntetíckej dráhe L-lyzínu.

V iných L-aminokyselinových biosyntetických dráhach má NADPH dôležitú úlohu ako koenzým. Navyše, kyselina L-glutámová je dôležitá ako donor aminoskupín v mnohých L-aminokyselinových biosyntetických dráhach, preto je NADPH potrebné tiež na dodávanie aminoskupín pri biosyntézach L-aminokyselín.

NADPH sa najčastejšie pripravuje metabolizmom glukózy v pentózovom fosfátovom cykle, v ktorom sú zahrnuté glukóza-6-fosfátdehydrogenáza a fosfoglukonátdehydrogenáza. V pentózovom fosfátovom cykle možno vypočítať, že produkčná účinnosť NADPH je 12 molekúl vzhľadom na jednu molekulu glukózy, pretože sa uvoľňuje oxid uhličitý.

Na druhej strane je redukovaný nikotínamidadeníndinukleotid (na ktorý budeme ďalej odkazovať ako na „NADH“) molekulou, ktorá je veľmi podobná NADPH, ale vo väčšine prípadov ju nemožno využiť ako koenzým pri biosyntéze L-aminokyseliny. NADH sa biosyntetizuje cez TCA cyklus a v bunke je obyčajne prítomné jeho dostatočné množstvo.

Čo sa týka L-aminokyselinových biosyntetických dráh, intravitálne zložky, ktoré nemožno účinne využiť, často vznikajú procesom biosyntézy požadovaných L-aminokyselin z glukózy. Predpokladá sa, že takéto zložky sa normálne oxidujú cez TCA cyklus, čo vyúsťuje do tvorby veľkého množstva NADH.

Autori tohto vynálezu postavili hypotézu, že v priebehu produkcie cieľovej látky v procese tvorby cieľovej látky použitím mikroorganizmu je potrebné veľké množstvo NADPH, glukóza sa nevyhnutne spotrebúva, aby vzniklo takéto NADPH, a v dôsledku toho sa produktivita cieľovej látky na spotrebovaný sacharid znižuje (hypotéza 1).

Ďalej autori tohto vynálezu postavili hypotézu, že intravitálne zložky, ktoré nemožno účinne využiť v priebehu produkcie cieľovej látky a ktoré sa metabolizujú cez TCA cyklus, sa nevyhnutne akumulujú v procese tvorby cieľovej látky použitím mikroorganizmu, čo vyúsťuje do zvýšenia koncentrácie NADH v bunke (hypotéza 2).

Na základe opísaných hypotéz 1 a 2 sa predpokladá, že ak možno vnútrobunkové NADH účinne prekonvertovať na NADPH, sacharid, ktorý je potrebný na biosyntézu NADPH mikroorganizmom, možno ušetriť a cieľovú látku možno produkovať s vyššou produktivitou. Súčasne sa predpokladá, že transhydrogenázu možno využiť ako prostriedok na konverziu NADH, vytvoreného cez TCA cyklus, na NADPH.

Autori tohto vynálezu vykonali štúdie na základe skôr opísanej predstavy. Ako výsledok intenzívnych štúdií boli autori tohto vynálezu úspešní, keď získali DNA fragment, obsahujúci gén transhydrogenázy, z baktérie, patriacej k rodu Escherichia, a použitím tohto fragmentu sa schopnosti mikroorganizmov produkovať redukovaný nikotínamidadeníndinukleotidfosfát zlepšili. Autori tohto vynálezu ďalej zistili, že sa zlepšila produktivita cieľovej látky pri uvedených mikroorganizmoch, ktoré majú zlepšenú schopnosť produkovať redukovaný nikotínamidadeníndinukleotidfosfát.

Menovite má tento vynález nasledujúce znaky:

1. spôsob produkcie cieľovej látky použitím mikroorganizmu, ktorý zahŕňa kroky:

kultivácie mikroorganizmu v kultivačnom médiu, aby sa cieľová látka mohla produkovať a akumulovať v kultivačnom médiu a izolácie cieľovej látky z kultivačného média, pričom prostredníctvom modifikácie uvedeného mikroorganizmu je zvýšená jeho schopnosť produkovať redukovaný nikotínamidadeníndinukleotid fosfát z nikotínamidadeníndinukleotidu;

2. spôsob podľa 1., pričom cieľovou látkou je L-aminokyselina;

3. spôsob podľa 2., pričom L-aminokyselina je vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje L-treonin, L-lyzín, kyselinu L-glutámovú, L-leucín, L-izoleucín, L-valín a L-fenylalanín;

4. spôsob podľa 1. alebo 2., pričom mikroorganizmom je mikroorganizmus, patriaci k rodu Escherichia;

5. spôsob podľa L alebo 2., pričom mikroorganizmom je koryneformná baktéria;

6. spôsob podľa ktoréhokoľvek z L až 5., pričom zlepšenie produktivity redukovaného nikotínamidadeníndinukleotid fosfátu mikroorganizmom sa dosiahne zvýšením enzýmovej aktivity nikotínamidnukleotidtranshydrogenázy v bunke mikroorganizmu;

7. spôsob podľa 6., pričom zlepšenie produktivity nikotínamidadenindinukleotid fosfátu mikroorganizmom sa dosiahne zvýšením expresie génu kódujúceho nikotínamidnukleotidtranshydrogenázu v bunke mikroorganizmu; a

8. spôsob podľa 7., pričom zlepšenie produktivity redukovaného nikotínamidadeníndinukleotid fosfátu mikroorganizmom sa dosiahne zvýšením počtu kópií génu kódujúceho nikotínamidnukleotidtranshydrogenázu v bunke mikroorganizmu.

