CN100366750C - 通过发酵生产靶物质的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用微生物生产靶物质的方法，包括在培养基中培养埃希氏菌属细菌以生产和积累培养基或细胞中的靶物质，并收集靶物质，例如，染色体上fis基因被断裂的、致使FIS蛋白在细胞中不能正常地起作用的菌株，可被用作该细菌。

Description

通过发酵生产靶物质的方法

发明领域

本发明涉及一种发酵工业技术，特别涉及一种通过使用微生物发酵生产靶物质如L-氨基酸的方法。

相关技术描述

大肠杆菌(E.coli)的染色体DNA由两个或更多的DNA结合蛋白折叠成一种所谓类核的核小体样结构。这些蛋白被称为类核构建蛋白(nucleoid-structuring proteins)。

FIS(倒位刺激因子)，是主要的类核构建蛋白之一，由存在于大肠杆菌染色体73.4min位置的fis基因编码。FIS表达在生长期被诱导而在稳定期被抑制。已有报道称，如果大肠杆菌野生型菌株的fis基因被断裂，则其在营养丰富的培养基中培养时的生长率下降，更确切地说，在原本应当产生高生长率的条件下，却表现为当最初生长率不高时其生长率没有发生变化(非专利文献1)。在细菌生产物质的条件下，细菌的生长率符合后者的情形。进一步而言，FIS是正负调节两种或多种基因表达的全局转录调节因子，已有报道称FIS调节转运RNA和核糖体RNA的表达(非专利文献2)，也调节包括代谢等方面基因的表达(非专利文献3)。

作为一种类核构建蛋白，H-NS与FIS一样，在生长期被诱导并且正负调节两种或多种基因的表达(非专利文献4)。H-NS由存在于大肠杆菌染色体27.8min位置的hns基因编码。

其它主要的类核构建蛋白的实例包括，例如HU、DPS等。HU是一种由hupA和hupB基因分别编码的Huα和Huβ组成的异源二聚体，hupA和hupB基因分别存在于大肠杆菌染色体的90.5min和9.7min(非专利文献5)，HU在生长期和稳定期都被表达。DPS由存在于大肠杆菌染色体18.3min的dps基因编码，其表达在生长期被抑制而在稳定期被诱导(非专利文献6)。

迄今尚无关于通过调节编码类核构建蛋白的基因如fis、hns、hupAB和dps基因的表达来提高物质生产的报道。

(非专利文献1)

Nilsson等，生物化学杂志(The Journnal ofBiological Chemistry)，269，9460-9465，1994

(非专利文献2)

Nilsson等，EMBO杂志(The EMBO Journal)，9，727-734，1990

(非专利文献3)

Xu等，细菌血杂志(Journal of Bacteriology)，177，938-947，1995

(非专利文献4)

Hulton等，细胞(Cell)，63，631-642，1990

(非专利文献5)

Wada等，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)，204，581-591，1988

(非专利文献6)

Almion等，基因与发育(Genes and Development)，6，2646-2654，1992

发明概述

本发明的目的是通过使用属于埃希氏菌属(Escherichia)细菌的发酵来提高有用物质生产的生产效率或生产率。

本发明的发明人为达到上述目的进行了刻苦研究。结果发现通过修饰编码普遍存在于大肠杆菌的类核构建蛋白的基因能提高埃希氏菌属细菌的物质生产。特别是发现通过断裂埃希氏菌属细菌的fis基因能提高其生产靶物质的能力，从而实现本发明。

因此，本发明提供：

(1)一种通过使用属于埃希氏菌属的细菌生产靶物质的方法，包括在培养基中培养细菌，生产和积累培养基或细胞中的靶物质，并收集靶物质，其中的细菌具有生产靶物质的能力，且FIS蛋白在细胞中不能正常地起作用。

(2)按照(1)的方法，其中细菌染色体上的fis基因已被断裂，致使FIS蛋白不能正常地起作用。

(3)按照(1)或(2)的方法，其中的属于埃希氏菌属细菌是大肠杆菌。

(4)按照(1)至(3)中的任何一种方法，其中的靶物质是一种L-氨基酸或者一种蛋白。

(5)按照(4)的方法，其中的L-氨基酸是天冬氨酸家族的L-氨基酸。

(6)按照(5)的方法，其中天冬氨酸家族包括赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸。

(7)按照(6)的方法，其中所述氨基酸是L-赖氨酸。

附图简述

图1表示菌株sMG1655、MG1655Δfis、MG1655Δhns、MGΔdps和MGΔhupAB的生长图。

图2表示WC196和WC196Δfis的生长图。

图3表示菌株WC196和WC196Δfis的葡萄糖消耗图。

图4表示菌株WC196和WC196Δfis的赖氨酸积累图。

图5表示菌株WC196/pCABD2和WC196Δfis/pCABD2的生长图。

图6表示菌株WC196/pCABD2和WC196Δfis/pCABD2的葡萄糖消耗图。

图7表示菌株WC196/pCABD2和WC196Δfis/pCABD2的赖氨酸积累图。

发明详述

下面将对本发明进行详细描述。

本发明使用的属于埃希氏菌属的细菌没有特殊限制，只要它是属于埃希氏菌属的微生物且具有生产靶物质的能力。特别是可以使用那些在Neidhardt等人的文章中提到的(Neidhardt，F.C.等，大肠杆菌和伤寒沙门氏菌(Escherichia coliand Salmonella Typhimurium)，美国微生物学协会，华盛顿特区，1208，表1)。更特别提到的是大肠杆菌。

