DE69133342T2

DE69133342T2 - Rekombinante DNS-Sequenzen kodierend für Enzyme frei von Feedback-Inhibition, Plasmide, die diese Sequenzen enthalten, transformierte Mikroorganismen, nützlich für Produktion aromatischer Aminosäuren, und deren Verfahren zur Herstellung durch Fermentation

Info

Publication number: DE69133342T2
Application number: DE69133342T
Authority: DE
Inventors: Naoto Kawasaki-shi Tonouchi; Hiroyuki Kawasaki-shi Kojima; Hiroshi Kawasaki-shi Matsui
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1990-11-30
Filing date: 1991-12-02
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2011-12-03
Also published as: EP1270721A1; EP0745671A3; EP0488424A3; EP0745671A2; EP0745671B1; DE69124939T2; EP1270721B1; DE69133342D1; DE69133587D1; DE69124939D1; EP0488424A2; EP0488424B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA-Sequenzen, die für von der Rückkopplungshemmung befreite Enzyme codieren, Plasmide, die diese rekombinanten DNA-Sequenzen enthalten, Mikroorganismen, die mit diesen Plasmiden transformiert sind, und ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan, L-Phenylalanin und L-Tyrosin durch Fermentation.
Stand der Technik
Der Bedarf an aromatischen Aminosäuren nimmt rasch zu. Zum Beispiel wird L-Phenylalanin als Ausgangsmaterial für den Süßstoff Aspartam verwendet; L-Tryptophan ist ein wichtiges Lebensmitteladditiv; und alle drei (L-Phenylalanin, L-Tryptophän und L-Tyrosin) eignen sich als Transfusionsarzneistoffe.
Es sind zahlreiche Verfahren zur Herstellung von aromatischen Aminosäuren unter Verwendung von Mikroorganismen bekannt. Zum Beispiel werden Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin unter Verwendung von rekombinanter Escherichia coli in den veröffentlichten ungeprüften japanischen Patentanmeldungen 56-1890; 58-103398, 61-92565 und 1-104160 sowie in WO-87/00202 beschrieben. Ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin oder L-Tyrosin unter Verwendung einer Mutante, die zu den Coryneform-Bakterien gehört, wird in der veröffentlichten ungeprüften japanischen Patentanmeldung 61-128897 beschrieben, und Verfahren unter Verwendung von rekombinanten Coryneform-Bakterien werden in den veröffentlichten ungeprüften japanischen Patentanmeldungen 60-34197, 60-24192, 61-260892 und 61-124375 beschrieben. Ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan unter Verwendung von rekombinanter E. coli wird in der veröffentlichten ungeprüften japanischen Patentanmeldung 57-71397 und im US-Patent 4 371 614 beschrieben; Verfahren unter Verwendung von Mutanten von Bacillus subtilis werden in den veröffentlichten ungeprüften japanischen Patentanmeldungen 53-39517 und 62-34399 beschrieben; Verfahren unter Verwendung von rekombinantem Bacillus subtilis werden in den veröffentlichten ungeprüften japanischen Patentanmeldungen 61-104790 und 62-34399 beschrieben; Verfahren unter Verwendung von Coryneform-Bakterien werden in der veröffentlichten ungeprüften japanischen Patentanmeldung 57-174096 beschrieben; und ein Verfahren unter Verwendung von rekombinanten Coryneform-Bakterien wird in der veröffentlichten ungeprüften japanischen Patentanmeldung 62-51980 beschrieben.
Allgemein unterliegt auf dem Biosyntheseweg für aromatische Aminosäuren ein Schlüsselenzym, das eine zentrale Rolle bei der Biosynthese spielt, einer Rückkopplungshemmung durch das Endprodukt. Bei den vorstehend beschriebenen Verfahren werden die gewünschten Aminosäuren hauptsächlich unter Verwendung von Mikroorganismen hergestellt, bei denen das Schlüsselenzym von der Rückkopplungshemmung durch das Endprodukt befreit ist. Die Schlüsselenzyme, die bei den vorstehenden Verfahren von der Rückkopplungshemmung befreit sind, umfassen 3-Desoxy-D-arabinoheptulonsäure-7-phosphatsynthase (nachstehend abgekürzt als "DS") und Prephenatdehydratase (nachstehend abgekürzt als "PD").
Es wird nun zunächst auf DS Bezug genommen. Unter den Mikroorganismen, die bei den vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet werden, weist Escherichia coli drei Typen von natürlich auftretenden (Wildtyp) DS-Isozymen auf. Diese Isozyme werden von Genen codiert, die als aroF, aroG und aroH bezeichnet werden und der Rückkopplungshemmung durch L-Tyrosin, L-Phenylalanin bzw. L-Tryptophan unterliegen.
Die Nucleotidsequenzen und die Aminosäuresequenzen, die für diese Gene und Enzyme relevant sind, sind bereits angegeben worden [aroF: G. S. Hudson und B. E. Davidson, J. Mol. Biol., Bd. 180 (1984), S. 1023; aroG: W. D. Davies und B. E. Davidson, Nucleic Acids Res., Bd. 13 (1982), S. 4045; aroH: J. M. Ray et al., J. Bacteriol., Bd. 170 (1988), S. 5500].
Um die gewünschten aromatischen Aminosäuren in wirksamer Weise herzustellen, muß die Expression dieser DS-Gene verbessert werden. Im Zusammenhang mit der von aroH codierten DS wurde die Rückkopplungshemmung durch L-Tryptophan unter Verwendung von mutiertem aroH aufgehoben [J. M. Ray et al., J. Bacteriol., Bd. 170 (1988), S. 5500]. Die von aroH abgeleitete DS-Aktivität ist jedoch sehr gering, und die von aroH abgeleitete DS eignet sich nicht für eine Verbesserung durch rekombinante DNA-Techniken. Es ist wirksamer, von aroF oder aroG codierte DS zu verwenden, die von der Rückkopplungshemmung befreit ist ("von der Rückkopplungshemmung befreite" DS).
Ein Beispiel für eine Mutation, die die Rückkopplungshemmung der von aroF codierten DS durch L-Tryptophan aufhebt, ist die Substitution des Prolinrestes 148 vom N-Terminus (¹⁴⁸Pro) durch einen Leucinrest [L. M. Weaver und K. M. Herrmann, J. Bacteriol., Bd. 172 (1980), S. 6581].
