BRPI0201520B1 - Method for producing a l-amino acid using a microorganism - Google Patents

Abstract

"método para produzir uma substância de marcação utilizando um microorganismo". em um método para produzir uma substância de marcação utilizando um microorganismo que compreende cultivar o microorganismo em um meio para produzir e acumular a substância de marcação no meio . e coletar a substância de marcação da cultura, usa-se, como o microorganismo, uma cepa mutante ou cepa recombinante de um microorganismo em que assimilação de maltose é controlada por uma interação entre proteína lia^ glc^ de glucose pts e uma proteína envolvida na absorção não-pts de maltose, e a interação entre proteína iia^ glc^ e a proteína envolvida na absorção não-pts de maltose é reduzida ou eliminada na cepa mutante ou cepa recombinante.

Description

"MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AM1NOÁCIDO UTILIZANDO UM MICRORGANISMO" Antecedentes da Invenção Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um método para produzir uma substância de marcação usando um microrganismo, mais precisamente, meios para melhorar a produtividade de uma substância que é um produto de marcação final em um método para produzir uma substância de marcação como L-aminoácidos, antibióticos, vitaminas, fatores de crescimento e substâncias bioativas usando um microrganismo.

Descrição da Arte Relacionada Como métodos típicos para produzir substâncias usando microrganismos, existem métodos conhecidos para produzir L-aminoácidos por fermentação. L-aminoácidos são usados não somente como temperos e gêneros alimentícios, mas também como componentes de várias misturas nutricionais para fins medicinais. Além disso, eles são usados como aditivos para ração, reagentes na indústria de fabricação de drogas e indústria química e fatores de crescimento para produção de L-aminoãcidos como L-lisina e L-homoserina pelo uso de um microrganismo. Como microrganismos que podem produzir L-aminoácidos por fermentação, existem bactérias corineformes conhecidas, bactérias Escherickia, bactérias Baciüus, bactérias Serralia e assim por diante.

Com relação a esta produção de substâncias de marcação por fermentação como descrito acima, pode-se afirmar que a maior parte dos materiais usados como matérias-primas são os que contêm sacarídeos como os terceiros melaços escuros. Também, na fermentação de aminoácidos ou fermentação de ácido nucleico, a cultura é realizada usando um sacarídeo como uma matéria-prima. Apesar da cana-de-açúcar, e semelhantes, conter amido abundantemente, é raro usar a mesma como ela se apresenta como matéria-prima, sendo usada, porém, na maioria dos casos, como um produto em decomposição em que o amido é decomposto, por exemplo, monossacarídeos ou dissacarídeos. Com relação ao processo de decomposição, uma solução de uma enzima sacarificante como amilase é geralmente usada e, assim, amido, que é um polissacarídeo, é decomposto em sacarídeos moleculares de teor relativamente baixo, como glucose, maltose e maltotriose.

Em fermentação usando enterobactérias gram-negativas como Escherichia coli (E. coli), o uso de uma solução de decomposição de amido causa um problema. Por exemplo, E. coli consome glucose que existe como um componente principal, mas sofre da denominada repressão de glucose, o que significa que oligossacarídeos contendo dois ou mais monossacarídeos como maltose são consumidos somente após os monossacarídeos terem sido completamente consumidos. Consequentemente, se a fermentação for concluída quando somente glucose, que é o componente principal da solução de decomposição de amido, é consumida, os oligossacarídeos como maltose não são assimilados, mas permanecem sem utilidade. Além disso, se se pretende consumir os oligossacarídeos após o consumo de glucose, o tempo de cultura pode ser prolongado, e, consequentemente, os custos e envolvidos e outros não serão aproveitados eficazmente.

Sabe-se que E. coli e Salmonella typhimurium sofrem geralmente de repressão de glucose. Isto é, quando se pretende assimilar glucose junto com outras fontes de carbono como lactose, maltose e glicerol, glucose é assimilada primeiro e as outras fontes de carbono são assimiladas depois. Monod et al. descobriram que, quando lactose e glucose eram usadas como fontes de carbono, observava-se proliferação em duas fases, denominada diauxia (Monod, J., Growth, 11, 223-247, 1947). Através de pesquisas em biologia molecular, o mecanismo da mesma se tomou evidente. Isto é, IIAGlc (enzima II glucose PST), que atua como um doador de fosfato para glucose na cascata de fosfato no momento da assimilação no sistema glucose-fosfoenolpiruvato-açúcar fosfotransferase, isto é, o assim denominado sistema PTS, existe em um estado desfosforilado. O IIAGlc desfosforilado causa a denominada exclusão indutora, em que o IIAGlc desfosforilado inibe a absorção dos outros sacarídeos (Postma P.W., Lengeler J.W. e Jacobson G.R.: em Escherichia coli e Salmonella: Cellular and Molecular Biology (ed. Neidhart F.C.), pp. 1149- 1174, 1996, ASM Press, Washington D.C.). A absorção de maltose em E. coli sofre da repressão de glucose e isto é causado pela interação entre o IIAGlc desfosforilado e a proteína MalK que constitui o sistema de absorção para maltose não-PTS. Isto é, quando a bactéria está absorvendo glucose, IIAGlc existe excessivamente na célula e liga-se à proteína MalK para inibir a absorção de maltose. Além disso, uma cepa mutante mostrando absorção melhorada de maltose na presença de análogo de glucose também foi obtida, e sabe-se que esta cepa mutante tem uma mutação no gene malK codificando a proteína MalK (Dean D.A. et al., Regulation of the Maltose Transport System of Escherichia coli by the Glucose-specific Enzyme III of the Phosphoenolpyruvate-Sugar Phosphotransferase System., J. Biol. Chem., 265 (34), 21005-21010, 1990; Kuhnau, S. et al., The Activities of the Scherichia coli MalK Protein in Maltose Transport and Regulation, and Inducer Exclusion Can Be Separated by Mutations, J. Bacteriol., 173 (7), 2180- 2186, 1991).