“生产靶物质的能力”是指当本发明使用的埃希氏菌属细菌在培养基中培养时，在细胞或培养基中生产具有可收集量的靶物质的能力。更确切的是指比野生型或未修饰的埃希氏菌属细菌菌株生产量更大的靶物质的能力。

靶物质没有特殊限制，只要可由属于埃希氏菌属的细菌生产的物质。该靶物质的实例包括各种L-氨基酸如L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-苯丙氨酸，蛋白质(包括肽)，核酸如鸟嘌呤、次黄苷、鸟苷酸和次黄苷酸，维生素，抗生素，生长因子，生理活性物质等，它们通常通过使用埃希氏菌属细菌能生产出。进一步而言，本发明甚至可应用于那些迄今尚未通过使用属于埃希氏菌属的细菌生产的物质。

靶物质可以是天冬氨酸家族的L-氨基酸。所述家族包括L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-甲硫氨酸。

至于产L-赖氨酸的埃希氏菌属细菌，可以用具有L-赖氨酸类似物抗性的突变体为例。赖氨酸类似物抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长，但是当培养基中同时存在L-赖氨酸时，这种抑制变得完全或部分地不敏感。L-赖氨酸类似物的实例包括溶菌素、赖氨酸氧肟酸、S-(2-氨乙基)L-半胱氨酸(AEC)、α-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺等。对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变体可以通过常规的人为诱变处理属于埃希氏菌属的细菌而得到。用来生产L-赖氨酸的细菌菌株的特例包括大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543，NRRL B-12185；参见日本专利公开(Kokai)第56-18596号和美国专利第4,346,170号)和大肠杆菌VL611。在这些微生物中，由L-赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制是不敏感的。

除上述以外，需要提到的是，例如后面描述的产L-苏氨酸细菌，在产L-苏氨酸细菌中，由L-赖氨酸对天冬氨酸激酶的抑制通常也是不敏感的。

在后面描述的实例中，WC196菌株用作大肠杆菌的产L-赖氨酸细菌。该细菌菌株是通过赋予源自大肠杆菌K-12的W3110菌株以AEC抗性而培育得到。该菌株被命名为大肠杆菌AJ13069菌株，且在国家生物科学和人体技术研究所(现为国家高等工业科学和技术协会，国际专利生物体保藏组织，TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)于1994年12月6日进行了保藏，得到的保藏号为FERM P-14690。然后，该菌株于1995年9月29日被转移到布达佩斯条约规定的国际保藏单位，得到的保藏号为FERM BP-5252(参见国际专利公开WO96/17930)。

属于埃希氏菌属的产L-苏氨酸细菌的实例包括大肠杆菌VKPM B-3996(RIA1867)(参见美国专利第5,175,107号)、MG442菌株(参见Gusyatiner等，Genetika(in Russian)，14，pp.947-956，1978)等。

属于埃希氏菌属的产L-高丝氨酸细菌的实例包括菌株NZ10，它是菌株C600的Leu+回复突变型(参见Appleyard R.K.，遗传学(Genetics)，39，pp.440-452，1954)。

属于埃希氏菌属的产L-谷氨酸细菌的实例包括AJ12624菌株(FERM BP-3853，参见法国专利公开第2,680,178号)和L-缬氨酸抗性菌株如大肠杆菌B11、大肠杆菌K-12(ATCC10798)、大肠杆菌B(ATCC11303)和大肠杆菌W(ATCC9637)。

属于埃希氏菌属的产L-亮氨酸细菌的实例包括具有β2-噻吩丙氨酸抗性的细菌菌株、具有β-2-噻吩丙氨酸抗性和β-羟基亮氨酸抗性的细菌菌株(参见日本专利公开(Kokoku)第62-34397号)和具有4-氮亮氨酸抗性或5，5，5-三氟亮氨酸抗性的细菌菌株(日本专利公开(Kokai)第8-70879号)。特别需要提到的菌株是AJ11478(FERM P-5274，参见日本专利公开(Kokoku)第62-34397号)。

