CN1230551C - 制备l－赖氨酸和逆境抗性微生物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用微生物来生产一种发酵产物的方法，该方法包括，在一种培养基中培养该微生物，来在培养基中生产和积累该发酵产物，并收集发酵产物，其中该微生物通过导入一种编码热休克蛋白的基因来在该微生物的细胞中表达一种来自极端嗜热古细菌菌株KOD-1的热休克蛋白。
Description
发明背景
本发明涉及一种制备发酵产物的方法。具体地说，本发明涉及一种使用微生物来发酵制备一种有用物质如一种氨基酸的方法以及一种对抑制其生长和/或发酵产物生产的逆境具有抗性的微生物。
当细胞处于逆境如高温、高渗透压、代谢抑制、重金属存在和病毒感染时，就会在短时间内诱导合成一组被称为“热休克蛋白”(以下简称“HSP”)的蛋白，来产生对逆境的防御反应。这些HSP在广泛的原核细胞和真核细胞中具有同源性，它们大致被分为几个族，如HSP60、HSP70、HSP90、TRiC和其他族(Hendrick，J.P.和Hartl，F.-V.《生物化学年鉴》62卷，349-384页(1993))。
HSP提供逆境抗性的机制是基于HSP形成蛋白高级结构(蛋白折叠)的功能。也就是说，HSP能够与因逆境而变性变得无法形成正确的高级结构的蛋白结合，通过将其折叠成正确的高级结构而恢复该蛋白的正常功能。
由于已经清楚，HSP在蛋白高级结构形成中的这种功能，不仅在变性蛋白中而且也在正常细胞中的蛋白装配、跨膜运输等中作为分子伴侣。因此其重要性已被人们认识，并且吸引了人们的注意(Ellis，R.J.等《科学》250卷，954-959页(1990))。“伴侣”一词意指一种支持者，被给予这个名称是因为HSP通过与不同的蛋白结合来发挥其功能。
当细胞处于上面提到的逆境中时，HSP的表达被诱导。这种诱导通常是暂时的。它很快减弱并达到一种新的稳定状态。已经发现HSP的这种诱导发生在转录水平(Cowing，D.C.等，《美国科学院院报》80卷，2679-2683页，(1995)；Zhou，Y.N.等《细菌学杂志》170卷，3640-3649页，(1988))。已经知道，一组HSP基因共同具有一种被称为热休克启动子的启动子结构，并且存在一种特异性地作用于这种热休克启动子的因子---σ-32(σ32)。还已经知道，σ32由rpoH基因编码，σ32是一种半衰期非常短(约1分钟)的蛋白质，并与HSP的短暂诱导密切相关(Straus，D.B.等，《自然》329卷，348-351页，(1987))。σ32自身的表达控制已经显示在转录水平和翻译水平完成，但其主要的控制在翻译水平完成。
热休克对HSP的诱导是基于两种机制，即增加σ32的合成数量和稳定性。在这些机制中，就σ32合成数量的增加而言，已经搞清楚热修饰的σ32 mRNA结构增强其翻译(Yura，T等，《微生物学年鉴》47卷，321-350页，(1993))。就σ32的稳定性而言，已经表明有一种HSP(DnaK等)参与σ32的解离，并且据认为是受到HSP作用的反馈控制(Tilly，K.等，《细胞》34卷，641-646页，(1983)；Liberk和K.，《美国科学院院报》89卷，3516-3520页，(1984))。
就大肠杆菌(E.coli)而言，已经知道在逆境存在时HSP与细胞生长的关系(Meury，J.等，《FEMS微生物学通讯》113卷，93-100页(1993))。并且已经知道dnaK和groE分别影响人生长激素的产生和原胶原酶的分泌。(Hockney，R.C.《生物技术动向》12卷，456页(1994))。
国际公开NO.WO96/26289介绍了通过将至少一个编码一种HSP的基因和一个编码一种特异性作用于一种HSP的σ因子的基因导入一种微生物以增加一种HSP的表达数量，来使该微生物获得对抑制微生物生长和/或发酵产物生产的逆境的抗性。
发明简述
本发明的目的是，在发酵生产一种有用的物质如一种氨基酸时，通过降低抑制微生物生长和/或发酵产物生产的逆境影响来进一步提高发酵产物的生产率和产量。
本发明的发明者进行研究来完成上述目标。结果为，他们发现，通过将一个来自极端嗜热古细菌菌株KOD-1的编码HSP的基因导入一种微生物来表达HSP，能在一种高逆境环境下使生产率和生长进一步提高，至此完成本发明。
