ES2403199T3

ES2403199T3 - Método para producir L-lisina

Info

Publication number: ES2403199T3
Application number: ES08791407T
Authority: ES
Inventors: Hidetaka Doi; Takuji Ueda
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2007-07-23
Filing date: 2008-07-22
Publication date: 2013-05-16
Anticipated expiration: 2028-07-22
Also published as: BRPI0814659A2; US20100190217A1; JP2010226956A; EP2180052B1; KR20100056460A; WO2009014117A1; KR101537508B1; CN101765659A; CN101765659B; EP2180052A4; EP2180052A1; PL2180052T3; BRPI0814659B1

Abstract

Método para producir L-lisina, que comprende hacer crecer en cultivo en un medio una Escherichia coli que tiene capacidad productora de L-lisina y recoger L-lisina del medio, en el que la Escherichia coli se ha modificado para disminuir la actividad o actividades de una o más clases de enzimas de la ruta de síntesis del ácido meso-,-diaminopimélico, y en el que se ha introducido un gen que codifica para diaminopimelato deshidrogenasa en la Escherichia coli.

Description

Método para producir L-lisina.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para producir L-lisina utilizando Escherichia coli. L-Lisina es un aminoácido esencial y se utiliza como componente de fármacos y diversas mezclas nutricionales tales como aditivos de piensos para animales.

Técnica anterior

Los L-aminoácidos tales como la L-lisina se producen industrialmente mediante fermentación usando bacterias productoras de aminoácidos tales como bacterias corineformes y bacterias Escherichia que tienen capacidad para producir tales L-aminoácidos. Como tales bacterias productoras de aminoácidos se usan cepas aisladas de la naturaleza, cepas mutantes artificiales de tales cepas, cepas recombinantes en las que está potenciada la actividad de las enzimas de biosíntesis de L-aminoácidos mediante recombinación génica, etc., con el fin de obtener productividad mejorada. Los ejemplos de métodos para producir L-lisina incluyen los métodos descritos en los documentos de patente 1 a 4.

Como métodos para mejorar la capacidad para producir aminoácidos tales como L-lisina, además del método de aumentar la expresión de una enzima de una ruta biosintética característica para un aminoácido diana, se ha desarrollado un método de modificación de la ruta de la cadena respiratoria para mejorar la eficacia energética (documento de patente 5) y un método de amplificación de un gen de nicotinamida nucleótido transhidrogenasa para aumentar la capacidad productora de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (documento de patente 6).

Además, como medio basado en la modificación de una ruta común a la biosíntesis de diversos aminoácidos, se conocen bacterias productoras de L-aminoácidos en las que está modificada la ruta anaplerótica, tal como la bacteria corineforme productora de L-lisina en la que está aumentada la actividad piruvato (documento de patente 7), la bacteria Escherichia productora de L-lisina deficiente en piruvato cinasa (documento de patente 8) y la bacteria corineforme productora de L-lisina que es deficiente en maleato quinona oxidorreductasa (documento de patente 9).

Como precursor de L-lisina, está el ácido meso- , -diaminopimélico (también denominado en lo sucesivo “meso-DAP”). Meso-DAP es un precursor de L-lisina, y al mismo tiempo, es una sustancia indispensable para el crecimiento de bacterias como componente constituyente de las paredes celulares. En cuanto a la síntesis de meso-DAP en bacterias Escherichia, se sabe que meso-DAP se sintetiza a partir de un precursor del mismo, el ácido 2,3,4,5-tetrahidropiridina-2,6-dicarboxílico (también denominado en lo sucesivo “THDP”), mediante las funciones de cuatro enzimas, 2,3,4,5-tetrahidropiridina-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferasa (también denominada en lo sucesivo “DapD”, documento no de patente 1), succinildiaminopimelato transaminasa (también denominada en lo sucesivo “DapC”, documento no de patente 2), succinildiaminopimelato desuccinilasa (también denominada en lo sucesivo “DapE”, documento no de patente 3) y diaminopimelato epimerasa (también denominada en lo sucesivo “DapF”, documento no de patente 4), que pertenecen a la ruta de síntesis de meso-DAP. Se ha esclarecido que las bacterias corineformes tienen otra ruta de síntesis de meso-DAP que utiliza THDP como precursor y sintetizan meso-DAP a partir de THDP mediante una reacción de una etapa usando meso-DAP deshidrogenasa (también denominada en lo sucesivo “diaminopimelato deshidrogenasa” o “DDH”), y se sabe que la expresión de DDH es útil para la producción de meso-DAP (documento de patente 10). Además, se dio a conocer que, en un procedimiento de investigación de la etapa limitante de la velocidad de la biosíntesis de L-lisina en bacterias Escherichia, se introdujo un gen que codifica para DDH de bacteria corineforme en una bacteria Escherichia productora de L-lisina, en lugar de potenciar una actividad de una enzima que pertenece a la ruta de síntesis de meso-DAP, para obtener la producción de L-lisina (documento de patente 13). Sin embargo, no se ha esperado que, cuando se expresa DDH en una bacteria Escherichia, la disminución de una actividad de una enzima que pertenece a la ruta de síntesis de meso-DAP será eficaz para la producción de L-lisina.