属于埃希氏菌属的产L-异亮氨酸细菌的实例包括大肠杆菌KX141(VKPMB-4781，参见欧洲专利公开第519,113号)。

属于埃希氏菌属的产L-缬氨酸细菌的实例包括大肠杆菌VL1970(VKPMB-4411，参见欧洲专利公开第519,113号)。

属于埃希氏菌属的产L-苯丙氨酸细菌的实例包括大肠杆菌AJ12604(FERMBP-3579，参见欧洲专利公开第488,424号)。

进一步而言，属于埃希氏菌属的具有L-氨基酸生产能力的细菌，也可以通过导入具有L-氨基酸生物合成遗传信息的DNA和利用基因重组技术提高这种生产能力来培育。例如，至于产L-赖氨酸细菌，可以导入的基因的实例包括，例如，编码L-赖氨酸生物合成途径的酶如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸激酶、二氧吡啶二羧酸合酶、二氧吡啶二羧酸还原酶、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的基因。假设一种基因编码受L-天冬氨酸或L-赖氨酸反馈抑制的酶如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或天冬氨酸激酶和二氧吡啶二羧酸合酶，期望使用编码该酶的突变基因，使该抑制不敏感。

进一步而言，至于产L-谷氨酸细菌，可以导入的基因的实例包括编码谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、顺乌头酸水合酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、烯醇酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶等的基因。

至于产L-缬氨酸细菌，可以导入的基因的实例包括，例如，ilvGMEDA操纵子，优选为不表达苏氨酸脱氨酶活性和消除弱化作用的ilvGMEDA操纵子(参见日本专利公开(Kokai)第8-47397号)。

进一步而言，酶从L-氨基酸生物合成途径脱离来催化生产非靶L-氨基酸的化合物的活性可能下降或减少。例如，从L-赖氨酸生物合成途径脱离来催化生产非靶L-赖氨酸的化合物的酶的实例包括高丝氨酸脱氢酶(参见国际专利公开WO95/23864)。进一步而言，从L-谷氨酸生物合成途径脱离来催化生产非靶L-谷氨酸的化合物的酶的实例包括α-酮戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂解酶、磷酸乙酰基转移酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰基转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉脱氢酶等。

进一步而言，属于埃希氏菌属的具有生产核酸能力的细菌在例如国际专利公开WO99/03988中作了详细描述。更特别的，需要提到的是在那篇申请中描述的大肠杆菌FADRaddG-8-3::KQ菌株(purFKQ，purA-，deoD-，purR-，add-，gsk-)。该菌株具有生产次黄苷和鸟嘌呤核苷的能力。该菌株具有突变的编码PRPP氨基转移酶的purF基因，其中326位上的赖氨酸残基被谷氨酸残基取代，且AMP和GMP的反馈抑制不敏感。在该菌株中，琥珀酰AMP合酶基因(purA)、嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)、嘌呤阻遏基因(purR)、腺苷脱氨酶基因(add)和次黄苷-鸟嘌呤核苷激酶基因(gsk)被断裂了。该菌株的专有号为AJ13334，在国家生物科学和人体技术研究所、工业科学和技术代理机构、国际贸易和工业部门(现为国家高等工业科学和技术协会，国际专利生物体保藏组织，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)于1997年6月24日作为布达佩斯条约规定的国际保藏进行了保藏，得到的保藏号为FERM BP-5993。

进一步而言，本发明适用的蛋白没有特殊的限制，只要它们能通过基因工程方法生产出，而特别需要提到的是酸性磷酸酶和GFP(绿色荧光蛋白)或其类似物。

此外，属于埃希氏菌属的具有生产有用物质如其它L-氨基酸、蛋白质(包括多肽)、核酸、维生素、抗生素、生长因子和生理活性物质能力的细菌，也可以为本发明所使用。

培育属于埃希氏菌属的具有上述生产靶物质能力的细菌，向埃希氏菌属细菌中导入基因来提高它们的能力，可以使用将属于埃希氏菌属细菌细胞中的自主复制载体与基因连接构建重组DNA，并用于转化大肠杆菌的方法。此外，也可能通过转导、转座子(Berg，D.E.和Berg，CM.，生物技术，1，p.417，1983)、Mu噬菌体公开(日本专利(Kokai)第2-109985号)或同源重组(分子遗传学实验，冷泉港实验室，1972)的方法将靶基因结合到染色体上。

本发明使用的埃希氏菌属细菌是具有上述生产靶物质能力的细菌，其中的FIS蛋白在细胞中不能正常地起作用。“FIS蛋白不能正常地起作用”的表述可以指fis基因的转录或翻译水平降低，从而该基因的产物FIS蛋白不生产或生产量下降，或者指生产的FIS蛋白发生突变，从而FIS蛋白原先的功能退化或消失。FIS蛋白不能正常地起作用的埃希氏菌属细菌的典型的实例包括基因断裂的菌株，其染色体上的fis基因通过基因重组技术被断裂，和突变的菌株，其中由于染色体的表达调节序列或fis基因编码区发生突变，不再生产功能性FIS蛋白。

大肠杆菌fis基因的核苷酸序列(GenBank登记号为AE000405的核苷酸序列中1067至1363位的核苷酸序列)和FIS蛋白的氨基酸序列的实例，如SEQ IDNOS：21和22所示。

