BRPI0814659B1

BRPI0814659B1 - Método para produzir l-lisina

Info

Publication number: BRPI0814659B1
Application number: BRPI0814659-4A
Authority: BR
Inventors: Hidetaka Doi; Takuji Ueda
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc
Priority date: 2007-07-23
Filing date: 2008-07-22
Publication date: 2023-01-17
Also published as: EP2180052A4; ES2403199T3; CN101765659B; PL2180052T3; KR20100056460A; BRPI0814659A2; WO2009014117A1; KR101537508B1; US20100190217A1; EP2180052A1; JP2010226956A; EP2180052B1; CN101765659A

Abstract

ESCHERICHIA COLI, E, MÉTODO PARA PRODUZIR L-LISINA. A L-lisina pode ser produzida pela cultura de uma célula de Escherichia coli em um meio de cultura e coleta da L-lisina do meio de cultura, em que a célula de Escherichia coli é capaz de produzir L-lisina, é assim modificado que as atividades de uma ou mais enzimas de uma ou mais enzimas envolvidas na via sintética de ácido meso-a,s-diaminopimélico (por exemplo 2,3,4,5-tetraidropiridino-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferase, succinildiaminopimelato transaminase, succinildiaminopimelato dessuccinilase, diaminopimelato epimerase) são diminuídos e tem um gene que codifica diaminopimelato desidrogenase introduzido no mesmo.

Description

Campo Técnico

[0001] A presente invenção diz respeito a um método para produzir L- lisina que utiliza Escherichia coli. A L-lisina é um aminoácido essencial e é utilizado como um componente de medicamentos e várias misturas nutricionais, tais como aditivos de alimentação para animais.

Fundamentos da Técnica

[0002] Os L-aminoácidos tais como L-lisina são industrialmente produzidos por fermentação usando-se bactérias produtoras de aminoácido tais como bactérias corineformes e bactérias Escherichia tendo uma capacidade de produzir tais L-aminoácidos. Como tais bactérias produtoras de aminoácido, cepas isoladas do estado natural, as cepas mutantes artificiais tais como cepas, cepas recombinantes em que a Atividade de enzima de biossíntese de L-aminoácido é intensificado pela recombinação genética e assim por diante são usados a fim de obter a produtividade melhorada. Os exemplos de métodos para a produção de L-lisina incluem os métodos descritos nos documentos de Patente 1 a 4.

[0003] Como métodos para melhorar uma capacidade de produzir aminoácido, tal como L-lisina, além do método de aumentar a expressão de uma enzima de uma característica de via biossintética característica a um aminoácido alvo, que desenvolveu um método de modificar a via da cadeia respiratória para melhorar a eficácia de energia (documento de Patente 5) e um método de amplificar um gene de nicotinamida nucleotídeo transidrogenase para aumentar a capacidade de produzir nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (documento de Patente 6).

[0004] Além disso, como meios fundamentados em modificação de uma via comum para a biossíntese de vários aminoácidos, existem bactérias produtoras de L-aminoácido conhecidas em que a via anaplerótica é modificada, tal como a bactéria corineforme produtora de L-lisina em que a atividade de piruvato carboxilase é aumentada (documento de Patente 7), a bactéria Escherichia produtora de L-lisina deficiente de piruvato cinase (documento de Patente 8) e bactéria corineforme produtora de L-lisina que é deficiente em maleato quinona oxidorredutase (documento de Patente 9).

[0005] Como um precursor de L-lisina, existe o ácido meso-α,ε- diaminopimélico (daqui em diante também referido como "meso-DAP"). O Meso-DAP é um precursor de L-lisina e ao mesmo tempo, é uma substância indispensável para o desenvolvimento de bactérias como um componente constituinte de paredes celulares. Como para a síntese de meso-DAP em bactérias Escherichia, é conhecido que o meso-DAP é sintetizado a partir de um precursor deste, ácido 2,3,4,5-tetraidropiridino-2,6-dicarboxílico (daqui em diante também referido como "THDP"), pelas funções de quatro enzimas, 2,3,4,5-tetraidropiridino-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferase (daqui em diante também referido como "DapD", documento que não de patente 1), succinildiaminopimelato transaminase (daqui em diante também referido como "DapC", Documento que não de patente 2), succinildiaminopimelato dessuccinilase (daqui em diante também referido como "DapE", Documento que não de patente 3) e diaminopimelato epimerase (daqui em diante também referido como "DapF", Documento que não de patente 4), que pertencem à via de síntese de meso-DAP. Foi esclarecido que as bactérias corineformes têm uma outra via de síntese de meso-DAP que utiliza THDP como um precursor e sintetiza meso-DAP do THDP por uma reação de etapa usando-se meso-DAP desidrogenase (daqui em diante também referido como "diaminopimelato desidrogenase" ou "DDH") e é conhecido que a expressão de DDH é útil para a produção de meso-DAP (documento de Patente 10). Além disso, foi descrito que, em um processo de investigar a etapa limitante de taxa de biossíntese de L-lisina em bactérias de Escherichia, um gene que codifica quanto ao DDH de bactéria corineforme foi introduzido em uma bactéria de Escherichia produtora de L-lisina, em vez de intensificar uma atividade de um atividade de uma enzima que pertence à via de síntese de meso-DAP, para realizar a produção de L-lisina (documento de Patente 13). Entretanto, não foi esperado que, quando o DDH é expressado em uma bactéria Escherichia, diminuição de uma atividade de uma enzima que pertence à via de síntese de meso-DAP é eficaz para a produção de L-lisina.

[0006] Documento de Patente 1: Patente Japonesa Aberta ao Público (KOKAI) N° 10-165180

[0007] Documento de Patente 2: Patente Japonesa Aberta ao Público N° 11-192088

[0008] Documento de Patente 3: Patente Japonesa Aberta ao Público N° 2000-253879

[0009] Documento de Patente 4: Patente Japonesa Aberta ao Público N° 2001-057896

[0010] Documento de Patente 5: Patente Japonesa Aberta ao Público N° 2002-17363

[0011] Documento de Patente 6: Patente Japonesa N° 2817400

[0012] Documento de Patente 7: Patente Japonesa Aberta ao Público com base no pedido PCT em língua estrangeira (KOHYO) N° 2002-508921

[0013] Documento de Patente 8: Publicação de Patente Japonesa WO03/008600

[0014] Documento de Patente 9: Pedido Publicado de Patente U. S. N° 2003/0044943

[0015] Documento de Patente 10: Patente Japonesa Aberta ao Público N° 61-289887

[0016] Documento de Patente 11: Publicação de Patente Japonesa WO2006/093322

[0017] Documento de Patente 12: Pedido Publicado de Patente U. S. N° 2006/0160191

[0018] Documento de Patente 13: Patente U. S. N° 6.040,160

[0019] Documento que não de patente 1: Richaud, C. et al., J. Biol. Chem., 259 (23):14824-14828, 1984

[0020] Documento que não de patente 2: Heimberg, H. et al., Gene, 90(1):69-78, 1990

[0021] Documento que não de patente 3: Bouvier, J. et al., J. Bacteriol., 174 (16):5265-71, 1992

[0022] Documento que não de patente 4: Wiseman, J.S. et al., J. Biol. Chem., 259 (14):8907-14, 1984

Descrição da Invenção Objetivo a ser Atingido pela Invenção

[0023] Um objetivo da presente invenção é fornecer um Escherichia coli tendo capacidade de produzir L-lisina melhorada e um método para produzir L-lisina utilizando um tal Escherichia coli.

