JP2002330763A - 発酵法による目的物質の製造法 - Google Patents
発酵法による目的物質の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 発酵法により微生物を利用して物質を製造す
るに際して、デンプン分解液等のグルコース及びオリゴ
糖を含む炭素源を用いたときに、前記微生物のオリゴ
糖、特にマルトースに対する資化性を向上させること。 【解決手段】 微生物を培地中に培養し、該培地中に目
的物質を生成蓄積させ、該培養物から目的物質を採取す
る、微生物を利用した目的物質の製造法において、前記
微生物として、グルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質
と、マルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用により、マルトース資化が調節される微
生物の変異株又は組換え株であって、IIＡGlcタンパク
質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用が弱化または消失した微生物を用いる。
るに際して、デンプン分解液等のグルコース及びオリゴ
糖を含む炭素源を用いたときに、前記微生物のオリゴ
糖、特にマルトースに対する資化性を向上させること。 【解決手段】 微生物を培地中に培養し、該培地中に目
的物質を生成蓄積させ、該培養物から目的物質を採取す
る、微生物を利用した目的物質の製造法において、前記
微生物として、グルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質
と、マルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用により、マルトース資化が調節される微
生物の変異株又は組換え株であって、IIＡGlcタンパク
質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用が弱化または消失した微生物を用いる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物を利用した
目的物質の製造法に関し、詳しくは、Ｌ−アミノ酸、抗
生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質などの目的
物質を微生物を利用して製造する方法において、最終目
的産物である物質の生産性を改善するための手段を開示
するものである。
目的物質の製造法に関し、詳しくは、Ｌ−アミノ酸、抗
生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質などの目的
物質を微生物を利用して製造する方法において、最終目
的産物である物質の生産性を改善するための手段を開示
するものである。
【０００２】
【従来の技術】微生物を利用した物質の製造法の代表的
なものとして、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法が知
られている。Ｌ−アミノ酸は、調味料や、食品として用
いられるだけでなく、医療を目的とする様々な栄養混合
物のコンポーネントとして利用される。さらに、動物用
飼料添加物として、製薬業および化学工業における試薬
として、微生物によるＬ−リジンやＬ−ホモセリンなど
のＬ−アミノ酸産生のための成長因子として利用され
る。発酵法によってＬ−アミノ酸を製造できる微生物と
しては、コリネ型細菌、エシェリヒア属細菌、バチルス
属細菌、セラチア属細菌等が知られている。
なものとして、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法が知
られている。Ｌ−アミノ酸は、調味料や、食品として用
いられるだけでなく、医療を目的とする様々な栄養混合
物のコンポーネントとして利用される。さらに、動物用
飼料添加物として、製薬業および化学工業における試薬
として、微生物によるＬ−リジンやＬ−ホモセリンなど
のＬ−アミノ酸産生のための成長因子として利用され
る。発酵法によってＬ−アミノ酸を製造できる微生物と
しては、コリネ型細菌、エシェリヒア属細菌、バチルス
属細菌、セラチア属細菌等が知られている。
【０００３】上記のような発酵法による目的物質の製造
においては、原材料として廃糖蜜などの糖を含んだもの
が大半を占めるといってよい。アミノ酸発酵や核酸発酵
においても例にもれず、糖を原料として培養を実施して
いる。サトウキビなどにはデンプンが多く含有されてい
るが、原料としてそのまま使用することは稀であり、ほ
とんどがそれらに含まれているデンプンを単糖あるいは
二単糖程度にまで分解したものが用いられている。分解
方法としては、一般的にアミラーゼなどの糖化酵素液を
使用するが、それにより、多糖であるデンプンはグルコ
ース、マルトースあるいはマルトトリオースといった比
較的、低分子の糖に分解される。
においては、原材料として廃糖蜜などの糖を含んだもの
が大半を占めるといってよい。アミノ酸発酵や核酸発酵
においても例にもれず、糖を原料として培養を実施して
いる。サトウキビなどにはデンプンが多く含有されてい
るが、原料としてそのまま使用することは稀であり、ほ
とんどがそれらに含まれているデンプンを単糖あるいは
二単糖程度にまで分解したものが用いられている。分解
方法としては、一般的にアミラーゼなどの糖化酵素液を
使用するが、それにより、多糖であるデンプンはグルコ
ース、マルトースあるいはマルトトリオースといった比
較的、低分子の糖に分解される。
【０００４】エシェリヒア・コリ（E. coli）等のグラ
ム陰性腸内細菌を用いた発酵では、これらのデンプン分
解液を用いるときには問題が生じる。例えば、E. coli
は、主成分として存在するグルコースを消費するが、マ
ルトース等の二単糖以上のオリゴ糖はグルコースを消費
し切ってからでないと消費しないという、いわゆるグル
コース抑制を受ける。そのため、デンプン分解液の主成
分であるグルコースのみを消費した時点で発酵を終了し
た場合、マルトースなどのオリゴ糖は資化されずに無駄
に残存することになる。また、グルコースを消費後、オ
リゴ糖を消費させた場合には、その分、培養時間を延長
しなくてはならず、そのために光熱費などを無駄に費や
すことになる。
ム陰性腸内細菌を用いた発酵では、これらのデンプン分
解液を用いるときには問題が生じる。例えば、E. coli
は、主成分として存在するグルコースを消費するが、マ
ルトース等の二単糖以上のオリゴ糖はグルコースを消費
し切ってからでないと消費しないという、いわゆるグル
コース抑制を受ける。そのため、デンプン分解液の主成
分であるグルコースのみを消費した時点で発酵を終了し
た場合、マルトースなどのオリゴ糖は資化されずに無駄
に残存することになる。また、グルコースを消費後、オ
リゴ糖を消費させた場合には、その分、培養時間を延長
しなくてはならず、そのために光熱費などを無駄に費や
すことになる。
【０００５】E. coli やサルモネラ・チフィムリウム
（Salmonella typhimurium）では一般に、グルコース抑
制を受けることが知られている。すなわち、グルコース
と他の炭素源、例えば、ラクトース、マルトースやグリ
セロールなどを資化させる場合、グルコースがはじめに
資化され、後に他の炭素源が資化される。モノーらは、
ラクトースとグルコースを炭素源にした場合、２段階増
殖、いわゆるジオキシーが観察されることを発見した
（Monod, J. 1947. Growth, 11, 223-247）。分子生物
学的研究により、その機構が明らかになりつつある。す
なわち、グルコース−ホスホエノールピルビン酸−糖ホ
スホトランスフェラーゼ系（Phosphoenolpyruvate-Suga
r Phosphotransferase System）、いわゆるPTS系で資化
される際に、リン酸カスケードにおけるグルコースへの
リン酸供与体であるIIAGlc（グルコースＰＴＳエンザイ
ムII）は、脱リン酸化された状態で存在する。その脱リ
ン酸化されたIIAGlcが、その他の糖の取り込みを阻害す
る、いわゆる、インデュサーイクスクルージョン（Indu
cer exclusion）を引き起こす（Postma, P. W., Lengel
er, J. W. and Jacobson, G. R. 1996. : in Escherich
ia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Bio
logy (ed. Neidhardt, F. C.), pp1149-1174, ASM Pres
s, Washington D. C.）。
（Salmonella typhimurium）では一般に、グルコース抑
制を受けることが知られている。すなわち、グルコース
と他の炭素源、例えば、ラクトース、マルトースやグリ
セロールなどを資化させる場合、グルコースがはじめに
資化され、後に他の炭素源が資化される。モノーらは、
ラクトースとグルコースを炭素源にした場合、２段階増
殖、いわゆるジオキシーが観察されることを発見した
（Monod, J. 1947. Growth, 11, 223-247）。分子生物
学的研究により、その機構が明らかになりつつある。す
なわち、グルコース−ホスホエノールピルビン酸−糖ホ
スホトランスフェラーゼ系（Phosphoenolpyruvate-Suga
r Phosphotransferase System）、いわゆるPTS系で資化
される際に、リン酸カスケードにおけるグルコースへの
リン酸供与体であるIIAGlc（グルコースＰＴＳエンザイ
ムII）は、脱リン酸化された状態で存在する。その脱リ
ン酸化されたIIAGlcが、その他の糖の取り込みを阻害す
る、いわゆる、インデュサーイクスクルージョン（Indu
cer exclusion）を引き起こす（Postma, P. W., Lengel
er, J. W. and Jacobson, G. R. 1996. : in Escherich
ia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Bio
logy (ed. Neidhardt, F. C.), pp1149-1174, ASM Pres
s, Washington D. C.）。
【０００６】E. coliでのマルトースの取り込みはグル
コース抑制を受けるが、これは脱リン酸化されたIIAGlc
とマルトースの非ＰＴＳ（non-PTS）による取り込み系
を構成するMalKタンパク質との相互作用によるものであ
る。すなわち、グルコースを取り込んでいるときは、II
AGlcが細胞内に過剰に存在し、それが、MalKタンパク質
と結合してマルトースの取り込みを抑制するのである。
また、グルコースアナログ存在下でのマルトースの取り
込みが向上した変異株が取得されているが、その変異株
はMalKタンパク質をコードするmalK遺伝子内に変異が存
在することが知られている（Dean, D. A. et al. 1990.