Cieľovou látkou, ktorá sa má produkovať mikroorganizmom podľa tohto vynálezu, sú rôzne L-aminokyseliny, ako L-treonín, L-lyzín, kyselina L-glutámová, L-leucín, L-izoleucín, L-valín a L-fenylalanín. To sa môže vzťahovať na ktorúkoľvek inú okrem už uvedených, pokiaľ je na jej biosyntézu potrebný NADPH, z tých, ktoré sa doteraz produkovali mikroorganizmami, ako nukleové kyseliny, ako je kyselina guanylová a kyselina inozinová, vitamíny, antibiotiká, rastové faktory a fyziologicky účinné látky. Nie je ďalej potrebné uvádzať, že dokonca aj v prípade látky, ktorá sa doteraz neprodukovala s použitím mikroorganizmu, možno tento vynález aplikovať za predpokladu, že na jej biosyntézu je potrebný NADPH.

Pri biosyntéze streptomycínu sa napríklad NADPH používa na syntézu dTDP-4-oxo-4,6-dideoxy-D-glukózy z dTDP-glukózy. Navyše, aminokyseliny slúžia ako prekurzory v prípade peptidových antibiotík, a teda NADPH sa samozrejme vyžaduje na ich biosyntézu už z princípu. Ďalej, prekurzormi penicilínu, beta-laktámového antibiotika, sú L-valín, L-cysteín a kyselina L-alfa-aminoadipová, a teda NADPH je potrebný na ich biosyntézu.

Ak chceme vedieť, ktorá látka vyžaduje NADPH pri jej biosyntéze, táto skutočnosť sa môže ozrejmiť z biosyntetickej dráhy, ak jej biosyntetická dráha už bola zistená.

Mikroorganizmus, ktorý sa má použiť podľa tohto vynálezu, nie je zvlášť ohraničený za predpokladu, že patrí k tým, ktoré sa doteraz používali na produkciu látok, ako sú baktérie, patriace k rodu Escherichia, koryneformné baktérie, baktérie, patriace k rodu Bacillus, a baktérie, ktoré patria k rodu Serratia. Výhode je ním taký mikroorganizmus, ktorý obsahuje DNA fragment obsahujúci plazmidový počiatok replikácie pre tento mikroorganizmus, transhydrogenázové génové funkcie, a v ktorom je možné zvýšiť počet kópií transhydrogenázového génu. Na druhej strane kmeň, ktorý mal pôvodne vysokú schopnosť produkovať cieľovú látku, je najvýhodnejší ako kmeň, ktorý sa použije na zlepšenie produktivity podľa tohto vynálezu. Dôvodom je, že sa predpokladá, že pri kmeni s vysokou produktivitou bude účinok zlepšenia produktivity podľa tohto vynálezu pôsobiť silne, pretože javy podľa opísanej hypotézy 1 a 2 účinkujú silne. Uvádzame kmeň Escherichia coli B-3996 a podobne, keď cieľovou látkou je L-treonín, kmeň Escherichia coli AJ 12604 (FERM BP-3579) a podobne, keď cieľovou látkou je L-fenylalanín, kmeň Escherichia coli AJ12624 (FERM BP-3853) a podobne, keď cieľovou látkou je kyselina L-glutámová, a Brevibacterium lactofermentum AJ3990 (FERM P-3387, ATCC 31269) a podobne, keď cieľovou látkou je L-lyzín.

Žiadny problém nie je s médiom, ktoré sa má použiť na produkciu cieľovej látky, ak sa použije dobre známe médium z tých, ktoré sa dosiaľ používali, v závislosti od použitého mikroorganizmu. Menovite je k dispozícii bežné médium, ktoré obsahuje zdroj uhlíka, zdroj dusíka, anorganické ióny a voliteľne ďalšie organické zložky. Na uskutočnenie tohto vynálezu sa nevyžaduje žiadne špeciálne médium.

Ako zdroj uhlíka možno použiť sacharidy, ako sú glukóza, laktóza, galaktóza, fruktóza a škrobový hydrolyzát;

alkoholy, ako sú glycerol a sorbitol; a organické kyseliny, ako sú kyselina fumarová, kyselina citrónová a kyselina jantárová a podobne.