Além disso, também para IIAGlc, descreveu-se uma cepa mutante que continha uma proteína mutante mostrando ligação reduzida com lactose permease (Zeng, G.A. et al., Mutation analysis of the enzyme IIIGlc of the phosphoenolpyruvate phosphotransferase system in Escherichia coli, Res. Microbiol., 143, 251- 261, 1992). A lactose permease é uma enzima de absorção para lactose que é um dos sacarídeos não-PTS.

No entanto, não se sabe se as cepas mutantes acima mencionadas assimilam maltose simultaneamente na presença de glucose. Sumário da Invenção Um objeto da presente invenção é melhorar a capacidade de assimilação de um microrganismo por oligossacarídeos, em particular, maltose, na produção de uma substância, por fermentação, utilizando o microrganismo com uma fonte de carbono contendo glucose e oligossacarídeos como soluções de decomposição de amido.

Os inventores da presente invenção realizaram extensivos estudos a fim de obter o objeto acima mencionado. Como um resultado, verificaram que um microrganismo, em que uma interação entre proteína IIA0lc de glucose PTS e uma proteína envolvida na absorção não-PTS de maltose foi reduzida ou eliminada, pode assimilar maltose mesmo na presença de glucose, e realizaram a presente invenção.

Assim, a presente invenção provê o seguinte: (1) Um método para produzir uma substância de marcação utilizando uni microrganismo e compreendendo cultivar o microrganismo em um meio para produzir e acumular a substância de marcação no meio e coletar a substância de marcação da cultura, em que o microrganismo é uma cepa mutante ou recombinante de um microrganismo em que assimilação de maltose é controlada por uma interação entre proteína íiÂGk de glucose PTS e uma proteína envolvida na absorção não-PTS de maltose, e a interação entre proteína IIA(,k e uma proteína envolvida na absorção não-PTS de maltose da cepa mutante ou recombinante é reduzida ou eliminada, e a cepa pode absorver glucose e maltose. (2) O método de acordo com (1), em que a proteína envolvida na absorção não-PTS de maltose é uma proteína veículo de maltose tendo uma atividade de decomposição ATP. (3) O método de acordo com (2), em que a proteína é proteína MalK. (4) O método de acordo com qualquer um de {1 )-(3), em que a interação entre proteína ÍIAGIl de glucose PTS e a proteína envolvida na absorção não-PTS de mal tose é reduzida ou eliminada porque a proteína MalK contida no mícrorganismo tem uma mutação selecionada dentre uma mutação para substituir um resíduo de Thr pelo resíduo de Ala em uma posição de 124 e uma mutação para substituir um resíduo de Gin pelo resíduo de Leu em uma posição de 327. (5) O método de acordo com qualquer um de (l )-(4), em que a interação entre proteína IIAGlt de glucose PTS e a proteína envolvida na absorção não-PTS de inaltose é reduzida ou eliminada porque a proteína IIAg,c contida no mícrorganismo tem uma mutação selecionada dentre uma mutação para substituir um resíduo de Ser pelo resíduo de Gly em uma posição de 47 e uma mutação substituindo um resíduo de Thr pelo resíduo de Ala em uma posição de 76. (6) O método de acordo com qualquer um de ¢1)-(5), em que a substância de marcação é um L-aminoácido. (7) O método de acordo com (6), em que a substância de marcação é selecionada dentre o grupo consistindo de L-Iisina, L-treonina e L-fenilalanina. (8) O método de acordo com qualquer um de (1)-(7), em que o mícrorganismo é uma bactéria Escherichia.

De acordo com a presente invenção, a capacidade de assimilação de um mícrorganismo por oligossacarídeo, em particular, maltosc, pode ser melhorada na produção de uma substância, por fermentação, usando o mícrorganismo com uma fonte de carbono contendo glucose e um oligossacarídeo como solução de decomposição de amido.

Breve Explicação dos Desenhos A figura 1 mostra a estrutura do vetor do plasmídeo pTSl tendo uma origem de replicação sensível à temperatura. A figura 2 mostra a cultura de E. coli W3100 (tyrA) mal Kl em um meio contendo glucose e mal to se. A figura 3 mostra a cultura de E. coli W3100 (tyrA) crr3 em um meio contendo glucose e maltose. A figura 4 mostra a cultura de E. coli W3100 (tyrA) malK327 em um meio comendo glucose e maltose.

Formas de Realização Preferidas da Invenção A seguir, a presente invenção será explicada em detalhe. A substância de marcação produzida pelo microrganismo de acordo com a presente invenção pode ser selecionada dentre vários L-aminoácidos incluindo, por exemplo, L-treonina, L-lisina, ácido L-glutâmico, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-fenilalanina e assim por diante. L-aminoácidos particularmente preferidos são L-lisina, L-treonina e L-fenilalanina. Além disso, a substância de marcação pode ser qualquer uma das substâncias que são produzidas convencionalmente por microrganismos usando um meio contendo glucose e um oligossacarídeo, como maltose, como fontes de carbono, e pode ser um ácido nucleico como ácido guanílico e ácido inosínico, vitamina, antibiótico, fator de crescimento, substância bioativa ou outros. A presente invenção pode, de fato, ser usada para quaisquer outras substâncias, desde que as substâncias requeiram uma fome de carbono na biossíntese das mesmas, mesmo não sendo correntemente produzidas por uso de um microrganismo. O microrganismo usado na presente invenção é um microrganismo em que a assimilação de maltose é controlada por uma interação entre a proteína IIAtUc de glucose PTS e uma proteína envolvida na absorção não-PTS de maltose. Especificamente, podem ser mencionadas bactérias pertencendo ao grupo de entero bactérias como bactérias Escheríchia, bactérias Enterohacter e bactérias Kiehsiefia, bactérias coríneformes, bactérias Bacillus, bactérias Serratia e assim por diante. Ele é, preferivelmente, um microrganismo que permite substituição de gene. Se um microrganismo pode ser usado ou não na presente invenção, pode ser determinado, por exemplo, observando o crescimento de uma cepa selvagem do microrganismo em um meio contendo glucose e maltose como fontes de carbono e confirmando se a proliferação em duas fases, isto é, a denominada diauxia, é observada ou não. Se se observar diauxia, considera-se que a assimilação de maltose deve ser controlada por uma interação da proteína IIAGlc de glucose PTS e uma proteína envolvida na absorção não-PTS de maltose.