Meios para Atingir o Objetivo

[0024] Os inventores da presente invenção conduziram várias pesquisas a fim de atingir o objetivo já mencionado e como um resultado, observou que a capacidade de produzir L-lisina de Escherichia coli pode ser melhorada pela modificação de Escherichia coli para diminuir a atividade de uma enzima que pertence à via sintética de meso-DAP e que introduz um gene que codifica quanto ao diaminopimelato desidrogenase. A presente invenção foi realizada na base desta descoberta.

[0025] Desta maneira, a presente invenção é como segue. (1) Um Escherichia coli tendo uma capacidade de produzir L- lisina, que foi modificado para diminuir a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas da via de síntese do ácido meso-a^-diaminopimélico e em que um gene que codifica quanto à diaminopimelato desidrogenase foi introduzido. (2) O Escherichia coli mencionado acima, em que as enzimas da via de síntese do ácido meso-a^-diaminopimélico são selecionadas de 2,3,4,5-tetraidropiridino-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferase, succinildiaminopimelato transaminase, succinildiaminopimelato dessuccinilase e diaminopimelato epimerase. (3) O Escherichia coli mencionado acima, em que o 2,3,4,5- tetraidropiridino-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferase, succinildiaminopimelato transaminase, succinildiaminopimelato dessuccinilase e diaminopimelato epimerase são codificados pelo gene dapD, gene dapC, gene dapE e gene dapF, respectivamente. (4) O Escherichia coli mencionado acima, em que as atividades das enzimas da via de síntese do ácido meso-a^-diaminopimélico são diminuídos pela diminuição da expressão dos genes ou pelo rompimento dos genes. (5) O Escherichia coli mencionado acima, que foi modificado para diminuir pelo menos a atividade de 2,3,4,5-tetraidropiridino-2,6- dicarboxilato N-succiniltransferase. (6) O Escherichia coli mencionado acima, em que o gene que codifica quanto à diaminopimelato desidrogenase é o gene ddh de uma bactéria corineforme. (7) O Escherichia coli mencionado acima, em que o 2,3,4,5- tetraidropiridino-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferase é uma proteína definida no seguinte (A) ou (B): (A) uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 2, (8) uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 2 incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou diversos resíduos de aminoácido e tendo a atividade de tendo a 2,3,4,5- tetraidropiridino-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferase. (8) O Escherichia coli mencionado acima, em que a succinildiaminopimelato transaminase é uma proteína definida no seguinte (C) ou (D): (C) uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 4, (D) uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 4 incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou diversos resíduos de aminoácido e tendo a atividade de succinildiaminopimelato transaminase. (9) O Escherichia coli mencionado acima, em que a succinildiaminopimelato dessuccinilase é uma proteína definida no seguinte (E) ou (F): (E) uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 6, (F) uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 6 incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou diversos resíduos de aminoácido e tendo a atividade de succinildiaminopimelato dessuccinilase. (10) O Escherichia coli mencionado acima, em que a diaminopimelato epimerase é uma proteína definida no seguinte (G) ou (H): (G) uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 8, (H) uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 8 incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou diversos resíduos de aminoácido e tendo uma atividade da diaminopimelato epimerase. (11) O Escherichia coli mencionado acima, em que o gene dapD é um DNA definido no seguinte (a) ou (b): (a) um DNA que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 1 ou (b) um DNA que é capaz de hibridizar com a sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 1 ou uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência de nucleotídeo sob condições severas e que codificam quanto a uma proteína tendo a atividade de tendo a 2,3,4,5-tetraidropiridino-2,6- dicarboxilato N-succiniltransferase. (12) O Escherichia coli mencionado acima, em que o gene dapC é um DNA definido no seguinte (c) ou (d): (c) um DNA que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 3 ou (d) um DNA que é capaz de hibridizar com a sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 3 ou uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência de nucleotídeo sob condições severas e que codificam quanto a uma proteína tendo a atividade de succinildiaminopimelato transaminase. (13) O Escherichia coli mencionado acima, em que o gene dapE é um DNA definido no seguinte (e) ou (f): (e) um DNA que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 5 ou (f) um DNA que é capaz de hibridizar com a sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 5 ou uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência de nucleotídeo sob condições severas e que codificam quanto a uma proteína tendo a atividade de succinildiaminopimelato dessuccinilase. (14) O Escherichia coli mencionado acima, em que o gene dapF é um DNA definido no seguinte (g) ou (h): (g) um DNA que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 7 ou (h) um DNA que é capaz de hibridizar com a sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 7 ou uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência de nucleotídeo sob condições severas e que codificam quanto a uma proteína tendo uma atividade da diaminopimelato epimerase. (15) O Escherichia coli mencionado acima, em que a diaminopimelato desidrogenase é uma proteína definida no seguinte (I) ou (J): (I) uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 10, 12, 14, 16 ou 18, (J) uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 10, 12, 14, 16 ou 18 incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou diversos resíduos de aminoácido e tendo a atividade de diaminopimelato desidrogenase. (16) O Escherichia coli mencionado acima, em que o gene ddh é um DNA definido no seguinte (i) ou (j): (i) um DNA que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 9, 11, 13, 15 ou 17 ou (j) um DNA que é capaz de hibridizar com a sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 9, 11, 13, 15 ou 17 ou uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência de nucleotídeo sob condições severas e que codificam quanto a uma proteína tendo a atividade de diaminopimelato desidrogenase. (17) O Escherichia coli mencionado acima, que ainda tem um diidrodipicolinato sintase que é dessensibilizada para a inibição da regeneração pela L-lisina e uma aspartocinase que é dessensibilizada para a inibição da regeneração pela L-lisina e tem atividade intensificada de diidrodipicolinato redutase. (18) Um método para produzir L-lisina, que compreende cultivar o Escherichia coli mencionado acima em um meio e coletar L-lisina do meio.

Melhor Maneira para Realizar a Invenção

[0026] A seguir, a presente invenção será explicada em detalhes.

<1> Escherichia coli da presente invenção

[0027] O Escherichia coli da presente invenção (daqui em diante também referido como a "bactéria da presente invenção") é um Escherichia coli tendo uma capacidade de produzir L-lisina, que foi modificado para diminuir a atividade ou atividades de uma ou mais enzimas da via de síntese do ácido mcso-α.ε-diaminopimclico e em que um gene que codifica quanto à diaminopimelato desidrogenase foi introduzido.