Ako zdroj dusíka možno použiť anorganické amónne soli, ako sú síran amónny, chlorid amónny a fosforečnan amónny; organický dusík, ako je sójový hydrolyzát; plynný amoniak; a vodný roztok amoniaku.

Čo sa týka organických stopových nutričných zdrojov, potrebné látky, ako je vitamín BI, L-homoserín a L-tyrozin alebo extrakt z kvasníc, sa vyžadujú v primeraných množstvách. Okrem uvedených sa voliteľne pridávajú malé množstvá fosforečnanu draselného, síranu horečnatého, iónu železa, iónu mangánu a podobne.

Kultiváciu možno uskutočniť v dobre známych podmienkach, ktoré sa doteraz používali, čo závisí od použitého mikroorganizmu. Menovite je výhodné uskutočniť kultiváciu počas 16 až 120 hodín za aeróbnych podmienok. Kultivačná teplota sa udržuje medzi 25 °C a 45 °C a pH sa počas kultivácie udržuje medzi 5 až 8. Mimochodom, na nastavenie pH možno použiť anorganické alebo organické kyslé alebo zásadité látky, ako aj plynný amoniak a podobne.

Podľa tohto vynálezu sa nevyžaduje žiadny zvláštny spôsob izolácie metabolického produktu z kvapaliny média po skončení kultivácie. Menovite možno tento vynález uskutočniť kombináciou dobre známych spôsobov, ako je metóda iónomeničovej živice, precipitačná metóda a podobne.

Ako príklad prostriedkov na zvýšenie NADPH produktivity mikroorganizmu uvádzame prostriedky na zvýšenie enzýmovej aktivity transhydrogenázy v mikrobiálnych bunkách.

Ako príklad prostriedkov na zvýšenie enzýmovej aktivity transhydrogenázy uvádzame prostriedky na zvýšenie expresie génu transhydrogenázy v mikrobiálnych bunkách. Ďalej, iným prostriedkom na zvýšenie enzýmovej aktivity transhydrogenázy je modifikácia génu transhydrogenázy a vytvorenie transhydrogenázy so zvýšenou aktivitou.

Ako príklad prostriedku na zvýšenie expresie génu transhydrogenázy v mikrobiálnych bunkách uvádzame prostriedok na zvýšenie počtu kópii génu transhydrogenázy v mikrobiálnych bunkách.

Na to, aby sa zvýšil počet kópií génu transhydrogenázy, je nevyhnutný fragment DNA, ktorý obsahuje uvedený gén. Mimochodom, gén transhydrogenázy bol klonovaný v kmeni Escherichia coli K-12 ako baktérii, patriacej k rodu Escherichia, a bola stanovená jeho nukleotidová sekvencia (D.M. Čiarke a spol., Eur. J. Biochem. 158, 647 až 65, 1986). Teda príprava DNA fragmentu, obsahujúceho uvedený gén, sa dosiahne použitím spôsobu, ktorý opísali D.M. Čiarke a spol. Ďalej možno požadovaný DNA fragment získať hybridizačnou metódou použitím syntetickej DNA sondy pripravenej podľa nukleotidovej sekvencie, ktorú opísali D.M. Čiarke a spol., a PCR metódou použitím syntetických DNA primerov pripravených podľa uvedenej nukleotidovej sekvencie. Ak sa DNA fragment, obsahujúci gén transhydrogenázy, zliguje s vektorovou DNA, schopnou autonómne sa replikovať v cieľovom mikroorganizme, a vloží sa do uvedeného mikroorganizmu, je možné zvýšiť počet kópií génu transhydrogenázy.

DNA primer, ktorý sa používa pri klonovaní génu transhydrogenázy z baktérie, patriacej k rodu Escherichia, použitím PCR metódy, možno vhodne pripraviť napríklad na základe sekvencie, známej v Escherichia coli (D.M. Čiarke a spol., Eur. J. Biochem. 158, 647 až 653, 1986). Keďže transhydrogenáza obsahuje dve podjednotky, môže byť nevyhnutné amplifikovať oba gény pntA a pntB každej z nich. Vhodné sú dva primery 5-CTGATTTTTGGATCCAGATCACAG-3' (sekv. č. :1) a 5’-CGTTCTGTTAAGCTTTCTCAATAA-3' (sekv. č. :2), ktoré môžu amplifikovať 3kb oblasť obsahujúcu oba gény pntA a pntB. Tieto primery sa mierne odlišujú od sekvencie, ktorú opísali D.M. Čiarke a spol. Ale v dôsledku zmeny v sekvencii je možné zaviesť BamHI štiepne miesto v protiprúdovom smere od oboch génov pntA a pntB, a HindlII štiepne miesto v poprúdovom smere od oboch génov pntA a pntB. Ani BamHI miesto, ani HindlII miesto sa nenachádzajú v žiadnom z oboch génov, ani v ich susedstve. Preto sú vhodné pri klonovaní amplifikovaného DNA fragmentu použitím týchto reštrikčných enzýmov a pri prenose do iného vektora DNA. Syntézu DNA primeru možno uskutočniť podľa bežnej metódy použitím DNA syntetizéra, model 380B, ktorý vyrába firma Applied Biosystems, a použitím fosfoamiditovej metódy (pozri Tetrahedron Letters 22, 1859, 1981). PCR možno uskutočniť použitím zariadenia Thermal Cycler Model PJ2000, ktoré vyrába firma Takara Shuzo Co., Ltd., a použitím Taq DNA polymerázy spôsobom, ktorý navrhuje výrobca.