本发明中，“FIS蛋白”可以是除了具有如SEQ ID NO：22所示氨基酸序列的大肠杆菌FIS蛋白外，还可以是该蛋白的同源物。进一步而言，被断裂的fis基因可以是除了具有如SEQ ID NO：21所示核苷酸序列的大肠杆菌fis基因外，还可以是该基因的同源物。例如，fis基因同源物的实例包括可以与具有SEQID NO：21所示核苷酸序列或其部分的探针，在严格条件下进行杂交和编码具有FIS蛋白功能的蛋白的基因。这里提到的“严格条件”，是指在该条件下产生所谓的特异性杂交，而不产生非特异性杂交。尽管很难通过使用一些数值来清楚地表述该条件，例如，该严格条件包括DNA具有高度同源性，例如DNA具有50％或以上，优选70％或以上，更优选90％或以上，甚至更优选95％或能相互杂交，而具有低于上述同源性的DNA之间不能相互杂交。可供选择地，作为实例的严格条件是在该条件下，当盐浓度符合Southern杂交洗脱条件时，即1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS，60℃，DNA相互杂交。

作为探针，也可以使用SEQ ID NO：21所示核苷酸序列的部分。这样的探针可以通过PCR生产，用根据SEQ ID NO：21所示核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物，用包含SEQ ID NO：21所示核苷酸序列的DNA片段作为模板。当长度约300bp的DNA片段作为探针时，2×SSC，0.1％SDS，50℃可作为杂交的洗脱条件。

作为在下面描述的基因破坏中使用的fis基因，优选使用与目标埃希氏菌属细菌染色体上的fis基因相同的基因。然而，具有一定程度同源性的基因，以至于细胞内可能发生同源重组，也可被使用。

下面将描述通过基因重组技术断裂染色体上fis基因的方法的一个实例。可以用具有被修饰的fis基因的DNA转化埃希氏菌属细菌来断裂染色体上的fis基因，致使不生产FIS。这一般是通过缺失fis基因的一部分(缺失型fis基因)以及使缺失型fis基因和染色体上的fis基因发生重组来实现的。通过同源重组来断裂基因方法已经建立，有使用线性DNA的方法、使用具有温度敏感性复制控制区的质粒的方法等。考虑到可靠性，优选使用具有温度敏感性复制控制区的质粒的方法。

宿主染色体的fis基因可以用缺失型fis基因代替如下。例如，可以通过将温度敏感性复制控制区、突变型fis基因和显示药物如氨苄青霉素抗性的标记基因连接而制备重组DNA，用该重组DNA转化属于埃希氏菌属的细菌，将转化体菌株在温度敏感性复制控制区不起作用的温度下培养，然后在含有药物的培养基中进一步培养，以获得转化体菌株，其中重组DNA结合到染色体DNA中。

如上所述，菌株中的重组DNA结合到染色体DNA上，与原先存在于染色体上的fis基因序列发生重组，两个融合基因染色体fis基因和缺失型fis基因插入到染色体中，位于重组DNA的其它部分(载体部分、温度敏感性复制控制区和药物抗性标记)的两端。因此，由于正常fis基因在该状态下为显性，转化体菌株表达正常的FIS蛋白。

随后，为了在染色体DNA上仅保留缺失型fis基因，通过两种fis基因的重组，从染色体DNA上除去fis基因的一个拷贝以及载体区(包括温度敏感性复制控制区和药物抗性标记)。此时，染色体DNA上保留了正常fis基因而除去了缺失型fis基因，或者相反地，染色体DNA上保留了缺失型fis基因而除去了正常fis基因。在任何一种情况下，当菌株在温度敏感性复制控制区起作用的温度中培养时，被除去的DNA以质粒形式停留在细胞中。另一方面，如果菌株在温度敏感性复制控制区不起作用的温度中培养，染色体DNA上保留了缺失型fis基因的细胞中会除去包含正常fis基因的质粒。因此，通过PCR克隆或类似方法确定细胞中fis基因的结构，可以获得染色体DNA上包含缺失型fis基因的菌株，而该细胞中正常fis基因被除去。

温度敏感性复制控制区在属于埃希氏菌属细菌的细胞中起作用，作为具有该控制区的质粒，需要提到的是pMAN997(国际专利公开WO99/03988)，其在后面描述的实例中被使用。

常规基因重组技术如DNA的消化和连接、转化、从转化体菌株提取重组DNA和PCR，在参考文献中详细描述，这对于本领域的技术人员来说是熟知的，例如，Sambrook，J.，Fritsch，E.F，Maniatis，T，分子克隆，冷泉港实验室，1989等。

进一步而言，通过用紫外线照射或使用常规突变处理用的诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸处理属于埃希氏菌属的细菌，可以获得不再生产功能性FIS蛋白的突变菌株。

生产靶物质，可以在培养基中培养上述获得的具有生产靶物质能力和细胞中FIS蛋白不能正常地起作用的埃希氏菌属细菌，在培养基或细胞中生产和积累靶物质，并收集靶物质。本发明中，使用具上述特性的埃希氏菌属细菌，能提高靶物质的生产率或者生产效率。据信这是因为具有fis基因的野生型埃希氏菌属细菌在培养过程中表达fis基因，促进或抑制一组转录受FIS蛋白调节的基因(包括已知和未知的基因)的表达，然而，在FIS蛋白不能正常地起作用的菌株中，上述这组基因的表达则不被调节。