[0028] Além das características mencionadas acima, a bactéria da presente invenção preferivelmente tem um diidrodipicolinato sintase que é dessensibilizada para a inibição da regeneração pela L-lisina e uma aspartocinase que é dessensibilizada para a inibição da regeneração pela L- lisina e tem uma atividade intensificada de diidrodipicolinato redutase.

[0029] A bactéria da presente invenção pode ser obtida usando-se Escherichia coli tendo capacidade de produzir L-lisina como uma cepa precursora, que o modifica para diminuir a atividade de uma enzima que pertence à via de síntese de meso-DAP e que ainda introduz um gene que codifica quanto ao diaminopimelato desidrogenase. A ordem da modificação para a diminuição da atividade de uma enzima que pertence à via de síntese de meso-DAP e a introdução de um gene que codifica quanto ao diaminopimelato desidrogenase não é particularmente limitado. Além disso, a capacidade de produzir L-lisina pode ser comunicada entre ou após a modificação e a introdução do gene.

[0030] A bactéria como uma cepa precursora de Escherichia coli usada para obter a bactéria da presente invenção não é particularmente limitada. Entretanto, os exemplos específicos incluem, por exemplo, aqueles descritos no trabalho de Neidhardt et al. (Neidhardt F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1029, tabela 1). Os exemplos específicos incluem o Escherichia coli W3110 (ATCC 27325), Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) e assim por diante derivado a partir da cepa do tipo selvagem do protótipo, cepa K12.

[0031] Estas cepas estão disponíveis a partir de, por exemplo, American Type Culture Collection (Address: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America). Isto é, os números de registro são dados a cada uma das cepas e as cepas podem ser ordenadas usando-se estes números de registro. Os números de registro das cepas são listados no catálogo da American Type Culture Collection.

<1-1> Comunicação da capacidade de produzir L-lisina e Escherichia coli tendo capacidade de produzir L-lisina

[0032] Os exemplos de bactérias de Escherichia coli que produz L-lisina incluem mutantes tendo resistência a um análogo de L-lisina. Os análogos de L-lisina inibem o desenvolvimento de Escherichia coli, mas esta inibição é total ou parcialmente dessensibilizada quando L-lisina está presente no meio. Os exemplos dos análogos de L-lisina incluem, mas não são limitadas a, oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), y- metillisina, α-clorocaprolactama e assim por diante. Os mutantes tendo resistência a estes análogos de lisina podem ser obtidos submetendo-se o Escherichia coli a uma mutagênese artificial convencional artificial. Os exemplos específicos de cepas bacterianas úteis para a produção de L-lisina incluem Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; ver Patente U. S. N° 4.346.170) e Escherichia coli VL611. Nestes microorganismos, a aspartocinase é dessensibilizada para a inibição da regeneração pela L-lisina.

[0033] A cepa WC196 pode ser usada como uma bactéria produtora de L-lisina de Escherichia coli. Esta cepa bacteriana foi criada conferindo-se resistência AEC à cepa W3110, que foi derivada de Escherichia coli K-12. A cepa resultante foi denominada cepa Escherichia coli AJ13069 e foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (atualmente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 6 de dezembro de 1994 e designado um número de acessão de FERM P-14690. Depois, o depósito foi convertido a um depósito internacional sob as disposições do Tratado de Budapeste em 29 de setembro de 1995 e designado um número de acessão de FERM BP-5252 (Patente U. S. N° 5.827.698).

[0034] Os exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-lisina também incluem cepas em que a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L- lisina é aumentada. Os exemplos de tais genes incluem, mas não são limitados a, genes que codificam quanto à diidrodipicolinato sintase (dapA), aspartocinase (lysC), diidrodipicolinato redutase (dapB), diaminopimelato decarboxilase (lysA), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), aspartato semialdeído desidrogenease (asd) e aspartase (aspA) (EP 1253195 A). Além disso, as cepas precursoras podem ter um nível aumentado de expressão do gene envolvido na eficiência de energia (cyo) (EP 1170376 A), o gene que codifica quanto à nicotinamida nucleotídeo transidrogenase (pntAB) (Patente U. S. N° 5.830.716), o gene ybjE (WO2005/073390), o gene que codifica quanto à glutamate desidrogenase (gdhA, Gene, 23:199-209 (1983)) ou uma combinação destes. As abreviações para os genes das enzimas são mostrados nos parênteses.

[0035] A sequência de nucleotídeo do gene lysC de Escherichia coli é mostrado SEQ ID N°: 21 e a sequência de aminoácido codificada de aspartocinase é mostrada na SEQ ID N°: 22. A sequência de nucleotídeo do gene dapA de Escherichia coli é mostrada em SEQ ID N°: 23 e a sequência de aminoácido codificada de diidrodipicolinato sintase é mostrada em SEQ ID N°: 24. Além disso, a sequência de nucleotídeo do gene dapB de Escherichia coli é mostrada em SEQ ID N°: 25 e a sequência de aminoácido codificada de diidrodipicolinato redutase é mostrada em SEQ ID N°: 26.

[0036] É conhecido que a diidrodipicolinato sintase do tipo selvagem derivada de Escherichia coli é objeto para a inibição da regeneração pela L- lisina e é conhecido que uma aspartocinase do tipo selvagem derivada de Escherichia coli é objeto para a supressão e inibição de regeneração pela L- lisina. Portanto, quando os genes dapA e lysC são usados, estes genes são preferivelmente genes que codificam quanto a enzimas mutantes que são dessensibilizadas à inibição de regeneração pela L-lisina.

[0037] Os exemplos de DNAs que codificam uma diidrodipicolinato synthetase mutante que é dessensibilizada para a inibição da regeneração pela L-lisina incluem um DNA que codifica uma proteína que tem a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 24 em que o resíduo de histidina na posição 118 é substituído por resíduo de tirosina. Os exemplos de DNA que codificam uma aspartocinase mutante que é dessensibilizada para a inibição da regeneração pela L-lisina incluem um DNA que codifica um AKIII tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 22 em que o resíduo de treonina na posição 352, o resíduo de glicina na posição 323 e o resíduo de metionina na posição 318 são substituídos por isoleucina, asparagina e resíduos de isoleucina, respectivamente (Patente U. S. N° 5.661.012 e Patente U. S. N° 6.040,160). Tais DNAs mutantes podem ser obtidos pela mutagênese específica de local usando-se PCR ou semelhante.

[0038] Os plasmídeos de faixa de hospedeiro ampla RSFD80, pCAB1 e pCABD2 derivados de RSF1010 são conhecidos como plasmídeos contendo um gene dapA mutante que codifica um Escherichia coli diidrodipicolinato sintase mutante e um gene lysC mutante que codifica um Escherichia coli aspartocinase mutante (Patente U. S. N° 6,040,160). A cepa de Escherichia coli JM109 transformada com RSFD80 foi denominada AJ12396 (Patente U. S. N° 6.040,160) e a cepa foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (correntemente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 28 de outubro de 1993 e designado um número de acessão de FERM P-13936 e o depósito foi então convertido a um depósito internacional sob as disposições do Tratado de Budapeste em 1 de novembro de 1994 e designado um número de acessão de FERM BP-4859. RSFD80 pode ser obtido a partir da cepa AJ12396 por um método convencional. pCAB1 foi preparado pela interseção adicional do gene dapB de Escherichia coli em RSFD80 descrito acima. Além disso, pCABD2 foi preparado pela interseção adicional do gene ddh da cepa Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) 2256 (ATCC 13869) em pCAB1 descrito acima (Patente U. S. N° 6.040.160).