DNA fragment, obsahujúci gén transhydrogenázy, možno získať z mikroorganizmov iných než z baktérii, ktoré patria k rodu Escherichia. Požadovaný DNA fragment možno získať použitím hybridizačnej metódy so syntetickou DNA sondou pripravenou podľa nukleotidovej sekvencie opísanej D.M. Clarkeom a spol., alebo použitím PCR metódy so syntetickými DNA primermi pripravenými podľa uvedenej nukleotidovej sekvencie, ako spôsovu na jeho získanie.

DNA sondu, ktorá sa má použiť pri hybridizačnej metóde, alebo DNA primery, ktoré sa majú použiť pri klonovaní génu použitím PCR metódy, možno vhodne pripraviť napríklad na základe sekvencie, známej v Escherichia coli (D.M. Čiarke a spol., Eur. J. Biochem. 158, 647 až 653, 1986). Predpokladá sa, že nukleotidová sekvencia génu je rôzna pre každý z mikroorganizmov. Je teda žiaduce pripraviť syntetické DNA zhodujúce sa s konzervovanými časťami transhydrogenáz pochádzajúcich z každého mikroorganizmu.

Gén transhydrogenázy amplifikovaný PCR metódou sa zliguje s vektorovou DNA schopnou autonómne sa replikovať v bunke baktérie, patriacej k rodu Escherichia, keď sa zavedie do baktérie, patriacej k rodu Escherichia, a zavedie sa do buniek baktérie, patriacej k rodu Escherichia.

V prípade zavedenia získaného DNA fragmentu obsahujúceho gén transhydrogenázy do mikroorganizmu iného, než je baktéria patriaca k rodu Escherichia, uvedený DNA fragment sa zliguje s vektorovou DNA schopnou autonómne sa replikovať v bunke mikroorganizmu, do ktorého sa zaviedol uvedený DNA fragment, a zavedie sa do uvedených buniek.

Ako vektorová DNA, ktorá sa dá použiť podľa tohto vynálezu, je výhodná plazmidová vektorová DNA, ktorej príkladom sú pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, RSF1010 a podobne. Okrem uvedených sú tiež k dispozícii fágové DNA vektory. Aby sa dosiahla účinná expresia transhydrogenázy, je tiež prijateľné použitie promótora funkčného v mikroorganizmoch, ako jc lac, trp a PL. Navyše, aby sa zvýšil počet kópií génu transhydrogenázy, DNA obsahujúcu uvedený gén možno včleniť do chromozómu pomocou metódy používajúcej transpozón (Berg, D.E. a Berg, C.M., Bio/Technol. 1, 417, 1983), Mu fág (japonský zverejnený patent č. 2-109985) alebo homologickú rekombináciu (Experimente in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)).

Ak je mikroorganizmom, do ktorého sa zavádza uvedený gén, koryneformná baktéria, vektorovou DNA, ktorú možno použiť podľa tohto vynálezu, je plazmidový vektor autonómne replikovateľný v koryneformnej baktérii, ako je pAM330 (pozri japonský patentový spis č. 1-11280) a pHM1519 (pozri japonský zverejnený patent č. 58-77895).

Aby sa vybral kmeň, ktorý má skutočne zlepšenú enzýmovú aktivitu transhydrogenázy, spomedzi kandidátov, ktoré majú potenciálne zlepšenú enzýmovú aktivitu transhydrogenázy, možno použiť známu metódu (napríklad, Dávid M. Čiarke a Philip D. Bragg, Joumal of Bacteriology 162, 367 až 373, 1985), ako metódu na potvrdenie zlepšenia enzýmovej aktivity transhydrogenázy.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr.l znázorňuje prípravu plazmidu pMW::THY. Obr.2 znázorňuje prípravu plazmidu pHSG::THYB. Obr.3 znázorňuje prípravu plazmidu pSU::THY.

Tento vynález konkrétnejšie vysvetlíme ďalej s odkazom na príklady.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Klonovanie génu transhydrogenázy

Nukleotidové sekvencie génov pntA a pntB, ktoré kódujú transhydrogenázu Escherichia coli, už boli stanovené (D.M. Čiarke a spol., Eur. J. Biochem. 158, 647 až 653, 1986) a bolo publikované, že pntA kóduje proteín s 502 aminokyselinovými zvyškami a pntB kóduje proteín so 462 aminokyselinovými zvyškami. Navyše tiež bolo známe, že oba uvedené proteiny sú potrebné na prejavenie enzýmovej aktivity transhydrogenázy, že oba gény pntA a pntB sú umiestnené za sebou v chromozomálnej DNA, a že tým je možné oba gény klonovať v jednom DNA fragmente.