Exemplos específicos de microrganismos que podem ser usados para a presente invenção incluem, por exemplo, Escherichia coli AJ11442 (NRRL B-12185 e FERM BP-1543, referir-se à patente US n2 4.346.170), Brevibacterium lactofermentum AJ3990 (ATCC31269, referir-se à patente US n2 4.066.501) etc. para L-lisina como a substância de marcação, Escherichia coli VKPM B-3996 (RIA1867, referir-se à patente US n2 5.175.107), Corynebacterium acetoacidophilum AJ12318 (FERM BP-1172, referir-se à patente US no 5.188.949) etc. para L-treonina, Escherichia coli AJ12604 (FERM BP-3579, referir-se à publicação de patente europeia n2 488.424), Brevibacterium lactofermentum AJ12637 (FERM BP-4160, referir-se à publicação de patente francesa n2 2.686.898) etc. para L-fenilalanina, Escherichia coli AJ12624 (FERM BP-3853, referir-se à publicação de patente francesa n2 2.680.178), Brevibacterium lactofermentum AJ12475 (FERMBP-2922, referir-se à patente US n2 5.272.067) etc. para ácido L-glutâmico, Escherichia coli AJ11478 (FERM P-5274, referir-se à publicação de patente japonesa (Kokoku) n2 62-34397), Brevibacterium lactofermentum AJ3718 (FERM P-2516, referir-se à patente US n2 3.970.519) etc. para L-leucina, Escherichia coli KX141 (VKPM B-4781, referir-se à publicação de patente europeia n2 519.113), Brevibacterium flavum AJ12149 (FERM BP- 759, referir-se à patente US no 4.656.135) etc. para L-isoleucina, Escherichia coli VL1970 (VKPM B-4411, referir-se à publicação de patente europeia n2 519.113), Brevibacterium lactofermentum AL12341 (FERM BP-1763, referir-se à patente US n2 5.188.948) etc. para L-valina e assim por diante.

Além disso, quando a substância de marcação é L-lisina, L-treonina ou L-fenilalanina, cepas obtidas introduzindo um plasmídeo pVIC40, pCABD2 ou pMGALl, que são incorporadas com um gene envolvido na produção de cada um dos aminoácidos, em E. coli W3100 (tyrA) também podem ser usadas de modo apropriado, e são descritas nos exemplos abaixo mencionados.

Além disso, no microrganismo usado para a presente invenção, a atividade de uma proteína envolvida na produção da substância de marcação pode ser melhorada, ou a atividade de uma proteína envolvida na decomposição, ou semelhante, da substância de marcação pode ser reduzida, dependendo da substância de marcação. O microrganismo usado para a presente invenção é uma cepa mutante ou cepa recombinante obtida deste microrganismo como descrito acima como uma cepa parental, em que a interação entre a proteína HAGlc de glucose PTS e uma proteína envolvida na absorção não-PTS de maltose é reduzida ou eliminada, mas é um microrganismo que pode absorver glucose e maltose. Isto é, na presente invenção, a proteína IIAGlc e a proteína envolvida na absorção não-PTS de maltose contêm uma mutação que não afeta substancialmente a absorção de glucose e maltose, mesmo reduzindo ou eliminando a interação entre as mesmas.

Em Escherichia coli, a proteína IIAGlc é codificada pelo gene crr. Além disso, como uma proteína envolvida na absorção não-PTS de maltose, a proteína MalK pode ser mencionada, sendo codificada pelo gene malK em Escherichia coli. A fim de reduzir ou eliminar a interação da proteína IIAGlc e a proteína envolvida na absorção não-PTS de maltose, uma mutação que reduz ou elimina a interação entre estas proteínas pode ser introduzida em um ou ambos os genes codificando estas proteínas.

Um gene crr ou gene malK que tem uma mutação como mencionada acima pode ser obtido, por exemplo, isolando o gene crr ou gene malK de uma cepa mutante que pode ser cultivada em um meio contendo maltose como uma fonte de carbono e um análogo de glucose como 2-deoxiglucose. Como um gene malK do tipo mutante, que pode ser obtido como descrito acima, conhece-se um gene malK do tipo mutante tendo uma mutação para substituir um resíduo de Thr pelo 124- resíduo de Ala da proteína MalK codificada (Dean, D.A. et al., J. Biol. Chem., 265 (34), 21005-21010, 1990; Kuhnau, S. et al., J. bacteríol., 173 (7), 2180-2186, 1991). Além disso, um gene malK do tipo mutante codificando a proteína MalK e tendo uma mutação para substituir um resíduo de Gin pelo 327- resíduo de Leu (mutação do tipo L327Q), que foi obtida pelos inventores da presente invenção, também pode ser usado apropriadamente para a presente invenção. Além disso, um gene malK do tipo mutante codificando uma proteína MalK do tipo mutante tendo tanto uma mutação para substituir um resíduo de Thr pelo 1242 resíduo de Ala como uma mutação para substituir um resíduo de Gin pelo 3272 resíduo de Leu também podem ser usados para a presente invenção.

Por outro lado, um exemplo do gene crr do tipo mutante é um gene crr contendo uma mutação para substituir um resíduo de Ser pelo 472 resíduo de Gly da proteína IIAGlc codificada, uma mutação para substituir um resíduo de Thr pelo 762 resíduo de Ala, ou ambas as mutações.