[0039] Os exemplos de bactérias produtoras de L-lisina ou cepas precursoras para a sua derivação também incluem as cepas em que a atividade de uma enzima que catalisa uma reação que se ramifica a partir da biossíntese de via de L-lisina e produz um outro composto que não L-lisina é diminuído e tornado deficiente. Os exemplos de tais enzimas que catalisam uma reação que se ramifica a partir da biossíntese da via de L-lisina e produz um outro composto que não L-lisina inclui homoserina desidrogenase, lisina descarboxilase (Patente U. S. N° 5.827.698) e enzima málica (WO2005/010175). É preferível que as expressões tanto dos genes cadA quanto ldcC que codificam lisina decarboxilase sejam diminuídas a fim de diminuir ou deletar a atividade de lisina decarboxilase (WO2006/038695).

[0040] Em uma bactéria usada para a presente invenção, a fim de intensificar a assimilabilidade de glicerol, expressão do gene glpR (EP 1715056) pode ser atenuada ou a expressão do genes de metabolismo de glicerol (EP 1715055 A) tais como os genes glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, tpiA, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa e talC pode ser intensificada.

<1-2> Construção de Escherichia coli da presente invenção

[0041] A seguir, a modificação para reduzir a atividade de uma enzima que pertence à via de síntese de meso-DAP e introdução de um gene que codifica quanto ao diaminopimelato desidrogenase será explicado.

[0042] A via de síntese de meso-DAP de Escherichia coli é uma via para gerar meso-DAP (meso-2,6-diaminopimalato, meso-α,ε-diaminopimelato ou meso-diaminoeptanedioato) de (S)-2,3,4,5-tetraidropiridino-2,6-dicarboxilato ((S)-2,3,4,5-tetraidrodipicolinato) e é catalisado pelas enzimas para as seguintes quatro etepas-reações. Estas reações são reações reversíveis. Em Escherichia coli, a via de síntese de meso-DAP também é denominada via DapDCEF.

1) DapD (2,3,4,5-tetraidropiridino-2,6-dicarboxilato N- succiniltransferase, EC 2.3.1.117)

[0043] Succinil-CoA + (S)-2,3,4,5-tetraidropiridino-2,6-dicarboxilato + H2O -> CoA + N-succinil-L-2-amino-6-oxoeptanodioato

[0044] O DapD é codificado pelo gene dapD. A sequência do gene dapD de Escherichia coli é mostrada em SEQ ID N°: 1 e a sequência de aminoácido de DapD é mostrada em SEQ ID N°: 2.

[0045] A atividade enzimática de DapD pode ser medido por referência ao método de S.A, Simms et al. (J. Biol. Chem., 1984, Mar 10; 259(5):2734- 2741).

2) DapC (succinildiaminopimelato transaminase, também referido como SDAP aminotransferase, EC 2.6.1.17)

[0046] N-Succinil-LL-2,6-diaminoeptanodioato + 2-oxoglutarate -> N- succinil-L-2-amino-6-oxoeptanodioato + L-glutamato

[0047] DapC é codificado pelo gene dapC. A sequência do gene dapC de Escherichia coli é mostrado em SEQ ID N°: 3 e a sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID N°: 4.

[0048] A atividade enzimática de DapC pode ser medida pelo método de Thilo, M. et al. (J. Bacteriol., 2000, Jul;182 (13):3626-3631).

3) DapE (succinildiaminopimelato dessuccinilase, também referido como enzima de dessuccinilação de SDAP, EC 3.5.1.18)

[0049] N-Succinil-LL-2,6-diaminoeptanodioato + H2O -> succinato + LL-2,6-diaminoeptanodioato

[0050] O DapE é codificado pelo gene dapE. A sequência do gene dapE de Escherichia coli é mostrada em SEQ ID N°: 5 e a sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID N°: 6.

[0051] A atividade enzimática de DapE pode ser medida pelo método de Lin, Y.K. et al. (J. Biol. Chem., 1988, 5 de Fev; 263(4):1622-1627).

4) DapF (diaminopimelato epimerase, EC 5.1.1.7)

[0052] LL-2,6-Diaminoeptanodioato -> meso-2,6-diaminopimalato

[0053] DapF é codificado pelo gene dapF. A sequência do gene dapF de Escherichia coli é mostrada em SEQ ID N°: 7 e a sequência de aminoácido é mostrada em SEQ ID N°: 8.

[0054] A atividade enzimática de DapF pode ser medida por referência ao método de Wiseman, J.S. et al. (J. Biol. Chem., 1984, Jul 25; 259(14):8907-8914).

[0055] Além disso, na presente invenção, DDH (diaminopimelato desidrogenase, EC 1.4.1.16) é uma enzima que gera reversivelmente (S)- 2,3,4,5-tetraidropiridino-2,6-dicarboxilato de meso-2,6-diaminopimelato e catalisa a seguinte reação.

[0056] Meso-2,6-diaminopimelato + H2O + NADP+ -> (S)-2,3,4,5- tetraidropiridino-2,6-dicarboxilato + NH3 + NADPH + H+

[0057] A atividade enzimática de DDH pode ser medida por referência ao método de Misono, H. et al. (J. Biol. Chem., 255, 10599-10605, 1980).

[0058] Embora as bactérias Escherichia não tenham qualquer gene ddh que codifica quanto a DDH, um gene ddh de uma bactéria corineforme tal como aquelas de Corynebacterium glutamicum (SEQ ID N°: 9), Brevibacterium lactofermentum (SEQ ID N°: 11) e Corynebacterium efficiens (SEQ ID N°: 13) podem ser usadas.

[0059] O gene ddh de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (NCgl2528) é registrado como Genbank NP_601818.2. GI:23308957 e o gene ddh de Corynebacterium efficiens (CE2498) é registrado como NP_739108.1. GI:25029054.

[0060] Além daquelas bactérias corineformes, o gene ddh de Herminiimonas arsenicoxydans (SEQ ID N°: 15) e o gene ddh de Bacteroides thetaiotaomicron (SEQ ID N°: 17) podem ser usados. O gene ddh de Herminiimonas arsenicoxydans é registrado como Genbank YP_001100730,1 GI:134095655 e o gene ddh de Bacteroides thetaiotaomicron é registrado como NP_810892.1. GI:29347389.