Na uľahčenie následných operácií autori tohto vynálezu súčasne klonovali nielen oba gény pntA a pntB, ale oblasť nachádzajúcu sa v protiprúdovom smere od týchto génov, ktorá má promótorovú aktivitu. Konkrétne, DNA fragment obsahujúci gény a promótorovú oblasť sa amplifíkovaj prostredníctvom PCR na účely ich klonovania.

Dva syntetické oligonukleotidy so sekvenciou 5'-CTGATTTTTGGATCCAGATCACAG-3' (sekv. č. :1) a 5'-CGTTCTGTTAAGCTTTCTCAATAA-3' (sekv. č. :2) sa syntetizovali ako printery pre PCR bežným spôsobom. Ako DNA templát pre PCR sa pripravila kompletná genómová DNA Escherichia coli K-12 MC 1061 metódou autorov Saitoh a Miura (Biochem. Biophys. Acta 72, 619, 1963). Cieľový DNA fragment sa amplifikoval prostredníctvom PCR použitím dvoch oligonukleotidových printerov a templátovej chromozomálnej DNA metódou podľa Erlicha a spol. (PCR Technology, Stockton Press 1989). Syntetické DNA používané ako primery majú nukleotidové sekvencie s malými rozdielmi v zodpovedajúcich centrálnych častiach fragmentov syntetických DNA oproti nukleotidovej sekvencii, ktorú opísali D.M. Čiarke a spol. Toto sa navrhlo na zavedenie BamHI štiepneho miesta a HindlII štiepneho miesta pri navrhovaní syntetických oligonukleotidov. Tieto štiepne miesta reštrikčných enzýmov sú potrebné na zavedenie amplifikovaného DNA fragmentu do vektorovej DNA. Zavedenie reštrikčných miest spôsobuje v danom mieste nesprávne párovanie medzi primermi a chromozomálnou DNA v procese PCR. Ale tento nesúlad neovplyvnil amplifikáciu DNA pomocou PCR, pretože tieto reštrikčné miesta boli umiestnené v centrálnych častiach syntetického DNA fragmentu. Amplifikácia 3kb DNA fragmentu sa potvrdila elektroforézou na agarózovom géli.

Amplifikovaný 3,0kb DNA fragment a plazmidový vektor pMWl 18 s amplicilínovým rezistenčným markerom (dostupný od firmy Nippon Gene Inc.) sa poštiepili s BamHI a HindlII. Tak poštiepený DNA fragment, ako aj poštiepená vektorová DNA sa zligovali s DNA ligázou, aby sa pripravila rekombinantná DNA. Výsledný rekombinantný plazmid sa pomenoval pMW::THY (pozri obr.l).

Escherichia coli JM109 (dostupná od firmy Takara Shuzo Co., Ltd.) sa transformovala plazmidom pMW: :THY a získala sa transformovaná Escherichia coli JM109 (pMW::THY). Enzýmová aktivita transhydrogenázy, existujúcej v každom roztoku bunkového extraktu z Escherichia coli JM109 a Escherichia coli JM109 (pMW::THY), sa merala známym spôsobom (Dávid M. Čiarke a Philip D. Bragg, J. Bacteriology 162, 367 až 373, 1985). Výsledok je uvedený v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Kmene	JM109	JM109 (pMW: :THY)
Špecifická aktivita transhydrogenázy (u/mg proteínu)	1,0	1,7

Ako je uvedené v tabuľke 1, je zrejmé, že Escherichia coli JM109 (pMW::THY) má vyššiu enzýmovú aktivitu transhydrogenázy než Escherichia coli JM109. Výsledkom sa dokázalo, že DNA fragment vložený do plazmidu pMW::THY obsahuje gén transhydrogenázy. Escherichia coli obsahujúca plazmid pMW::THY bola označená ako kmeň AJ12929. Kmeň AJ 12929 bol uložený v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of lndustrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry (Národný inštitút biologických vied a humánnej technológie, Agentúra priemyselných vied a technológie, Ministerstvo medzinárodného obchodu a priemyslu) (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japan; zip code 305) dňa 4.októbra 1993 pod číslom uloženia FERM P-13890, prenesený z pôvodného miesta uloženia do medzinárodného depozitu na základe Budapeštianskej dohody zo 4. septembra 1994 a bol uložený pod číslom uloženia FERM BP-4798.

Plazmidová DNA pMW::THY sa pripravila bežným spôsobom a poštiepila sa s BamHI a HindlII, aby sa izoloval 3,0kb DNA fragment obsahujúci gén transhydrogenázy. Plazmidový vektor pHSG399 s markerom chloramfenikolovej rezistencie (dostupný od firmy Takara Shuzo Co., Ltd.) sa poštiepil s BamHI a HindlII a izoloval sa veľký fragment. Potom sa DNA fragment obsahujúci gén transhydrogenázy a BamHI-HindlII veľký fragment z pHSG399 zligovali DNA ligázou, čím sa získal plazmid pHSG::THY.