Wie nachstehend gezeigt wird, wird nur bei einigen Beispielen für die Herstellung von aromatischen Aminosäuren durch Fermentation von der Rückkopplungshemmung befreite DS mit einer klar bezeichneten Mutationsstelle eingesetzt. Edwards et al. lehren, daß die Rückkopplungshemmung durch L-Tyrosin bei der Herstellung von L-Phenylalanin durch Fermentation aufgehoben wird, indem der Glutaminrest 152 (¹⁵²Gln) von DS, die von aroF codiert wird, durch Isoleucin substituiert wird [WO-87/00202]. Ferner lehren Sinenki et al., daß die Rückkopplungshemmung durch L-Phenylalanin bei der Herstellung von L-Phenylalanin durch Fermentation durch Substitution des Leucinrestes 76 (⁷⁶Leu) von DS, die von aroG codiert wird, durch Leucin unterdrückt wird [veröffentlichte ungeprüfte japanische Patentanmeldung 58-103398]. Die Enzymaktivität der von der Rückkopplungshemmung befreiten DS und die Menge an gebihdetem L-Phenylalanin sind jedoch unbekannt. Es sind keine Berichte über die Herstel lung von L-Tryptophan durch von der Rückkopplungshemmung befreite DS-Mutanten bekannt.
Es wird nun auf PD Bezug genommen. Ein bifunktionelles Wildtyp-Enzym (CM-PD), das in Escherichia coli vorhanden ist und sowohl Chorismatmutase-Aktivität (nachstehend abgekürzt als "CM"-Aktivität) als auch PD-Aktivität aufweist, unterliegt der Rückkopplungshemmung durch L-Phenylalanin. Das Enzym wird durch ein als pheA bezeichnetes Gen codiert. Die Nucleotidsequenz von pheA und die Aminosäuresequenz der Wildtyp-CM-PD sind bekannt [G. S. Hudson und B. E. Davidson, J. Mol. Biol., Bd. 180 (1984), S. 1023]. Um in wirksamer Weise L-Phenylalanin herzustellen, ist es wichtig, die Rückkopplungshemmung von CM-PD durch L-Phenylalanin aufzuheben.
Von einigen Beispielen der Modifikation und der Mutation auf der Aminosäureebene ist bekannt, daß sie die Rückkopplungshemmung für die fermentative Herstellung von L-Phenylalanin aufheben. Durch Modifizierung von zwei Tryptophanresten (Aminosäuren 226 und 338 vom N-Terminus) von CM-PD mit Dimethyl-(2-hydroxy-5-nitrobenzylsulfoniumbromid) kann ein Enzym erhalten werden, das der Rückkopplungshemmung widersteht [M. J. H. Gething und B. E. Davidson, Eur. J. Biochem., Bd. 78 (1977), S. 111]. Ein von der Rückkopplungshemmung befreites Enzym kann durch Deletion des Tryptophanrestes 338 (³³⁸Trp) oder Substitution von 338^Trp und des anschließenden Restes durch Arginin-Glycin erhalten werden (veröffentlichte ungeprüfte japanische Patentanmeldung 1-235597). Die Insertion der Aminosäuresequenz Tryptophan-Arginin-Serin-Prolin in die Stelle des gleichen Tryptophanrestes 338 hebt ebenfalls die Rückkopplungshemmung auf (WO-87/00202). Diese Techniken konzentrieren sich auf den Tryptophanrest 338. Es sind jedoch keine endgültigen Untersuchungen über die Wirkungen der Modifizierung oder Mutation des Restes ²²⁶Trp durchgeführt worden.
Andererseits unterliegt bei Coryneform-Bakterien PD der Rückkopplungshemmung durch L-Phenylalanin. Ein Gen, bei dem die Rückkopplungshemmung durch L-Phenylalanin aufgehoben ist, ist bekannt [A. Ozaki et al., Agric. Biol. Chem., Bd. 49 (1986), S. 2925; J. Ito et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., Bd. 33 (1989), S. 190]. Die Nucleotidsequenz des Wildtyp-Coryneform-PD-Gens zeigt eine Homologie zum pheA-Gen von Escherichia coli K-12 [M. T. Follettie und A. J. Sinsky, J. Bacteriol., Bd. 167 (1986), S. 695]. Die Nucleotidsequenz des von der Rückkopplungshemmung befreiten PD-Gens in Coryneform-Bakterien ist jedoch unbekannt, was auch für eine Mutation der Nucleotidsequenz und die Aufhebung der Rückkopplungshemmung durch Substitution der entsprechenden Aminosäuresequenz gilt.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Dementsprechend besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur wirksamen Herstellung aromatischer Aminosäuren durch Fermentation bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe besteht darin, transformierte Mikroorganismen bereitzustellen, die sich für die Herstellung von aromatischen Aminosäuren durch Fermentation eignen.
Eine weitere Aufgabe besteht darin, rekombinante Plasmide bereitzustellen, die Gene exprimieren, die für Schlüsselenzyme der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren codieren, bei denen die Rückkopplungshemmung aufgehoben ist.
Eine weitere Aufgabe besteht darin, rekombinante DNA-Sequenzen bereitzustellen, die für Schlüsselenzyme der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren codieren, bei denen die Rückkopplungshemmung aufgehoben ist.
Eine weitere Aufgabe besteht darin, neue rekombinante Enzyme bereitzustellen, die wichtig für die Biosynthese von aromatischen Aminosäuren sind und bei denen die Rückkopplungshemmung aufgehoben ist.
Diese und weitere Aufgaben, die aus der nachstehenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen ersichtlich sind, wurden durch eine rekombinante DNA-Sequenz, die für ein Enzym des Biosynthesewegs für aromatische Aminosäuren codiert, bei dem die Rückkopplungshemmung aufgehoben ist, ein Plasmid, das die rekombinante DNA-Sequenz umfaßt, einen Mikroorganismus, der sich für die Herstellung von aromatischen Aminosäuren eignet und der mit einem oder mehreren dieser Plasmide transformiert ist, und ein Verfahren zur Herstellung einer aromatischen Aminosäure, das das Kultivieren des transformierten Mikroorganismus und die Isolierung der dabei gebildeten aromatischen Aminosäure umfaßt, gelöst.
Die vorliegende Erfindung stellt bereit:

(1) ein DNA-Fragment, welches ein mutiertes aroG-Gen enthält, das für 3-Deoxy-D-arabinoheptulonsäure-7-phosphatsynthase codiert, in welcher der Aminosäurerest in Position 150 substituiert oder deletiert ist und die von Rückkopplungshemmung befreit ist;
(2) einen Vektor, worin das DNA-Fragment nach (1) funktionsfähig mit einer regulatorische DNA verknüpft ist, welche die Expression der dieses Protein codierenden DNA bewirkt;
(3) einen Mikroorganismus, der diesen Vektor enthält und
(4) ein Verfahren zur Herstellung einer aromatischen Aminosäure, welches das Kultivieren dieses Mikroorganismus in einem Medium und das Isolieren der hergestellten aromatischen A-minosäure umfasst.

Bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Eine vollständigere Würdigung der Erfindung und zahlreicher damit verbundener Vorteile ist ohne weiteres möglich, wenn die Erfindung durch Bezugnahme auf die nachstehende ausführliche
Beschreibung im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen besser verstanden wird, worin:
1 die Konstruktion der Plasmide pTS-aroF und pTS-aroG zeigt;
2 das Ausmaß der Hemmung der Aktivität von DS, die von Wildtyp- und mutiertem aroF codiert wird, durch L-Tyrosin zeigt;
3 das Ausmaß der Hemmung der Aktivität von DS, die von Wildtyp- und mutiertem aroG codiert wird, durch L-Phenylalanin zeigt;
4 das Ausmaß der Hemmung der Prephenatdehydratase-Aktivität von Wildtyp- und mutierter Chorismatmutase-Prephenatdehydratase durch L-Phenylalanin zeigt;
5 die Konstruktion des Plasmids pACKG4 zeigt.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein mutiertes, von der Rückkopplungshemmung befreites Enzym des Biosynthesewegs für aromatische Aminosäuren; eine rekombinante DNA-Sequenz, die ein Enzym des Biosynthesewegs für aromatische Aminosäuren codiert, wobei die Rückkopplungshemmung aufgehoben ist; ein Plasmid, das eine rekombinante DNA-Sequenz umfaßt, die ein Enzym des Biosynthesewegs für aromatische Aminosäuren codiert, wobei die Rückkopplungshemmung aufgehoben ist; einen Mikroorganismus, der sich für die Herstellung von aromatischen Aminosäuren eignet und der mit einem oder mehreren Plasmiden transformiert ist, die eine rekombinante DNA-Sequenz, die ein Enzym des Biosynthesewegs für aromatische Aminosäuren codiert, umfassen, wobei die Rückkopplungshemmung aufgehoben ist; und ein Verfahren zur Herstellung einer aromatischen Aminosäure, das das Kultivieren eines Mikroorganismus, der mit einem oder mehreren Plasmiden transformiert ist, die eine rekombinante DNA-Sequenz umfassen, die für ein Enzym des Biosynthesewegs für aromatische Aminosäu ren codiert, wobei die Rückkopplungshemmung aufgehoben ist, und die Isolierung der dabei hergestellten Aminosäure umfaßt.
In der vorliegenden Anmeldung bezieht sich der Ausdruck "aromatische Aminosäure" auf L-Phenylalanin, L-Tryptophan und L-Tyrosin. Ein Enzym wird von der Rückkopplungshemmung durch ein Endprodukt "befreit", wenn die Aktivität des Enzyms in Gegenwart des Endprodukts nicht abnimmt.
Vorzugsweise handelt es sich bei den Enzymen im Biosyntheseweg für aromatische Aminosäuren, die von der Rückkopplungshemmung befreit sind, um 3-Desoxy-D-arabinoheptulonsäure-7-phosphatsynthase (DS), Prephenatdehydratase (PD) und Chorismatmutase-Prephenatdehydratase (CM-PD). Das Mittel, durch das diese Enzyme von der Rückkopplungshemmung befreit werden, ist vorzugsweise die Mutation, wobei ein oder zwei Aminosäurereste durch andere Aminosäurereste ersetzt werden oder ein oder mehrere Aminosäurereste deletiert werden. Ferner gehört der transformierte Mikroorganismus vorzugsweise zur Gattung Escherichia und ist vorzugsweise mit einem oder mehreren Plasmiden transformiert, die eine rekombinante DNA-Sequenz tragen, die einem der vorstehenden mutierten Enzyme entspricht.
Zunächst haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung ein neues Gen erhalten, das für DS codiert, wobei die Rückkopplungshemmung durch Clonierung des natürlichen DS-Gens von E-scherichia coli und Durchführung einer Mutation mit dem clonierten Gen aufgehoben wird. Ferner wird das natürliche PD-Gen aus Brevibacterium lactofermentum cloniert, und ein Gen, das PD codiert, wobei die Rückkopplungshemmung aufgehoben ist, wird aus L-Phenylalanin bildenden Coryneform-Bakterien cloniert. Ferner wird das natürliche CM-PD-Gen von Escherichia coli cloniert, und mit dem clonierten Gen wird anschließend eine Mutation durchgeführt, um ein neues Gen herzustellen, das CM-PD codiert, wobei die Rückkopplungshemmung aufgehoben ist. Durch Transfektion oder Transformation von Phenylalanin bildenden Bakterien mit dem erfindungsgemäßen Gen kann die Herstellung von L-Phenylalanin durch Fermentation verbessert werden.
Die Erfinder haben auch die fermentative Herstellung von L-Tryptophan durch Transformation eines Microorganismus mit dem erfindungsgemäßen neuen DS-Gen in Kombination mit einem Tryptophan-Operon, das ebenso von der Rückkopplungshemmung durch die Anthranilatsynthase (im Folgenden als AS abgekürzt), ein Enzym für das L-Tryptophan Biosynthesesystem, befreit ist.
Das DS codierende Gen, das von der Rückkopplungshemmung befreit ist, wird nach folgendem Verfahren hergestellt.
Zuerst werden die Gene aroF und aroG aus chromosomaler DNA von Escherichia coli unter Anwendung des PCR-Verfahrens, wie es in den US-Patenten 4 800 159, 4 683 202 und 4 683 195, die alle durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht werden, beschrieben ist, cloniert. Die chromosomale DNA, die sich als Quelle für die Gene aroF und aroG eignet, kann aus einem beliebigen Stamm von Escherichia coli cloniert werden, wobei der bevorzugte Stamm jedoch K-12 MC1061 (ATCC 53338) ist. Die gewünschten Gene werden dann mit Hydroxylamin nach einem bekannten Verfahren, z. B. dem, das in J. Mol. Biol., Bd. 175 (1984), S. 331 beschrieben ist, mutiert.
Die Gene aroF und aroG codieren eine DS, die einer Rückkopplungshemmung durch L-Tyrosin bzw. L-Phenylalanin unterliegt, und sie umfassen auch Mutanten, die durch genetischen Polymorphismus und dergl. hervorgerufen werden. Genetischer Polymorphismus bezieht sich auf eine Modifikation einer Aminosäuresequenz eines Proteins aufgrund einer natürlichen Mutation eines Gens.
Um eine Mutation des Gens hervorzurufen, sind eine Anzahl von wirksamen Verfahren bekannt. Beispiele umfassen rekombinante PCR-Verfahren [PCR Technology, Stockton Press (1989)], die gezielte Mutation [W. Kramer und H. J. Frits, Methods in Enzymology, Bd. 154 (1987), S. 350], herkömmliche Verfahren der Bestrahlung eines Stammes, der das Gen trägt, mit UV-Strahlen (ultraviolettem Licht), herkömmliche Verfahren der Behandlung der DNA oder des DNA tragenden Mikroorganismus mit einer Chemikalie (N-Methyl-N'-nitrosoguanidin, Salpetersäure und dergl.) und herkömmliche Verfahren der chemischen Synthese des gewünschten Gens, wie Verfahren unter Einsatz eines bekannten Syntheseautomaten.