Documento de patente 1: patente japonesa abierta a consulta por el público (KOKAI) n.º 10-165180

Documento de patente 2: patente japonesa abierta a consulta por el público n.º 11-192088

Documento de patente 3: patente japonesa abierta a consulta por el público n.º 2000-253879

Documento de patente 4: patente japonesa abierta a consulta por el público n.º 2001-057896

Documento de patente 5: patente japonesa abierta a consulta por el público n.º 2002-17363

Documento de patente 6: patente japonesa n.º 2817400 Documento de patente 7: patente japonesa abierta a consulta por el público basada en la solicitud PCT en lengua extranjera (KOHYO) n.º 2002-508921 Documento de patente 8: publicación de patente internacional WO03/008600 Documento de patente 9: solicitud publicada de patente estadounidense n.º 2003/0044943 Documento de patente 10: patente japonesa abierta a consulta por el público n.º 61-289887 Documento de patente 11: publicación de patente internacional WO2006/093322 Documento de patente 12: solicitud publicada de patente estadounidense n.º 2006/0160191 Documento de patente 13: patente estadounidense n.º 6.040.160 Documento no de patente 1: Richaud, C. et al., J. Biol. Chem., 259 (23):14824-14828, 1984 Documento no de patente 2: Heimberg, H. et al., Gene, 90 (1): 69-78, 1990 Documento no de patente 3: Bouvier, J. et al., J. Bacteriol., 174 (16):5265-71, 1992 Documento no de patente 4: Wiseman, J.S. et al., J. Biol. Chem., 259 (14):8907-14, 1984

Descripción de la invención Objeto que ha de lograrse mediante la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar una Escherichia coli que tiene capacidad productora de L-lisina mejorada y un método para producir L-lisina utilizando tal Escherichia coli.

Medios para lograr el objeto

Los inventores de la presente invención realizaron diversas investigaciones con el fin de lograr el objeto mencionado anteriormente, y como resultado, encontraron que la capacidad productora de L-lisina de Escherichia coli podría mejorarse modificando Escherichia coli para disminuir la actividad de una enzima que pertenece a la ruta sintética de meso-DAP e introduciendo un gen que codifica para diaminopimelato deshidrogenasa. La presente invención se llevó a cabo partiendo de la base de este hallazgo.

Por tanto, la presente invención es tal como sigue.

: (1) Una Escherichia coli que tiene una capacidad productora de L-lisina, que se ha modificado para disminuir la actividad o actividades de una o más clases de enzimas de la ruta de síntesis del ácido meso-, -diaminopimélico y en la que se ha introducido un gen que codifica para diaminopimelato deshidrogenasa.

(2): La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que las enzimas de la ruta de síntesis del ácido mesodiaminopimélico se seleccionan de 2,3,4,5-tetrahidropiridina-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferasa, succinildiaminopimelato transaminasa, succinildiaminopimelato desuccinilasa y diaminopimelato epimerasa.

(3): La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que la 2,3,4,5-tetrahidropiridina-2,6-dicarboxilato Nsucciniltransferasa, succinildiaminopimelato transaminasa, succinildiaminopimelato desuccinilasa y diaminopimelato epimerasa se codifican por el gen dapD, gen dapC, gen dapE y gen dapF, respectivamente.

: (4) La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que las actividades de las enzimas de la ruta de síntesis del ácido meso-, -diaminopimélico se disminuyen mediante la disminución de la expresión de los genes o mediante la alteración de los genes.

(5): La Escherichia coli mencionada anteriormente, que se ha modificado para disminuir al menos la actividad de 2,3,4,5-tetrahidropiridina-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferasa.

(6): La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que el gen que codifica para diaminopimelato deshidrogenasa es el gen ddh de una bacteria corineforme.

(7): La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que la 2,3,4,5-tetrahidropiridina-2,6-dicarboxilato Nsucciniltransferasa es una proteína definida en (A) o (B) siguientes:

(A): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,

(B): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos y que tiene la actividad de 2,3,4,5tetrahidropiridina-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferasa.

(8): La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que la succinildiaminopimelato transaminasa es una proteína definida en (C) o (D) siguientes:

(C): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4,

(D): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos y que tiene la actividad de succinildiaminopimelato transaminasa.