[0061] Os genes mencionados acima e a biossíntese mencionada acima do genes de enzima de L-lisina não são limitados aos genes que correspondem exatamente à informação do gene descrita acima ou genes tendo sequências conhecidas e podem ser genes tendo uma mutação conservativa tal como homólogos destes e genes artificialmente modificados, de modo que as funções das proteínas codificadas não sejam prejudicadas. Isto é, os genes podem ser um gene que codifica quanto a uma sequência de aminoácido de uma proteína conhecida incluindo substituições, deleções, inserções, adições ou semelhante de um ou diversos resíduos de aminoácido em uma ou diversas posições.

[0062] Embora o número entendido pelo termo “um ou diversos” usados neste podem diferir dependendo das posições na estrutura tridimensional da proteína ou tipos de resíduos de aminoácido, especificamente, pode ser preferivelmente de 1 a 20, mais preferivelmente de 1 a 10, ainda mais preferivelmente de 1 a 5. A mutação conservativa é tipicamente uma substituição conservativa. A substituição conservativa é uma substituição em que a substituição acontece mutuamente entre Phe, Trp e Tyr, se o local de substituição for um aminoácido aromático; entre Leu, Ile e Val, se o local de substituição for um aminoácido hidrofóbico; entre Gln e Asn, se este for um aminoácido polar; entre Lys, Arg e His, se este for um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se este for um aminoácido ácido e entre Ser e Thr, se este for um aminoácido tendo grupo hidroxila. Os exemplos específicos de substituição considerada substituição conservativa inclui: substituição de Ser ou Thr for Ala; substituição de Gln, His ou Lys para Arg; substituição de Glu, Gln, Lys, His ou Asp para Asn; substituição de Asn, Glu ou Gln para Asp; substituição de Ser ou Ala para Cys; substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg para Gln; substituição de Gly, Asn, Gln, Lys ou Asp para Glu; substituição de Pro para Gly; substituição de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr para His; substituição de Leu, Met, Val ou Phe para Ile; substituição de Ile, Met, Val ou Phe para Leu; substituição de Asn, Glu, Gln, His ou Arg para Lys; substituição de Ile, Leu, Val ou Phe para Met; substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu para Phe; substituição de Thr ou Ala para Ser; substituição de Ser ou Ala para Thr; substituição de Phe ou Tyr para Trp; substituição de His, Phe ou Trp para Tyr e substituição de Met, Ile ou Leu para Val. A mutação para tal substituição, deleção, inserção, adição, inversão ou semelhante de resíduos de aminoácido como descrito acima também inclui uma mutação de ocorrência natural com base na diferença individual, diferença em espécies de microorganismos a partir dos quais os genes são derivados (mutante ou variante) e assim por diante. Um tal gene pode ser obtido pela modificação de uma sequência de nucleotídeo de um gene conhecido, por exemplo, pela mutagênese específica de local, de modo que a substituição, deleção, inserção ou adição de um resíduo ou resíduos de aminoácido estão incluídas em um local específico da proteína codificada.

[0063] Além disso, um gene tendo a mutação conservativa mencionada acima pode ser um gene que codifica quanto a uma proteína que apresenta uma homologia de 80 % ou mais, preferivelmente 90 % ou mais, mais preferivelmente 95 % ou mais, particularmente preferível 97 % ou mais, para a sequência total da proteína codificada tendo uma função equivalente àquela de uma proteína do tipo selvagem correspondente. Neste relatório descritivo, o termo "homologia" pode ser usado para referir-se à "identidade".

[0064] Além disso, os códons das sequências genéticas podem ser substituídos por aqueles que são facilmente usados por um hospedeiro em que os genes são introduzidos.

[0065] Os genes tendo uma mutação conservativa podem ser aqueles obtidos por um método usualmente usado para a mutagênese, tal como tratamento com um mutagênio.

[0066] Além disso, os genes também podem ser um DNA hibridizável com uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência do gene conhecida, por exemplo, as sequências genéticas já mencionadas e as sequências complementares a estas, sob condições severas e que codificam quanto a uma proteína tendo uma função equivalente àquela de um produto do gene conhecido correspondente. As “condições severas” referidas a condições onde um denominado híbrido específico é formado e o híbrido não específico não é formado. Os exemplos de condições severas incluem, por exemplo, condições sob as quais os DNAs que apresentam homologia alta um com relação ao outro, por exemplo, DNAs que apresentam uma homologia de, por exemplo, não menos do que 80 %, preferivelmente não menos do que 90 %, mais preferivelmente não menos do que 95 %, particularmente preferível não menos do que 97 %, hibridizam um com o outro e DNAs tendo homologia menor do que o nível acima, não hibridizam um com o outro e condições de lavagem com a hibridização de Southern comum, isto é, condições de lavagem única, preferivelmente duas ou três vezes, em concentrações de sal e temperatura de 1 x SSC, 0,1 % de SDS a 60°C, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS a 60°C, mais preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS a 68°C.

[0067] Como a sonda, uma parte de sequências complementares dos genes também pode ser usada. Uma tal sonda pode ser produzida por PCR usando-se oligonucleotídeos preparados na base de uma sequência do gene conhecido como iniciadores e um fragmento de DNA incluindo sequência de nucleotídeo do gene como o modelo. Quando um fragmento de DNA tendo uma força de cerca de 300 bp é usado como uma sonda, as condições de lavagem após a hibridização sob as condições mencionadas acima pode ser exemplificada por 2 x SSC, 0,1 % de SDS a 50°C.

[0068] A expressão "a ser modificada de modo que uma atividade enzimática da via de síntese de meso-DAP diminua" significa ser modificada de modo que a atividade de uma enzima que pertence à via de síntese de meso-DAP (daqui em diante também referido como "via DapDCEF"), especialmente, pelo menos uma de quatro enzimas, DapD, DapC, DapE e DapF, é completamente eliminada ou diminuída como comparada aquela de uma cepa não modificada de Escherichia coli, por exemplo, uma cepa de tipo selvagem.

[0069] A enzima de que a atividade é diminuída pode ser qualquer um de DapD, DapC, DapE e DapF e pode consistir de dois ou mais grupos destes. Este é preferível diminuir uma atividade de uma funcionamento da enzima na região a montante da via DapDCEF e é particularmente preferível realizar a modificação de modo que pelo menos a atividade de DapD diminua.

[0070] Diminuição de uma atividade enzimática da via DapDCEF é preferivelmente significa que, por exemplo, cada atividade enzimática na via DapDCEF é diminuído a 50 % ou menos, preferivelmente 30 % ou menos, mais preferivelmente 10 % ou menos, por célula, como comparado aquela de uma cepa não modificada, por exemplo, uma cepa de tipo selvagem.

[0071] Exemplos de cepa como um objeto de comparação incluem o Escherichia coli W3110 (ATCC 27325), Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) e assim por diante, derivada da cepa de tipo selvagem protótipo, cepa K12, como cepa de tipo selvagem.