作为培养本发明中属于埃希氏菌属细菌的培养基，根据使用的细菌菌株种类或靶物质，可以使用常规熟知的培养基。也就是说，可以使用包含碳源、氮源、无机离子和作为需要的其它有机成分的常规培养基。实施本发明不需要特殊的培养基。

作为碳源，可以使用糖类如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解产物，醇类如甘油和山梨醇，有机酸如反丁烯二酸、柠檬酸和琥珀酸等。

作为氮源，可以使用无机铵盐如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，有机氮如大豆水解产物，氨气，氨水等。

至于有机微量营养素，根据埃希氏菌属细菌的特性，优选添加适量的所需物质如维生素B1、L-高丝氨酸和L-酪氨酸、酵母提取物等。除这些物质外，按需可添加少量磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。

培养可根据使用的细菌菌株，在熟知的常规使用的条件下进行。例如，优选地，在有氧条件下培养16-120小时。在培养过程中，培养温度控制在25-45℃，pH控制在5-8。可以使用无机或有机酸或碱物质以及氨气等来调节pH。

培养完成后，本发明不需要特殊的方法来收集培养基或细胞中的靶物质。

也就是说，收集靶物质可以根据靶物质的种类，通过结合熟知的方法如那些使用离子交换树脂、沉淀法和其它方法达到。进一步而言，积累在细胞中的靶物质，可以在经物理地或酶促破碎细胞之后，根据靶物质从细胞提取物或膜级分(membrane fiaction)中收集。根据靶物质，当其存在于细胞中时，该靶物质可以作为微生物催化剂或类似物利用。

按照本发明，通过使用埃希氏菌属细菌，能提高有用物质如L-氨基酸生产的生产率或者生产效率。

实施例

下面将通过实施例更详细地描述本发明。

实施例1：编码大肠杆菌MG1655的类核构建蛋白基因的断裂及其对生长的作用

通过交换PCR断裂编码大肠杆菌类核构建蛋白的基因(参见Link，A.J.，Phillips，D.，Church，G.M.，细菌血杂志(J.Bacteriol.)，Vol.179，6228-6237，1997)。

(1)fis基因的断裂

合成SEQ ID NOS：1和2所示的寡核苷酸(引物1和2)作为引物，用来扩增一段约300bp的区域包括fis基因编码区的N-末端约20bp和其上游区。合成SEQ ID NOS：3和4所示的寡核苷酸(引物3和4)作为引物，用来扩增一段约300bp的区域包括fis基因编码区的C-末端约20bp和其下游区。引物2和3包括部分互补的共同序列，设计引物使得当扩增产物被连接到那些部分时，fis基因的ORF的一部分将被除去。

进行第一个PCR，使用引物1和2结合、引物3和4结合以及以通过常规方法制备的野生型菌株MG1655的基因组DNA作为模板。在该PCR中，引物1和2与引物4和3的摩尔比为10∶1。进行第二个PCR，使用第一个PCR获得的产物作为模板和引物1和4。将由第二个PCR构建的具有缺失型fis基因的DNA片段克隆到pGEMT-Easy，一种由Promega生产的克隆载体试剂盒中，按照操作步骤获得重组载体pGEM-fis。

用EcoR I消化pGEM-fis以获得包括缺失型fis基因的DNA片段。将该消化片段连接到温度敏感性质粒pMAN997(参见国际专利公开WO99/03988)中，用相同的酶消化后，再用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)纯化。上述pMAN997可以通过将pMAN031的Vsp I-HindIII片段(细菌血杂志(J.Bacteriol.)，162，1196(1985))和pUC19(Takara Shuzo)交换而获得。

大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuzo)用上述连接反应混合物转化，接种到含有25μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上(Meiji Seika)(LB+氨苄青霉素)，在30℃中培养，以筛选氨苄青霉素抗性的克隆。将这些克隆在含有25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基的试管中30℃培养，用Wizard Plus Miniprep(Promega)从细胞中提取质粒。用EcoR I消化这些质粒，筛选出含有目标长度片段的质粒作为fis断裂的质粒pMANΔfis。

用pMANΔfis转化大肠杆菌MG1655。

该转化菌株在LB+氨苄青霉素平板上30℃培养，并筛选氨苄青霉素抗性克隆。筛选的克隆在30℃下液体培养过夜，稀释10³倍后接种到LB+氨苄青霉素平板上，在42℃下筛选氨苄青霉素抗性克隆。在这一阶段，pMANΔfis结合到染色体DNA中。

随后，筛选的克隆涂布在LB+氨苄青霉素平板上，30℃培养。然后，将适量细胞加到2mlLB培养基中，42℃摇床培养4至5小时。将培养液稀释10⁵倍后接种到LB平板上。在获得的克隆中，将几百个克隆接种到LB平板和LB+氨苄青霉素平板上，并检测它们的生长，以确定氨苄青霉素敏感性和抗性。氨苄青霉素敏感性菌株的染色体DNA缺少pMANΔfis载体部分和原先存在于染色体DNA上的正常fis基因，或者缺失型fis基因。几个氨苄青霉素敏感性菌株经过了克隆PCR，以筛选预期用期望的缺失型基因取代fis基因的菌株。因此，由大肠杆菌MG1655制备得到fis基因断裂的菌株即MG1655Δfis。