Plazmid pHSG::THY sa môže autonómne replikovať v bunkách mikroorganizmov patriacich k rodu Escherichia, ale neudrží sa stabilne v bunkách koryneformných baktérii. Preto sa do plazmidu pHSG::THY zaviedol počiatok replikácie získaný z autonómne sa replikujúceho plazmidu odvodeného od korynefromných baktérií.

Plazmid pIIM1519 autonómne replikovateľný v bunkách koryneformných baktérií (pozri japonský zverejnený patent č. 58-77895) sa štiepil reštrikčným enzýmom BamHI, aby sa získal 3,0kb DNA fragment obsahujúci počiatok replikácie. Na druhej strane sa plazmid pHSG::THY štiepil s BamHI, aby sa získal DNA fragment. Oba DNA fragmenty sa zligovali DNA ligázou, aby sa pripravil plazmid pHSG::THYB (obr. 2). Kmeň Escherichia coli obsahujúci pHSG::THYB sa označil ako kmeň AJ 12872. Tento kmeň AJ12872 bol uložený v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of Intemational Trade and Industry dňa 4. októbra 1993 pod číslom uloženia FERM P-13889, prenesený z pôvodného miesta uloženia do medzinárodného depozitu na základe Budapeštianskej dohody zo

4. septembra 1994 a bol uložený pod číslom uloženia FERM BP-4797.

Ďalej sa plazmid pSU18, ktorý je autonómne replikovateľný v bunkách baktérie patriacej k rodu Escherichia a má marker kanamycínovej rezistencie (Borja, Bartlome a spol., Gene 102, 75 až 78, 1991), štiepil reštrikčnými enzýmami BamHI a HindlJl, aby sa získal veľký fragment. Tento veľký fragment sa ligoval s opísaným 3,0kb DNA fragmentom, obsahujúcim gén transhydrogenázy, použitím DNA ligázy, aby sa pripravil plazmid pSU::THY (obr.3). Kmeň Escherichia coli obsahujúci pSU::THY sa označil ako kmeň AJ12930. Tento kmeň AJ12930 bol uložený v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of Intemational Trade and Industry dňa 4.októbra 1993 pod číslom uloženia FERM P-13891, prenesený z pôvodného miesta uloženia do medzinárodného depozitu na základe Budapeštianskej dohody zo 4. septembra 1994 a bol uložený pod číslom uloženia FERM BP-4799.

Potvrdilo sa, ako sa ovplyvnila produktivita rôznych L-aminokysclín v bunkách baktérie, patriacej k rodu Escherichia, alebo v bunkách koryneformnej baktérie zvýšením aktivity transhydrogenázy v oboch baktériách.

Príklad 2

Fermentačná produkcia L-treonínu kmeňom so zavedenou transhydrogenázou

Ako L-treonin produkujúca baktéria Escherichia coli má spomedzi v súčasnosti známych kmeňov najvyššiu produkčnú schopnosť kmeň B-3996 (pozri japonský- zverejnený patent č. 3-501682 (PCT)). Preto sa kmeň B-3996 použil ako hostiteľ na vyhodnotenie účinku posilnenia transhydrogenázy. Kmeň B-3996 obsahuje plazmid pVIC40 (medzinárodný patentový spis W090/04636), ktorý sa získal vložením treoninového operónu do vektorového plazmidu pAYC32 so širokým hostiteľským rozsahom, ktorý má marker streptomycínovej rezistencie (porovnaj Chistoserdov A.Y. a Tsygankov Y.D., Plasmid 16, 161 až 167, 1986). Kmeň B-3996 bol uložený v Research Inštitúte for Genetics and Industrial Microorganism Breeding (Výskumný ústav pre genetiku a priemyselné množenie mikroorganizmov) pod registračným číslom RIA1867.

Plazmid pMW::THY sa spätne získal z Escherichia coli AJ12929 získaného v príklade 1 pomocou metódy autorov Maniatis a spol. (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular cloning (Molekulárne klonovanie), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1, 21, 1989). Získaný plazmid pMW::THY sa zaviedol do kmeňa B-3996 pomocou metódy D.M. Morrisona (Methods in Enzymology 68, 326, 1979). Kmeň B-3996 transformovaný s pMH::THY sa označil ako kmeň B-3996(pMW::THY). Kmeň B-3996 a kmeň B-3996(pMW::THY) sa kultivovali v nasledujúcich podmienkach.

Kultivácia sa uskutočňovala 38 hodín pri teplote 37 °C za miešania so 114 až 116 otáčok/min. použitím média so zložením uvedeným v tabuľke 2. V tabuľke 2 sa zložky A, B a C oddelene pripravili, sterilizovali a chladili a zmiešali sa použitím 16/20 objemu zložky A, 4/20 objemu zložky B a 30 g/1 zložky C. Výsledky kultivácie sú uvedené v tabuľke 3. Zistilo sa, že produktivita L-treonínu sa zlepšila zvý šením aktivity vnútrobunkovej transhydrogenázy v L-trconín produkujúcej baktérii, ktorá patrí k rodu Escherichia.