As posições das mutações acima mencionadas são numeradas do resíduo de Met correspondente ao códon de iniciação, que é tomado como o primeiro códon. Além disso, o gene malK ou gene crr pode conter uma ou mais mutações diferentes das mutações de acordo com a presente invenção, e, assim, deleção, substituição ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácidos pode ocorrer na proteína MalK codificada ou proteína IIAGlc. Ainda um gene malK ou gene crr pode ser usado para a presente invenção, desde que a interação entre a proteína MalK e proteína IIAGlc seja reduzida ou eliminada, e a absorção de glucose e maltose não seja substancialmente afetada. Quando a proteína MalK ou proteína IIAGlc contém deleção ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácidos, as posições das mutações acima mencionadas podem mudar. Por exemplo, se a proteína MalK incluir deleção de um resíduo de aminoácido no lado N-terminal do 3272 resíduo de Leu, o 3272 resíduo de Leu deve se tomar o 3262 resíduo. Mesmo neste caso, o 3262 resíduo de Leu corresponde ao 3272 resíduo de Leu de uma proteína do tipo selvagem. Consequentemente, no presente relatório, as posições de mutações devem representar posições correspondentes às posições em um gene do tipo selvagem ou proteína do tipo selvagem.

Como o método para introduzir as mutações acima mencionadas no gene malK e/ou gene crr, pode ser mencionado um método para introduzir uma mutação de marcação no gene malK e/ ou gene crr pela mutagênese específica do sítio ou semelhante para produzir um gene do tipo mutante e substituir o gene do tipo mutante obtido pelo gene malK e/ ou gene crr em um cromossoma de microrganismo através de substituição do gene utilizando recombinação homóloga.

Esta substituição de gene pode ser realizada, por exemplo, do mesmo modo como a substituição de gene usando plasmídeo sensível à temperatura descrita abaixo. Exemplos de plasmídeo sensível à temperatura de Escherichia coli incluem pMAN031 (J. Bacteriol., 162, 1196, 1985), pMAN997 (WO99/03988) e assim por diante. Estes plasmídeos podem replicar autonomamente em Escherichia coli pelo menos a 30°C, mas não podem replicar autonomamente a 37- 42°C.

Além disso, uma cepa mutante tendo uma mutação de marcação no gene malK e/ ou gene crr também pode ser obtida tratando um microrganismo por irradiação UV ou com um agente mutagenizante usado para tratamento com mutagênese comum, como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou ácido nitroso e selecionando uma cepa que pode ser cultivada em um meio contendo um análogo de glucose como 2-deoxiglucose.

Se uma cepa candidata obtida é uma cepa mutante de marcação ou não, isto pode ser confirmado isolando o gene malK ou gene crr da cepa candidata e investigando sua sequência de nucleotídeo próxima ao ponto de mutação.

Como o meio usado para cultura do microrganismo da presente invenção, meios bem conhecidos usados convencionalmente podem ser usados dependendo do tipo do microrganismo a ser usado. Isto é, meios comuns contendo uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio, íons inorgânicos e outros componentes orgânicos, como requeridos, podem ser usados. No entanto, prefere-se usar um meio contendo glucose e um oligossacarídeo como maltose como fontes de carbono.

Como a fonte de carbono diferente de glucose e maltose, açúcares como lactose, galactose e hidrolisado de amido, álcoois como glicerol e sorbitol, ácidos orgânicos como ácido fumárico, ácido cítrico e ácido succínico, e semelhantes, podem ser usados.

Como a fonte de nitrogênio, sais de amônio inorgânicos como sulfato de amônio, cloreto de amônio e fosfato de amônio, nitrogênio orgânico como hidrolisado de soja, gás de amônia, amônia aquosa, e semelhantes, podem ser usados.

Como fonte de nutrientes traços orgânicos, quantidades apropriadas de substâncias requeridas como vitamina Bi, L-homoserína e L-tirosina, extrato de levedura, e semelhantes, estão preferivelmente contidas. Além destes, quantidades pequenas de fosfato de potássio, sulfato de magnésio, íons de ferro, íons de manganês, e semelhantes, são adicionados como requerido. A cultura pode ser realizada em condições bem conhecidas que são convencionalmente usadas dependendo do microrganismo a ser usado. Por exemplo, a cultura é realizada, preferivelmente, em uma condição aeróbica durante 16-120 h. A temperatura da cultura é controlada para ser 25-45°C e o pH é controlado para ser 5-8 durante a cultura. Substâncias alcalinas ou ácidas orgânicas ou inorgânicas bem como gás amônia, e semelhantes, podem ser usadas para ajustamento de pH.

Para coletar um produto metabólito de um meio após o término da cultura, nenhum método especial é requerido para a presente invenção. Isto é, a coleta da substância de marcação pode ser obtida por uma combinação de métodos bem conhecidos como os que usam uma resina de troca iônica, precipitação e outros.

Melhor Modo para Realizar a Invenção A seguir, a presente invenção será explicada mais espeeifieamence com referência aos seguintes exemplos. Os reagentes usados nos seguintes exemplos foram adquiridos de Wako Fure Chemicals ou Nakarai Tesque salvo indicado em contrário. As composições dos meios usados em cada exemplo são mostradas abaixo.

[Meio L] Bacto triptona peptona (DIFCO) 10 g/1 Extrato de levedura (DIFCO) 5 g/1 NaCI 5 g/1 Estes foram autoclavados a 120°C durante 20 min.

[Meio agar L] Meio L

Bacto agar (DIFCO) 15 g/1 Estes foram esterilizados com vapor a 120°C durante 20 min.

[Meio SOC] Bacto triptona peptona (DIFCO) 20 g/1 Extrato de levedura (DIFCO) 5 g/1 NaCl 10 mM

KC1 2,5 mM

MgSÜ4 10 mM

MgCl2 10 mM

Glucose 20 mM

Os componentes, exceto para solução de magnésio e glucose, foram autoclavados (120°C, 20 min), depois adicionados com solução de carga de magnésio 2 M (MgS04 1 M, MgCl2 1 M) e solução de glucose 2 M, cujas soluções foram preliminarmente passadas através de um filtro de 0,22 μ m e passadas através de um filtro de 0,22 μηι novamente.