(9): La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que la succinildiaminopimelato desuccinilasa es una proteína definida en (E) o (F) siguientes:

(E): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6,

(F): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos y que tiene la actividad de succinildiaminopimelato desuccinilasa.

(10): La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que la diaminopimelato epimerasa es una proteína definida en (G) o (H) siguientes:

(G): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8,

(H): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos y que tiene la actividad de diaminopimelato epimerasa.

(11): La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que el gen dapD es un ADN definido en (a) o (b) siguientes:

(a): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o

(b): un ADN que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que codifica para una proteína que tiene la actividad 2,3,4,5-tetrahidropiridina-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferasa.

(12): La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que el gen dapC es un ADN definido en (c) o (d) siguientes:

(c): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, o

(d): un ADN que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que codifica para una proteína que tiene la actividad de succinildiaminopimelato transaminasa.

(13): La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que el gen dapE es un ADN definido en (e) o (f) siguientes:

(e): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, o

(f): un ADN que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que codifica para una proteína que tiene la actividad de succinildiaminopimelato desuccinilasa.

(14): La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que el gen dapF es un ADN definido en (g) o (h) siguientes:

(g): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, o

(h): un ADN que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que codifica para una proteína que tiene la actividad de diaminopimelato epimerasa.

(15): La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que la diaminopimelato deshidrogenasa es una proteína definida en (I) o (J) siguientes:

(I): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16 ó 18,

(J): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16 ó 18 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos y que tiene la actividad de diaminopimelato deshidrogenasa.

(16): La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que el gen ddh es un ADN definido en (i) o (j) siguientes:

(i): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 ó 17, o

(j): un ADN que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 ó 17 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que codifica para una proteína que tiene la actividad de diaminopimelato deshidrogenasa.

(17): La Escherichia coli mencionada anteriormente, que tiene además una dihidrodipicolinato sintasa que está desensibilizada para la retroinhibición por L-lisina y una aspartocinasa que está desensibilizada para la retroinhibición por L-lisina, y tiene actividad potenciada de dihidrodipicolinato reductasa.

(18): Un método para producir L-lisina, que comprende hacer crecer en cultivo la Escherichia coli mencionada anteriormente en un medio y recoger L-lisina del medio.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

A continuación en el presente documento, se explicará la presente invención en detalle.

<1> Escherichia coli de la presente invención

La Escherichia coli de la presente invención (también denominada en lo sucesivo la “bacteria de la presente invención”) es una Escherichia coli que tiene una capacidad productora de L-lisina, que se ha modificado para disminuir la actividad o actividades de una o más enzimas de la ruta de síntesis del ácido meso-, -diaminopimélico, y en la que se ha introducido un gen que codifica para diaminopimelato deshidrogenasa. Además de las características mencionadas anteriormente, la bacteria de la presente invención tiene preferiblemente una dihidrodipicolinato sintasa que está desensibilizada para la retroinhibición por L-lisina y una aspartocinasa que está desensibilizada para la retroinhibición por L-lisina, y tiene una actividad potenciada de dihidrodipicolinato reductasa.

La bacteria de la presente invención puede obtenerse usando Escherichia coli que tiene capacidad productora de Llisina como cepa original, modificándola para disminuir una actividad de una enzima que pertenece a la ruta de síntesis de meso-DAP, e introduciendo adicionalmente un gen que codifica para diaminopimelato deshidrogenasa. El orden de la modificación para disminuir una actividad de una enzima que pertenece a la ruta de síntesis de meso-DAP y la introducción de un gen que codifica para diaminopimelato deshidrogenasa no está limitado particularmente. Además, la capacidad productora de L-lisina puede transmitirse entre o tras la modificación y la introducción del gen.

La bacteria como cepa original de Escherichia coli usada para obtener la bacteria de la presente invención no está limitada particularmente. Sin embargo, los ejemplos específicos incluyen, por ejemplo, los descritos en el trabajo de Neidhardt et al. (Neidhardt F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1029, tabla 1). Los ejemplos específicos incluyen Escherichia coli W3110 (ATCC 27325), Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) etc., derivadas de la cepa de tipo natural prototipo, cepa K12.

Estas cepas están disponibles de, por ejemplo, American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo) (Dirección: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos de América). Es decir, se facilitan números de registro para cada una de las cepas y las cepas pueden ordenarse usando esos números de registro. Los números de registro de las cepas se enumeran en el catálogo de la American Type Culture Collection.