这样，本发明提供了一种利用一种微生物来生产一种发酵产物的方法，该方法包括，在一种培养基中培养该微生物，来在培养物中生产和积累该发酵物，并收集发酵产物，其中该微生物通过导入一种编码热休克蛋白的基因来在该微生物的细胞中表达一种来自极端嗜热古细菌菌株KOD-1的热休克蛋白。
本发明还提供一种能产生一种发酵产物的微生物，该微生物通过导入一种编码热休克蛋白的基因来在该微生物的细胞中表达一种来自极端嗜热古细菌菌株KOD-1的热休克蛋白。
在上面提到的本发明的方法和微生物中，发酵产物可以是，例如，一种氨基酸如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-苯丙氨酸；一种核酸或一种核苷如鸟苷酸、肌苷和肌苷酸；一种维生素；一种抗生素等，优选是一种氨基酸。
至于本发明可以应用的微生物，可以是属于埃希氏菌属的细菌和棒状杆菌。
根据本发明，在发酵生产有用的物质如氨基酸时，逆境的影响可进一步减少，生产率和产量可进一步提高。
附图简述
图1是表示质粒pMWcpkB的构建示意图。
发明详述
以下对本发明作详细解释。
本发明能应用的发酵产物没有特别的限制，只要其能用一种微生物发酵生产。其例子包括那些由微生物生产的发酵产物。例如各种氨基酸如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-苯丙氨酸；核酸或核苷如鸟苷酸、肌苷和肌苷酸；维生素；抗生素等。而且本发明甚至可用于目前不是由微生物生产的物质，一旦这种物质按照遗传重组或类似技术能够用微生物进行生产时，就可应用本发明。在上面提到的物质中，本发明的方法可适用于在一种培养基中分泌和积累、并因而增加培养基的渗透压的物质，尤其是如氨基酸。
用来通过导入一个编码HSP的基因来在其细胞中表达衍生自极端嗜热古细菌菌株KOD-1的HSP的微生物并没有特别的限制，只要它能通过发酵生产一种发酵产物。其例子包括那些常规用于发酵生产的微生物，例如属于埃希氏菌属的细菌、棒状杆菌、属于芽孢杆菌属的细菌、属于沙雷氏菌属的细菌等。该微生物优选是这样一种微生物，获得了含有质粒所需的复制区域的DNA片段、在该微生物中上面提到的HSP基因具有功能、并且该基因的拷贝数能够增加。前面提到的棒状杆菌是指《伯杰氏细菌学鉴定手册》第8版，599页(1974)中定义的细菌种类，它们是好氧的、革兰氏阳性和不具备芽孢形成能力的抗酸染色阴性的杆菌。它们包括属于棒状杆菌属的细菌、属于以前归于短杆菌属但现在归于棒状杆菌属的短杆菌属的们包括属于棒状杆菌属的细菌、属于以前归于短杆菌属但现在归于棒状杆菌属的短杆菌属的细菌、以及属于与属于棒状杆菌属的细菌相近的短杆菌属的细菌。
具体地说，上面所提到的这种微生物可以是大肠杆菌VKPM B-3996(RIA1867，见美国专利NO.5,175,107)、嗜乙酰乙酸棒杆菌AJ12318(FERM BP-1172，见美国专利NO.5,188,949)或其他生产L-苏氨酸的细菌；大肠杆菌AJ11442(NRRL B-12185和FERM BP-1543，见美国专利NO.4,346,170)、大肠杆菌W3110(tyrA)(该菌株可通过从大肠杆菌W3110(tyrA)/pHATerm(FERM BP-3653)中去除质粒pHATerm来获得，见国际公开NO.WO95/16042)、乳发酵短杆菌AJ12435(FERM BP-2294，见美国专利NO.5,304,476)、乳发酵短杆菌AJ3990(ATCC 31269，见美国专利NO.4,066,501)、或其他生产L-赖氨酸的菌株；大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853，见法国专利公开NO.2,680,178)、乳发酵短杆菌AJ12821(FERM BP-4172，见日本专利申请公开NO.5-26811(1993)、法国专利公开NO.2,701,489)、乳发酵短杆菌AJ12475(FERM BP-2922，见美国专利NO.5,272,067)、乳发酵短杆菌AJ13029(FERM BP-5189，见国际公开NO.WO96/06180)或其他生产L-谷氨酸的菌株；大肠杆菌AJ11478(FERM P-5274，见日本专利公开NO.62-34397(1987))、乳发酵短杆菌AJ3718(FERM P-2516，见美国专利NO.3,970,519)或其他生产L-亮氨酸的菌株；大肠杆菌KX141(VKPM