Regulation of the Maltose TransportSystem of Esch
erichia coli by the Glucose-specific Enzyme III of
the Phosphoenolpyruvate-Sugar Phosphotransferase
System. J. Biol. Chem., 265(34), 21005-21010； Kuh
nau, S. et al. 1991. The Activities of the Escheri
chia coli MalK Protein in Maltose Transport, Regul
ation, and Inducer Exclusion Can Be Separated by M
utations. J. Bacteriol., 173(7), 2180-2186）。
コース抑制を受けるが、これは脱リン酸化されたIIAGlc
とマルトースの非ＰＴＳ（non-PTS）による取り込み系
を構成するMalKタンパク質との相互作用によるものであ
る。すなわち、グルコースを取り込んでいるときは、II
AGlcが細胞内に過剰に存在し、それが、MalKタンパク質
と結合してマルトースの取り込みを抑制するのである。
また、グルコースアナログ存在下でのマルトースの取り
込みが向上した変異株が取得されているが、その変異株
はMalKタンパク質をコードするmalK遺伝子内に変異が存
在することが知られている（Dean, D. A. et al. 1990.
Regulation of the Maltose TransportSystem of Esch
erichia coli by the Glucose-specific Enzyme III of
the Phosphoenolpyruvate-Sugar Phosphotransferase
System. J. Biol. Chem., 265(34), 21005-21010； Kuh
nau, S. et al. 1991. The Activities of the Escheri
chia coli MalK Protein in Maltose Transport, Regul
ation, and Inducer Exclusion Can Be Separated by M
utations. J. Bacteriol., 173(7), 2180-2186）。
【０００７】また、IIAGlcについても、非ＰＴＳ糖の一
つであるラクトースの取り込み酵素であるラクトース透
過酵素との結合が低下した変異タンパク質を保持する変
異株が報告されている（Zeng, G. A. et al., 1992. Mu
tational analysis of the enzyme IIIGlc of the phos
phoenolpyruvate phosphotransferease system in Esch
erichia coli. Res. Microbiol., 143, 251-261）。
つであるラクトースの取り込み酵素であるラクトース透
過酵素との結合が低下した変異タンパク質を保持する変
異株が報告されている（Zeng, G. A. et al., 1992. Mu
tational analysis of the enzyme IIIGlc of the phos
phoenolpyruvate phosphotransferease system in Esch
erichia coli. Res. Microbiol., 143, 251-261）。
【０００８】しかしながら、上述の変異株がグルコース
存在下でマルトースを同時に資化しているかについては
不明である。
存在下でマルトースを同時に資化しているかについては
不明である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、発酵法によ
り微生物を利用して物質を製造するに際して、デンプン
分解液等のグルコース及びオリゴ糖を含む炭素源を用い
たときに、前記微生物のオリゴ糖、特にマルトースに対
する資化性を向上させることを課題とする。
り微生物を利用して物質を製造するに際して、デンプン
分解液等のグルコース及びオリゴ糖を含む炭素源を用い
たときに、前記微生物のオリゴ糖、特にマルトースに対
する資化性を向上させることを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、IIＡGlcタン
パク質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタン
パク質との相互作用が弱化または消失した微生物が、グ
ルコース存在下でもマルトースを資化し得ることを見い
出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、
以下のとおりである。
を解決するために鋭意研究を行った結果、IIＡGlcタン
パク質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタン
パク質との相互作用が弱化または消失した微生物が、グ
ルコース存在下でもマルトースを資化し得ることを見い
出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、
以下のとおりである。
【００１１】（１）微生物を培地中に培養し、該培地中
に目的物質を生成蓄積させ、該培養物から目的物質を採
取する、微生物を利用した目的物質の製造法において、
前記微生物は、グルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質
と、マルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用により、マルトース資化が調節される微
生物の変異株又は組換え株であって、IIＡGlcタンパク
質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用が弱化または消失し、かつ、グルコース
とマルトースの取り込みが可能な微生物であることを特
徴とする方法。 （２）マルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパ
ク質がＡＴＰ分解活性を有するマルトースキャリアプロ
テインである（１）記載の方法。 （３）前記タンパク質がＭａｌＫタンパク質である
（２）記載の方法。 （４）前記微生物が保持するＭａｌＫタンパク質が、１
２４位のＡｌａ残基がＴｈｒ残基に置換する変異、及び
３２７位のＬｅｕ残基がＧｌｎ残基に置換する変異から
選ばれる変異を有することにより、IIＡGlcタンパク質
とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質
との相互作用が弱化または消失したことを特徴とする
（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。 （５）前記微生物が保持するIIＡGlcタンパク質が、４
７位のＧｌｙ残基がＳｅｒ残基に置換する変異、及び７
６位のＡｌａ残基がＴｈｒ残基に置換する変異から選ば
れる変異を有することにより、IIＡGlcタンパク質とマ
ルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質との
相互作用が弱化または消失したことを特徴とする（１）
〜（４）のいずれかに記載の方法。 （６）前記目的物質がＬ−アミノ酸である（１）〜
（５）のいずれかに記載の方法。 （７）前記目的物質がＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ
−フェニルアラニンから選ばれる（６）記載の方法。 （８）前記微生物がエシェリヒア属細菌である（１）〜
（７）のいずれかに記載の方法。
に目的物質を生成蓄積させ、該培養物から目的物質を採
取する、微生物を利用した目的物質の製造法において、
前記微生物は、グルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質
と、マルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用により、マルトース資化が調節される微
生物の変異株又は組換え株であって、IIＡGlcタンパク
質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用が弱化または消失し、かつ、グルコース
とマルトースの取り込みが可能な微生物であることを特
徴とする方法。 （２）マルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパ
ク質がＡＴＰ分解活性を有するマルトースキャリアプロ
テインである（１）記載の方法。 （３）前記タンパク質がＭａｌＫタンパク質である
（２）記載の方法。 （４）前記微生物が保持するＭａｌＫタンパク質が、１
２４位のＡｌａ残基がＴｈｒ残基に置換する変異、及び
３２７位のＬｅｕ残基がＧｌｎ残基に置換する変異から
選ばれる変異を有することにより、IIＡGlcタンパク質
とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質
との相互作用が弱化または消失したことを特徴とする
（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。 （５）前記微生物が保持するIIＡGlcタンパク質が、４
７位のＧｌｙ残基がＳｅｒ残基に置換する変異、及び７
６位のＡｌａ残基がＴｈｒ残基に置換する変異から選ば
れる変異を有することにより、IIＡGlcタンパク質とマ
ルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質との
相互作用が弱化または消失したことを特徴とする（１）
〜（４）のいずれかに記載の方法。 （６）前記目的物質がＬ−アミノ酸である（１）〜
（５）のいずれかに記載の方法。 （７）前記目的物質がＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ
−フェニルアラニンから選ばれる（６）記載の方法。 （８）前記微生物がエシェリヒア属細菌である（１）〜
（７）のいずれかに記載の方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本願発明において微生物によって生産される目的物質
は、例えばＬ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミ
ン酸、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、
Ｌ−フェニルアラニン等の種々のＬ−アミノ酸である。
Ｌ−アミノ酸として特に好ましいものは、Ｌ−リジン、
Ｌ−スレオニン及びＬ−フェニルアラニンである。その
他にも、グアニル酸、イノシン酸等の核酸類、ビタミン
類、抗生物質、成長因子、生理活性物質など、従来より
微生物により生産されてきたものであって、炭素源とし
てグルコース、及びマルトース等のオリゴ糖を含む培地
を用いて生産されるものであれば、特に制限されない。
また、現在微生物を利用して生産されていない物質であ
っても、その生合成において炭素源が必要とされるもの
であれば、本願発明が利用できることはいうまでもな
い。
本願発明において微生物によって生産される目的物質
は、例えばＬ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミ
ン酸、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、
Ｌ−フェニルアラニン等の種々のＬ−アミノ酸である。
Ｌ−アミノ酸として特に好ましいものは、Ｌ−リジン、
Ｌ−スレオニン及びＬ−フェニルアラニンである。その
他にも、グアニル酸、イノシン酸等の核酸類、ビタミン
類、抗生物質、成長因子、生理活性物質など、従来より
微生物により生産されてきたものであって、炭素源とし
てグルコース、及びマルトース等のオリゴ糖を含む培地
を用いて生産されるものであれば、特に制限されない。
また、現在微生物を利用して生産されていない物質であ
っても、その生合成において炭素源が必要とされるもの
であれば、本願発明が利用できることはいうまでもな
い。
【００１３】本願発明において利用される微生物は、グ
ルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質と、マルトースの
非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質との相互作用に
より、マルトース資化が調節される微生物である。具体
的には、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細
菌、クレブシエラ属細菌等の腸内細菌群に属する細菌、
コリネホルム細菌、バチルス属細菌、セラチア属細菌等
が挙げられる。好ましくは、遺伝子置換が可能な微生物
である。本発明に利用できる微生物であるか否かは、例
えば、微生物の野生株について、グルコースとマルトー
スを炭素源として含む培地における生育を追跡し、２段
階増殖いわゆるジオキシーが観察されるか否かによっ
て、判定することができる。ジオキシーが観察されれ