<1-1> Transmisión de la capacidad productora de L-lisina y Escherichia coli que tiene capacidad productora de L-lisina

Los ejemplos de bacterias Escherichia coli productoras de L-lisina que tienen resistencia a un análogo de L-lisina. Los análogos de L-Lisina inhiben el crecimiento de Escherichia coli, pero esta inhibición está completa o parcialmente desensibilizada cuando la L-lisina está presente en el medio. Los ejemplos de análogos de L-lisina incluyen, pero sin limitarse a, oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), -metil-lisina, clorocaprolactama, etc. Pueden obtenerse mutantes que tienen resistencia a estos análogos de lisina sometiendo la Escherichia coli a una mutagénesis artificial convencional. Los ejemplos específicos de cepas bacterianas útiles para producir L-lisina incluyen Escherichia coli AJ11442 (FERM BP- 1543, NRRL B-12185; véase la patente estadounidense n.º 4.346.170) y Escherichia coli VL611. En estos microorganismos, la aspartocinasa está desensibilizada para la retroinhibición por L-lisina.

La cepa WC196 puede usarse como una bacteria productora de L-lisina de Escherichia coli. Esta cepa bacteriana se obtuvo confiriendo resistencia a AEC a la cepa W3110, que se deriva de Escherichia coli K-12. La cepa resultante de designó cepa Escherichia coli AJ13069 y se depositó en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (actualmente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 6 de diciembre de 1994 y se le asignó un número de registro de FERM P-14690. Entonces, el depósito se convirtió en un depósito internacional según las disposiciones del Tratado de Budapest el 29 de septiembre de 1995 y se le asignó un número de registro de FERM BP-5252 (patente estadounidense n.º 5.827.698).

Los ejemplos de cepas originales que pueden usarse para derivar bacterias productoras de L-lisina también incluyen cepas en las que está aumentada la expresión de uno o más genes que codifican para una enzima biosintética de Llisina. Los ejemplos de tales genes incluyen, pero sin limitarse, genes que codifican para dihidrodipicolinato sintasa (dapA), aspartocinasa (lysC), dihidrodipicolinato reductasa (dapB), diaminopimelato descarboxilasa (lysA), fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc), aspartato semialdehído deshidrogenasa (asd) y aspartasa (aspA) (documento EP 1253195 A). Además, las cepas originales pueden tener un nivel aumentado de expresión del gen implicado en la eficacia energética (cyo) (documento EP 1170376 A), el gen que codifica para nicotinamida nucleótido transhidrogenasa (pntAB) (patente estadounidense n.º 5.830.716), el gen ybjE (documento WO2005/073390), el gen que codifica para glutamato deshidrogenasa (gdhA, Gene, 23:199-209 (1983)) o una combinación de los mismos. Las abreviaturas para los genes de las enzimas se muestran en los paréntesis.

La secuencia de nucleótidos del gen lysC de Escherichia coli se muestra en SEQ ID NO: 21 y la secuencia de aminoácidos codificada de aspartocinasa se muestra en SEQ ID NO: 22. La secuencia de nucleótidos del gen dapA de Escherichia coli se muestra en SEQ ID NO: 23 y la secuencia de aminoácidos codificada de dihidrodipicolinato sintasa se muestra en SEQ ID NO: 24. Además, la secuencia de nucleótidos del gen dapB de Escherichia coli se muestra en SEQ ID NO: 25 y la secuencia de aminoácidos codificada de dihidrodipicolinato reductasa se muestra en SEQ ID NO: 26.

Se sabe que la dihidrodipicolinato sintasa de tipo natural derivada de Escherichia coli se somete a la retroinhibición por L-lisina y se sabe que la aspartocinasa de tipo natural derivada de Escherichia coli se somete a supresión y retroinhibición por L-lisina. Por tanto, cuando se usan los genes dapA y lysC, estos genes son preferiblemente genes que codifican para enzimas mutantes que están desensibilizadas para la retroinhibición por L-lisina.

Los ejemplos de ADN que codifican para una dihidrodipicolinato sintetasa mutante que está desensibilizada para la retroinhibición por L-lisina incluyen un ADN que codifica para una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 en la que el residuo de histidina en la posición 118 está sustituido por un residuo de tirosina. Los ejemplos de ADN que codifica para una aspartocinasa mutante que está desensibilizada para la retroinhibición por L-lisina incluyen un ADN que codifica para una AKIII que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 en la que el residuo de treonina en la posición 352, el residuo de glicina en la posición 323 y el residuo de metionina en la posición 318 están sustituidos por residuos de isoleucina, asparagina e isoleucina, respectivamente (patente estadounidense n.º 5.661.012 y patente estadounidense n.º 6.040.160). Tales ADN mutantes pueden obtenerse mediante mutagénesis específica de sitio usando PCR o similares.