Der mutierte Aminosäurerest von DS befindet sich in dem Bereich der Aminosäuresequenz, der an dem Mechanismus der Rückkopplungshemmung durch L-Tyrosin, L-Phenylalanin oder L-Tryptophan teilnimmt. Erfindungsgemäß ist bei der DS, die von aroG codiert wird, der Leucinrest 150 (¹⁵⁰Leu) vom N-Terminus der mutierte Aminosäurerest. Es eignet sich eine beliebige Mutation des Aminosäurerestes 150, die zu einer Befreiung von der Rückkopplungshemmung führt. Zum Beispiel sind Substitution oder Deletion geeignet. Die DS-Mutationen und die entsprechenden Nucleotidsequenzmutationen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
Durch Transfektion eines geeigneten Mikroorganismus mit den vorstehenden mutierten Genen aroF oder aroG als rekombinanten DNA-Sequenzen kann der Mikroorganismus das rekombinante mutierte Gen exprimieren, bei dem die Rückkopplungshemmung aufgehoben ist.
Das Gen, das PD in Brevibacterium lactofermentum codiert, und das Gen, das CM-PD in Escherichia coli codiert, wurde wie folgt hergestellt.
Zuerst würde die Nucleotidsequenz des Brevibacterium lactofermentum-PD-Gens, das PD codiert, bei der die Rückkopplungshemmung durch L-Phenylalanin aufgehoben ist, bestimmt und analysiert. Dabei wurde festgestellt, daß der L-Phenylalanin bildende Stamm eine PD exprimiert, bei der eine Aminosäure im Vergleich mit dem Wildtyp-Stamm substituiert ist. Sodann wurde auf der Basis dieses Befundes eine Substitution oder Deletion eines Aminosäurerestes/mehrerer Aminosäurereste an der entsprechenden Position von CM-Pn in Escherichia coli K-12 durchgeführt, was zu einer CM-PD führte, die von der Rückkopplungshemmung befreit war.
Enzyme mit PD-Aktivität, auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, beziehen sich auf Enzyme, die aus Mikroorganismen, wie Coryneform-Bakterien, mit PD-Aktivität stammen, und ferner beziehen sie sich auf Enzyme, die aus Mikroorganismen, wie Escherichia coli und dergl., mit der bifunktionellen Aktivität von CM-PD stammen.
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der mutierte A-minosäurerest von PD auf eine Substitution eines Aminosäurerestes oder eine Deletion eines Aminosäurerestes/mehrerer Aminosäurereste, die in dem Bereich der Aminosäuresequenz vorhanden sind, der an dem Mechanismus der Rückkopplungshemmung durch L-Phenylalanin teilnimmt. In einer PD, die aus Brevibacterium lactofermentum stammt, eignet sich z. B. der Serinrest 235 (²³⁵Ser) für eine Mutation, und in einer CM-PD, die aus Escherichia coli stammt, ist der Serinrest 330 (³³⁰Ser) vom N-Terminus ein Aminosäurerest, der sich für die Mutation eignet. Geeignete Mutationen umfassen beliebige Mutationen, die zu einer Aufhebung der Rückkopplungshemmung führen; besonders geeignete Mutationen umfassen jedoch die Substitutionen von ²³⁵Ser oder ³³⁰Ser durch einen Prolin- oder Asparaginsäurerest oder die Deletion der Aminosäurereste stromabwärts von ³³⁰Ser.
Durch Transfektion eines geeigneten Mikroorganismus mit dem mutierten PD- oder CM-PD-Gen, das vorstehend beschrieben wurde, als einer rekombinanten DNA-Sequenz wird die Expression einer PD, bei der die Rückkopplungshemmung aufgehoben ist, in dem transfizierten Mikroorganismus erreicht.
Die rekombinanten DNA-Sequenzen, die nach den vorstehenden Verfahren erhalten wurden, beziehen sich auf solche Sequenzen, die durch Einbau eines Gens, das von der Rückkopplungshemmung befreite DS oder PD codiert, in einen Vektor aus Plasmid- oder Phagen-DNA erhalten wird. In der vorliegenden Erfindung können Promotoren, wie lac, trp, PL und dergl., die in dem Mikroorga nismus wirken, ebenfalls verwendet werden, um die Expression des Gens in wirksamer Weise durchzuführen. Die rekombinanten DNA-Sequenzen, auf die hier Bezug genommen wird, umfassen solche Sequenzen, die durch Einbau eines oder mehrerer der vorstehend beschriebenen Gene in ein Chromosom nach bekannten Verfahren erhalten werden. Beispiele umfassen Verfahren unter Verwendung eines Transposons (D. E. Berg und C. M. Berg, Bio/Technol., Bd. 1 (1983), S. 417), eines Mu-Phagen (veröffentlichte ungeprüfte japanische Patentanmeldung 2-109985) oder der homologen Rekombination [Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)].
Als Mikroorganismus, der die rekombinante DNA enthält, kann ein beliebiger Mikroorganismus unabhängig von Spezies und Stamm des Mikroorganismus verwendet werden, solange er das Gen, das das gewünschte Enzym (wie DS oder PD) codiert, exprimiert und imstande ist, die aromatische Aminosäure zu bilden (z. B. im Fall von L-Phenylalanin ein Mikroorganismus, der die Fähigkeit zur Bildung von L-Phenylalanin erworben hat, indem ihm eine Resistenz gegenüber L-Phenylalanin-Analoga verliehen wurde). Besonders geeignete Mikroorganismen werden aus der Gattung Escherichia, der Gattung Brevibacterium, der Gattung Corynebacterium, der Gattung Bacillus, der Gattung Serratia, der Gattung Pseudomonas und dergl. ausgewählt.
Der auf diese Weise erhaltene Mikroorganismus, der mit der rekombinanten DNA transformiert ist, die das von der Rückkoppolungshemmungs befreite DS-Gen trägt, oder ein Mikroorganismus, der zusätzlich CM-PD oder PD herstellt, wird kultiviert, die gewünschte aromatische Aminosäure wird durch den transformierten Mikroorganismus in einem geeigneten Medium gebildet, und die angereicherte Aminosäure wird aufgefangen und isoliert.
Das für die Herstellung der aromatischen Aminosäure verwendete Medium ist ein herkömmliches Medium, das geeignete Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Ionen und gegebenenfalls weitere organische Komponenten enthält. Geeignete Kohlenstoffquellen umfassen Zucker, wie Glucose, Lactose, Galactose, Fructose, Stärkehydrolysat und dergl.; Alkohole, wie Glycerin, Sorbit und dergl.; organische Säuren, wie Fumarsäure, Citronensäure, Bernsteinsäure und dergl.
Geeignete Stickstoffquellen umfassen anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat und dergl.; organischen Stickstoff, wie Sojabohnenhydrolysat und dergl.; Ammoniakgas, Ammoniakwasser und dergl.
Geeignete organische Spurennährstoffquellen sind vorzugsweise vorhanden und umfassen erforderliche Substanzen, wie Vitamin B₁, L-Tyrosin oder Hefeextrakt und dergl. in einer geeigneten Menge.
Zusätzlich dazu können kleine Mengen an Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen und dergl. vorhanden sein.
Die Inkubation wird für 16 bis 72 Stunden unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Die Temperatur für die Inkubation wird zwischen 30 und 45°C gehalten, und der pH-Wert wird während der Inkubation im Bereich von 5 bis 7 gehalten. Der pH-Wert kann mit Säuren oder alkalische Substanzen eingestellt werden, bei denen es sich um anorganische oder organische Substanzen handeln kann, und er kann mit Ammoniakgas und dergl. eingestellt werden, wie es zweckmäßig ist, um den gewünschten pH-Wert und die Konzentrationen der Komponenten in dem Medium aufrechtzuerhalten.
Die gewünschte Aminosäure wird aus dem Fermentationsmedium im allgemeinen nach herkömmlichen Verfahren, wie unter Anwendung eines geeigneten Ionenaustauscherharzes, der Ausfällung und/oder weiterer bekannter Techniken allein oder in Kombination isoliert.