ば、グルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質と、マルト
ースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質との相互
作用により、マルトース資化が調節されると考えられ
る。
ルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質と、マルトースの
非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質との相互作用に
より、マルトース資化が調節される微生物である。具体
的には、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細
菌、クレブシエラ属細菌等の腸内細菌群に属する細菌、
コリネホルム細菌、バチルス属細菌、セラチア属細菌等
が挙げられる。好ましくは、遺伝子置換が可能な微生物
である。本発明に利用できる微生物であるか否かは、例
えば、微生物の野生株について、グルコースとマルトー
スを炭素源として含む培地における生育を追跡し、２段
階増殖いわゆるジオキシーが観察されるか否かによっ
て、判定することができる。ジオキシーが観察されれ
ば、グルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質と、マルト
ースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質との相互
作用により、マルトース資化が調節されると考えられ
る。
【００１４】本発明に用いることができる微生物として
具体的には、例えば目的物質がＬ−リジンの場合はエシ
ェリヒア・コリ AJ11442（NRRL B-12185, FERM BP-154
3)(米国特許第4,346,170号参照）、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム AJ3990（ATCC31269)(米国特許
第4,066,501号参照）等であり、Ｌ−スレオニンの場合
はエシェリヒア・コリ VKPM B-3996(RIA 1867)(米国特
許第5,175,107号参照）、コリネバクテリウム・アセト
アシドフィラム AJ12318（FERM BP-1172)(米国特許第5,
188,949号参照）等であり、Ｌ−フェニルアラニンの場
合は、エシェリヒア・コリ AJ 12604（FERM BP-3579)
(欧州特許出願公開第 488,424号参照）、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム AJ12637（FERM BP-4160)
(フランス特許出願公開第 2,686,898号参照）等であ
り、Ｌ−グルタミン酸の場合はエシェリヒア・コリ AJ1
2624 (FERM BP-3853)(フランス特許出願公開第2,680,17
8号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムAJ12475（FERM BP-2922)(米国特許第5,272,067号参
照）等であり、Ｌ−ロイシンの場合はエシェリヒア・コ
リ AJ11478（FERM P-5274)(特公昭 62-34397号参照）、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3718（F
ERM P-2516)(米国特許第3,970,519号参照）等であり、
Ｌ−イソロイシンの場合はエシェリヒア・コリKX141（V
KPM B-4781）(欧州特許出願公開第519,113号参照）、ブ
レビバクテリウム・フラバム AJ12149（FERM BP-759)
(米国特許第4,656,135号参照）等であり、Ｌ−バリンの
場合はエシェリヒア・コリ VL1970（VKPM B-4411)）(欧
州特許出願公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム AJ12341（FERM BP-1763)(米
国特許第5,188,948号参照）等である。
具体的には、例えば目的物質がＬ−リジンの場合はエシ
ェリヒア・コリ AJ11442（NRRL B-12185, FERM BP-154
3)(米国特許第4,346,170号参照）、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム AJ3990（ATCC31269)(米国特許
第4,066,501号参照）等であり、Ｌ−スレオニンの場合
はエシェリヒア・コリ VKPM B-3996(RIA 1867)(米国特
許第5,175,107号参照）、コリネバクテリウム・アセト
アシドフィラム AJ12318（FERM BP-1172)(米国特許第5,
188,949号参照）等であり、Ｌ−フェニルアラニンの場
合は、エシェリヒア・コリ AJ 12604（FERM BP-3579)
(欧州特許出願公開第 488,424号参照）、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム AJ12637（FERM BP-4160)
(フランス特許出願公開第 2,686,898号参照）等であ
り、Ｌ−グルタミン酸の場合はエシェリヒア・コリ AJ1
2624 (FERM BP-3853)(フランス特許出願公開第2,680,17
8号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムAJ12475（FERM BP-2922)(米国特許第5,272,067号参
照）等であり、Ｌ−ロイシンの場合はエシェリヒア・コ
リ AJ11478（FERM P-5274)(特公昭 62-34397号参照）、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3718（F
ERM P-2516)(米国特許第3,970,519号参照）等であり、
Ｌ−イソロイシンの場合はエシェリヒア・コリKX141（V
KPM B-4781）(欧州特許出願公開第519,113号参照）、ブ
レビバクテリウム・フラバム AJ12149（FERM BP-759)
(米国特許第4,656,135号参照）等であり、Ｌ−バリンの
場合はエシェリヒア・コリ VL1970（VKPM B-4411)）(欧
州特許出願公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム AJ12341（FERM BP-1763)(米
国特許第5,188,948号参照）等である。
【００１５】また、目的物質がＬ−リジン、Ｌ−スレオ
ニン又はＬ−フェニルアラニンの場合は、後述する実施
例に記載のE. coli W3100 (tyrA)に各々のアミノ酸の生
産に関与する遺伝子を組み込んだプラスミドpVIC40、pC
ABD2、又はpMGAL1を導入した株も、好適に使用すること
ができる。
ニン又はＬ−フェニルアラニンの場合は、後述する実施
例に記載のE. coli W3100 (tyrA)に各々のアミノ酸の生
産に関与する遺伝子を組み込んだプラスミドpVIC40、pC
ABD2、又はpMGAL1を導入した株も、好適に使用すること
ができる。
【００１６】さらに、本発明に用いる微生物は、目的物
質に応じて、当該目的物質の産生に関与するタンパク質
の活性が高められていてもよく、当該目的物質の分解等
に関与するタンパク質の活性が低下させられていてもよ
い。
質に応じて、当該目的物質の産生に関与するタンパク質
の活性が高められていてもよく、当該目的物質の分解等
に関与するタンパク質の活性が低下させられていてもよ
い。
【００１７】本発明に用いる微生物は、上記のような微
生物を親株とする変異株又は組換え株であって、IIＡ
Glcタンパク質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与
するタンパク質との相互作用が弱化または消失し、か
つ、グルコースとマルトースの取り込みが可能な微生物
である。すなわち、本発明においては、IIＡGlcタンパ
ク質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパ
ク質は、各々の相互作用は弱化又は消失しても、グルコ
ース及びマルトースの取り込みには実質的に影響がない
ような変異を有する。
生物を親株とする変異株又は組換え株であって、IIＡ
Glcタンパク質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与
するタンパク質との相互作用が弱化または消失し、か
つ、グルコースとマルトースの取り込みが可能な微生物
である。すなわち、本発明においては、IIＡGlcタンパ
ク質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパ
ク質は、各々の相互作用は弱化又は消失しても、グルコ
ース及びマルトースの取り込みには実質的に影響がない
ような変異を有する。
【００１８】IIＡGlcタンパク質は、エシェリヒア・コリ
ではcrr遺伝子によってコードされている。また、マル
トースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質として
は、エシェリヒア・コリではmalK遺伝子によってコード
されるMalKタンパク質が挙げられる。
ではcrr遺伝子によってコードされている。また、マル
トースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質として
は、エシェリヒア・コリではmalK遺伝子によってコード
されるMalKタンパク質が挙げられる。
【００１９】IIＡGlcタンパク質とマルトースの非ＰＴ
Ｓ取り込みに関与するタンパク質との相互作用が弱化ま
たは消失させるには、これらのタンパク質をコードする
遺伝子の一方又は両方に、これらのタンパク質の相互作
用が弱化または消失するような変異を導入すればよい。
Ｓ取り込みに関与するタンパク質との相互作用が弱化ま
たは消失させるには、これらのタンパク質をコードする
遺伝子の一方又は両方に、これらのタンパク質の相互作
用が弱化または消失するような変異を導入すればよい。
【００２０】上記のような変異を有するcrr遺伝子又はm
alK遺伝子は、例えばマルトースを炭素源とし、２−デ
オキシグルコース等のグルコースアナログを含有する培
地で生育できる変異株からcrr遺伝子又はmalK遺伝子を
単離することによって、取得することができる。このよ
うにして得られる変異型malK遺伝子としては、コードさ
れるMalKタンパク質の124位のAla残基がThr残基に置換
する変異を有する変異型malK遺伝子が知られている（De
an, D. A. et al. 1990, J. Biol. Chem., 265(34), 21
005-21010； Kuhnau, S. et al. 1991, J. Bacteriol.,
173(7), 2180-2186）。また、本発明者により取得され
た、327位のLeu残基がGln残基に置換する変異（L327Q型
変異）を有するMalKタンパク質をコードする変異型malK
遺伝子も、本発明に好適に用いることができる。さら
に、124位のAla残基がThr残基に置換する変異、及び327
位のLeu残基がGln残基に置換する変異の両方を有する変
異型MalKをコードするmalK遺伝子も、本発明に用いるこ
とができる。
alK遺伝子は、例えばマルトースを炭素源とし、２−デ
オキシグルコース等のグルコースアナログを含有する培
地で生育できる変異株からcrr遺伝子又はmalK遺伝子を
単離することによって、取得することができる。このよ
うにして得られる変異型malK遺伝子としては、コードさ
れるMalKタンパク質の124位のAla残基がThr残基に置換
する変異を有する変異型malK遺伝子が知られている（De
an, D. A. et al. 1990, J. Biol. Chem., 265(34), 21
005-21010； Kuhnau, S. et al. 1991, J. Bacteriol.,
173(7), 2180-2186）。また、本発明者により取得され
た、327位のLeu残基がGln残基に置換する変異（L327Q型
変異）を有するMalKタンパク質をコードする変異型malK
遺伝子も、本発明に好適に用いることができる。さら
に、124位のAla残基がThr残基に置換する変異、及び327
位のLeu残基がGln残基に置換する変異の両方を有する変
異型MalKをコードするmalK遺伝子も、本発明に用いるこ
とができる。
【００２１】一方、変異型crr遺伝子としては、コード
されるIIＡGlcタンパク質の47位のGly残基がSer残基に
置換する変異、もしくは76位のAla残基がThr残基に置換
する変異、又はこれらの両方が挙げられる。
されるIIＡGlcタンパク質の47位のGly残基がSer残基に
置換する変異、もしくは76位のAla残基がThr残基に置換
する変異、又はこれらの両方が挙げられる。
【００２２】上記変異の位置は、開始コドンに対応する
Met残基を１番目としたときのものである。尚、malK遺
伝子又はcrr遺伝子に本発明に係る変異以外の変異が存
在し、コードされるMalKタンパク質又はIIＡGlcタンパ
ク質にアミノ酸残基の欠失、置換、又は挿入が生じるこ