Los plásmidos con amplia variedad de huéspedes RSFD80, pCAB1 y pCABD2 derivados de RSF1010 se conocen como plásmidos que contienen un gen dapA mutante que codifica para una dihidrodipicolinato sintasa de Escherichia coli mutante y un gen lysC que codifica para una aspartocinasa de Escherichia coli mutante (patente estadounidense n.º 6.040.160). La cepa de Escherichia coli JM109 transformada con RSFD80 se denominó AJ12396 (patente estadounidense n.º 6.040.160) y la cepa se depositó en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (actualmente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 28 de octubre de 1993 y se le asignó un número de registro de FERM P-13936, y luego el depósito se convirtió en un depósito internacional según las disposiciones del Tratado de Budapest el 1 de noviembre de 1994 y se le asignó un número de registro de FERM BP-4859. RSFD80 puede obtenerse a partir de la cepa AJ12396 mediante un método convencional. pCAB1 se preparó insertando adicionalmente el gen dapB de Escherichia coli en RSFD80 descrito anteriormente. Además, pCABD2 se preparó insertando adicionalmente el gen ddh de la cepa de Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) 2256 (ATCC 13869) en pCAB1 descrito anteriormente (patente estadounidense n.º 6.040.160).

Los ejemplos de bacterias productoras de L-lisina o cepas originales para derivarlas también incluyen cepas en las que está disminuida o se ha vuelto deficiente la actividad de una enzima que cataliza una reacción que se ramifica desde la ruta de biosíntesis de L-lisina y produce un compuesto distinto de L-lisina. Los ejemplos de tales enzimas que catalizan una reacción que se ramifica desde la ruta de biosíntesis de L-lisina y produce un compuesto distinto de L-lisina incluyen homoserina deshidrogenasa, lisina descarboxilasa (patente estadounidense n.º 5.827.698) y enzima málica (documento WO2005/010175). Es preferible que las expresiones de ambos genes cadA y ldcC que codifican para lisina descarboxilasa estén disminuidas con el fin de disminuir o eliminar la actividad de lisina descarboxilasa (documento WO2006/038695).

En la bacteria usada para la presente invención, con el fin de potenciar la capacidad de asimilación de glicerol, puede atenuarse la expresión del gen glpR (documento EP 1715056) o puede potenciarse la expresión de genes del metabolismo de glicerol (documento EP 1715055 A) tales como los genes glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, tpiA, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa y talC.

<1-2> Construcción de Escherichia coli de la presente invención

A continuación en el presente documento se explicará la modificación para reducir la actividad de una enzima que pertenece a la ruta de síntesis de meso-DAP y la introducción de un gen que codifica para diaminopimelato deshidrogenasa.

La ruta de síntesis meso-DAP de Escherichia coli es una ruta para generar meso-DAP (meso-2,6diaminopimalato, meso-, -diaminopimelato o meso-diaminoheptanodioato) a partir de (S)-2,3,4,5-tetrahidropiridina2,6-dicarboxilato ((S)-2,3,4,5-tetrahidrodipicolinato), y está catalizada por las enzimas para las siguientes reacciones de cuatro etapas. Estas reacciones son reacciones reversibles. En Escherichia coli, la ruta de síntesis de meso-DAP también se denomina ruta DapDCEF.

1) DapD (2,3,4,5-tetrahidropiridina-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferasa, EC 2.3.1.117)

Succinil-CoA + (S)-2,3,4,5-tetrahidropiridina-2,6-dicarboxilato + H2O -> CoA + N-succinil-L-2-amino-6oxoheptanodioato

DapD está codificada por el gen dapD. La secuencia del gen dapD de Escherichia coli se muestra en SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de DapD se muestra en SEQ ID NO: 2.

La actividad enzimática de DapD puede medirse haciendo referencia al método de S.A, Simms et al. (J. Biol. Chem., 10 de marzo de 1984; 259(5):2734-2791).

2) DapC (succinildiaminopimelato transaminasa, también denominada SDAP aminotransferasa, EC 2.6.1.17)

N-Succinil-LL-2,6-diaminoheptanodioato + 2-oxoglutarato -> N-succinil-L-2-amino-6-oxoheptanodioato + L-glutamato

DapC está codificada por el gen dapC. La secuencia del gen dapC de Escherichia coli se muestra en SEQ ID NO: 3 y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 4.

La actividad enzimática de DapC puede medirse mediante el método de Thilo, M. et al. (J. Bacteriol., julio de 2000; 182 (13):3626-3631).

3) DapE (succinildiaminopimelato desuccinilasa, también denominada enzima de desuccinilación de SDAP, EC 3.5.1.18)

N-Succinil-LL-2,6-diaminoheptanodioato + H2O -> succinato + LL-2,6-diaminoheptanodioato

DapE está codificada por el gen dapE. La secuencia del gen dapE de Escherichia coli se muestra en SEQ ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 6.