B-4781，见欧洲专利公开NO.519,113)、黄色短杆菌AJ12149(FERM BP-759，见美国专利NO.4,656,135)或其他生产L-异亮氨酸的菌株；大肠杆菌VL1970(VKPMB-4411，见欧洲专利公开519,113)、乳发酵短杆菌AJ12341(FERMBP-1763，见美国专利NO.5,188,948)或其他生产L-缬氨酸的菌株；大肠杆菌AJ12604(FERM BP-3579，日本专利申请公开NO.5-236947(1993)、欧洲专利申请NO.488,424)、乳发酵短杆菌AJ12637(FERMBP-4160，见法国专利公开NO.2,686,898)或其他生产苯丙氨酸的菌株。
本发明的微生物是如上所述的这样一种微生物，该微生物通过导入一个编码HSP的基因而在其细胞中表达来自极端嗜热古细菌菌株KOD-1的HSP。通过这种HSP的表达，赋予该微生物对抑制该微生物生长和/或发酵产物生产的逆境的抗性。
编码极端嗜热古细菌菌株KOD-1的HSP的基因优选以提高HSP表达量的方式进行导入。具体地说，一个细胞中的HSP基因的拷贝数可通过使用能在微生物细胞中自主复制的载体、特别是一种多拷贝质粒作为将该HSP基因导入微生物细胞的载体进行提高。而且，HSP的表达还可通过使用具有高表达效率的启动子以增加每个HSP基因的表达量来有效提高。
编码来自极端嗜热古细菌KOD-1的HSP的基因可用日本专利申请公开NO.9-173078(1997)中介绍的方法来获得。具体地说，这可以用诸如PCR的方法来获得，PCR用从极端嗜热古细菌菌株KOD-1菌株(《应用与环境微生物》60(12)卷，4559-4566(1994)制备的染色体DNA作为模板，以日本专利申请公开NO.9-173078(1997)中公开的、编码来自极端嗜热古细菌菌株KOD-1的HSP的基因的核苷酸序列为基础制备的寡核苷酸以及其他作为引物来进行。用作引物的寡核苷酸的例子是具有显示于日本专利申请公开NO.9-173078(1997)中SEQ ID NO：8和9的核苷酸序列的寡核苷酸。
编码极端嗜热古细菌菌株KOD-1的HSP的基因也可以用整合了含有该基因的DNA片段的质粒的方式来获得。作为这样一种质粒，可以推荐质粒pTrc99AcpkB。携带了这种质粒pTrc99AcpkB的大肠杆菌JM109被命名为AJ13478，它于1998年7月8日在通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮编305-0046，1-3，Higashi，1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)进行了保藏，并获得保藏号FERM P-16887。该保藏随后在1999年6月14日根据布达佩斯条约转为国际保藏，并获得了保藏号FERM BP-6758。
为将按前面介绍获得的基因导入一个属于埃希氏菌属的细菌，例如，可以将一个含有上述基因的DNA片段连接到一个能在该细菌的细胞中自主复制的载体DNA中，并用所获得的重组载体转化该细菌。为将上述基因导入一个不属于埃希氏菌属细菌的微生物中，例如，可以将一个含有上述基因的DNA片段连接到一个能在该微生物中自主复制的载体DNA中，并用所获得的重组载体转化该微生物。
作为能用于本发明的载体DNA，优选是一种质粒载体DNA，当导入基因的微生物是一种属于埃希氏菌属的细菌时，可以使用诸如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等。噬菌体DNA载体也可以使用。为获得该HSP的有效表达，可以用一种在该微生物中有功能的启动子如lac、trp或PL来取代HSP自身的启动子。为将该HSP基因导入一种微生物，可以采用使用转座子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，《生物/技术》1卷，417(1983))、Mu噬菌体(日本专利申请公开NO.2-109985(1990)、或同源重组(《分子遗传学实验》冷泉港实验室(1972))的方法，来将一个含有该基因的DNA片段整合到上面提到的微生物的染色体中。而且，当导入基因的微生物是一种棒状杆菌时，可以使用一种能在棒状杆菌中自主复制的质粒载体，如pMA330(见日本专利公开NO.1-11280(1989))、pHM1519(见日本专利申请公开NO.58-77895(1983))等。