とがある。そのようなmalK遺伝子又はcrr遺伝子であっ
ても、MalKタンパク質とIIＡGlcタンパク質との相互作
用が弱化又は消失し、かつ、グルコース及びマルトース
の取り込みには実質的に影響がない限り、本発明に用い
ることができる。MalKタンパク質又はIIＡGlcタンパク
質にアミノ酸残基の欠失又は挿入がある場合には、上記
の変異の位置は変化する。例えば、MalKタンパク質の32
7位のLeu残基は、それよりもN末端側で一アミノ酸残基
の欠失があると326位になる。そのような場合であって
も、326位のLeu残基は、野生型タンパク質の327位のLeu
残基に相当する。したがって、本明細書においては、変
異の位置は野生型遺伝子又は野生型タンパク質における
位置に相当する位置を示すものとする。
Met残基を１番目としたときのものである。尚、malK遺
伝子又はcrr遺伝子に本発明に係る変異以外の変異が存
在し、コードされるMalKタンパク質又はIIＡGlcタンパ
ク質にアミノ酸残基の欠失、置換、又は挿入が生じるこ
とがある。そのようなmalK遺伝子又はcrr遺伝子であっ
ても、MalKタンパク質とIIＡGlcタンパク質との相互作
用が弱化又は消失し、かつ、グルコース及びマルトース
の取り込みには実質的に影響がない限り、本発明に用い
ることができる。MalKタンパク質又はIIＡGlcタンパク
質にアミノ酸残基の欠失又は挿入がある場合には、上記
の変異の位置は変化する。例えば、MalKタンパク質の32
7位のLeu残基は、それよりもN末端側で一アミノ酸残基
の欠失があると326位になる。そのような場合であって
も、326位のLeu残基は、野生型タンパク質の327位のLeu
残基に相当する。したがって、本明細書においては、変
異の位置は野生型遺伝子又は野生型タンパク質における
位置に相当する位置を示すものとする。
【００２３】malK遺伝子及び／又はcrr遺伝子に、上記
の変異を導入するには、部位特異的変異法等によって目
的の変異をmalK遺伝子及び／又はcrr遺伝子に導入して
変異型遺伝子を作製し、得られた変異型遺伝子を、相同
組換えを利用した遺伝子置換により、微生物の染色体上
のmalK遺伝子及び／又はcrr遺伝子と置換する方法が挙
げられる。
の変異を導入するには、部位特異的変異法等によって目
的の変異をmalK遺伝子及び／又はcrr遺伝子に導入して
変異型遺伝子を作製し、得られた変異型遺伝子を、相同
組換えを利用した遺伝子置換により、微生物の染色体上
のmalK遺伝子及び／又はcrr遺伝子と置換する方法が挙
げられる。
【００２４】遺伝子置換は、例えば後述の温度感受性プ
ラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことがで
きる。エシェリヒア・コリの温度感受性プラスミドとし
ては、pMAN031（J.Bacteriol., 162, 1196(1985)）、及
びpMAN997（WO99/03988）等が挙げられる。これらのプ
ラスミドは、エシェリヒア・コリ中で少なくとも30℃で
は自律複製することができるが、37〜42℃では自律複製
できないまた、malK遺伝子及び／又はcrr遺伝子に目的
の変異を有する変異株は、微生物を紫外線照射またはN
−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）
もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異
剤によって処理し、２−デオキシグルコース等のグルコ
ースアナログを含有する培地で生育できる株を選択する
ことによっても、取得することができる。
ラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことがで
きる。エシェリヒア・コリの温度感受性プラスミドとし
ては、pMAN031（J.Bacteriol., 162, 1196(1985)）、及
びpMAN997（WO99/03988）等が挙げられる。これらのプ
ラスミドは、エシェリヒア・コリ中で少なくとも30℃で
は自律複製することができるが、37〜42℃では自律複製
できないまた、malK遺伝子及び／又はcrr遺伝子に目的
の変異を有する変異株は、微生物を紫外線照射またはN
−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）
もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異
剤によって処理し、２−デオキシグルコース等のグルコ
ースアナログを含有する培地で生育できる株を選択する
ことによっても、取得することができる。
【００２５】得られた候補株が目的の変異株であること
は、候補株からmalK遺伝子又はcrr遺伝子を単離し、変
異点付近の塩基配列を調べることによって、確認するこ
とができる。
は、候補株からmalK遺伝子又はcrr遺伝子を単離し、変
異点付近の塩基配列を調べることによって、確認するこ
とができる。
【００２６】本発明に係る微生物を培養するのに用いる
培地は、利用される微生物に応じて従来より用いられて
きた周知の培地を用いてかまわない。つまり、炭素源、
窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を
含有する通常の培地である。但し、炭素源として、グル
コース及びマルトース等のオリゴ糖を含有する培地を用
いることが好ましい。
培地は、利用される微生物に応じて従来より用いられて
きた周知の培地を用いてかまわない。つまり、炭素源、
窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を
含有する通常の培地である。但し、炭素源として、グル
コース及びマルトース等のオリゴ糖を含有する培地を用
いることが好ましい。
【００２７】グルコース及びマルトース以外の炭素源と
しては、ラクトース、ガラクトース、でんぷんの加水分
解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのア
ルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機
酸類等を用いることができる。
しては、ラクトース、ガラクトース、でんぷんの加水分
解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのア
ルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機
酸類等を用いることができる。
【００２８】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。
【００２９】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、
Ｌ−ホモセリン、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵
母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの
他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウ
ム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
Ｌ−ホモセリン、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵
母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの
他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウ
ム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００３０】培養は、利用される微生物に応じて従来よ
り用いられてきた周知の条件で行ってかまわない。例え
ば、好気的条件下で１６〜１２０時間培養を実施するの
がよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５
〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の
酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を
使用することができる。
り用いられてきた周知の条件で行ってかまわない。例え
ば、好気的条件下で１６〜１２０時間培養を実施するの
がよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５
〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の
酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を
使用することができる。
【００３１】培養終了後の培地液からの代謝産物の採取
は、本願発明において特別な方法が必要とされることは
ない。すなわち、本発明は従来より周知となっているイ
オン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を組み合わせるこ
とにより実施できる。
は、本願発明において特別な方法が必要とされることは
ない。すなわち、本発明は従来より周知となっているイ
オン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を組み合わせるこ
とにより実施できる。
【００３２】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。以下の実施例において、試薬は特に指定しな
い限り和光純薬、あるいはナカライテスク社製のものを
用いた。各実施例で用いる培地の組成は以下に示すとお
りである。
説明する。以下の実施例において、試薬は特に指定しな
い限り和光純薬、あるいはナカライテスク社製のものを
用いた。各実施例で用いる培地の組成は以下に示すとお
りである。
【００３３】〔Ｌ培地〕バクトトリプトン（ディフコ社
製）10g/L、酵母エキス（ディフコ社製）5g/L、NaCl 5g
/L。120℃、20分間の蒸気滅菌を行った。
製）10g/L、酵母エキス（ディフコ社製）5g/L、NaCl 5g
/L。120℃、20分間の蒸気滅菌を行った。
【００３４】〔Ｌ寒天培地〕Ｌ培地、バクトアガー（デ
ィフコ社製）15g/L。120℃、20分間の蒸気滅菌を行っ
た。
ィフコ社製）15g/L。120℃、20分間の蒸気滅菌を行っ
た。
【００３５】〔SOC培地〕バクトトリプトン（ディフコ
社製）20g/L、酵母エキス（ディフコ社製）5g/L、10mM
NaCl、2.5mM KCl、10mM MgSO4、10mM MgCl2、20mMグル
コース。マグネシウム溶液及びグルコースを除いて、蒸
気滅菌（120℃、20分間）した後、予め0.22μmのフィル
ターを通した2Mのマグネシム保存液（1M MgSO4、1M MgC
l2）並びに2Mグルコース溶液を加え、再び0.22μmのフ
ィルターを通した。
社製）20g/L、酵母エキス（ディフコ社製）5g/L、10mM
NaCl、2.5mM KCl、10mM MgSO4、10mM MgCl2、20mMグル
コース。マグネシウム溶液及びグルコースを除いて、蒸
気滅菌（120℃、20分間）した後、予め0.22μmのフィル
ターを通した2Mのマグネシム保存液（1M MgSO4、1M MgC
l2）並びに2Mグルコース溶液を加え、再び0.22μmのフ
ィルターを通した。
【００３６】〔M9最少培地〕Na2HPO4・12H2O 80g/L、KH2
PO4 15g/L、NaCl 2.5g/L、NH4Cl 5g/L、MgSO4・7H2O246.
48mg/L、糖（グルコースもしくはマルトース又はそれら
を適当な割合で混ぜた混合物）5g/L, pH 7.0。MgSO4、
およびグルコースは、別に殺菌（120℃、20分間）して
加えた。また、必要に応じて適量のアミノ酸およびビタ
ミンを添加した。pHはNaOHで調整した。
PO4 15g/L、NaCl 2.5g/L、NH4Cl 5g/L、MgSO4・7H2O246.
48mg/L、糖（グルコースもしくはマルトース又はそれら
を適当な割合で混ぜた混合物）5g/L, pH 7.0。MgSO4、
およびグルコースは、別に殺菌（120℃、20分間）して
加えた。また、必要に応じて適量のアミノ酸およびビタ
ミンを添加した。pHはNaOHで調整した。
【００３７】〔M9最少寒天培地〕M9最少培地、バクトア
ガー（ディフコ社製）15g/L。
ガー（ディフコ社製）15g/L。
【００３８】〔アミノ酸生産培地〕(NH4)2SO4 20g/L、K
H2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 1g/L、FeSO4・7H2O 10mg/L、M
nSO4・5H2O 10mg/L、酵母エキス（ディフコ社製）2g/L、
糖（グルコースあるいはマルトースあるいはそれらを適
当な割合で混ぜた混合物）40g/L、Ｌ−チロシン 100mg
/L、CaCO3（日本薬局方）30g/L、ストレプトマイシン 5
0mg/L。糖、MgSO4・7H2O、CaCO3、ストレプトマイシンは
別殺菌した。それ以外のものを混合し、KOHにてｐHを7.