Nach dem allgemeinen Verfahren, das vorstehend beschrieben wurde, wird die Transformante, die die von der Rückkopplungshemmung befreite DS alleine oder zusammen mit der von der Rückkopplungshemmung befreiten PD oder CM-PD exprimiert, erhalten, und durch Kultivierung der Transformante kann die Produktivität der aromatischen Aminosäuren stark verbessert werden.
Weitere Merkmale der Erfindung sind im Verlauf der folgenden Beschreibung von beispielhaften Ausführungsformen ersichtlich, die zur Erläuterung der Erfindung vorgelegt werden, die die Erfindung jedoch nicht beschränken sollen.
Beispiel 1: Herstellung eines Gens, das eine von der Rückkopplungshemmung befreite DS codiert
(1) Gewinnung eines von aroF abgeleiteten mutierten DS-Gens von Escherichia coli (nur zum Vergleich)
Chromosomale DNA wurde aus dem Stamm Escherichia coli K-12 MC1061 auf herkömmliche Weise extrahiert. In einem getrennten Verfahren wurden zwei synthetische DNA-Primer, die durch die Sequenzen Nr. 1 (SEQ ID NO: 1) und 2 (SEQ ID NO: 2) angegeben sind, auf herkömmliche Weise auf der Basis der bekannten Nucleotidsequenz des Zielgens aroF [J. Mol. Biol., Bd. 180 (1984), S. 1023] synthetisiert.
Diese Primer weisen homologe Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts vom aroF-Gen auf. Unter Verwendung der chromosomalen DNA und der DNA-Primer wurde eine PCR (Polymerasekettenreaktion) nach dem Verfahren von Erlich et al. [PCR Technology, Stockton Press (1989)] durchgeführt, wobei man ein DNA-Fragment von 1,5 kbp erhielt. Anschließend wurde das Fragment, wie es in 1 auf der linken Seite gezeigt ist, mit den Restriktionsenzymen EcoRV und Eco47III geschnitten, und das Produkt wurde dann mit dem Produkt des SmaI-Verdaus von pHSG398 (hergestellt von Takara Shuzo) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Kompetente Zellen des Stamms Escherichia coli JM109 (herge stellt von Takara Shuzo) wurden mit dem Reaktionsgemisch transformiert. Ein Plasmid mit dem aroF-Gen wurde aus Stämmen, die resistent gegenüber Chloramphenicol waren, extrahiert, wobei man das Plasmid pHSG-aroF erhielt.
Anschließend wurde pHSG-aroF mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII verdaut, und das resultierende DNA-Fragment, das das aroF-Gen trug, wurde mit dem Fragment des EcoRI- und HindIII-Verdaus des Plasmids pTS1 (japanische Patentanmeldung 2-192162) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Kompetente Zellen des DS-deletierten (aroF, aroG, aroH) Stamms AB3257 von Escherichia coli K-12 wurden mit dem Reaktionsgemisch transformiert (der Stamm AB3257 wurde vom Escherichia coli Genetic Stock Center erhalten). Unter den Stämmen, die resistent gegenüber Ampicillin waren, wurde der Stamm ausgewählt, bei dem die Auxotrophie für L-Tyrosin, L-Phenylalanin und L-Tryptophan verschwunden war, und ein Plasmid wurde daraus extrahiert, wobei man das Plasmid pTS-aroF erhielt.
Nach der Mutation des Plasmids pTS-aroF unter Verwendung von Hydroxylamin nach dem Verfahren aus J. Mol. Biol., Bd. 175 (1984), S. 331 wurde die Mutante dann zur Transformation des E. coli-Stamms AB3257 verwendet. Nachdem Ampicillin-resistente Stämme gewonnen worden waren, wurden zwei Stämme, die in einem minimalen Medium, das mit 1 mM L-Tyrosin angereichert war, wuchsen, ausgewählt. Aus diesen Stämmen wurden die Plasmide pTS-aroF15 und pTS-aroF33, die die Gene tragen, die von der Rückkopplungshemmung befreite DS codieren, erhalten.
Zellen des Stamms AB3257, die mit den Plasmiden transformiert waren, die das Gen enthalten, das nicht von der Rückkopplungshemmung befreite DS codiert, wurden einer Rückkopplungshemmung bei einer Konzentration von 1 mM L-Tyrosin in dem minimalen Medium unterworfen. Dementsprechend war der Stamm, der der Rückkopplungshemmung unterlag, nicht zur Synthese aromatischer Aminosäuren, wie L-Phenylalanin oder L-Tryptophan, imstande und wuchs nicht.
(2) Herstellung eines von aroG abgeleiteten mutierten DS-Gens aus Escherichia coli
Ein mutiertes aroG-Gen wurde auf ähnliche Weise wie im Fall des aroF-Gens gewonnen. Zwei synthetische DNA-Primer, die durch die Sequenzen Nr. 3 (SEQ ID NO: 3) und 4 (SEQ ID NO: 4) angegeben sind, wurden auf herkömmliche Weise auf der Basis der bekannten Nucleotidsequenz des aroG-Gens (Nucleic Acids Res., Bd. 10 (1982), S. 4045) synthetisiert.
Unter Verwendung der Primer und der chromosomalen DNA des E. coli-Stamms MC1061 wurde eine PCR durchgeführt, wobei man ein DNA-Fragment von 2,1 kbp erhielt. Wie in 1 auf der rechten Seite gezeigt ist, wurde das Fragment mit den Restriktionsenzymen SalI und Eco47III geschnitten, und das Produkt wurde anschließend mit dem Produkt des SalI- und SmaI-Verdaus von pHSG398 (hergestellt von Takara Shuzo) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Kompetente Zellen des Escherichia coli-Stamms JM109 wurden mit dem Reaktionsgemisch transformiert. Aus den Stämmen, die gegenüber Chloramphenicol resistent waren, wurde ein Plasmid mit dem aroG-Gen extrahiert, wobei man das Plasmid pHSG-aroG erhielt.
Anschließend wurde pHSG-aroG mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII verdaut, und das resultierende DNA-Fragment, das das aroG-Gen enthielt, wurde mit dem Fragment des EcoRI- und HindIII-Verdaus des Plasmids pTS1 unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Unter den gezüchteten Stämmen, die resistent gegenüber Ampicillin waren, wurden die Stämme, bei denen die Auxotrophie für L-Tyrosin, L-Phenylalanin und L-Tryptophan verschwunden war, ausgewählt, und ein Plasmid wurde daraus extrahiert, wobei man das Plasmid pTS-aroG erhielt.
Nach der Mutation des Plasmids unter Anwendung des Hydroxylaminverfahrens des vorstehenden Beispiels 1–(1) wurde das mutierte Plasmid verwendet, um kompetente Zellen des E. coli-Stamms AB3257 zu transformieren. Nach der Isolierung von Ampicillin-resistenten Stämmen wurden sechs Stämme, die in einem minimalen Medium, das mit 10 mM L-Phenylalanin angereichert war, wuchsen, ausgewählt. Aus diesen Stämmen wurden die Plasmide pTS-aroG4, pTS-aroG8, pTS-aroG15, pTS-aroG17, pTS-aroG29 und pTS-aroG40, die das aroG-Gen trugen, das für von der Rückkopplungshemmung befreite DS codierte, erhalten.
In Zellen des Stamms AB3257, die nicht von der Rückkopplungshemmung befreite DS codieren, tritt die Rückkopplungshemmung bei einer Konzentration von 10 mM L-Phenylalanin in minimalem Medium auf. Dementsprechend kann der Stamm, bei dem die Rückkopplungshemmung nicht unterdrückt ist, keine aromatischen Aminosäuren, wie L-Tryptophan und/oder L-Tyrosin, synthetisieren und daher nicht wachsen.
(3) Bestimmung der DS-Enzymaktivität
Die vorstehenden Plasmide, die mutiertes aroF (pTS-aroF15 und pTS-aroF33) oder mutiertes aroG (pTS-aroG4, pTS-aroG8, pTS-aroG15, pTS-aroG17, pTS-aroG29 und pTS-aroG40) trugen, wurden verwendet, um den Escherichia coli-Stamm AB3257, der keine DS-Aktivität aufweist, zu transformieren. Die entsprechenden Transformanten wurden als AJ 12598 (AB3257/pTS-aroF15), AJ 12599 (AB3257/ pTS-aroF33), AJ 12562 (AB3257/pTS-aroG4), AJ 12600 (AB3257/pTS-aroG8), AJ 12563 (AB3257/pTS-aroG15), AJ 12601 (AB3257/pTS-aroGl7), AJ 12602 (AB3257/pTS-aroG29) bzw. AJ 12603 (AB3257/pTS-aroG40) bezeichnet. Unter diesen Transformanten wurden AJ 12563 und AJ 12603 als repräsentative Stämme beim Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science & Technology of Japan unter den Hinterlegungsnummern Escherichia coli FERM BP-3567 bzw. FERM BP-3568 hinterlegt. Zu Vergleichszwecken wurden Plasmide, die Wildtyp-Gene trugen, e benfalls zur Transformation des E. coli-Stamms AB3257 verwendet.