[Meio mínimo M9] Na2HP04.12H20 80 g/1 KH2P04 15 g/1 NaCl 2,5 g/1 NH4C1 5 g/1 MgS04.7H20 246,48 mg/1 Sacarídeo (glucose ou maltose ou mistura destes em uma relação apropriada) 5 g/1 pH 7,0 MgSC>4 e glucose foram esterilizados separadamente (120°C, 20 min) e adicionados. Uma quantidade apropriada de aminoácidos e vitaminas foi adicionada como requerido. O pH foi ajustado com NaOH. [Meio agar mínimo M9] Meio mínimo M9 Bacto agar (DIFCO) 15 g/1 [Meio de produção de aminoácidos] (NH4)2S04 20 g/1 kh2po4 1 g/1 MgS04 ·7Η20 1 g/1 FeS04*7H20 10mg/l MnS04 ·4Η20 10 mg/1 Extrata de levedura (DÍFCO) 2 g/1 Sacarídeo (glucose ou maltose ou mistura destes em uma relação apropriada) 40 g/1 L-tirosina 100 mg/1 CaCOj (farmacopeia japonesa) 30 g/1 Estreptomicina 50 mg/1 O sacarídeo, MgS04,*7H20 e estreptomicina foram esterilizados separadamente. Os outros componentes foram misturados, ajustados em pH 7,0 com KOH e autoclavados a 115°C durante 10 min, CaCOi foi submetido a esterilização a seco a 180°C durante 2 dias. Estreptomicina foi esterilizada por filtragem.

Exemplo 1; Introdução de mutação no gene malK e confirmação de melhora na propriedade de assimilação de maltose Uma colônia de E. coli W3100 foi inoculada em 5 ml de meio L e cultivada durante a noite com agitação. Das células obtidas, DNA cromossômico foi preparado usando kit de purificação de DNA genômico Wizard (Promega). PCR foi realizado usando o DNA cromossômico acima como um gabarito e os iniciadores mostrados abaixo.

[Iniciador 1] 5 ’-GGCGGTA ATGTGGAGATGCGCACATA A A ATCGCC“31 (SEQ ID NO: 1 [Iniciador 2] 5 * - C CTG AGTC ATT GCTTTTCTTTTTTC AC AT C ACTGTG A.C -3 * (SEQ ID NO: 2) PCR foi realizado usando polimerase de DNA Pyrobest produzida por Takara Shuzo e de acordo com o protocolo fixado à enzima. Após o término da reação, o produto de amplificação foi terminado de modo obtuso e fosforilado usando kit BKL produzido por Takara Shuzo. O fragmento amplificado foi ligado usando kit Ligation ver. 2 (Takara Shuzo) em pSTV28 (Takara Shuzo) tratado com uma enzima de restrição Sma I (Takara Shuzo) e então desfosforilado. Esta mistura de reação de ligação foi transformada em E. coli JM109 de acordo com o método de Hanahan et al. (Hanahan D., Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids, J. Mol. Biol., 166, 557- 580, 1983]. Seleção dos transformantes foi realizada em meio agar L contendo 50 μg/ ml de cloranfenicol (Cm), IPTG 0,2 mM (isopropil-l-tio- β-D- galactopiranosídeo) e 40 μg/ml de X- gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil- β-D- galactopiranosídeo). Um plasmídeo foi extraído dos transformantes de um modo convencional, e a sequência de nucleotídeos do fragmento inserido foi determinada para confirmar que o gene malK foi inserido no sítio Sma I de pSTV28. Este plasmídeo foi designado como pSTVmalK.

Substituição de nucleotídeos do gene malK em pSTVmalK foi realizada como a seguir. Decidiu-se introduzir substituição de A por G como o nucleotídeo na posição 370â (substituição de Thr pelo 124- resíduo de Ala na proteína MalK). As posições nas sequências de nucleotídeos de DNA usadas aqui são numeradas de A do códon de iniciação, ATG, que foi tomado como o primeiro nucleotídeo, e as posições de resíduos de aminoácidos são numeradas do resíduo de Met correspondendo ao códon de iniciação acima, que foi tomado como o primeiro resíduo de aminoácidos.

Primeiramente, a substituição do nucleotídeo no plasmídeo foi realizada usando o kit de mutagênese direcionada ao sítio QuickChange™ (STRATAGENE). As sequências e os iniciadores para introduzir a mutação malK são mostradas abaixo.

[Iniciador 3] 5 ’ -CGGAAGTGCTACAACTGACGCATTGCTGGATCGC-3 ’ (SEQ ID NO: 3) 5 ’ -GCGATCC AGC AAATGCGTC AGTTGTAGCACTTCCG-3 ’ (SEQ ID NO: 4) A introdução da mutação foi confirmada determinando a sequência de nucleotídeos do sítio de interesse de acordo com o protocolo fixado ao kit. O plasmídeo produzido foi designado pSTVmalK- A124T. O plasmídeo foi digerido com enzimas de restrição EcoR I e Hind III (todas produzidas por Takara Shuzo) e ligado aos mesmos sítios de restrição de um vetor de plasmídeo pTSl tendo uma origem de replicação sensível à temperatura. pSTl foi obtido mudando fragmentos Pst I- Hind III de pMAN031 (Matsuyama, S. e Mizushima S., Construction and characterization of a deletion mutation lacking micF, a proposed regulatory gene for OmpF synthesis in Escherichia coli, J. bacteriol., 162 (3), 1196-1202, 1985) e pBR322 (produzido por Takara Shuzo) (figura 1). O plasmídeo produzido foi designado como pTSmalK- A124T.

Recombinação homóloga do gene malK com malK no cromossoma de E. coli W3100 (tyrA) (ver publicação de patente europeia n-488.424), de acordo com um procedimento usual para recombinação homóloga (Matsuyama, S. e Mizushima, S., J. Bacteriol., 162 (3), 1196-1202, 1965) utilizando a sensibilidade à temperatura do plasmídeo pTSmalK-A124T acima mencionado.