0に調整し、115℃、10分間オートクレーブした。CaCO 3
は180℃、2日間乾熱滅菌した。ストレプトマイシンは濾
過滅菌した。
H2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 1g/L、FeSO4・7H2O 10mg/L、M
nSO4・5H2O 10mg/L、酵母エキス（ディフコ社製）2g/L、
糖（グルコースあるいはマルトースあるいはそれらを適
当な割合で混ぜた混合物）40g/L、Ｌ−チロシン 100mg
/L、CaCO3（日本薬局方）30g/L、ストレプトマイシン 5
0mg/L。糖、MgSO4・7H2O、CaCO3、ストレプトマイシンは
別殺菌した。それ以外のものを混合し、KOHにてｐHを7.
0に調整し、115℃、10分間オートクレーブした。CaCO 3
は180℃、2日間乾熱滅菌した。ストレプトマイシンは濾
過滅菌した。
【００３９】
【実施例１】malK遺伝子への変異導入とマルトース資化
性向上確認 E. coli W3100のコロニーをＬ培地5mlに植菌し、一夜振
盪培養して得た細胞より、Wizard Genomic DNA Purific
ation kit（Promega社）を使用して、染色体DNAを調製
した。この染色体DNAを鋳型として、以下に示すプライ
マーを用いてPCR反応を実施した。
性向上確認 E. coli W3100のコロニーをＬ培地5mlに植菌し、一夜振
盪培養して得た細胞より、Wizard Genomic DNA Purific
ation kit（Promega社）を使用して、染色体DNAを調製
した。この染色体DNAを鋳型として、以下に示すプライ
マーを用いてPCR反応を実施した。
【００４０】 〔Primer-1〕 5’-GGCGGTAATGTGGAGATGCGCACATAAAATCGCC-3’（配列番号１） 〔Primer-2〕 5’-CCTGAGTCATTGCTTTTCTTTTTTCACATCACCTGTGAC-3’（配列番号２）
【００４１】PCR反応は、宝酒造（株）製のPyrobest DN
A polymeraseを用い、同酵素に添付のプロトコールに従
って行った。反応終了後、宝酒造（株）製のBKL kitを
用いて、増幅産物の平滑末端化とリン酸化を行った。得
られた増幅断片を、pSTV28（宝酒造（株））を制限酵素
SmaI（宝酒造（株））で処理後、脱リン酸化したもの
と、Ligation kit ver.2（宝酒造（株））を用いて連結
した。このライゲーション反応液を用いて、Hanahanら
の方法（Hanahan, D. 1983. Studies on transformatio
n of Escherichia coli with plamids, J. Mol. Biol.,
166, 557-580）により、E. coli JM109を形質転換し
た。50μg/mlのクロラムフェニコール（Cm）と0.2mMのI
PTG（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）と40μg
/mlのX-gal（5-Bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galacto
side）を含むＬ寒天培地上で、形質転換体を選択した。
常法に従い、形質転換体よりプラスミドを抽出し、挿入
断片の塩基配列を決定し、pSTV28のSmaI 部位にmalK遺
伝子が挿入されていることを確認した。このプラスミド
をpSTVmalKと命名した。
A polymeraseを用い、同酵素に添付のプロトコールに従
って行った。反応終了後、宝酒造（株）製のBKL kitを
用いて、増幅産物の平滑末端化とリン酸化を行った。得
られた増幅断片を、pSTV28（宝酒造（株））を制限酵素
SmaI（宝酒造（株））で処理後、脱リン酸化したもの
と、Ligation kit ver.2（宝酒造（株））を用いて連結
した。このライゲーション反応液を用いて、Hanahanら
の方法（Hanahan, D. 1983. Studies on transformatio
n of Escherichia coli with plamids, J. Mol. Biol.,
166, 557-580）により、E. coli JM109を形質転換し
た。50μg/mlのクロラムフェニコール（Cm）と0.2mMのI
PTG（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）と40μg
/mlのX-gal（5-Bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galacto
side）を含むＬ寒天培地上で、形質転換体を選択した。
常法に従い、形質転換体よりプラスミドを抽出し、挿入
断片の塩基配列を決定し、pSTV28のSmaI 部位にmalK遺
伝子が挿入されていることを確認した。このプラスミド
をpSTVmalKと命名した。
【００４２】pSTVmalK上のmalK遺伝子の塩基置換を、以
下のようにして実施した。370位の塩基であるGをAに置
換する（MalKタンパク質の124位のAla残基をThrに置換
する）塩基置換を導入することとした。なお、ここで表
記したDNA塩基配列における位置は、開始コドンのATGの
Aを１番目とし、アミノ酸残基の位置は上記開始コドン
に対応するMet残基を１番目としたときのものである。
下のようにして実施した。370位の塩基であるGをAに置
換する（MalKタンパク質の124位のAla残基をThrに置換
する）塩基置換を導入することとした。なお、ここで表
記したDNA塩基配列における位置は、開始コドンのATGの
Aを１番目とし、アミノ酸残基の位置は上記開始コドン
に対応するMet残基を１番目としたときのものである。
【００４３】まず、プラスミド上の塩基置換には、Quic
kChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGEN
E社）を使用した。malK変異を導入するのに用いたプラ
イマーの配列を以下に示す。
kChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGEN
E社）を使用した。malK変異を導入するのに用いたプラ
イマーの配列を以下に示す。
【００４４】 〔Primer-3〕 5’-CGGAAGTGCTACAACTGACGCATTTGCTGGATCGC-3’（配列番号３） 〔Primer-4〕 5’-GCGATCCAGCAAATGCGTCAGTTGTAGCACTTCCG-3’（配列番号４）
【００４５】変異導入は、前記キットに添付のプロトコ
ールに従い、当該部位の塩基配列を決定することで変異
導入を確認した。作製したプラスミドをpSTVmalK-A124T
と命名した。当該プラスミドを制限酵素EcoRIとHindIII
（いずれも宝酒造（株）製）で消化し、温度感受性複製
開始起点を有するプラスミドベクターpTS1の同じ制限酵
素部位に連結した。
ールに従い、当該部位の塩基配列を決定することで変異
導入を確認した。作製したプラスミドをpSTVmalK-A124T
と命名した。当該プラスミドを制限酵素EcoRIとHindIII
（いずれも宝酒造（株）製）で消化し、温度感受性複製
開始起点を有するプラスミドベクターpTS1の同じ制限酵
素部位に連結した。
【００４６】pTS1は、pMAN031（Matsuyama, S and Mizu
shima, S. 1985. Construction andcharacterization o
f a deletion mutant lacking micF, a proposed regul
atory gene for OmpF synthesis in Escherichia coli.
J. Bacteriol. 162(3), 1196-1202）とpBR322（宝酒造
（株）製）のそれぞれPstI-HindIII断片を繋ぎ換えたも
のである（図１）。作製したプラスミドをpTSmalK-A124
Tと命名した。
shima, S. 1985. Construction andcharacterization o
f a deletion mutant lacking micF, a proposed regul
atory gene for OmpF synthesis in Escherichia coli.