Jeder dieser Stämme wurde für 24 Stunden in einem bekannten L-Phenylalanin bildenden Medium kultiviert [S. Sugimoto et al., J. Biotechnol., Bd. 5 (1988), S. 237]. Aus den Kulturzellen wurde die Rohenzymlösung durch Ultraschallhomogenisierung hergestellt. Die Enzymaktivität von DS wurde auf herkömmliche Weise bestimmt [E. Gollub et al., Methods Enzymol., Bd. 17, S. 349], und zwar in Gegenwart von L-Tyrosin im Fall von aroF und in Gegenwart von L-Phenylalanin im Fall von aroG. Die in den 2 und 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die DS-Enzymaktivität für die Wildtyp-Transformanten (Escherichia coli AB3257/pTS-aroF) in Gegenwart von L-Tyrosin stark gehemmt wird, während die entsprechenden mutierten Transformanten von der Rückkopplungshemmung durch L-Tyrosin befreit sind. Entsprechend ist bei der Wildtyp-Transformante Escherichia coli AB3257/pTSaroG die Enzymaktivität in Gegenwart von L-Phenylalanin stark gehemmt, während die entsprechenden mutierten Transformanten von der Rückkopplungshemmung durch L-Phenylalanin befreit sind. Ferner ist der mutierte Stamm AJ 12562 nicht nur von der Rückkopplungshemmung durch L-Phenylalanin befreit, sondern überraschenderweise steigt auch die DS-Enzymaktivität an, wenn die Konzentration an L-Phenylalanin ansteigt.
(4) Bestimmung der Mutationsstelle von DS, die von der Rückkopplungshemmung befreit ist
Die Nucleotidsequenzen der von der Rückkopplungshemmung befreiten aroF15, aroF33, aroG4, aroG8, aroG15, aroG17, aroG29 und aroG40 wurden auf herkömmliche Weise bestimmt [Molecular Cloning (2. Auflg.), Cold Spring Harbor Press (1989)]. Die spezifische Substitutionsstelle in der Aminosäuresequenz und die Mutationsstelle in der entsprechenden Nucleotidsequenz sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Beispiel 2: Herstellung eines neuen Gens, das für eine PD codiert, bei der die Rückkopplungshemmung aufgehoben ist
(1) Bestimmung der Mutationsstelle der mutierten Brevibacterium lactofermentum-PD (nur zum Vergleich)
Die Nucleotidsequenz des NcoI-Fragments im Plasmid pAJ16, das das PD-Gen des Wildstamms von Brevibacterium lactofermentum trägt, wurde nach dem Didesoxyverfahren unter Ausnutzung der Homologie zu dem bekannten Corynebacterium s. p.-PD-Gen [M. T. Follettie und A. J. Sinsky, J. Bacteriol., Bd. 167 (1986), S. 695] als Index bestimmt. Das Plasmid befindet sich in Brevibacterium lactofermentum AJ 12125 (FERM P-7546). Die resultierende Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 5) und die entsprechende Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 6) sind nachstehend angegeben. Die B. lactofermentum-PD-Aminosäuresequenz unterscheidet sich nur in einem Aminosäurerest von der aus Corynebacterium s. p.
Sequenz 5:
Als nächstes wurde die Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 7) des Gens auf dem Plasmid pPH14, die PD des Phenylalanin bildenden Stamms von Brevibacterium lactofermentum codiert, bestimmt. Man erhielt die nachstehend angegebene Sequenz. Das verwendete Plasmid war das Plasmid, das in Brevibacterium lactofermentum AJ 12259 (FERM BP-3565) enthalten ist. Es wurde ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der Wildtyp-PD und der von der Rückkopplungshemmung befreiten PD (SEQ ID NO: 8) durchgeführt, und es wurde festgestellt, daß der Rest ²³⁵Ser des Wildtyp-Stamms zu einem Prolinrest in der von der Rückkopplungshemmung befreiten PD mutiert war.
Sequenz von Brevibacterium lactofermentum PD (pPH14):
(2) Konstruktion eines Gens, das eine mutierte CM-PD aus Escherichia coli codiert (nur zum Vergleich).
Chromosomale DNA wurde aus dem Escherichia coli-Stamm K-12 RR1 auf herkömmliche Weise extrahiert.
In einem getrennten Verfahren wurden vier synthetische DNA-Primer (Sequenzen Nr. 7–10) (SEQ ID NO: 9–12) chemisch auf herkömmliche Weise auf der Basis der bekannten Nucleotidsequenz des pheA-Gens [G. S. Hudson und B. E. Davidson, J. Mol. Biol., Bd. 180 (1984), S. 1023] synthetisiert.
Die Sequenzen Nr. 7 und 8 haben homologe Sequenzen stromaufwärts bzw. stromabwärts vom pheA-Gen. Die Sequenzen Nr. 9 und 10 sind komplementär zueinander und weisen eine fast perfekte Homologie zu der Sequenz um den Serinrest 330 (³³⁰Ser) auf, mit der Ausnahme, daß ein Basenpaar verschieden ist, d. h. T (Thyminbase) ist gegen C (Cytosinbase) ausgetauscht. CM-PD aus Escherichia coli K-12 weist eine hohe Homologie zu PD aus Brevibacterium lactofermentum auf. Insbesondere entspricht der Serinrest 330 vom N-Terminus (³³⁰Ser) der CM-PD aus Escherichia coli K-12 dem Serinrest 235 (²³⁵Ser) von Brevibacterium lactofermentum-PD. Die Sequenzen Nr. 9 und 10 werden auf eine solche Weise synthetisiert, daß der Serinrest 330 zu einem Prolinrest wird.
Als nächstes wurde unter Verwendung von 1 μg chromosomaler DNA und entweder 300 ng jedes der Primer der Sequenzen Nr. 7 und 10 oder 300 ng jedes der Primer der Sequenzen Nr. 8 und 9 eine PCR durchgeführt, wobei man DNA-Fragmente von 1,3 kbp bzw. 0,5 kbp erhielt. Der PCR-Temperaturzyklus aus Reaktion bei 94°C für 1 min, bei 50°C für 2 min und bei 72°C für 3 min wurde für 20 Zyklen unter Verwendung einer kontinuierlichen Replikationsreaktionsvorrichtung (Thermal Cycler, hergestellt von Perkin Elmer Cetus Co.) gemäß dem Verfahren von Erlich et al. [PCR Technology, Stockton Press (1989)] wiederholt. Diese DNA-Fragmente wurden einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen und unter Verwendung eines Standard-DNA-Isolierungsreagenzsatzes (Gene Clean, hergestellt von Funakoshi Co.) gewonnen.
Getrennt davon wurde unter Verwendung dieser Fragmente und der Primer der Sequenzen Nr. 7 und 8 eine PCR-Reaktion durchgeführt, wobei man ein DNA-Fragment von 1,8 kbp erhielt. Nachdem das Fragment von 1,8 kbp mit BamHI und PstI verdaut worden war, wurde ein DNA-Fragment von 1,7 kbp durch Agarosegel-Elektrophorese gewonnen. Anschließend wurde das Fragment von 1,7 kbp mit dem Produkt des BamHI- und PstI-Verdaus des Plasmids pHSG398 (hergestellt von Takara Shuzo) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Das Ligationsprodukt wurde verwendet, um den Escherichia coli-Stamm KA197 (pheA) zu transfizieren. Unter Stämmen, die resistent gegenüber Chloramphenicol waren, wurde der Stamm, bei dem die Phenylalanin-Auxotrophie verschwunden war, ausgewählt, und es wurde ein Plasmid gewonnen. Das Plasmid wurde als pPHAB bezeichnet. Seine Nucleotidsequenz wurde bestimmt. Dieses Plasmid trägt das mutierte CM-PD-Enzymgen, bei dem der Serinrest 330 durch einen Prolinrest substituiert ist.
Unter Anwendung der gleichen Verfahren, wie sie vorstehend genannt wurden, wurde der Serinrest 330 vom N-Terminus (³³⁰Ser) der CM-PD von Escherichia coli K-12 durch einen Asparaginsäurerest ersetzt. Die Sequenzen Nr. 11 und 12 wurden auf eine solche Weise synthetisiert, daß der Serinrest 330 zu einem Asparaginsäurerest wurde.