Brevemente, E. coli W3100 (tyrA) foi transformado pelo método de Hanahan et al. (J. Mol. Biol., 166, 557- 580) usando pTSmalK-A124T. Uma colônia que apareceu após a cultura a 30°C foi inoculada em 5 ml de meio L contendo 50 μg/ml de ampicilina em um tubo de teste e cultivada a 30°C durante a noite com agitação. Este caldo de cultura foi diluído 103 a 104 vezes, e 0,1 ml da diluição foi aplicado a um meio agar L contendo 50 pg/ml de ampicilina e cultivado durante a noite a 42°C. Uma colônia que apareceu foi inoculada em 5 ml de meio L contido em um tubo de teste e cultivada durante a noite a 30°C com agitação. Este caldo de cultura em um volume de 0,1 ml foi inoculado em 5 ml de meio L contido em um tubo de teste e cultivado a 37- 42°C durante 3-4 h com agitação. Este caldo de cultura foi diluído 103 a 107 vezes, e 0,1 ml da diluição foi aplicado ao meio agar L e cultivado durante a noite a 37- 42°C. A sensibilidade à ampicilina de uma colônia que apareceu foi confirmada. O ponto de mutação da cepa substituída pelo gene de marcação foi confirmado como a seguir. PCR foi realizado usando a colônia acima mencionada como um gabarito e polimerase de DNA Pyrobest. Iniciador 1 e iniciador 2 foram usados como os iniciadores, e PCR foi realizado de acordo com o protocolo fixado à enzima. Após o término da reação, a mistura de reação foi submetida à filtragem com gel com o fim de remover iniciadores residuais na mistura de reação. A coluna usada foi coluna S-400HR MicroSpin™ (produzida por Amersham Pharmacia Biotech) e o procedimento foi de acordo com o protocolo fixado à coluna. O produto PCR obtido foi um gene malK do tipo mutante da cepa substituída pelo gene malK. A sequência de nucleotídeos deste gene foi determinada principalmente para a região contendo o ponto de mutação. A cepa mutante confirmada ser introduzida com a mutação desejada no gene malK como desejado foi designada como E. coli W3100 (tyrA) malKl.

Cultura de E. coli W3100 (tyrA) malKl em um meio consistindo de meio M9 adicionado com 0,05% de glucose e 0,45% de maltose foi monitorada pela medição OD (figura 2). E. coli W100 (tyrA) foi usado como um controle. Como visto dos resultados mostrados na figura 2, apesar da proliferação em duas fases, isto é, a denominada diauxia, ser observada para E. coli W3100 (tyrA), esta proliferação em duas fases não foi observada para a cepa introduzida na mutação malK, E. coli W100 (tyrA) malKl. Isto é, verificou-se que, devido à introdução da mutação malK, a exclusão indutora não foi causada e mal tose foi assimilada simultaneamente com a assimilação de glucose.

Exemplo 2: Introdução de mutação no gene crr e confirmação de melhora na propriedade de assimilação de mal to se Neste exemplo, decidiu-se introduzir uma mutação no gene crr a fim de reduzir a interação entre a proteína MalK e o produto do gene crr, IIA0|C.

Uma colônia de E. coli W3100 foi inoculada em 5 ml de meio L e cultivada durante a noite com agitação. Das células obtidas, DNA cromossômico foi preparado usando kit de purificação de DNA genômico Wizard (Promega). PCR foi realizado usando o DNA cromossômico acima como um gabarito e os iniciadores mostrados abaixo, llniciador 5 ] 5 ’-GATTTCTTTAGTATCGGCACCAATGATTTAACGC-3’ (SEQ ID NO. 5) [Iniciador 6J 5 ’ - A A ATTGCCGCG ATCT AG AC AGTG C C ATTGC-3 ’ (SEQ ID NO. 6) PCR foi realizado usando polimerase de DNA Pyrobest produzida por Takara Shuzo e de acordo com o protocolo fixado à enzima. Após o término da reação, o produto de amplificação na mistura de reação foi blunt-ended e fosforilado usando kit BKL produzido por Takara Shuzo. O fragmento amplificado obtido foi ligado usando kit Ligation ver, 2 (Takara Shuzo) em pMW219 (Nippon Gene) que foi tratado com uma enzima de restrição Smal (Takara Shuzo) e então des fosforilado. E. coli JM109 foi transformado com esta mistura de reação de ligação de acordo com o método de Hanahan et al. A seleção dos transformantes foi realizada em meio agar L contendo 25 pg/ ml de cana miei na (Km), IPTG (isopropil-1 -tio- β-D- galactopiranosídeo) 0,2 MM e 40 pg/ ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil- β-D- galactopiranosídeo). Um plasmídeo foi extraído dos transformantes de um modo convencional, e a sequência de nucleotídeos do fragmento inserido foi determinada para confirmar que o gene crr foi inserido no sítio Sma I de pMW219. Este plasmídeo foi designado como pMWcrr. A substituição de nucleotídeos do gene crr em pMWcrr foi realizada como a seguir. Decidiu-se introduzir a substituição de nucleotídeo de A pelo de G na 226â posição (substituição de Thr pelo 76- resíduo de Ala, Zeng, G.A. et al., Mutational analysis of the enzyme IIIGlc of the phosphoenolpyruvato phosphotransferease system in Escherichia coli., Res. Microbiol., 143, 251- 261, 1992). As posições nas sequências de nucleotídeos de DNA usadas aqui são numeradas de A do códon de iniciação, ATG, que foi tomado como o primeiro nucleotídeo, e as posições de resíduos de aminoácidos são numeradas do resíduo de Met correspondendo ao códon de iniciação acima, que foi tomado como o primeiro resíduo de aminoácido.

Primeiramente, a substituição do nucleotídeo no plasmídeo foi realizada usando o kit de mutagênese direcionada ao sítio QuickChange™ (STRATAGENE). As sequências dos iniciadores usados para introduzir a mutação crr são mostradas abaixo.