J. Bacteriol. 162(3), 1196-1202）とpBR322（宝酒造
（株）製）のそれぞれPstI-HindIII断片を繋ぎ換えたも
のである（図１）。作製したプラスミドをpTSmalK-A124
Tと命名した。
【００４７】上記プラスミドpTSmalK-A124Tの温度感受
性を利用し、一般的な相同性組換えの手法（Matsuyama,
S and Mizushima, S. 1985. J. Bacteriol. 162(3), 1
196-1202）により、E. coli W3100 (tyrA)（欧州特許公
開第488424号公報を参照）の染色体上のmalKと相同組換
えを実施した。
性を利用し、一般的な相同性組換えの手法（Matsuyama,
S and Mizushima, S. 1985. J. Bacteriol. 162(3), 1
196-1202）により、E. coli W3100 (tyrA)（欧州特許公
開第488424号公報を参照）の染色体上のmalKと相同組換
えを実施した。
【００４８】簡単に説明すると、pTSmalK-A124T を用い
て、Hanahanらの方法（J. Mol. Biol., 166, 557-580）
にてE. coli W3100 (tyrA)を形質転換した。30℃の培養
により出現したコロニーを、50μg/mlのアンピシリンを
含むＬ培地を5ml張り込んだ試験管に植菌し、30℃で一
夜振盪培養した。この培養液を103〜104倍に希釈し、そ
の希釈液0.1mlを50μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天
培地に塗布し、42℃で一夜培養した。出現したコロニー
をＬ培地を5ml張り込んだ試験管に植菌し、30℃で一夜
振盪培養した。この培養液0.1mlをＬ培地を5ml張り込ん
だ試験管に植菌し、37〜42℃で3〜4時間振盪培養した。
この培養液を103〜107倍に希釈し、その希釈液0.1mlを
Ｌ寒天培地に塗布し、37〜42℃で一夜培養した。出現し
たコロニーのアンピシリン感受性を確認した。
て、Hanahanらの方法（J. Mol. Biol., 166, 557-580）
にてE. coli W3100 (tyrA)を形質転換した。30℃の培養
により出現したコロニーを、50μg/mlのアンピシリンを
含むＬ培地を5ml張り込んだ試験管に植菌し、30℃で一
夜振盪培養した。この培養液を103〜104倍に希釈し、そ
の希釈液0.1mlを50μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天
培地に塗布し、42℃で一夜培養した。出現したコロニー
をＬ培地を5ml張り込んだ試験管に植菌し、30℃で一夜
振盪培養した。この培養液0.1mlをＬ培地を5ml張り込ん
だ試験管に植菌し、37〜42℃で3〜4時間振盪培養した。
この培養液を103〜107倍に希釈し、その希釈液0.1mlを
Ｌ寒天培地に塗布し、37〜42℃で一夜培養した。出現し
たコロニーのアンピシリン感受性を確認した。
【００４９】目的の遺伝子置換株の変異点の確認は以下
の通り行った。前記コロニーを鋳型として、Pyrobest D
NA polymeraseを用いてPCR反応を実施した。プライマー
はPrimer-1とPrimer-2を使用し、PCR反応は酵素に添付
のプロトコールに従った。反応終了後、反応液中の残存
プライマーを除去する目的でゲル濾過を行った。用いた
カラムは、MicroSpinTM S-400HR Columns（Amersham Ph
armacia Biotech 社製）であり、方法はカラムに添付の
プロトコールに従った。得られたPCR産物は、malK遺伝
子置換株の変異型malK遺伝子である。この遺伝子の変異
点を含む領域を中心に、塩基配列を決定した。こうして
目的どおりの変異がmalK遺伝子に導入されたことを確認
した変異株を、E. coli W3100 (tyrA)malK1と命名し
た。
の通り行った。前記コロニーを鋳型として、Pyrobest D
NA polymeraseを用いてPCR反応を実施した。プライマー
はPrimer-1とPrimer-2を使用し、PCR反応は酵素に添付
のプロトコールに従った。反応終了後、反応液中の残存
プライマーを除去する目的でゲル濾過を行った。用いた
カラムは、MicroSpinTM S-400HR Columns（Amersham Ph
armacia Biotech 社製）であり、方法はカラムに添付の
プロトコールに従った。得られたPCR産物は、malK遺伝
子置換株の変異型malK遺伝子である。この遺伝子の変異
点を含む領域を中心に、塩基配列を決定した。こうして
目的どおりの変異がmalK遺伝子に導入されたことを確認
した変異株を、E. coli W3100 (tyrA)malK1と命名し
た。
【００５０】E. coli W3100 (tyrA)malK1について、M9
培地にグルコースを0.05%とマルトースを0.45%添加した
培地における生育を、OD測定により追跡した（図２）。
対照には、E. coli W3100 (tyrA)を用いた。図２からわ
かるように、E. coli W3100(tyrA)では２段階増殖いわ
ゆるジオキシーが観察されるが、malK変異導入株E. col
i W3100 (tyrA)malK1では２段階増殖は認められなかっ
た。すなわち、malK変異導入により、インデュサーイク
スクルージョンが起こらず、グルコース資化と同時にマ
ルトースが資化されていることがわかった。
培地にグルコースを0.05%とマルトースを0.45%添加した
培地における生育を、OD測定により追跡した（図２）。
対照には、E. coli W3100 (tyrA)を用いた。図２からわ
かるように、E. coli W3100(tyrA)では２段階増殖いわ
ゆるジオキシーが観察されるが、malK変異導入株E. col
i W3100 (tyrA)malK1では２段階増殖は認められなかっ
た。すなわち、malK変異導入により、インデュサーイク
スクルージョンが起こらず、グルコース資化と同時にマ
ルトースが資化されていることがわかった。
【００５１】
【実施例２】crr遺伝子への変異導入とマルトース資化
性向上確認 MalKタンパク質とcrr遺伝子産物IIAGlcの相互作用を弱
化させる目的で、本実施例ではcrr遺伝子に変異を導入
することとした。
性向上確認 MalKタンパク質とcrr遺伝子産物IIAGlcの相互作用を弱
化させる目的で、本実施例ではcrr遺伝子に変異を導入
することとした。
【００５２】E. coli W3100のコロニーをＬ培地5mlに植
菌し、一夜振盪培養して得た細胞より、Wizard Genomic
DNA Purification kit（Promega社）を使用して、染色
体DNAを調製した。この染色体DNAを鋳型として、以下に
示すプライマーを用いてPCR反応を実施した。
菌し、一夜振盪培養して得た細胞より、Wizard Genomic
DNA Purification kit（Promega社）を使用して、染色
体DNAを調製した。この染色体DNAを鋳型として、以下に
示すプライマーを用いてPCR反応を実施した。
【００５３】 〔Primer-5〕 5’-GATTTCTTTAGTATCGGCACCAATGATTTAACGC-3’（配列番号５） 〔Primer-6〕 5’-AAATTGCCGCGATCTAGACAGTGCCATTGC -3’（配列番号６）
【００５４】PCR反応は、宝酒造（株）製のPyrobest DN
A polymeraseを用い、同酵素に添付のプロトコールに従
って行った。反応終了後、反応液を用いて宝酒造（株）
製のBKL kitを用いて平滑末端化とリン酸化を行った。
得られた増幅断片を、pMW219（ニッポンジーン製）を制
限酵素SmaI（宝酒造（株））で処理後、脱リン酸化した
ものと、Ligation kit ver.2（宝酒造（株））を用い
て連結した。このライゲーション反応液を用いて、Hana
hanらの方法によりE. coli JM109を形質転換した。25μ
g/mlのカナマイシン（Km）と0.2mMのIPTG（Isopropyl-
β-D-thiogalactopyranoside）と40μg/mlのX-gal（5-B
romo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactoside）を含むＬ
寒天培地上で形質転換体を選択した。常法に従い、形質
転換体よりプラスミドを抽出し、挿入断片の塩基配列を
決定し、pMW219のSmaI部位にcrr遺伝子が挿入されてい
ることを確認した。このプラスミドをpMWcrrと命名し
た。
A polymeraseを用い、同酵素に添付のプロトコールに従
って行った。反応終了後、反応液を用いて宝酒造（株）
製のBKL kitを用いて平滑末端化とリン酸化を行った。
得られた増幅断片を、pMW219（ニッポンジーン製）を制
限酵素SmaI（宝酒造（株））で処理後、脱リン酸化した
ものと、Ligation kit ver.2（宝酒造（株））を用い
て連結した。このライゲーション反応液を用いて、Hana
hanらの方法によりE. coli JM109を形質転換した。25μ
g/mlのカナマイシン（Km）と0.2mMのIPTG（Isopropyl-
β-D-thiogalactopyranoside）と40μg/mlのX-gal（5-B
romo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactoside）を含むＬ
寒天培地上で形質転換体を選択した。常法に従い、形質
転換体よりプラスミドを抽出し、挿入断片の塩基配列を
決定し、pMW219のSmaI部位にcrr遺伝子が挿入されてい
ることを確認した。このプラスミドをpMWcrrと命名し
た。
【００５５】pMWcrr上のcrr遺伝子の塩基置換を以下の
ように実施した。226位のGをAに置換する（76位のAla残
基をThrに置換する）塩基置換を導入することとした（Z
eng,G. A. et al., 1992. Mutational analysis of the
enzyme IIIGlc of the phosphoenolpyruvate phosphot
ransferease system in Escherichia coli. Res. Micro
biol., 143, 251-261）。なお、ここで表記したDNA塩基
配列における位置号は、開始コドンのATGのAを1番目と
し、アミノ酸残基の位置は上記開始コドンに対応するMe
t残基を１番目としたときのものである。
ように実施した。226位のGをAに置換する（76位のAla残
基をThrに置換する）塩基置換を導入することとした（Z
eng,G. A. et al., 1992. Mutational analysis of the
enzyme IIIGlc of the phosphoenolpyruvate phosphot
ransferease system in Escherichia coli. Res. Micro
biol., 143, 251-261）。なお、ここで表記したDNA塩基
配列における位置号は、開始コドンのATGのAを1番目と
し、アミノ酸残基の位置は上記開始コドンに対応するMe
t残基を１番目としたときのものである。
【００５６】まず、プラスミド上の塩基置換には、Quic
kChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGEN
E社）を使用した。crr変異を導入するのに用いたプライ
マーの配列を以下に示す。
kChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGEN
E社）を使用した。crr変異を導入するのに用いたプライ
マーの配列を以下に示す。
【００５７】 〔Primer-7〕 5’-GAAACCAACCACACATTCTCTATCGAATCTGATAGCGGCG -3’（配列番号７） 〔Primer-8〕 5’-CGCCGCTATCAGATTCGATAGAGAATGTGTGGTTGGTTTC -3’（配列番号８）
【００５８】変異導入は、前記キットに添付のプロトコ
ールに従い、当該部位の塩基配列決定することで変異導
入を確認した。作製したプラスミドをpMWcrr-A76Tと命
名した。当該プラスミドを制限酵素EcoRI とXbaI（いず
れも宝酒造（株）製）で消化し、温度感受性複製開始起
点を有するプラスミドベクターpMAN997（WO99/03988号
国際公開パンフレット参照）の同じ制限酵素部位に連結
した。
ールに従い、当該部位の塩基配列決定することで変異導
入を確認した。作製したプラスミドをpMWcrr-A76Tと命
名した。当該プラスミドを制限酵素EcoRI とXbaI（いず
れも宝酒造（株）製）で消化し、温度感受性複製開始起
点を有するプラスミドベクターpMAN997（WO99/03988号
国際公開パンフレット参照）の同じ制限酵素部位に連結
した。
【００５９】作製したプラスミドをpMANcrr-A76Tと命名
した。このプラスミドを用いて、malK変異株を取得した
のと同様の方法を用いて、E. coli W3100 (tyrA)染色体
上のcrr遺伝子と相同性組換えを行い、crr遺伝子に変異