[0072] Tal modificação que uma atividade enzimática na via DapDCEF diminua é atingida por, especialmente, deleção de uma parte de ou gene inteiro em um cromossomo que codifica quanto a uma enzima da via DapDCEF, especialmente, a região codificadora do dapD, dapC, dapE ou gene dapF ou modificação de uma sequência de controle de expressão tal como promotor e sequência Shine-Dalgarno (SD). Além disso, a expressão de um gene também pode ser diminuída pela modificação de uma região de não tradução outra do que a sequência de controle de expressão. Além disso, o gene inteiro incluindo a sequências em ambos os lados do gene em um cromossomo pode ser deletado. Além disso, também pode ser atingido pela introdução de uma mutação para a substituição de aminoácido (mutação sentido), um códon de rompimento (mutação não sentido) ou um fragmento de mudança da mutação que adiciona ou deleta um ou dois nucleotídeos, em uma região codificadora que codifica quanto a uma enzima em um cromossomo (Journal of Biological Chemistry, 272:8611-8617 (1997); Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95 5511-5515 (1998); Journal of Biological Chemistry, 266, 20833-20839 (1991)).

[0073] Na presente invenção, este é preferível diminuir uma atividade enzimática intracelular pela deleção de uma parte de ou sequência do gene reguladora da expressão total em um cromossomo tal como uma região promotora ou uma parte de ou região codificadora inteira ou uma região não codificadora ou inserindo outras sequências em uma destas sequências usando-se recombinação de homólogos. Entretanto, a modificação pode ser uma modificação causada por uma mutagênese com base no raio X ou irradiação ultravioleta ou uso de uma mutagene tal como N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina, de modo que tão logo a modificação diminua uma atividade enzimática da via DapDCEF.

[0074] A modificação de uma sequência de controle de expressão é preferivelmente realizada por um ou mais ou mais nucleotídeos, mais preferivelmente dois ou mais nucleotídeos, particularmente três preferíveis ou mais nucleotídeos. Quando a deleção é realizada pela região codificadora, a região a ser deletada pode ser uma região de terminal N, uma região interna ou uma região de terminal C ou ainda a região codificadora inteira, deste modo tão longo a função de uma proteína de enzima a ser produzida é diminuída ou deletada. A deleção de uma região mais longa pode usualmente mais seguramente inativar um gene. Além disso, é preferido que os fragmentos de leitura localizando a montante e a jusante da região a ser deletada não são os mesmos.

[0075] Quando uma outra sequência é inserida em uma região codificadora, a sequência pode ser inserida em qualquer região do gene e inserção de uma sequência mais longa pode usualmente mais seguramente inativar o gene que codifica quanto a uma enzima. É preferido que os fragmentos de leitura localizando a montante e a jusante do local de inserção não são os mesmos. A outra sequência não é particularmente limitada de modo como a sequência no qual diminua ou deleta a função de uma proteína de enzima é escolhida e exemplos incluem, por exemplo, um transpóson que realiza um gene de resistência a antibiótico ou um gene útil para a produção de L-lisina e assim por diante.

[0076] Um gene em um cromossomo pode ser modificado como descrito acima por, por exemplo, preparação de uma versão tipo deleção do gene em que uma sequência parcial do gene é deletada de modo que o gene tipo deleção não produz uma proteína que não funciona normalmente e transforma uma bactéria com um DNA contendo o gene tipo deleção para causar a recombinação de homólogos entre o gene tipo deleção e o gene natural no cromossomo e portanto substitue o gene tipo deleção pelo gene no cromossomo. A proteína codificada pelo gene tipo deleção tem uma conformação diferente de que a proteína de enzima de tipo selvagem, se ainda é produzida e deste modo a função é diminuída ou deletada. Tal rompimento do gene com base na substituição do gene utilizando a recombinação de homólogos já foi estabelecida e existe um método denominado integração acionada por Red (Datsenko, K.A e Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645 (2000)), um método de uso de um DNA linear tal como um método que utiliza a integração acionada por Red em combinação com um sistema taxado derivado de fago À (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., J. Bacteriol., 184:5200-5203 (2002)), um método de uso de um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível a temperatura ou uma plasmídeo capaz da transferência conjugativa, um método de utilização de um vetor suicida não tendo a origem de replicação em um hospedeiro (Patente U. S. N° 6.303.383, Patente Japonesa Aberta ao Público N° 05-007491) e assim por diante.

[0077] A diminuição da quantidade de expressão de um gene pode ser confirmado pela comparação na quantidade de mRNA transcrito a partir do gene com que em um tipo selvagem ou cepa não modificada. A quantidade de expressão pode ser confirmada pela hibridização Northern, RT-PCR (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA, 2001)) e assim por diante.

[0078] A diminuição da quantidade de uma proteína codificada por um gene pode ser confirmada pela Western blotting usando-se anticorpos (Molecular Cloning, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA, 2001).

[0079] A fim de introduzir um gene que codifica quanto ao DDH (ddh) em Escherichia coli, por exemplo, Escherichia coli pode ser transformada com um gene ddh pelo uso de um vetor tal como plasmídeo ou um fago. Exemplos de tais vetores incluem pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 e assim por diante. Embora um promotor inerente do gene DDH possa ser usado, contanto que o gene pode ser expressado em Escherichia coli com este, um promotor em que funciona eficientemente em Escherichia coli também pode ser usado. Exemplos de tais promotores incluem promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor PR e promotor PL de fago X, promotor tet e assim por diante.

[0080] O gene ddh também pode ser incorporado no cromossomo de Escherichia coli por um método usando-se a transdução, um transpóson (Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)), fago Mu (Patente Japonesa Aberta ao Público N° 2-109985) ou recombinação de homólogos (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)). Além disso, o número de cópias do gene ddh pode ser aumentado por transferir o gene ddhs incorporado no cromossomo.

[0081] A incorporação do gene ddh pode ser confirmado pela, por exemplo, hibridização Southern. Além disso, se Escherichia coli em que o gene ddh foi introduzido tem a atividade DDH ou não pode ser confirmada pela, por exemplo, medição da atividade DDH de acordo com o método descrito em Haruo Misono, Fermentation and Industry, 45, 964 (1987). Além disso, o DDH também pode ser deletado por Western blotting usando-se um anticorpo.

<2> Método para a produção de L-lisina

[0082] O método para a produção de L-lisina da presente invenção compreende a cultura de uma bactéria da presente invenção em um meio para produzir e acumular L-lisina no meio ou células e coleta de L-lisina do meio ou células.

[0083] Como o meio a ser usado, o meio convencionalmente usado na produção de L-lisina por fermentação usando-se microorganismos podem ser usados. Que é, o meio convencional contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, íons inorgânicos e opcionalmente outros componentes orgânicos como requerido podem ser usados. Como a fonte de carbono, os sacarídeos tal como glicose, sacarose, lactose, galactose, frutose e hidrolisado de amido; alcoóis tal como glicerol e sorbitol; e ácidos orgânicos tal como ácido fumárico, ácido cítrico e ácido succínico podem ser usados. Como a fonte de nitrogênio, sais de amônio inorgânico tal como sulfato de amônio, cloreto de amônio e nitrogênio orgânico de sulfato de amônio tal como hidrolisado de soja, gás de amônia, amônia aquosa e assim por diante pode ser usado. Como para as fontes de nutrientes do traço orgânico, é desejável que o meio contenha as substâncias requeridas tal como vitamina B1 e L- homoserina, extrato de levedura ou semelhante nas quantidades apropriadas. Outros do que o acima, fosfato de potássio, sulfato de magnésio, íons de ferro, íons de manganês e assim por diante são adicionados em pequenas quantidades, como requerido. Além disso, o meio usado na presente invenção pode ser um meio natural ou meio sintético, de modo como um meio contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e íons inorgânicos e contendo outros componentes de traço orgânicos como requerido é usado.