(2)hns基因的断裂

和(1)中的方法一样，由MG1655制备得到hns基因断裂的菌株。合成SEQID NOS：5和6所示的寡核苷酸(引物5和6)作为引物，用来扩增一段约600bp的区域包括hns基因编码区的N-末端约40bp和其上游区，合成SEQ ID NOS：7和8所示的寡核苷酸(引物7和8)作为引物，用来扩增一段约600bp的区域包括hns基因编码区的C-末端约40bp和其下游区。

进行第一个PCR，使用引物5和6结合、引物7和8结合以及用通过常规方法制备的野生型菌株MG1655的基因组DNA作为模板。进行第二个PCR，使用第一个PCR获得的产物作为模板和引物5和8。获得由第二个PCR构建的具有缺失型hns基因的DNA片段。后面进行的程序与(1)中的方法相同，以获得hns基因断裂的菌株MG1655Δhns。

(3)dps基因的断裂

和(1)中的方法一样，由MG1655制备得到dps基因断裂的菌株。合成SEQID NOS：9和10所示的寡核苷酸(引物9和10)作为引物，用来扩增一段约400bp的区域包括dps基因编码区的N-末端约20bp和其上游区，合成SEQ ID NOS：11和12所示的寡核苷酸(引物11和12)作为引物，用来扩增一段约300bp的区域包括dps基因编码区的C-末端约20bp和其下游区。

进行第一个PCR，使用引物9和10结合、引物11和12结合以及用通过常规方法制备的野生型菌株MG1655的基因组DNA作为模板。进行第二个PCR，使用第一个PCR获得的产物作为模板和引物9和12。获得包括由第二个PCR构建的缺失型dps基因的DNA片段。后面进行的程序与(1)中的方法相同，以获得dps基因断裂的菌株MG1655Δdps。

(4)hupAB基因的断裂

由于hupA和hupB在基因组中是不相邻的，因此这些基因需分别进行断裂。首先，断裂hupA基因。合成SEQ ID NOS：13和14所示的寡核苷酸(引物13和14)作为引物，用来扩增一段约300bp的区域包括hupA基因编码区的N-末端约20bp和其上游区，合成SEQ ID NOS：15和16所示的寡核苷酸(引物15和16)作为引物，用来扩增一段约300bp的区域包括hupA基因编码区的C-末端约20bp和其下游区。

进行第一个PCR，使用引物13和14结合、引物15和16结合以及以通过常规方法制备的野生型菌株MG1655的基因组DNA作为模板。进行第二个PCR，使用第一个PCR获得的产物作为模板和引物13和16。获得由第二个PCR构建的具有缺失型hupA基因的DNA片段。后面进行的程序与(1)中的方法相同，以获得hupA基因断裂的菌株MG1655ΔhupA。

随后，在hupA基因断裂的菌株MG1655ΔhupA中断裂hupB基因。合成SEQID NOS：17和18所示的寡核苷酸(引物17和18)作为引物，用来扩增一段约300bp的区域包括hupB基因编码区的N-末端约20bp和其上游区，合成SEQ IDNOS：19和20所示的寡核苷酸(引物19和20)作为引物，用来扩增一段约300bp的区域包括hupB基因编码区的C-末端约20bp和其下游区。

进行第一个PCR，使用引物17和18结合、引物19和20结合以及用通过常规方法制备的野生型菌株MG1655的基因组DNA作为模板。进行第二个PCR，使用第一个PCR获得的产物作为模板和引物17和20。获得由第二个PCR构建的具有缺失型hupB基因的DNA片段。后面进行的程序与(1)中的方法相同，以获得hupA基因和hupB基因断裂的菌株MG1655ΔhupAB。

(5)基因断裂菌株的培养

用容量10ml的L-管，将fis基因断裂的菌株MG1655Δfis、hns基因断裂的菌株MG1655Δhns、hupAB基因断裂的菌株MG1655ΔhupAB、dps基因断裂的菌株MG1655Δdos和它们的亲本菌株MG1655，培养在含有20mMNH₄Cl、2mM MgSO₄、40mM NaHPO₄、30mM KH₂PO₄、0.01mM CaCl₂、0.01mMFeSO₄、0.01mM MnSO₄、5mM柠檬酸、10mM葡萄糖、2mM盐酸硫胺素、2.5g/L水解酪蛋白氨基酸(Difco)和50mM MES-NaOH(pH 6.8)的培养基中。开始培养时，液体培养基的量为5ml。在37℃下以70rpm的旋转率进行旋转摇动培养。培养基、容器等在使用前都经过高压灭菌。

持续测定液体培养基中的细胞浓度。细胞浓度是通过使用生物光检测器(biophotodetector)(Advantech)测量660nm处的混浊度来测定的。结果如图1所示。