[Iniciador 7] 5 ’ -GAAACCAACCACACATTCTCTATCGAATCTGATAGCGGCG-3 ’ (SEQID NO. 7) [Iniciador 8] 5 ’ -CGCCGCTATCAGATTCGATAGAGAATGTGTGGTTGGTTTC-3 ’ (SEQ ID NO. 8) A introdução da mutação foi confirmada determinando a sequência de nucleotídeos do sítio de interesse de acordo com o protocolo fixado ao kit acima mencionado. O plasmídeo produzido foi designado como pMWcrr-A76T. O plasmídeo foi digerido com enzimas de restrição EcoR I e Xba I (ambos produzidos por Takara Shuzo) e ligados entre os mesmos sítios de enzimas de restrição do vetor de plasmídeo pMAN997 (referir-se à publicação de patente internacional W099/ 03988) tendo uma origem de replicação sensível à temperatura. O plasmídeo produzido foi designado como pMANcrr- A76T. Recombinação homóloga foi realizada pelo gene crr no cromossoma de E. coli W3100 (tyrA), usando este plasmídeo, pelo mesmo processo como o usado para obter a cepa mutante malK, e, assim, uma cepa introduzida com a mutação no gene crr foi obtida. O ponto de mutação da cepa substituída pelo gene de marcação foi confirmada do mesmo modo como o caso de obter a cepa mutante malK. PCR foi realizada usando uma colônia resistente a ampicilina como um gabarito e polimerase Ex Taq (produzida por Takara Shuzo). Iniciador 5 e iniciador 6 foram usados como os iniciadores e PCR foi realizada de acordo com o protocolo fixado à enzima. Após o término da reação, a mistura de reação foi submetida à filtragem com gel com o fim de remover iniciadores residuais na mistura de reação. A coluna usada foi coluna S-400HR MicroSpin™ (produzida por Amersham Pharmacia Biotech), e o procedimento foi de acordo com o protocolo fixado à coluna. O produto PCR obtido foi um gene crr do tipo mutante da cepa substituída pelo gene crr. A sequência de nucleotídeos deste gene foi determinada principalmente para a região contendo o ponto de mutação. A cepa mutante que foi confirmada ser introduzida com a mutação desejada como descrito acima foi designada como E. coli W3100 (tyrA) crr3. A cultura de E. coli W3100 (tyrA) crr3 em um meio consistindo de meio M9 adicionado com 0,05% de glucose e 0,45% de maltose foi monitorada pela medição OD (figura 3). E. coli W3100 (tyrA) foi usado como um controle. Como visto dos resultados mostrados na figura 3, apesar da proliferação em duas fases, isto é, a denominada diauxia, ser observada para E. eoli W3100 (tyrA), esta proliferação em duas fases não foi observada para a cepa introduzida na mutação crr, E. coli W3100 (tyrA) crr3. Isto é, verificou-se que, devido à introdução de mutação crr, a exclusão indutora não foi obtida e maitose foi assimilada simultaneamente com a assimilação de glucose. O mesmo caso foi observado quando a substituição de nucleotídeo de A pelo 139- G (substituição de Ser pelo 47- resíduo de Gly) foi introduzida.

Exemplo 3: Aquisição de cepa resistente a análogo de glucose, identificação do ponto de mutação da cepa resistente e introdução da mutação em E.coli W3100 (tvrA) Uma colônia de E. coli W3100 (tyrA) foi inoculada em 5 ml de meio L contido em um tubo de teste e cultivada durante a noite com agitação. As células cultivadas foram lavadas duas vezes com 5 ml de solução salina fisiológica e colocadas em suspensão no mesmo volume de solução salina fisiológica. Esta suspensão foi aplicada em uma quantidade de 0,1 ml a meio agar M9 contendo maitose como uma fonte de carbono e a superfície foi secada. Um laço de platina de 2- deoxiglucose foi colocado na placa, e as células foram cultivadas a 37°C durante dois ou três dias. E. coli W3100 (tyrA) pode utilizar maitose como uma fonte de carbono, mas se um análogo de glucose como 2- deoxiglucose existe, ele sofre da repressão e torna-se incapaz de ser cultivado. Neste caso, um círculo de inibição de cultura é formado próximo ao ponto onde o análogo de glucose é colocado como o centro. Se cultura é realizada durante dois ou três dias, colônias que podem ser cultivadas emergem em uma certa frequência no círculo de inibição. Cepas resistentes a análogo de glucose foram obtidas baseadas no fenômeno acima.

Mutações do gene malK de malK#1 e malK#2 foram investigadas dentre as cepas resistentes a análogo de glucose. Os pontos de mutação foram confirmados como a seguir. Uma colônia de cada cepa foi formada e PCR foi realizado usando a colônia como um gabarito e poli mera se de DNA Pyrobest. PCR foi realizado usando iniciador 1 e iniciador 2 como os iniciadores e de acordo com o protocolo fixado à enzima. Após o término da reação, a mistura de reação foi submetida a filtragem com gel com o fim de remover iniciadores residuais na mistura de reação. A coluna usada foi coluna S-40ÜHR MicroSpin™ (produzida por Amersham Pharmacia Biotech), e o procedimento foi de acordo com o protocolo fixado à coluna. Os produtos PCR obtidos foram genes malK das cepas resistentes a glucose malK#l e malK#2, e as sequências de nucleotídeos destes genes foram determinadas. Como um resultado, verificou-se que um substituto para o 98Q2 T em ambas as cepas, e em conexão com o mesmo, Oln foi substituído pelo 327a resíduo de Leu. Esta é uma mutação que não foi conhecida até agora. Esta mutação foi designada como mutação do tipo L327Q. A mutação do tipo L327Q foi introduzida em E. coli W3100 (tyrA) pelo método descrito acima. A cepa introduzida na mutação obtida foi designada como E. coli W310Ü (tyrA) malK327. De um modo similar, cultura de E. coli W31Q0 (tyrA) malK327 em um meio consistindo de meio M9 adicionado com 0,05% de glucose e 0,45% de maltose foi monitorada por medição OD (figura 4). E. coli W3100 (tyrA) foi usado como um controle. Como visto dos resultados acima na figura 4, apesar da proliferação em duas fases, isto é, a denominada diauxia. foi observada para E. coli W3100 (tyrA), esta proliferação em duas fases não foi observada para a cepa introduzida na mutação malK, E. coli W3100 (tyrA) malK327. Isto é, verificou-se que, devido à introdução da nova mutação malK, a exclusão induiora não foi obtida e maltose foi assimilada simultaneamente com a assimilação de glucose.