[0084] Na presente invenção, o glicerol é particularmente preferível usado como uma fonte de carbono. Embora o glicerol possa ser um glicerol reagente, é desejável o uso industrialmente produzido de glicerol contendo impurezas. Por exemplo, é desejável o uso glicerol industrialmente produzido pela reação de esterificação para a produção de combustível biodiesel (Mu Y, et al, Biotechnol Lett., 28, 1755-91759 (2006); Haas M.J., et al., Bioresour. Technol., 97, 4, 671-8678 (2006)).

[0085] O Glicerol contido no meio usado na presente invenção pode ser uma fonte de carbono sozinha ou um meio misturado no qual outras fontes de carbono são adicionados além disso o glicerol também pode ser usado. Outras fontes de carbono preferíveis são sacarídeos tal como glicose, frutose, sacarose, lactose, galactose, melaços finais, hidrolisado de amido, solução de açúcar obtido pela hidrólise de biomassa, alcoóis tal como etanol e ácidos orgânicos tal como ácido fumárico, ácido cítrico e ácido succínico. Quando um meio misturado é usado, é desejável que o glicerol seja contido no meio em uma razão de 50 % ou mais, preferivelmente 60 % ou mais, mais preferivelmente 70 % ou mais, ainda mais preferivelmente 80 % ou mais, especialmente preferivelmente 90 % ou mais, com base na fonte de carbono total contida no meio.

[0086] A cultura é preferivelmente realizada por 1 a 7 dias sob as condições aeróbicas. A temperatura a cultura é preferivelmente 24 a 37°C e pH durante a cultura é preferivelmente entre 5 a 9. Para ajustar pH, as substâncias ácidas inorgânicas ou orgânicas ou alcalinas, gás de amônia e assim por diante podem ser usadas. Para coletar a L-lisina a partir do meio de fermentação, uma combinação de métodos conhecidos podem ser usados, tal como pelo uso de uma resina trocadora de íon e precipitação. Quando a L- lisina acumula nas células, ondas supersônicas, por exemplo ou outras podem ser usadas para romper as células e L-lisina podem ser coletadas pelo uso de uma resina trocadora de íon ou semelhante, a partir do sobrenadante obtido pela remoção de células a partir da suspensão rompida das células pela centrifugação.

[0087] A produção também pode ser realizada por um método em que a fermentação é realizada pelo controle de pH do meio durante a cultura ser 6,5 a 9,0 e pH do meio na extremidade da cultura ser 7,2 a 9,0 e controle da pressão no tanque de fermentação durante estar positivo ou aplicar o dióxido de carbono ou um gás misturado contendo dióxido de carbono ao meio de modo que os íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato estão presentes no meio de cultura em uma quantidade de pelo menos 2 g/L durante a cultura e estes íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato servem como íons contadores de cátions principalmente que consiste de aminoácido básico e lisina é então coletado (refere-se a Patente Japonesa Aberta ao Público N° 2002-065287, Pedido de Patente Publicado U.S. N° 2002/025564).

Exemplos

[0088] A seguir, a presente invenção ainda será mais especialmente explicada como referência aos exemplos.

Exemplo 1: Construção de bactéria que produz lisina L rompida por dapD <1-1> Construção da cepa rompida pelo gene dapD

[0089] Primeiro, uma cepa rompida por dapD foi construída usando-se a cepa de tipo selvagem de Escherichia coli, a cepa MG1655.

[0090] Usando-se o plasmídeo pMW118 (XattL-Kmr-XattR) (refere-se a Publicação de Patente Japonesa WO2006/093322) como o modelo e oligonucleotídeos sintéticos da SEQ ID Nos: 19 e 20 tendo sequências correspondentes a ambas extremidades de uma sequência de locais de ligação de fago X, attL e attR, nas extremidades finais de 3' e sequências correspondentes a partes do gene dapD como o gene alvo nas extremidades finais de 5' como iniciadores, PCR foi realizado para construir a cepa MG1655ΔdapD::att-Km de acordo com o método X-red descrito no Pedido Publicado de Patente U. S. N° 2006/0160191 e WO2005/010175. Um recombinante resistente a Km foi obtido de acordo com o método X-red pela cultura da bactéria a 37°C em um meio ágar L contendo Km (canamicina, 50 mg/L) como cultura de placas e selecionando o recombinante resistente a Km.

<1-2> Transdução de bactéria que produz lisina L da cepa WC196LC/pCABD2 com ΔdapD::att-kan

[0091] O lisado P1 foi obtido da cepa MG1655ΔdapD::att-Km obtida em <1-1> em uma maneira convencional e a bactéria que produz lisina L da cepa WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2 construída pelos métodos descrito no Pedido Publicado de Patente U. S. N° 2006/0160191 foi usado como um hospedeiro para construir a cepa WC196ΔcadAΔldcCΔdapD::att- Km/pCABD2 de acordo com o método de transdução P1. A cepa WC196ΔcadAΔldc foi obtida da cepa de Escherichia coli WC196 pelo rompimento dos genes de lisina decarboxilase, o cadA e ldc de acordo com o método usando-se o método de integração acionado por Red (Datsenko K.A., Wanner, B.L., 2000, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645) e o sistema taxado derivado de fago À (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., J. Bacteriol., 184:5200-5203 (2002)) em combinação (refere-se a WO2005/010175). Uma cepa obtida pela introdução de pCABD2 nesta cepa é a cepa WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2.

[0092] A cepa transdutora objetiva foi obtido pela realização da cultura de placa a 37°C em um meio de ágar L contendo Km (canamicina, 50 mg/L) e Sm (estreptomicina, 20 mg/L) e selecionado uma cepa recombinante resistente a Sm e resistente a Km.

[0093] Além disso, cada uma destas cepas foi submetida à cultura a 37°C em um meio L contendo 20 mg/L de estreptomicina até o OD600 final atingir cerca de 0,6, então a cultura foi adicionada com um volume igual de 40 % de solução de glicerol e a mistura foi agitada, dividida em volumes apropriados e armazenados a -80°C. Estas misturas serão denominadas estoques de glicerol.