Auf diese Weise wurde das Plasmid pPHAD, das das mutierte CM-PD-Enzymgen trägt, bei dem der Serinrest 330 durch Asparaginsäure substituiert ist, erhalten.
Ebenfalls unter Anwendung der vorstehend genannten Verfahren wurden die Aminosäurereste stromabwärts von ³³⁰Ser der CM-PD von Escherichia coli K-12 deletiert. Die Sequenzen Nr. 13 und 14 wurden auf eine solche Weise synthetisiert, daß das Codon des Serinrestes 330 zu einem Terminationscodon wurde.
Auf diese Weise wurde das Plasmid pPHATerm, das das mutierte CM-PD-Enzymgen trägt, bei dem die Aminosäurereste stromabwärts vom Serinrest 330 deletiert sind, erhalten.
(3) Konstruktion eines tyrA-Gen-defekten W3110-Stamms von Escherichia coli K-12
Der Escherichia coli-Stamm W3110 (erhalten vom National Institute of Heredity) wurde auf einem Plattenmedium ausgestrichen, das Streptomycin enthielt, um einen Streptomycinresistenten Stamm zu erhalten. Als nächstes wurde dieser Stamm in einem Kulturmedium in Kombination mit dem Escherichia coli-Stamm K-12 ME8424 (HfrPO45, thi, relA1, tyrA: : Tn10, ung-1, nadB) (erhalten vom National Institute of Heredity) kultiviert, und man ließ das Medium für 15 Minuten bei 37°C stehen, um eine Konjugationsübertragung durchzuführen. Anschließend wurde das Medium auf ein Plattenmedium aufgetragen, das Streptomycin, Tetracyclin und L-Tyrosin enthielt. Die gebildete Kolonie, d. h. der Escherichia coli W3110 (tyrA)-Stamm, wurde gewonnen.
Die im vorstehenden Beispiel (2)–2 erhaltenen Plasmide pPHAB, pPHAD und pPHATerm wurden verwendet, um kompetente Zellen des Stamms E. coli W3110 (tyrA) zu transformieren. Die Transformanten Escherichia coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB], E-scherichia coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] und Escherichia coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] wurden beim Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science & Technology of Japan hinterlegt. Die Hinterlegungsnummern sind FERM BP-3566, FERM BP-12659 bzw. FERM BP-12662.
(4) Messung der PD-Enzymaktivität
Der Stamm Escherichia coli K-12 W3110 (tyrA)/(pPHAB) wurde bei 37°C für 15 Stunden in L-Medium kultiviert, und die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 250 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH-Wert: 7,5) mit einem Gehalt an 0,5 mM Dithiothreit unter Eiskühlung suspendiert. Durch Ultraschallbehandlung (20 kHz) für viermal 30 Sekunden wurde die Rohenzymlösung hergestellt.
Die PD-Enzymaktivität wurde auf herkömmliche Weise bestimmt [R. G. H. Cotton und F. Gibson, Meth. in Enzymol., Bd. 17 (1970), S. 564). Unter Verwendung des Rohenzyms wurde die enzymatische Reaktion bei 37°C für 10 min in Gegenwart von 50 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH-Wert: 8,2) mit einem Gehalt an 1 mM Bariumprephenat und 0,5 mM L-Tyrosin durchgeführt. Wäßriges Natriumhydroxid (1 N) wurde zugegeben, um die Reaktion zu beenden, und die gebildete Phenylbrenztraubensäure wurde bei einer Extinktionswellenlänge von 320 nm gemessen.
Die quantitative Bestimmung des Proteins erfolgte unter Verwendung des Protein Assay Kit (hergestellt von Bio Rad Co.) gemäß der Anleitung des Herstellers.
Die in 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Enzymreaktion bei Stämmen, die mit dem Wildtyp-CM-PD-Gen transformiert waren, stark durch das Vorhandensein von 0,5 mM L-Phenylalanin gehemmt wurde, während Stämme, die mit einem mutierten CM-PD-Gen transformiert waren, fast keine Hemmung selbst in Gegenwart von 5 mM L-Phenylalanin zeigten.
Ferner betrug im Fall des Plasmids, das das Wildtyp-Enzymgen trug, die Enzymaktivität in Abwesenheit von L-Phenylalanin nur 3,5 × 10² U/mg Protein. Im Fall des mutierten CM-PD-Gens betrug die Aktivität 1,5 × 104 U/mg Protein. Die Ergebnisse zeigen nicht nur, daß die Expression des mutierten CM-PD-Enzymgens, das von der Rückkopplungshemmung durch L-Phenylalanin befreit ist, in Transformanten, die das mutierte Gen enthalten, auftritt, sondern überraschenderweise auch, daß die Menge des Enzyms und/oder die Enzymaktivität um grob zwei Größenordnungen erhöht werden können.
Unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie vorstehend wurden die PD-Enzymaktivitäten von Escherichia coli W3110 (tyrA)/ (pPHAD) und Escherichia coli W3110 (tyrA)/(pPHATerm) bestimmt. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß die PD-Enzyme beider Stämme von der Rückkopplungshemmung durch L-Phenylalanin befreit waren.
Beispiel 3: Herstellung von L-Phenylalanin durch Fermentation
(1) Konstruktion von Escherichia coli K-12, die ein CM-PD-Gen allein und in Kombination mit einem DS-Gen, das von der Rückkopplungshemmung befreit ist, trägt
Aus dem in Beispiel 1 erhaltenen pTS-aroG4, das das von der Rückkopplungshemmung befreite DS-Gen trägt, wurde der aroG4-Anteil mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII ausgeschnitten. Das Fragment wurde in die Schnittstelle von pBR322 mit E-coRI und HindIII inseriert, wobei man das Plasmid pBR-aroG4 (mit einem Ampicillin-Resistenzmarker) erhielt.
In einem getrennten Verfahren wurde das in Beispiel 2 erhaltene pPHAB, das das von der Rückkopplungshemmung befreite CM-PD-Gen trägt, mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII verdaut, um das Fragment, das das CM-PD-Gen enthält, auszuschneiden. Dieses Fragment wurde in die Schnittstelle von pA-CYC184 mit BamHI und HindIII inseriert, wobei das Plasmid pAC-MAB konstruiert wurde (Selektionsmarker war die Chloramphenicol-Resistenz). Das Plasmid pACAMB wurde verwendet, um kompetente Zellen von Escherichia coli K-12 W3110 (tyrA) zu transformieren, wobei man die Transformante W3110 (tyrA)/pACMAB erhielt.
Ferner wurden die beiden Plasmide pACMAB und pBR-aroG4 verwendet, um W3110 (tyrA) zu transformieren, wobei man die Transformante W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB erhielt. Die Transformante W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB wurde als Stamm AJ 12604 bezeichnet und beim Fermentation Research Institute of the A- gency of Industrial Science & Technology of Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3579 hinterlegt.
(2) Herstellung von L-Phenylalanin
Die vorstehend beschriebenen Transformanten AJ 12604, W3110 (tyrA)/pACMAB, W3110 (tyrA)/pPHAD, W3110 (tyrA)/pPHATerm und W3110 (tyrA) wurden bei 37°C für 24 Stunden in L-Phenylalanin bildendem Medium (mit einem Gehalt an 20 g Glucose, 29,4 g Dinatriumhydrogenphosphat, 6 g Kaliumdihydrogenphosphat, 1 g Natriumchlorid, 2 g Ammoniumchlorid, 10 g Natriumcitrat, 0,4 g Natriumglutamat, 3 g Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,23 g Calciumchlorid und 2 mg Thiamin-hydrochlorid in 1 l Wasser) kultiviert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Die quantitative Bestimmung wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie durchgeführt. Es wurde eine herausragende Verbesserung der fermentativen Herstellung von L-Phenylalanin unter Verwendung des Stamms AJ 12604 erzielt. Tabelle 2