Exemplo 4; Avaliação da produtividade de L-aminoácidos de cenas mutantes malK pVIC40 (WO90/ 04636), pCABD2 (WQ95/ 16042) e pMGALl (publicação de patente JP acessível ao público (Kokai) n- 5-344881) foram, cada um, introduzidos em E. coli W3100 (tyrA) malK327, e capacidades para produzir L-lisina, L-treonina e L-fenilalanina foram investigadas para cada cepa. pVIC40 é um plasmídeo contendo o operon treonina e pode ser preparado da cepa VKPM B-3996 de E. coli (depositada em USSR Antibiotics Research Institute (VNIIA) com um número de registro de RIA1867) abrigando o plasmídeo (WO90/ 04636). pCABD2 contém DNA (dapA*24) codificando diidrodipicolinato sintase (DDPA) derivado de Escherichia coli e tendo uma mutação para eliminar a inibição de realimentação por L-lisina„ DNA (lysC*80) codificando aspartocinase III derivada de Escherichia coli e tendo uma mutação para eliminar a inibição de realimentação por L-lisina, DNA (dapB) codificando diidrodipicolinato reductase derivado de Escherichia coli, e DNA (ddh) codificando diaminopimelato desidrogenase derivado de Brevibacterium lactofermentum (W095/16042). pMGALl contém um gene codificando 3-deóxi-D-arabino-hepturonato-7- fosfato sintase derivado da bactéria Escherichium da qual a inibição de realimentação foi eliminada, e um gene codificando corismato mutase- prefenato desidratase derivada da bactéria Escherichium da qual a inibição de realimentação é eliminada (publicação de patente JP acessível ao público (Kokai) n- 5-344881). E. coli W3100 (tyrA) malK327 foi transformado com cada plasmídeo pelo método de Hanahan et al. Cada transformante obtido foi inoculado em 5 ml de meio L contendo 50 μg/ml de estreptomicina e cultivado a 37°C durante a noite com agitação. Então, o caldo de cultura foi aplicado em uma quantidade de 50 μΐ a meio agar L contendo 50 μg/ml de estreptomicina e cultivado durante a noite a 37°C. Um meio de produção de aminoácidos contendo uma mistura de glucose e maltose (36 g/1 de glucose, 5,8 g/l de maltose) como a fonte de carbono, em um volume de 20 ml, foi introduzido em um frasco Sakaguchi com volume de 500 ml, e 1/8 das células cultivadas no meio agar acima mencionado foi raspado e inoculado no meio. Após o término da cultura, concentração de cada aminoácido e maltose e glucose restantes foram quantificados. Como controles, transformantes obtidos introduzindo cada um dos plasmídeos em E. coii W3100 ftyrA) foram usados. Os resultados são mostrados na tabela 1. TABELA 1 Não testado, pRS: vetor (concentrações iniciais de glucose e maltose foram 36 g/l e 5,8 g/l, respectivamente, e tempo de cultura foi 14 h) Lys: lisitia; Thr: treoninu; Phe: fenilalanina Quando E. coli W3100 (tyrA) foi usado como o hospedeiro, maltose ainda não tinha sido assimilada quando glucose foi consumida. Por outro lado, quando E. coli W3100 (tyrA) malK327 foi usado como o hospedeiro, maltose foi assimilada cm um tempo dc cultura similar, c, assim, verificou-se que o consumo de maltose não sofreu da repressão de glucose. Além disso, as cepas W3100 (tyrA) malK327 de E, coli abrigando cada um de pVIC40, pCABD2 e pMGALl mostraram capacidades melhoradas de produção de L-lisina, L-treonina e L-fenilalanina comparadas com as cepas W3100 (tyrA) de E. coli abrigando cada um dos plasmídeos.

REIVINDICAÇÕES

Claims (4)

1. Método para produzir um L-amínoãcido utilizando um microrganismo, caracterizado pelo fato de compreender cultivar o microrganismo em um meio contendo maltose como fonte de carbono para produzir e acumular o L-aminoácido no meio e coletar o L-aminoácido da cultura, em que o microrganismo é uma cepa mutante ou recombinante de um microrganismo em que assimilação de maltose é controlada por uma interação entre uma proteína IIAGk de glucose PTS e uma proteína MalK, e a interação entre a proteína IIAGk e a proteína MalK da cepa mutante ou recombinante é reduzida ou eliminada porque a proteína MalK contida no microrganismo tem uma mutação e/ou a proteína IIAG,C contida no microrganismo tem uma mutação, e a cepa pode absorver glucose e maltose, em que a mutação da proteína MalK é selecionada dentre uma mutação para substituir um resíduo de Thr pelo resíduo de Ala em uma posição 124 e uma mutação para substituir um resíduo de Gin pelo resíduo de Leu em uma posição 327 e em. que a mutação da proteína 1IAG,C é selecionada dentre uma mutação para substituir um resíduo de Ser pelo resíduo de Gly em uma posição 47 e uma mutação substituindo um resíduo de Thr pelo resíduo de Ala em uma posição 76.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é selecionado do grupo consistindo de L-lisina, L-treonina e L-fenilalanina.

3. Método dc acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é uma bactéria Escherichia.

4. Método de acordo com a reivindicação 3. caracterizado pelo fato de que o microrganismo Escherichia é uma Escherichia coii.