结果发现，dps基因断裂的菌株显示出与对照菌株相似的生长水平，而hns基因断裂的菌株和hupAB基因断裂的菌株显示出生长水平下降。另一方面发现，与对照菌株相比，fis基因断裂的菌株显示出生长水平提高。因此，证实了fis基因断裂在发酵生产上的作用。

实施例2：大肠杆菌fis基因的断裂及其对L-赖氨酸生产的作用

(1)fis基因的断裂

与实施例1中的方法相同，由大肠杆菌WC196菌株制备得到fis基因断裂的菌株WC196Δfis。WC196菌株是一种源自AEC抗性大肠杆菌的L-赖氨酸生产细菌。该菌株的专有号为AJ13069，保藏在国家生物科学和人体技术研究所、工业科学和技术代理机构(现为国家高等工业科学和技术协会，国际专利生物体保藏组织，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，得到的保藏号为FERMP-14690。然后，它于1995年9月29日被转移到布达佩斯条约规定的国际保藏单位，得到的保藏号为FERM BP-5252(参见国际专利公开WO96/17930)。使用实施例1中获得的fis基因断裂的质粒pMANΔfis来转化产L-赖氨酸细菌大肠杆菌WC 196。随后进行的程序与实施例1中的方法相同，由L-赖氨酸细菌大肠杆菌产WC196制备得到fis基因断裂的菌株WC196Δfis。

(2)fis基因断裂菌株的培养

用200ml锥形瓶，将fis基因断裂的菌株WC196Δfis和其亲本菌株WC196培养在含有20mM NH₄Cl、2mM MgSO₄、40mM NaHPO₄、30mM KH₂PO₄、0.01mM CaCl₂、0.01mM FeSO₄、0.01mM MnSO₄、5mM柠檬酸、50mM葡萄糖、2mM盐酸硫胺素、2.5g/L水解酪蛋白氨基酸(Difco)和50mM MES-NaOH(pH6.8)的培养基中。开始培养时，液体培养基的量为20ml。在37℃下以144rpm的旋转率进行旋转摇动培养。培养基、容器等在使用前都经过高压灭菌。

持续测定液体培养基中的细胞浓度、葡萄糖浓度和L-赖氨酸的积累。细胞浓度是通过使用分光光度计(Beckman)测量经水稀释至适当浓度的液体培养基在562nm处的混浊度来测定的。离心除去细胞后，将培养上清液稀释至适当浓度，再用生物技术分析仪(biotech analyzer)(Sakura Seiki)测定葡萄糖浓度和L-赖氨酸的浓度。结果如图2至4所示。进一步而言，培养8小时后的L-赖氨酸的积累值和残余葡萄糖浓度如下所示。

表1：fis断裂的菌株8小时后的L-赖氨酸积累和残余葡萄糖浓度

细菌菌株	L-赖氨酸积累(mg/L)	葡萄糖(g/L)
			WC196Δfis	205	6.20
WC196	95	2.00

结果发现，与对照菌株相比，fis基因断裂的菌株显示出其生长水平(图2)、葡萄糖消耗率(图3)和L-赖氨酸生产率(图4)都提高了。

实施例3：将产L-赖氨酸的质粒导入fis基因断裂的大肠杆菌菌株极其对L-赖氨酸生产的作用

(1)将产L-赖氨酸的质粒导入fis基因断裂的菌株

用含有突变的二氢吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)合成酶基因、突变得源自埃希氏菌属细菌的天冬氨酸激酶III基因和二氢吡啶二羧酸还原酶基因以及源自乳发酵短杆菌(Brevibacterium Lactofermentum)的二氨基庚二酸脱氢酶基因的质粒pCABD2(WO95/16042)，转化实施例2中获得的fis基因断裂的菌株WC196Δfis和其亲本菌株WC196，以获得WC196/pCABD2菌株和WC196Δfis/pCABD2菌株。上述突变的二氧吡啶二羧酸合成酶基因和突变的天冬氨酸激酶III基因，都具有对L-赖氨酸的反馈抑制不敏感的突变。

(2)fis基因断裂菌株的培养

用200ml锥形瓶，将fis基因断裂的WC196Δfis/pCABD2菌株和具有fis基因的野生型菌株WC196/pCABD2培养在含有20mM NH₄Cl、2mM MgSO₄、40mM NaHPO₄、30mM KH₂PO₄、0.01mM CaCl₂、0.01mM FeSO₄、0.01mMMnSO₄、5mM柠檬酸、50mM葡萄糖、2mM盐酸硫胺素、2.5g/L水解酪蛋白氨基酸(Difco)和50mM MES-NaOH(pH 6.8)的培养基中。开始培养时，液体培养基的量为20ml。在37℃下以144rpm的旋转率进行旋转摇动培养。培养基、容器等在使用前都经过高压灭菌。