の導入した株を取得した。
した。このプラスミドを用いて、malK変異株を取得した
のと同様の方法を用いて、E. coli W3100 (tyrA)染色体
上のcrr遺伝子と相同性組換えを行い、crr遺伝子に変異
の導入した株を取得した。
【００６０】目的の遺伝子置換株の変異点の確認は、ma
lK変異株取得のときと同様に行った。アンピシリン耐性
のコロニーを鋳型として、Ex Taq polymerase（宝酒造
（株）製）を用いてPCR反応を実施した。プライマー
は、Primer-5とPrimer-6を使用し、PCR反応は酵素に添
付のプロトコールに従った。反応終了後、反応液中の残
存プライマーを除去する目的でゲル濾過を行った。用い
たカラムはMicroSpinTMS-400HR Columns（Amersham Pha
rmacia Biotech 社製）であり、方法はカラムに添付の
プロトコールに従った。得られたPCR産物はcrr遺伝子置
換株の変異型crr遺伝子である。この遺伝子の変異点を
含む領域を中心に塩基配列を決定した。こうして目的ど
おりの変異が得られた変異株を、E. coli W3100 (tyrA)
crr3と命名した。
lK変異株取得のときと同様に行った。アンピシリン耐性
のコロニーを鋳型として、Ex Taq polymerase（宝酒造
（株）製）を用いてPCR反応を実施した。プライマー
は、Primer-5とPrimer-6を使用し、PCR反応は酵素に添
付のプロトコールに従った。反応終了後、反応液中の残
存プライマーを除去する目的でゲル濾過を行った。用い
たカラムはMicroSpinTMS-400HR Columns（Amersham Pha
rmacia Biotech 社製）であり、方法はカラムに添付の
プロトコールに従った。得られたPCR産物はcrr遺伝子置
換株の変異型crr遺伝子である。この遺伝子の変異点を
含む領域を中心に塩基配列を決定した。こうして目的ど
おりの変異が得られた変異株を、E. coli W3100 (tyrA)
crr3と命名した。
【００６１】E. coli W3100 (tyrA)crr3について、M9培
地にグルコースを0.05%とマルトースを0.45%添加した培
地における生育を、OD測定により追跡した（図３）。対
照にはE. coli W3100 (tyrA)を用いた。図３からわかる
ように、E. coli W3100 (tyrA)では２段階増殖いわゆる
ジオキシーが観察されるが、crr変異導入株E. coliW310
0 (tyrA)crr3では２段階増殖は認められなかった。すな
わち、crr変異導入により、インデュサーイクスクルー
ジョンが起こらず、グルコース資化と同時にマルトース
が資化されていることがわかった。また、139位のGをA
に（47位のGly残基をSerに置換する）する塩基置換を導
入しても、同様の現象が観察された。
地にグルコースを0.05%とマルトースを0.45%添加した培
地における生育を、OD測定により追跡した（図３）。対
照にはE. coli W3100 (tyrA)を用いた。図３からわかる
ように、E. coli W3100 (tyrA)では２段階増殖いわゆる
ジオキシーが観察されるが、crr変異導入株E. coliW310
0 (tyrA)crr3では２段階増殖は認められなかった。すな
わち、crr変異導入により、インデュサーイクスクルー
ジョンが起こらず、グルコース資化と同時にマルトース
が資化されていることがわかった。また、139位のGをA
に（47位のGly残基をSerに置換する）する塩基置換を導
入しても、同様の現象が観察された。
【００６２】
【実施例３】グルコースアナログ耐性株の取得、同耐性
株の変異点の同定、及び当該変異のE. coli W3100 (tyr
A)への導入 E. coli W3100 (tyrA)のコロニーを5mlのL培地を含む試
験管に植菌し、一夜振盪培養した。培養菌体を生理食塩
水5mlで２回洗浄し同量の生理食塩水に懸濁した。この
懸濁液を、マルトースを炭素源とするM9寒天培地に懸濁
液0.1mlを塗布し、表面を乾燥させた。プレート上に一
白金耳分の２−デオキシグルコースを静置させ、2〜3日
間37℃にて培養した。 E. coli W3100 (tyrA)はマルト
ースを炭素源とすることができるが、グルコースアナロ
グ例えば、２−デオキシグルコースが存在すると、抑制
がかかり生育できなくなる。この場合、グルコースアナ
ログを静置した地点を中心に生育阻止円が形成される。
2〜3日間培養を行うと、その阻止円の中に、ある頻度で
生育可能なコロニーが出現する。こうして、グルコース
アナログ耐性株を取得した。
株の変異点の同定、及び当該変異のE. coli W3100 (tyr
A)への導入 E. coli W3100 (tyrA)のコロニーを5mlのL培地を含む試
験管に植菌し、一夜振盪培養した。培養菌体を生理食塩
水5mlで２回洗浄し同量の生理食塩水に懸濁した。この
懸濁液を、マルトースを炭素源とするM9寒天培地に懸濁
液0.1mlを塗布し、表面を乾燥させた。プレート上に一
白金耳分の２−デオキシグルコースを静置させ、2〜3日
間37℃にて培養した。 E. coli W3100 (tyrA)はマルト
ースを炭素源とすることができるが、グルコースアナロ
グ例えば、２−デオキシグルコースが存在すると、抑制
がかかり生育できなくなる。この場合、グルコースアナ
ログを静置した地点を中心に生育阻止円が形成される。
2〜3日間培養を行うと、その阻止円の中に、ある頻度で
生育可能なコロニーが出現する。こうして、グルコース
アナログ耐性株を取得した。
【００６３】グルコースアナログ耐性株のうち、malK#1
とmalK#2のmalK遺伝子上の変異を調べた。変異点の確認
は以下の通り行った。当該菌株のコロニー形成させ、そ
のコロニーを鋳型として、Pyrobest DNA polymeraseを
用いてPCR反応を実施した。PCR反応は、プライマーはPr
imer-1とPrimer-2を使用し、酵素に添付のプロトコール
に従って行った。反応終了後、反応液中の残存プライマ
ーを除去する目的でゲル濾過を行った。用いたカラム
は、MicroSpinTM S-400HR Columns（Amersham Pharmaci
a Biotech 社製）であり、方法はカラムに添付のプロト
コールに従った。得られたPCR産物は、各々、グルコー
ス耐性株malK#1とmalK#2のmalK遺伝子であり、これらの
遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、両株ともに98
0位のTがAに置換しており、これに伴い327位のLeu残基
がGlnに置換していることがわかった。これは、これま
でには知られていない変異である。この変異をL327Q型
変異と命名した。
とmalK#2のmalK遺伝子上の変異を調べた。変異点の確認
は以下の通り行った。当該菌株のコロニー形成させ、そ
のコロニーを鋳型として、Pyrobest DNA polymeraseを
用いてPCR反応を実施した。PCR反応は、プライマーはPr
imer-1とPrimer-2を使用し、酵素に添付のプロトコール
に従って行った。反応終了後、反応液中の残存プライマ
ーを除去する目的でゲル濾過を行った。用いたカラム
は、MicroSpinTM S-400HR Columns（Amersham Pharmaci
a Biotech 社製）であり、方法はカラムに添付のプロト
コールに従った。得られたPCR産物は、各々、グルコー
ス耐性株malK#1とmalK#2のmalK遺伝子であり、これらの
遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、両株ともに98
0位のTがAに置換しており、これに伴い327位のLeu残基
がGlnに置換していることがわかった。これは、これま
でには知られていない変異である。この変異をL327Q型
変異と命名した。
【００６４】L327Q型変異を、E. coli W3100 (tyrA)へ
上述の方法で導入した。取得した変異導入株を、E. col
i W3100 (tyrA)malK327と命名した。同様に、E. coli W
3100(tyrA)malK327について、M9培地にグルコースを0.0
5%とマルトースを0.45%添加した培地における生育を、O
D測定により追跡した（図４）。対照にはE. coli W3100
(tyrA)を用いた。図４からわかるように、E. coli W31
00 (tyrA)では２段階増殖いわゆるジオキシーが観察さ
れるが、malK変異導入株E. coli W3100 (tyrA)malK327
では２段階増殖は認められなかった。すなわち、新規ma
lK変異導入により、インデュサーイクスクルージョンが
起こらず、グルコース資化と同時にマルトースが資化さ
れていることがわかった。
上述の方法で導入した。取得した変異導入株を、E. col
i W3100 (tyrA)malK327と命名した。同様に、E. coli W
3100(tyrA)malK327について、M9培地にグルコースを0.0
5%とマルトースを0.45%添加した培地における生育を、O
D測定により追跡した（図４）。対照にはE. coli W3100
(tyrA)を用いた。図４からわかるように、E. coli W31
00 (tyrA)では２段階増殖いわゆるジオキシーが観察さ
れるが、malK変異導入株E. coli W3100 (tyrA)malK327
では２段階増殖は認められなかった。すなわち、新規ma
lK変異導入により、インデュサーイクスクルージョンが
起こらず、グルコース資化と同時にマルトースが資化さ
れていることがわかった。
【００６５】
【実施例４】malK変異株のＬ−アミノ酸生産性の評価 E. coli W3100 (tyrA)malK327に、pVIC40（WO90/0463
6）、pCABD2（WO95/16042）、およびpMGAL1（特開平5-3
44881）を導入し、各々Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、
およびＬ−フェニルアラニンの生産能を調べた。
6）、pCABD2（WO95/16042）、およびpMGAL1（特開平5-3
44881）を導入し、各々Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、
およびＬ−フェニルアラニンの生産能を調べた。
【００６６】pVIC40は、スレオニンオペロンを含むプラ
スミドであり、同プラスミドを保持するE. coli VKPM B
-3996株（USSR Antibiotics Research Institute (VNII
A)に、登録番号 RIA1867 のもとに寄託されている）か
ら調製することができる（WO90/04636）。
スミドであり、同プラスミドを保持するE. coli VKPM B
-3996株（USSR Antibiotics Research Institute (VNII
A)に、登録番号 RIA1867 のもとに寄託されている）か
ら調製することができる（WO90/04636）。
【００６７】pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバッ
ク阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由
来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードす
るDNA(dapA*24) と、L-リジンによるフィードバック阻
害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来の
アスパルトキナーゼIIIをコードするDNA(lysC*80)と、
エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダク
ターゼをコードするDNA(dapB)と、及びブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デ
ヒドロゲナーゼをコードするDNA(ddh)を有している（WO
95/16042）。
ク阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由
来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードす
るDNA(dapA*24) と、L-リジンによるフィードバック阻
害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来の
アスパルトキナーゼIIIをコードするDNA(lysC*80)と、
エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダク
ターゼをコードするDNA(dapB)と、及びブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デ
ヒドロゲナーゼをコードするDNA(ddh)を有している（WO
95/16042）。
【００６８】pMGAL1は、フィードバック阻害が解除され
たエシェリヒア属由来の３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘ
プツロン酸−７−リン酸シンターゼをコードする遺伝
子、及びフィードバック阻害が解除されたエシェリヒア
属由来のコリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラ
ターゼを有している（特開平5-344881号）。
たエシェリヒア属由来の３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘ
プツロン酸−７−リン酸シンターゼをコードする遺伝
子、及びフィードバック阻害が解除されたエシェリヒア
属由来のコリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラ
ターゼを有している（特開平5-344881号）。
【００６９】各々のプラスミドを用いて、Hanahanらの
方法によりE. coli W3100 (tyrA)malK327を形質転換し
た。得られた各形質転換体を、50μg/mlのストレプトマ
イシンを含むＬ培地5mlに植菌し、37℃にて一夜振盪培養
した後、培養液50μlを50μg/mlのストレプトマイシン
を含むＬ寒天培地に塗布し、37℃にて一夜培養した。グ
ルコースとマルトースの混合物を炭素源としたアミノ酸
生産培地（グルコース36g/L、マルトース5.8g/L）を500
ml容の坂口フラスコに20ml張り込み、先の寒天培地に生
育した菌体を1/8プレート分かきとり植菌した。培養終
了後、各アミノ酸濃度と、残存するグルコースおよびマ
ルトースを定量した。対照としてはE. coli W3100 (tyr
A)に各プラスミドを導入した形質転換体を用いた。結果
を表１に示す。
方法によりE. coli W3100 (tyrA)malK327を形質転換し
た。得られた各形質転換体を、50μg/mlのストレプトマ
イシンを含むＬ培地5mlに植菌し、37℃にて一夜振盪培養
した後、培養液50μlを50μg/mlのストレプトマイシン
を含むＬ寒天培地に塗布し、37℃にて一夜培養した。グ
ルコースとマルトースの混合物を炭素源としたアミノ酸
生産培地（グルコース36g/L、マルトース5.8g/L）を500
ml容の坂口フラスコに20ml張り込み、先の寒天培地に生
育した菌体を1/8プレート分かきとり植菌した。培養終
了後、各アミノ酸濃度と、残存するグルコースおよびマ
ルトースを定量した。対照としてはE. coli W3100 (tyr
A)に各プラスミドを導入した形質転換体を用いた。結果
を表１に示す。
【００７０】
【表１】
【００７１】E. coli W3100 (tyrA)を宿主とした場合
は、グルコースを消費した時点でまだマルトースを資化
していないのに対して、E. coli W3100 (tyrA)malK327
を宿主とした場合には、同様の培養時間でマルトースを
資化しており、マルトースの消費がグルコース抑制を受
けていないことがわかった。
は、グルコースを消費した時点でまだマルトースを資化
していないのに対して、E. coli W3100 (tyrA)malK327
を宿主とした場合には、同様の培養時間でマルトースを
資化しており、マルトースの消費がグルコース抑制を受
けていないことがわかった。
【００７２】また、pVIC40、pCABD2、およびpMGAL1を保
持するE. coli W3100 (tyrA)malK327株は、それぞれの
プラスミドを保持するE. coli W3100 (tyrA)に比べて、
Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン及びＬ−フェニルアラニン
生産能が向上していた。
持するE. coli W3100 (tyrA)malK327株は、それぞれの
プラスミドを保持するE. coli W3100 (tyrA)に比べて、
Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン及びＬ−フェニルアラニン
生産能が向上していた。
【００７３】
【発明の効果】本発明により、発酵法により微生物を利
用して物質を製造するに際して、デンプン分解液等のグ
ルコース及びオリゴ糖を含む炭素源を用いたときに、前
記微生物のオリゴ糖、特にマルトースに対する資化性を
向上させることができる。
用して物質を製造するに際して、デンプン分解液等のグ
ルコース及びオリゴ糖を含む炭素源を用いたときに、前
記微生物のオリゴ糖、特にマルトースに対する資化性を
向上させることができる。
【００７４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.） <120> 発酵法による目的物質の製造法 <130> P-8452 <140> <141> 2001-05-02 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0
【００７５】 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 1 ggcggtaatg tggagatgcg cacataaaat cgcc 34
【００７６】 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 2 cctgagtcat tgcttttctt ttttcacatc acctgtgac 39
【００７７】 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 cggaagtgct acaactgacg catttgctgg atcgc 35
【００７８】 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 gcgatccagc aaatgcgtca gttgtagcac ttccg 35
【００７９】 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 gatttcttta gtatcggcac caatgattta acgc 34
【００８０】 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 aaattgccgc gatctagaca gtgccattgc 30
【００８１】 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 7 gaaaccaacc acacattctc tatcgaatct gatagcggcg 40
【００８２】 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 8 cgccgctatc agattcgata gagaatgtgt ggttggtttc 40
【図１】 温度感受性複製開始起点を有するプラスミド
ベクターpTS1の構造を示す図。
ベクターpTS1の構造を示す図。
【図２】 グルコース及びマルトースを含む培地におけ
るE. coli W3100 (tyrA)malK1の生育を示す図。
るE. coli W3100 (tyrA)malK1の生育を示す図。
【図３】 グルコース及びマルトースを含む培地におけ
るE. coli W3100 (tyrA)crr3の生育を示す図。
るE. coli W3100 (tyrA)crr3の生育を示す図。
【図４】 グルコース及びマルトースを含む培地におけ
るE. coli W3100 (tyrA)malK327の生育を示す図。
るE. coli W3100 (tyrA)malK327の生育を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 伊藤 久生 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA71 BA72 BA73 CA04 DA06 EA04 GA11 GA25 HA01 HA12 4B064 AE10 AE25 AE29 CA02 CA19 CC24 CD09
Claims (8)
- 【請求項１】 微生物を培地中に培養し、該培地中に目
的物質を生成蓄積させ、該培養物から目的物質を採取す
る、微生物を利用した目的物質の製造法において、 前記微生物は、グルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質
と、マルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用により、マルトース資化が調節される微
生物の変異株又は組換え株であって、IIＡGlcタンパク
質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用が弱化または消失し、かつ、グルコース
とマルトースの取り込みが可能な微生物であることを特
徴とする方法。 - 【請求項２】 マルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与す
るタンパク質がＡＴＰ分解活性を有するマルトースキャ
リアプロテインである請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記タンパク質がＭａｌＫタンパク質で
ある請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 前記微生物が保持するＭａｌＫタンパク
質が、１２４位のＡｌａ残基がＴｈｒ残基に置換する変
異、及び３２７位のＬｅｕ残基がＧｌｎ残基に置換する
変異から選ばれる変異を有することにより、IIＡGlcタ
ンパク質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタ
ンパク質との相互作用が弱化または消失したことを特徴
とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項５】 前記微生物が保持するIIＡGlcタンパク
質が、４７位のＧｌｙ残基がＳｅｒ残基に置換する変
異、及び７６位のＡｌａ残基がＴｈｒ残基に置換する変
異から選ばれる変異を有することにより、IIＡGlcタン
パク質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタン
パク質との相互作用が弱化または消失したことを特徴と
する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】 前記目的物質がＬ−アミノ酸である請求
項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】 前記目的物質がＬ−リジン、Ｌ−スレオ
ニン、Ｌ−フェニルアラニンから選ばれる請求項６記載
の方法。 - 【請求項８】 前記微生物がエシェリヒア属細菌である
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
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|---|---|---|---|
| JP2001135517A JP2002330763A (ja) | 2001-05-02 | 2001-05-02 | 発酵法による目的物質の製造法 |
| DE60208459T DE60208459T3 (de) | 2001-05-02 | 2002-04-11 | Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure mittels Fermentation |
| EP02008316A EP1254957B2 (en) | 2001-05-02 | 2002-04-11 | Method for producing an L-amino acid substance by fermentation |
| US10/121,693 US7097999B2 (en) | 2001-05-02 | 2002-04-15 | Method for producing target substance using microorganisms with reduced interactions between MalK and IIAGlc |
| BR0201520-0A BR0201520A (pt) | 2001-05-02 | 2002-04-30 | Método para produzir uma subst ncia de marcação utilizando um microorganismo |
| BRPI0201520-0A BRPI0201520B1 (pt) | 2001-05-02 | 2002-04-30 | Method for producing a l-amino acid using a microorganism |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| DE (1) | DE60208459T3 (ja) |
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- 2002-04-30 BR BR0201520-0A patent/BR0201520A/pt active IP Right Grant
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