La actividad enzimática de DapE puede medirse mediante el método de Lin, Y.K. et al. (J. Biol. Chem., 5 de febrero de 1988; 263(4):1622-1627).

4) DapF (diaminopimelato epimerasa, EC 5.1.1.7)

LL-2,6-Diaminoheptanodioato -> meso-2,6-diaminopimalato

DapF está codificada por el gen dapF. La secuencia del gen dapF de Escherichia coli se muestra en SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 8.

La actividad enzimática de DapF puede medirse haciendo referencia al método de Wiseman, J.S. et al. (J. Biol. Chem., 25 de julio de 1984; 259(14):8907-8914).

Además, en la presente invención, DDH (diaminopimelato deshidrogenasa, EC 1.4.1.16) es una enzima que genera de manera reversible (S)-2,3,4,5-tetrahidropiridina-2,6-dicarboxilato a partir de meso-2,6-diaminopimalato y cataliza la siguiente reacción.

Meso-2,6-diaminopimalato + H2O + NADP+ -> (S)-2,3,4,5-tetrahidropiridina-2,6-dicarboxilato + NH3 + NADPH + H+

La actividad enzimática de DDH puede medirse haciendo referencia al método de Misono, H. et al. (J. Biol. Chem., 255, 10599-10605, 1980).

Aunque las bacterias Escherichia no tienen ningún gen ddh que codifica para DDH, puede usarse un gen ddh de una bacteria corineforme tal como los de Corynebacterium glutamicum (SEQ ID NO: 9), Brevibacterium lactofermentum (SEQ ID NO: 11) y Corynebacterium efficiens (SEQ ID NO: 13).

El gen ddh de Corynebacterium glutamicum, ATCC 13032 (NCg12528), está registrado como Genbank NP_601818.2. GI:23308957, y el gen ddh de Corynebacterium efficiens (CE2498) está registrado como NP_739108.1. GI: 25029054.

Además de los de las bacterias corineformes, puede usarse el gen ddh de Herminiimonas arsenicoxydans (SEQ ID NO: 15) y el gen ddh de Bacteroides thetaiotaomicron (SEQ ID NO: 17). El gen ddh de Herminiimonas arsenicoxydans está registrado como Genbank YP_001100730.1 GI:134095655 y el gen ddh de Bacteroides thetaiotaomicron está registrado como NP_810892.1. GI:29347389.

Los genes mencionados anteriormente y los genes de la enzima de biosíntesis de L-lisina mencionados anteriormente no se limitan a genes que se corresponden exactamente con la información génica descrita anteriormente ni con genes que tienen secuencias conocidas, y pueden ser genes que tienen una mutación conservadora tal como homólogos de los mismos y genes modificados artificialmente, siempre que no se transmitan las funciones de las proteínas codificadas. Es decir, los genes pueden ser un gen que codifica para una secuencia de aminoácidos de una proteína conocida que incluye sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o similares de uno o varios residuos de aminoácidos en una o varias posiciones.

Aunque el número representado por el término “uno o varios” usado en el presente documento puede diferir dependiendo de las posiciones en la estructura tridimensional de la proteína o de los tipos de residuos de aminoácidos, específicamente, puede ser preferiblemente de 1 a 20, más preferiblemente de 1 a 10, todavía más preferiblemente de 1 a 5. La mutación conservadora es normalmente una sustitución conservadora. La sustitución conservadora es una sustitución en la que la sustitución tiene lugar mutuamente entre Phe, Trp y Tyr, si el sitio de sustitución es un aminoácido aromático; entre Leu, Ile y Val, si el sitio de sustitución es un aminoácido hidrófobo; entre Gln y Asn, si es un aminoácido polar; entre Lys, Arg y His, si es un aminoácido básico; entre Asp y Glu, si es un aminoácido ácido; y entre Ser y Thr, si es un aminoácido que tiene un grupo hidroxilo. Los ejemplos específicos de sustitución considerada sustitución conservadora incluyen: sustitución de Ser o Thr por Ala; sustitución de Gln, His o Lys por Arg; sustitución de Glu, Gln, Lys, His o Asp por Asn; sustitución de Asn, Glu o Gln por Asp; sustitución de Ser o Ala por Cys; sustitución de Asn, Glu, Lys, His, Asp o Arg por Gln; sustitución de Gly, Asn, Gln, Lys o Asp por Glu; sustitución de Pro por Gly; sustitución de Asn, Lys, Gln, Arg o Tyr por His; sustitución de Leu, Met, Val o Phe por Ile; sustitución de Ile, Met, Val o Phe por Leu; sustitución de Asn, Glu, Gln, His o Arg por Lys; sustitución de Ile, Leu, Val o Phe por Met; sustitución de Trp, Tyr, Met, Ile o Leu por Phe; sustitución de Thr o Ala por Ser; sustitución de Ser o Ala por Thr; sustitución de Phe o Tyr por Trp; sustitución de His, Phe o Trp por Tyr; y sustitución de Met, Ile o Leu por Val. La mutación para tal sustitución, deleción, inserción, adición, inversión o similares de residuos de aminoácidos tal como se describió anteriormente también incluye una mutación que se produce de manera natural basándose en la diferencia individual, la diferencia en especies de microorganismos de los que se derivan los genes (mutantes o variantes) etc. Un gen de este tipo puede obtenerse modificando una secuencia de nucleótidos de un gen conocido mediante, por ejemplo, mutagénesis específica de sitio, de modo que la sustitución, deleción, inserción o adición de un residuo o residuos de aminoácido se incluye en un sitio específico de la proteína codificada.