转化可按照传统的微生物转化子制备方法来完成。例如，属于埃希氏菌属的细菌可用D.A.Morrison的方法(《酶学方法》68卷，326页(1979))或一种受体细胞用氯化钙处理以增加DNA的通透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，《分子生物学杂志》53卷，159页(1970))来进行转化。棒状杆菌的转化可用上面介绍的Mandel等人的方法或一种将DNA导入处于生长期的细胞(所谓的感受态细胞)以使细胞像在枯草芽孢杆菌中报道的那样(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Yong，F.E.《基因》1卷，153页(1971))整合DNA的方法来完成。也可以制备一种DNA受体菌株的原生质体和球质体，而原生质体和球质体容易整合DNA，然后像已知的枯草芽孢杆菌、放线菌和酵母那样(Changs，S.和Choen，S.N.，《分子和普通遗传学》168卷，111页(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，《自然》274卷，398页(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，《美国科学院院报》75卷，1929页(1978))将DNA导入其中。而且，还可以用电脉冲技术(Sugimoto等，日本专利申请公开No.2-207791(1990))将重组DNA导入属于短杆菌属和棒状杆菌属的细菌。
当一种普通微生物处于逆境如培养基温度升高、发酵产物引起的高渗透压、一种高浓度的培养基成分等或伴随一种靶发酵产物生成的不正常代谢时，其生长会受到抑制或发酵产物的生产率可能会降低。但通过表达来自极端嗜热古细菌菌株KOD-1的HSP，该微生物能获得对逆境非常好的抗性。结果，在该微生物处于上面提到的逆境中时，发酵产物的生产率会进一步提高。因此，除了直接检测HSP外，在导入了来自极端嗜热古细菌菌株KOD-1的HSP编码基因以在其细胞中表达HSP的微生物中，培养基渗透压(例如高渗透压)、一种培养基中的一种氨基酸高浓度等，这些逆境对微生物的生长有害。
本发明所用的进行发酵生产的培养基可以是一种常规使用的、众所周知的培养基。也就是说，它可以是一种含有一种碳源、一种氮源、无机盐离子和其他所需的有机成分的普通培养基。使用本发明并不需要任何特殊的培养基。
就碳源而言，可以使用一种糖类如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解物、一种醇类如甘油和山梨醇、一种有机酸如延胡索酸、柠檬酸和琥珀酸等。
就氮源而言，可以使用一种无机铵盐如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵、一种有机氮源如大豆水解物、氨气、氨水等。
就微量有机营养而言，需要加入适量的所需物质如维生素B1、L-高丝氨酸和L-酪氨酸或酵母抽提物等。除了这些，根据需要可加入微量的磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。
培养可在根据所用微生物的种类而从常规使用的、众所周知的条件中选择的条件下进行。例如，培养可在一种厌氧环境中进行16~120小时，并将发酵温度控制在25至45℃，pH控制在5至8。为调节pH，可以使用有机或无机的酸性或碱性的物质以及氨气等。
在本发明中，完成培养后从培养基中收集发酵产物不需要特别的方法。也就是说，根据本发明生产的代谢产物可以用一种众所周知的传统方法如离子交换层析、沉淀、以及这些或其他技术的任意组合等进行收集。
实施例
本发明将参照下面的实施例作更具体的解释。
实施例1
使用导入了来自极端嗜热古细菌菌株KOD-1的HSP编码基因(cpkB基因)的L-赖氨酸生产大肠杆菌来生产L-赖氨酸。
大肠杆菌W3110(tyrA)被用作一种生产L-赖氨酸的宿主。菌株W3110(tyrA)在欧洲专利申请No.488424中有详细的介绍，其制备方法将在下面概述。大肠杆菌W3110获自国立遗传研究所(Mishima-shi Shizuoka，日本)。将该菌株接种于含有链霉素的LB平板，并通过挑选形成菌落的菌使用导入了来自极端嗜热古细菌菌株KOD-1的HSP编码基因(cpkB基因)的L-赖氨酸生产大肠杆菌来生产L-赖氨酸。