Stamm Menge an L-Phenylalanin

W3110 (tyrA) 0,1

W3110 (tyrA)/pACMAB 0,5

W3110 (tyrA)/pPHAD 0,5

W3110 (tyrA)/pPHATerm 0,5

AJ 12604 3,8
Beispiel 4: Herstellung von L-Tryptophan durch Fermentation
(1) Konstruktion eines Plasmids, das von der Rückkopplungshemmung befreite DS trägt
Das Plasmid pACYC177 (erhalten vom National Institute of Heredity; Ampicillin-Resistenz; 3,6 kbp) wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI verdaut. Nachdem die Stelle des Verdaus durch Klenow-Behandlung stumpfendig gemacht worden war, wurde ein E-coRI-Linker damit unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert, wobei man das Plasmid pACYC177E erhielt, bei dem die XhoI-Stelle zu einer EcoRI-Stelle geworden war. Als nächstes wurde das in den vorstehenden Beispielen 1–(2) und 1–(3) beschriebene Plasmid pTS-aroG4 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII verdaut, wobei man das Fragment erhielt, das aroG4 enthielt. Dieses Fragment wurde mit dem mit EcoRI und HindIII verdauten pACYC177E unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Kompetente Zellen des Stamms AB3257 (beschrieben in Beispiel 1) wurden mit dem Reaktionsgemisch transformiert. Unter den gezüchteten Ampicillin-resistenten Stämmen wurde ein Stamm, bei dem die Auxotrophie für L-Tyrosin, L-Phenylalanin und L-Tryptophan verschwunden war, ausgewählt, und das Plasmid wurde extrahiert. Auf diese Weise wurde das Plasmid pACEG4 (5,1 kbp) erhalten. Ein EcoRI-EcoRI-Fragment, das ein Gen enthielt, das Kanamycin-Resistenz verleiht (Kanamycin-Gen-Block; 1,3 kbp, hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals), wurde mit dem Plasmid pACEG4 an der EcoRI-Stelle unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert, wobei man das Plasmid pACKG4 (resistent gegenüber Ampicillin und Kanamycin; 6,4 kbp) erhielt. Das Verfahren der Konstruktion von pACKG4 ist in 5 skizziert.
(2) Konstruktion von Escherichia coli K-12, die ein von der Rückkopplungshemmung befreites DS-Gen und ein Tryptophan-Operon trägt
Kompetente Zellen des Escherichia coli-Stamms K-12 AGX6aroP (beschrieben im US-Patent 4 371 614, das durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird; Hinterlegungsnummer: NRRL B-12264), der das Plasmid pGX50 trägt, das ein Tryptophan-Operon enthält, wurden mit dem vorstehend beschriebenen Plasmid pACKG4 transformiert, wobei man Escherichia coli AGX6aroP/pGX50, pACKG4 erhielt. Der Genotyp des Escherichia coli-Stamms AGX6aroP ist tna, trpR+, aroP.
(3) Herstellung von L-Tryptophan
Die vorstehend beschriebenen Transformanten Escherichia coli AGX6aroP/pGX50, pACKG4 und AGX6aroP/pGX50 wurden bei 30°C für 72 Stunden in L-Tryptophan bildendem Medium (mit einem Gehalt von 40 g Glucose, 15 g Ammoniumsulfat, 1 g Kaliummonohydrogenphosphat, 1 g Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,01 g Eisen(II)-sulfat-heptahydrat, 0,01 g Manganchlorid-tetrahydrat, 2 g Hefeextrakt und 40 g Calciumcarbonat in 1 1 Wasser, pH-Wert: 7) kultiviert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. Die quantitative Bestimmung von L-Tryptophan wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie durchgeführt. Es wurde eine herausragende Verbesserung der fermentativen Herstellung von L-Tryptophan unter Verwendung des Stamms AGXaroP/pGX50, pACKG erzielt. Tabelle 3

Stamm Menge an gebildetem Tryptophan (g/l)

AGX6aroP/pGX50 0,15

AGX6aroP/pGX50, pACKG4 0,45
Offensichtlich sind zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung im Licht der vorstehenden Lehre möglich. Es versteht sich daher, daß innerhalb des Schutzumfangs der beigefügten Ansprüche die Erfindung anders als es hier speziell beschrieben wurde, ausgeführt werden kann.
Sequenzprotokoll

Claims

DNA-Fragment, welches ein mutiertes aroG-Gen enthält; das für 3-Deoxy-D-arabinoheptulonsäure-7-phosphatsynthase codiert, in welcher der Aminosäurerest in Position 150 substituiert oder deletiert ist und die von Rückkopplungshemmung befreit ist.
DNA-Fragment nach Anspruch 1, worin der Substituent des Prolinrestes 150 ein Leucinrest ist.
Vektor, worin das DNA-Fragment nach Anspruch 1 oder 2 funktionsfähig mit einer regulatorische DNA verknüpft ist, welche die Expression der dieses Protein codierenden DNA bewirkt.
Mikroorganismus, der einen Vektor nach Anspruch 3 enthält.
Mikroorganismus, worin das DNA-Fragment nach Anspruch 1 oder 2 in das Chromosom eingebaut ist und funktionsfähig mit regulatorischer DNA verknüpft ist, welche die Expression der dieses Protein codierenden DNA bewirkt.
Mikroorganismus nach Anspruch 4 oder 5, der zusätzlich ein mutiertes den enthält, welches Chorismamutase-Prephenatdehydratase aus Escherichia coli oder Prephenatdehydratase aus einem coryneformen Bakterium codiert, worin ein oder zwei Aminosäurereste substituiert sind oder ein oder zwei Aminosäurereste deletiert sind.
Mikroorganismus nach Anspruch 6, worin der Serinrest in Position 330 der Chorismatmutase-Prephenatdehydratase substituiert ist oder Aminosäurereste stromabwärts des Serinrests 330 deletiert sind oder worin der Serinrest in Position 235 der Prephenatdehydratase substituiert ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 7, worin die Serinreste durch einen Prolinrest oder einen Aspartatrest substituiert sind.
Verfahren zur Herstellung einer aromatischen Aminosäure, welches das Kultivieren eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 4 bis 8 in einem Medium und das Isolieren der hergestellten aromatischen Aminosäure umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Aminosäure nach Anspruch 9, wobei die aromatische Aminosäure L-Phenylalanin oder L-Tryptophan ist.