Además, un gen que tiene la mutación conservadora mencionada anteriormente puede ser un gen que codifica para una proteína que muestra una homología del 80% o más, preferiblemente del 90% o más, más preferiblemente del 95% o más, de manera particularmente preferible del 97% o más, con la secuencia entera de la proteína codificada y que tiene una función equivalente a la de una proteína de tipo natural correspondiente. En esta memoria descriptiva, el término “homología” puede usarse para referirse a “identidad”.

Además, pueden sustituirse codones de las secuencias génicas por los que usa fácilmente un huésped en el que se introducen los genes.

Los genes que tienen una mutación conservadora pueden ser los obtenidos mediante un método habitualmente usado para mutagénesis tal como tratamiento con un mutagén.

Además, los genes también pueden ser un ADN que puede hibridarse con una sonda que puede prepararse a partir de una secuencia génica conocida, por ejemplo, las secuencias génicas mencionadas anteriormente y secuencias complementarias a ellas, en condiciones rigurosas y que codifica para una proteína que tiene una función equivalente a la de un producto génico conocido correspondiente. Las “condiciones rigurosas” se refieren a condiciones en las que se forma un híbrido denominado específico y no se forma un híbrido no específico. Los ejemplos de las condiciones rigurosas incluyen, por ejemplo, condiciones en las que ADN que muestran alta homología entre sí, por ejemplo, ADN que muestran una homología de, por ejemplo, no menos del 80%, preferiblemente no menos del 90%, más preferiblemente no menos del 95%, de manera particularmente preferible no menos del 97%, se hibridan entre sí, y ADN que tienen una homología inferior al nivel anterior no se hibridan entre sí, y condiciones de lavado en hibridación de tipo Southern convencional, es decir, condiciones de lavado una vez, preferiblemente dos veces o tres veces, a concentraciones de sal y temperatura de 1 x SSC, SDS al 0,1% a 60ºC, preferiblemente 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 60ºC, más preferiblemente 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 68ºC.

Como sonda, también puede usarse una parte de secuencias complementarias de los genes. Una sonda de este tipo puede producirse mediante PCR usando oligonucleótidos preparados basándose en una secuencia génica conocida como cebadores y un fragmento de ADN que incluye la secuencia de nucleótidos del gen como molde. Cuando se usa un fragmento de ADN que tiene una longitud de aproximadamente 300 pb como sonda, las condiciones de lavado tras la hibridación en las condiciones mencionadas anteriormente pueden mostrarse a modo de ejemplo mediante 2 x SSC, SDS al 0,1% a 50ºC.

La expresión “que va a modificarse de modo que disminuya una actividad enzimática de la ruta de síntesis de meso-DAP” significa que va a modificarse de modo que se elimine completamente o disminuya la actividad de una enzima que pertenece a la ruta de síntesis de meso-DAP (también denominada en lo sucesivo “ruta DapDCEF”), específicamente, al menos una de las cuatro enzimas, DapD, DapC, DapE y DapF, en comparación con la de una cepa no modificada de Escherichia coli, por ejemplo, una cepa de tipo natural.

La enzima de la que se disminuye la actividad puede ser cualquiera de DapD, DapC, DapE y DapF, y puede consistir en dos o más clases de ellas. Resulta preferible disminuir una actividad de una enzima que funciona en la región anterior de la ruta DapDCEF, y es particularmente preferible realizar una modificación de modo que al menos disminuya la actividad DapD.

La disminución de una actividad enzimática de la ruta DapDCEF significa preferiblemente que, por ejemplo, cada actividad enzimática en la ruta DapDCEF disminuye hasta el 50% o menos, preferiblemente el 30% o menos, más preferiblemente el 10% o menos, por célula, en comparación con la de una cepa no modificada, por ejemplo, una cepa de tipo natural.