大肠杆菌W3110(tyrA)被用作一种生产L-赖氨酸的宿主。菌株W3110(tyrA)在欧洲专利申请No.488424中有详细的介绍，其制备方法将在下面概述。大肠杆菌W3110获自国立遗传研究所(Mishima-shiShizuoka，日本)。将该菌株接种于含有链霉素的LB平板，并通过挑选形成菌落的菌株来获得一个链霉素抗性菌株。将所选择的链霉素抗性菌株和大肠杆菌K-12 ME8424的细胞混合，并在一种完全培养基(L-肉汤：1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母抽提物、0.5％NaCl)中在37℃静止培养15分钟来诱导细胞接合。大肠杆菌K-12 ME8424的遗传特征为(HfrPO45、thi、relA1、tyrA：：Tn10、ung-1、nadB)，并可从国立遗传所获得。然后，将培养物接种于一种含有链霉素、四环素和L-酪氨酸的完全培养基(L-肉汤：1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母抽提物、0.5％NaCl、1.5％琼脂)，选择一个能形成菌落的菌株。该菌株被命名为大肠杆菌W3110(tyrA)。
在欧洲专利申请No.488424中公开了通过向这种菌株导入一种质粒而制备的多种菌株。例如，通过向该菌株导入质粒pHATerm而制备的一个菌株被命名为大肠杆菌W3110(tyrA)/pHATerm，它于1991年在通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮编305-0046，1-3，Higashi，1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)根据布达佩斯条约作为国际保藏进行了保藏，并获得了保藏号FERM BP-3653。大肠杆菌W3110(tyrA)可用一种常规方法从上述菌株中去除质粒pHATerm来获得。
质粒pCABD2含有赖氨酸生物合成基因，并在国际公开No.WO95/16042中公开。将该质粒导入上述大肠杆菌W3110(tyrA)中，在一种含有50ug/ml链霉素的L平板培养基(在1升纯水中含有10克聚胨、5克酵母抽提物、5克NaCl和15克琼脂，pH7.2)中选择导入了该质粒的转化子。
另一方面，一种用于导入cpkB的质粒按下述方法构建。一个含有cpk基因的PCR片段按日本专利申请公开No.9-173078(1997)的实施例5中介绍的方法获得，并用NcoI和BamHI消化。将酶切片段克隆到一种载体质粒pTrc99A(Pharmacia制造)的NcoI和BamHI位点之间来获得一种质粒pTrc99AcpkB。携带质粒pTrc99AcpkB的大肠杆菌JM109被命名为大肠杆菌AJ13478，它已于1998年7月8日在通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮编305-0046，1-3，Higashi，1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)进行了保藏，并获得保藏号FERMP-16887。该保藏随后在1999年6月14日根据布达佩斯条约转为国际保藏，并获得了保藏号FERM BP-6758。而且，一个含有加入的trc启动子(用EcoRI和BamHI从pTrc99AcpkB中消化切出)的cpkB基因被克隆到pMW218(Wako Pure Chemical Industries制造)的SmaI和BamHI位点之间来获得一个质粒pMWcpkB，构建该质粒的概述示于图1。用前面提到的方法将此pMWcpkB导入一个大肠杆菌W3110(tyrA)/pCABD2的细胞。在含有50ug/ml链霉素和50ug/ml卡那霉素的L平板培养基上选择导入了该质粒的转化细胞。