持续测定液体培养基中的细胞浓度、葡萄糖浓度和L-赖氨酸的积累。细胞浓度是通过使用分光光度计(Beckman)测量经水稀释至适当浓度的液体培养基在562nm处的混浊度来测定的。离心除去细胞后，将培养上清液稀释至适当浓度，再用生物技术分析仪(Sakura Seiki)测定葡萄糖浓度和L-赖氨酸的浓度。结果如图5至7所示。进一步而言，培养8小时后的L-赖氨酸的积累值和残余葡萄糖浓度如下所示。

表2：fis断裂的菌株8小时后的L-赖氨酸积累和残余葡萄糖浓度

细菌菌株	L-赖氨酸积累(g/L)	葡萄糖(g/L)
			WC196/pCABD2	0.80	7.35
WC196Δfis/pCABD2	1.60	4.40

结果发现，与对照菌株相比，导入产L-赖氨酸质粒的fis基因断裂的菌株的生长水平(图5)、葡萄糖消耗率(图6)和L-赖氨酸生产率(图7)都提高了。

序列表

<110>味之素株式会社

<120>生产物质的方法

<130>OP1626

<140>

<141>2003-11-11

<150>JP 2002-327205

<151>2002-11-11

<160>22

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>1

cctggatctt tcgggaaatc

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>2

tacgcgttgt tcgaacatag

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>3

ctatgttcga acaacgcgta aaatacggca tgaactaatt

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>4

cactctgcaa tcacttcaaa

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>5

atagggaatt ctcgtaaaca

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>6

tttaagtgct tcgctcattg

<210>7

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>7

caatgagcga agcacttaaa ttcctgatca agcaataatc

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>8

agaaacggtg gaagcctatc

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>9

cccatacagc tactggcgct

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>10

taatttagcg gtactcataa

<210>11

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>11

ttatgagtac cgctaaatta gagtctaaca tcgaataaat cc

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>12

cggcaaaaac gtgatgcacg

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<212>DNA

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<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>13

atattccgac ttttagctga

<210>14

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>14

cagttgagtc ttgttcataa

<210>15

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>15

ttatgaacaa gactcaactg aaagacgcag ttaagtaaga

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>16

aacattgata ttgatgagcg

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>17

tggacattca tcctgtgaag

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>18

caattgagat ttattcactc

<210>19

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；PGR引物

<400>19

gagtgaataa atctcaattg aaagacgcgg taaactaagc

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>20

cgccaatcag gtaaccactc

<210>21

<211>497

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(101)..(397)

<400>21

cgcacattca acgccattga ggatgccagc gaacagctgg aggcgttgga ggcatacttc 60

gaaaattttg cgtaaacaga aataaagagc tgacagaact atgttcgaac aacgcgtaaa 120

ttctgacgta ctgaccgttt ctaccgttaa ctctcaggat caggtaaccc aaaaacccct 180

gcgtgactcg gttaaacagg cactgaagaa ctattttgct caactgaatg gtcaggatgt 240

gaatgacctc tatgagctgg tactggctga agtagaacag cccctgttgg acatggtgat 300

gcaatacacc cgtggtaacc agacccgtgc tgcgctgatg atgggcatca accgtggtac 360

gctgcgtaaa aaattgaaaa aatacggcat gaactaattc aggttagcta aatgcttgat 420

taaaaaggcg ctactcggca tggggaagcg ccttttttat aggtgtcaca aagggagtga 480

ccatgagaac aggatgt                                                497

<210>22

<211>98

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>22

Met Phe Glu Gln Arg Val Asn Ser Asp Val Leu Thr Val Ser Thr Val

1                 5                  10                  15

Asn Ser Gln Asp Gln Val Thr Gln Lys Pro Leu Arg Asp Ser Val Lys

             20                  25                  30

Gln Ala Leu Lys Asn Tyr Phe Ala Gln Leu Asn Gly Gln Asp Val Asn

         35                  40                  45

Asp Leu Tyr Glu Leu Val Leu Ala Glu Val Glu Gln Pro Leu Leu Asp

     50                  55                  60

Met Val Met Gln Tyr Thr Arg Gly Asn Gln Thr Arg Ala Ala Leu Met

 65                  70                  75                  80

Met Gly Ile Asn Arg Gly Thr Leu Arg Lys Lys Leu Lys Lys Tyr Gly

                 85                  90                  95

Met Asn

Claims (6)

1.一种通过使用属于埃希氏菌属的细菌生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养细菌以在培养基或其细胞中生产和积累该L-氨基酸，并收集该L-氨基酸，其中的细菌具有生产该L-氨基酸的能力，且该细菌被修饰使得FIS蛋白在细胞中不能正常地起作用。

2.按照权利要求1的方法，其中细菌染色体上的fis基因已被断裂，致使FIS蛋白不能正常地起作用。

3.按照权利要求1或2的方法，其中属于埃希氏菌属的细菌是大肠杆菌。

4.按照权利要求3的方法，其中所述L-氨基酸是天冬氨酸家族的L-氨基酸。

5.按照权利要求4的方法，其中所述天冬氨酸家族包括赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸。

6.按照权利要求5的方法，其中所述氨基酸是L-赖氨酸。

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