Tabuľka 2. Médium pre treonín produkujúce baktérie

	(g/i)
(A) (NH₄)₂SO₄	16
KH₂PO₄	1
MgSO₄.7 H₂O	1
FeSO₄.7 H₂O	0,01
MnSO₄.5 H₂O	0,01
Kvasnicový extrakt (Difco)	2
L-Met	0,5
Nastavené na pH 7,0 pomocou KOH a autoklávované pri 115
°C 10 minút	(16/20 objemu)
(B) 20%-ná glukóza
Autoklávovaná pri 115 °C 10 minút	(4/20 objemu)
(C) CaCO₃ podľa liekopisu
Autoklávovaný pri 180 °C 2 dni	M
Antibiotiká (streptomycín: 100 pg/ml, kanamycín: 5 gg/ml)

Tabuľka 3

Kmene	B-3996	B-3996 (pMW: :THY)
Treonín (g/1)	12,97	13,99

Príklad 3

Fermentačná produkcia L-lyzínu kmeňom so zavedenou transhydrogenázou

Zisťovalo sa, či sa L-lyzínová produktivita zlepšila zvýšením aktivity vnútrobunkovej transhydrogenázy v koryneformnej baktérii, ktorá produkuje L-lyzín, alebo nie. Ako L-lyzin produkujúca baktéria patriaca ku koryneformným baktériám sa použil kmeň Brevibacterium lactofermentum AJ3990. Kmeň AJ3990 bol uložený v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry a dostal číslo uloženia FERM P-3387. Plazmid pHSG::THYB sa spätne získal z kmeňa Escherichia coli AJ12872 získaného v príklade 1 pomocou metódy autorov Maniatis a spol. (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1, 21, 1989). Získaný plazmid sa zaviedol do kmeňa AJ3990 pomocou transformačnej metódy použitím elektrického impulzu (pozri japonský zverejnený patent č. 2-207791). Kmeň AJ3990 transformovaný s pHSG::THYB sa označil ako kmeň AJ3990(pHSG::THYB). Kmeň AJ3990 a kmeň AJ3990(pHSG::THYB) sa kultivovali v nasledujúcich podmienkach.

Kultivácia sa uskutočňovala 72 hodín pri teplote 31,5 °C za miešania so 114 až 116 otáčkami/min. použitím média so zložením uvedeným v tabuľke 4. Ako sacharidy sa použili tri rôzne sacharidy: glukóza, sacharóza a fruktóza. Výsledky kultivácie sú uvedené v tabuľke 5. Zistilo sa, že produktivita L-lyzínu sa zlepšila zvýšením aktivity vnútrobunkovej transhydrogenázy v L-lyzín produkujúcej koryneformnej baktérii.

Tabuľka 4. Médium na produkciu lyzínu

Sacharid	36 g/1
NH₄C1	20 g/1
KH₂PO₄	1 g/1
MgSO₄.7H₂O	0,4 g/1

FeSO₄.7H₂O	10g/l
MnSO₄.5H₂O	8g/l
Hydrolyzát sójového proteínu (ako zdroj dusíka)	1 mg
Tiamin - HC1	100 mg
Biotín	300 mg
Po autoklávovaní pri 115 °C 10 minút sa pridali 3 % oddelene sterilizovaného uhličitanu vápenatého.

Tabuľka 5

NH₄C1	2
Citrát sodný	20
L-glutamát sodný	0,4
MgSO₄.7H₂O	3
CaCl₂	0,23
Tiamin - HC1	2 mg
L-tyrozín	75 mg
Po autoklávovaní pri 115 °C 10 minút sa pridali 3 % oddelene sterilizovaného uhličitanu vápenatého.

	Akumulácia lyzínhydrochloridu množstvo (g/1)
AJ3990 AJ3990 (pHSG: :THYB)
Glukóza	13,6 14,5
Sacharóza	11,1 12,6
Fruktóza	8,2 11,9

Tabuľka 7

Kmeň	AJ 12604	AJ 12604 (pSU: :THY)
L-fenylalanín	4,28	4,89
Akumulované množstvo (g)	3,75	4,28