而且，按下面的方法构建一个用于导入rpoH基因的质粒。rpoH基因用国际公开No.WO96/26289的实施例1<1>中介绍的PCR技术进行扩增，并使用一个用于平末端化DNA末端的商业试剂盒(Blunting试剂盒，Takara Shuzo制造)将所获得的扩增产物在两端平末端化，并克隆到载体质粒pMW119(Wako Pure Chemical Industries制造)的HincII位点来获得质粒pMWrpoH。用上面提到的方法将该质粒导入大肠杆菌W3110(tyrA)/pCABD2。在含有50ug/ml链霉素和50ug/ml青霉素的L平板培养基上选择导入了该质粒的转化细胞。
评价按上述介绍获得的大肠杆菌W3110(tyrA)/pCABD2、大肠杆菌W3110(tyrA)/pCABD2+pMWrpoH、和大肠杆菌W3110(tyrA)/pCABD2+pMWcpkB的L-赖氨酸生产率。
对所获转化子的L-赖氨酸生产率的评价按下述进行。将细胞在L平板培养基上培养进行复苏，并将每种复苏的转化子在1升纯水中含有40克葡萄糖、1克KH2PO4、0.01克MnSO47H2O、0.01克FeSO47H2O、2克酵母抽提物、0.1克L-酪氨酸、1克MgSO47H2O和25克CaCO3(pH用KOH调至7.0)的培养基中在37℃培养30小时。还将细胞在相同条件下但在开始培养时加入40克/升的L-赖氨酸盐酸盐进行培养。L-赖氨酸的定量试验使用Asahi Chemical Industry Co.，Ltd制造的Biotech Analyzer AS210来进行。L-赖氨酸的产量(数量用从培养后培养基中的L-赖氨酸数量中减去开始时加入的L-赖氨酸数量来获得)用培养基中基于糖的L-赖氨酸盐酸盐的产量(重量％)来表示。结果示于表1。
表1
| 菌株 | 基于糖的L-赖氨酸盐酸盐产量(％) | |
| 开始时加入的L-赖氨酸盐酸盐(g/L) | ||
| 0 | 40 | |
| W3110(tyrA)/pCABD2 | 30.0 | 27.4 |
| W3110(tyrA)/pCABD2+pMWrpoH | 30.2 | 28.8 |
| W3110(tyrA)/pCABD2+pMWcpkB | 30.4 | 29.3 |
从这些结果可明显看出，与没有cpkB基因导入的菌株和导入了rpoH基因的菌株相比，导入了cpkB基因的大肠杆菌即使在存在高浓度的L-赖氨酸的情况下，也能显示提高的L-赖氨酸生产率。
并且，在培养开始时加入22g/L的NaCl的条件下，对L-赖氨酸的生产率进行了相似的评价。结果示于表2。
表2
| 菌株 | 基于糖的L-赖氨酸盐酸盐产量(％) | |
| 开始时加入的NaCl(g/L) | ||
| 0 | 22 | |
| W3110(tyrA)/pCABD2 | 30.0 | 24.3 |
| W3110(tyrA)/pCABD2+pMWrpoH | 30.2 | 25.0 |
| W3110(tyrA)/pCABD2+pMWcpkB | 30.4 | 25.5 |
从这些结果可明显看出，与没有cpkB基因导入的菌株和导入了rpoH基因的菌株相比，导入了cpkB基因的大肠杆菌即使在存在高浓度的NaCl的情况下，也能显示提高的L-赖氨酸生产率。因此，已经发现其对高渗透压有很好的抗性。
然后，研究了培养温度对L-赖氨酸生产的影响。L-赖氨酸生产率用上面介绍的相同方式进行评价，但培养在作为标准条件的37℃下和在42℃下进行。结果示于表3。
表3
| 菌株 | 基于糖的L-赖氨酸盐酸盐产量(％) | |
| 培养温度(℃) | ||
| 37 | 42 | |
| W3110(tyrA)/pCABD2 | 30.0 | 26.3 |
| W3110(tyrA)/pCABD2+pMWrpoH | 30.2 | 27.7 |
| W3110(tyrA)/pCABD2+pMWcpkB | 30.4 | 27.9 |
从这些结果可明显看出，与没有cpkB基因导入的菌株和导入了rpoH基因的菌株相比，导入了cpkB基因的大肠杆菌即使在高温的培养中，也能显示提高的L-赖氨酸生产率。
Claims (2)
1.一种利用微生物来生产L-赖氨酸的方法，该方法包括在一种培养基中培养该微生物来在培养基中生产和积累L-赖氨酸，并收集L-赖氨酸，其中该微生物通过导入一种编码热休克蛋白的基因来在该微生物的细胞中表达一种来自极端嗜热古细菌菌株KOD-1的热休克蛋白，所述微生物是属于埃希氏菌属的细菌。
2.权利要求1的方法，其中微生物是大肠杆菌。
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