Exemplo 2: Avaliação da capacidade de produção de lisina L da bactéria que produz a lisina L rompida por dapD

[0094] Os estoques de glicerol das cepas obtidas no Exemplo 1 foram descongelados e uniformemente aplicados a uma placa L contendo 20 mg/L de estreptomicina em um volume de 100 μL de cada e a cultura foi realizada a 37°C por 24 horas. As células em uma quantidades de cerca de 1/8 das células obtidas em uma placa foram recolocadas em suspensão em 0,5 ml de solução salina fisiológica e turvação da suspensão foi medida a 600 nm usando-se um espectrofotômetro (U-2000, Hitachi). A suspensão contendo as células obtidas foi inoculada em 20 ml de um meio de fermentação (meio MS, composição é mostrada abaixo) contendo 20 mg/L de estreptomicina em um 500-mL de frasco Sakaguchi em um tal volume que a turvação da mistura tornar-se 0,15 a 600 nm e a cultura foi realizada a 37°C e 114 rpm por 24 horas em uma máquina de cultura reciprocamente de agitação. Após a cultura, as quantidades de lisina L acumulada e glicose restante no meio foram medidos usando-se o analisador Biotec AS210 (SAKURA SEIKI). O glicerol acumulado no meio também foi medido usando-se o analisador Biotec BF-5 (Oji Scientific Instruments). Composição do meio de fermentação, g/L Glicerol ou glicose 40 (NH4)2SO4 24 KH2PO4 11,0 MgSO^VIbO 1,0 FeS()-7IM) 0,01 MnSO4^5H2O 0,01 Extrato de levedura 2,0

[0095] O meio foi ajustado a pH 7.0 com KOH, submetido à autoclave a 115°C por 10 minutos (fornecido que o glicerol ou glicose e MgSO4<H2O foram separadamente esterilizados) e então adicionado com 30 g/L de CaCO3 (Japanese Pharmacopoeia) (submetido à esterilização ao ar de calor a 180°C por 2 horas). A estreptomicina foi adicionada em uma quantidade de 20 mg/L.

[0096] Os resultados são mostrados na Tabela 1 (OD significa a quantidade celular indicada em termos de absorbância a 660 medido pela cultura diluída 26 vezes, Lys (g/L) significa a quantidade de lisina L acumulada no frasco, Glicose (g/L) e Glicerol (g/L) significa as quantidades de glicose e glicerol remanescentes no meio, respectivamente e rendimento (%) significa o rendimento de lisina L com base no substrato). Como visto a partir dos resultados mostrados na Tabela 1, a cepa WC196ΔcadAΔldcCΔdapD::att-Km/pCABD2 acumulada por lisina L em uma ampla quantidade como em comparação aquele obtido com a cepa WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2 em que o gene dapD não foi rompido. Tabela 1

[0097] Explanação da listagem de sequência SEQ ID N°: 1: Sequência de nucleotídeo de E. coli dapD SEQ ID N°: 2: Sequência de aminoácido de E. coli DapD SEQ ID N°: 3: Sequência de nucleotídeo de E. coli dapC SEQ ID N°: 4: Sequência de aminoácido de E. coli DapC SEQ ID N°: 5: Sequência de nucleotídeo de E. coli dapE SEQ ID N°: 6: Sequência de aminoácido de E. coli DapE SEQ ID N°: 7: Sequência de nucleotídeo de E. coli dapF SEQ ID N°: 8: Sequência de aminoácido de E. coli DapF SEQ ID N°: 9: Sequência de nucleotídeo do gene ddh de C. glutamicum SEQ ID N°: 10: Sequência de aminoácido de DDH de C. glutamicum SEQ ID N°: 11: Sequência de nucleotídeo do gene ddh de B. lactofermentum SEQ ID N°: 12: Sequência de aminoácido de DDH de B. lactofermentum SEQ ID N°: 13: Sequência de nucleotídeo do gene ddh de C. efficiens SEQ ID N°: 14: Sequência de aminoácido de DDH de C. efficiens SEQ ID N°: 15: Sequência de nucleotídeo do gene ddh de H. arsenicoxydans SEQ ID N°: 16: Sequência de aminoácido de DDH de H. arsenicoxydans SEQ ID N°: 17: Sequência de nucleotídeo do gene ddh de B. thetaiotaomicron SEQ ID N°: 18: Sequência de aminoácido de DDH de B. thetaiotaomicron SEQ ID N°: 19: Iniciador para a deleção do gene dapD SEQ ID N°: 20: Iniciador para a deleção do gene dapD SEQ ID N°: 21: Sequência de nucleotídeo de E. coli lysC SEQ ID N°: 22: Sequência de aminoácido de E. coli LysC SEQ ID N°: 23: Sequência de nucleotídeo de E. coli dapA SEQ ID N°: 24: Sequência de aminoácido de E. coli DapA SEQ ID N°: 25: Sequência de nucleotídeo de E. coli dapB SEQ ID N°: 26: Sequência de aminoácido de E. coli DapB Aplicabilidade industrial

[0098] De acordo com a presente invenção, na produção de lisina L por fermentação usando-se Escherichia coli, a produção da quantidade e/ou rendimento da fermentação de lisina L pode ser melhorado. Além disso, a presente invenção pode ser usada pela criação de bactéria que produz lisina L de Escherichia coli.

Claims

1. Método para produzir L-lisina, caracterizado pelo fato de compreender cultivar em um meio uma Escherichia coli que tem a capacidade de produzir L-lisina e coletar L-lisina a partir do meio, em que a Escherichia coli foi modificada para romper um ou mais dentre os genes dapD, dapC, dapE e dapF, diminuindo a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas da via de síntese do ácido meso- α.ε-diaminopimclico. e em que um gene ddh exógeno foi introduzido na Escherichia coli.

2. Método de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os genes dapD, dapC, dapE e dapF codificam a 2,3,4,5- tetraidropiridino-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferase, succinildiaminopimelato transaminase, succinildiaminopimelato dessuccinilase e diaminopimelato epimerase, respectivamente.

3. Método de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a Escherichia coli foi modificada para romper pelo menos o gene dapD.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o gene ddh é o gene ddh de uma bactéria corineforme.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 4, caracterizado pelo fato de que a 2,3,4,5-tetraidropiridino-2,6- dicarboxilato N-succiniltransferase é uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 2.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 5, caracterizado pelo fato de que a succinildiaminopimelato transaminase é uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 4.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 6, caracterizado pelo fato de que a succinildiaminopimelato dessuccinilase é uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 6.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 7, caracterizado pelo fato de que a diaminopimelato epimerase é uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 8.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o gene dapD é um DNA que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 1.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o gene dapC é um DNA que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 3.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o gene dapE é um DNA que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 5.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o gene dapF é um DNA que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 7.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o gene ddh codifica diaminopimelato desidrogenase, e a diaminopimelato desidrogenase é uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 10, 12, 14, 16 ou 18.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o gene ddh é um DNA que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 9, 11, 13, 15 ou 17.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a Escherichia coli ainda tem uma diidrodipicolinato sintase que é dessensibilizada para a inibição da regeneração pela L-lisina e uma aspartocinase que é dessensibilizada para a inibição da regeneração pela L-lisina e tem atividade intensificada de diidrodipicolinato redutase.