Príklad 4

Fermentačná produkcia L-fenylalanínu kmeňom so zavedenou transhydrogenázou

Zisťovalo sa sa, či sa L-fenyalanínová produktivita zlepšila zvýšením aktivity vnútrobunkovej transhydrogenázy v L-fenylalanín produkujúcej baktérii patriacej k rodu Escherichia, alebo nie. Ako L-fenylalanín produkujúca baktéria patriaca k rodu Escherichia sa použil kmeň Escherichia coli AJ 12604. Kmeň AJ12604 obsahuje plazmid pBR-aroG4, ktorý sa získal vložením mutantného aroG génu do vektorového plazmidu pBR322, ktorý má marker amplicilínovej rezistencie, a plazmid pACMAB, ktorý sa získal vložením mutantného pheA génu do vektorového plazmidu pACYC184, ktorý má marker chloramfenikolovej rezistencie (pozri japonský zverejnený patent č.5-236947). Kmeň AJ 12604 bol uložený v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of Intemational Trade and Industry dňa 28. januára 1991 pod číslom uloženia FERM P-11975, prenesený z pôvodného miesta uloženia do medzinárodného depozitu na základe Budapeštianskej dohody dňa 26. septembra 1991 a bol uložený pod číslom uloženia FERM BP-3579. Plazmid pSU::THY sa spätne získal z kmeňa Escherichia coli AJ12930 získaného v príklade 1 pomocou metódy autorov Maniatis a spol. (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1, 21, 1989). Získaný plazmid sa zaviedol do kmeňa AJ12604 pomocou metódy D.M. Morrisona (Methods in Enzymology 68, 326, 1979). Kmeň AJ12604 transformovaný s pSU/.THY sa označil ako kmeň AJ12604(pSU::THY). Kmeň AJ12604 a kmeň AJ12604(pSU::THY) sa kultivovali v nasledujúcich podmienkach.

Kultivácia sa uskutočňovala 16 hodín pri teplote 37 °C za miešania so 114 až 116 otáčkami/min. použitím média so zložením uvedeným v tabuľke 6. Výsledky kultivácie sú uvedené v tabuľke 7. Zistilo sa, že produktivita L-fenylalanínu sa zlepšila zvýšením aktivity vnútrobunkovej transhydrogenázy v L-fenylalanín produkujúcej baktérii, ktorá patrí k rodu Escherichia.

Tabuľka 6. Médium na produkciu fenylalanínu

	(g/i)
Glukóza	20
Na₂HPO₄	29,4
KH₂PO₄	6
NaCl	1

Zoznam sekvencií (1) Všeobecná informácia:

(1) Prihlasovateľ: Ajimoto Co. Inc.

(ii) Názov vynálezu: Spôsob produkcie látok (iii) Počet sekvencií: 2 (iv) Adresa na korešpondenciu:

(A) Adresát:

(B) Ulica:

(C) Mesto:

(D) Štát:

(E) Krajina:

(F) Smerové číslo:

(vi) Údaje o tejto prihláške:

(A) Číslo prihlášky:

(B) Dátum podania:

(C) Zatriedenie:

(vii) Údaje o predchádzajúcej prihláške:

(A) Číslo prihlášky:

(B) Dátum podania:

(viii) Informácia o zástupcovi/agentovi:

(A) Meno:

(B) Registračné číslo:

(C) Odkazové/registračné číslo:

(ix) Telekomunikačná informácia:

(A) Telefón:

(B) Telefax:

(2) Informácia o sekv. č. 1:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 24 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iný...syntetická DNA (iii) Hypotetický: nie (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 1:

CTGATTTTTG GATCCAGATC ACAG 24 (2) Informácia o sekv. č. 2:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 24 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iný...syntetická DNA (iii) Hypotetický·: nie (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 2:

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob produkcie cieľovej látky použitím mikroorganizmu zahŕňajúci kroky: kultivácie mikroorganizmu v kultivačnom médiu na umožnenie produkcie a akumulovania cieľovej látky v uvedenom kultivačnom médiu, a izolácie cieľovej látky z uvedeného kultivačného média, vyznačujúci sa tým, že prostredníctvom modifikácie uvedeného mikroorganizmu je zvýšená jeho schopnosť produkovať redukovaný nikotinamidadeníndinukleotid fosfát z nikotínamidadeníndinukleotidu.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedenou cieľovou látkou je L-aminokyselina.
3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že uvedená L-aminokyselina je vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje L-treonín, L-lyzín, kyselinu L-glutámovú, L-leucín, L-izoleucín, L-valín a L-fenylalanín.
4. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že uvedeným mikroorganizmom je mikroorganizmus patriaci k rodu Escherichia.
5. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že uvedeným mikroorganizmom je koryneformná baktéria.
6. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že zvýšenie produktivity redukovaného nikotínamidadeníndinukleotid fosfátu uvedeným mikroorganizmom sa dosiahne zvýšením enzýmovej aktivity nikotínamidnukleotidtranshydrogenázy v bunke mikroorganizmu.
7. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že zvýšenie produktivity redukovaného nikotínamidadeníndinukleotid fosfátu uvedeným mikroorganizmom sa dosiahne zvýšením expresie génu kódujúceho nikotínamidnukleotidtranshydrogenázu v bunke mikroorganizmu.
8. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že zvýšenie produktivity redukovaného nikotínamidadeníndinukleotid fosfátu uvedeným mikroorganizmom sa dosiahne zvýšením počtu kópií génu kódujúceho nikotínamidnukleotidtranshydrogenázu v bunke mikroorganizmu.