Los ejemplos de la cepa como objeto de la comparación incluyen Escherichia coli W3110 (ATCC 27325), Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) etc., derivadas de la cepa de tipo natural prototipo, cepa K12, como cepa de tipo natural.

Una modificación de este tipo en que disminuye una actividad enzimática en la ruta DapDCEF se logra específicamente delecionando una parte de o todo el gen de un cromosoma que codifica para una enzima de la ruta DapDCEF, específicamente, la región codificante del gen dapD, dapC, dapE o dapF, o modificando una secuencia de control de la expresión tal como la secuencia promotora y de Shine-Dalgarno (SD). Además, la expresión de un gen también puede disminuirse mediante la modificación de una región de no traducción distinta de la secuencia de control de la expresión. Además, puede delecionarse todo el gen que incluye las secuencias a ambos lados del gen en un cromosoma. Además, también puede lograrse mediante la introducción de una mutación para una sustitución de aminoácido (mutación de aminoácido), un codón de terminación (mutación sin sentido) o una mutación de cambio de marco que añade o deleciona uno o dos nucleótidos, dando lugar a una región codificante que codifica para una enzima en un cromosoma (Journal of Biological Chemistry, 272:8611-8617 (1997); Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95 5511-5515 (1998); Journal of Biological Chemistry, 266, 20833-20839 (1991)).

En la presente invención, es preferible disminuir una actividad enzimática intracelular delecionando una parte de o toda la secuencia reguladora de la expresión del gen en un cromosoma tal como una región promotora, o una parte

o toda la región codificante o una región no codificante, o insertando otras secuencias en una de esas secuencias usando recombinación homóloga. Sin embargo, la modificación puede ser una modificación producida por una mutagénesis habitual basada en irradiación con rayos X o ultravioleta o por el uso de un mutágeno tal como N-metilN’-nitro-N-nitrosoguanidina, siembre que la modificación disminuya una actividad enzimática de la ruta DapDCEF.

Modificación de una secuencia de control de la expresión se realiza preferiblemente para uno o más nucleótidos, más preferiblemente dos o más nucleótidos, de manera particularmente preferible tres o más nucleótidos. Cuando se realiza la deleción para una región codificante, la región que va a delecionarse puede ser una región N-terminal, una región interna o una región C-terminal, o incluso toda la región codificante, siempre que se disminuya o elimine la función de la proteína enzimática que va a producirse. La deleción de una región más larga puede inactivar habitualmente de manera más segura un gen. Además, se prefiere que los marcos de lectura que se ubican en el sentido de 5’ y en el sentido de 3’ de la región que va a delecionarse no sean iguales.

Cuando se inserta otra secuencia en una región codificante, la secuencia puede insertarse en cualquier región del gen, y la inserción de una secuencia más larga puede inactivar habitualmente de manera más segura el gen que codifica para una enzima. Se prefiere que los marcos de lectura que se ubican en el sentido de 5’ y en el sentido de 3’ del sitio de inserción no sean iguales. La otra secuencia no está limitada particularmente siempre que se escoja una secuencia que disminuya o elimine la función de la proteína enzimática, y los ejemplos incluyen, por ejemplo, un transposón que porta un gen de resistencia a antibióticos o un gen útil para la producción de L-lisina, etc.

Un gen en un cromosoma puede modificarse tal como se describió anteriormente, por ejemplo, preparando una versión de tipo deleción del gen en el que se deleciona una secuencia parcial del gen de modo que el gen de tipo deleción no produzca una proteína que no funciona normalmente, y transformando una bacteria con un ADN que contiene el gen de tipo deleción para producir recombinación homóloga entre el gen de tipo deleción y el gen nativo en el cromosoma, y de ese modo sustituir el gen de tipo deleción por el gen en el cromosoma. La proteína codificada por el gen de tipo deleción tiene una conformación diferente de la de la proteína enzimática de tipo natural, si acaso se produce, y por tanto la función está disminuida o eliminada. Ya se ha establecido una alteración génica de este tipo basada en la sustitución génica que utiliza recombinación homóloga y existe un método denominado integración conducida por Red (“Red-driven integration”) (Datsenko, K.A, y Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:66406645 (2000)), un método de uso de un ADN lineal tal como un método que utiliza la integración conducida por Red en combinación con un sistema de escisión derivado del fago (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., J. Bacteriol., 184: 5200-5203 (2002)), un método de uso de un plásmido que contiene un origen de replicación sensible a temperatura o un plásmido que puede realizar transferencia conjugativa, un método de utilización de un vector suicida que no tiene origen de replicación en un huésped (patente estadounidense n.º 6.303.383, patente japonesa abierta a consulta por el público n.º 05-007491), etc.

La disminución de la cantidad de expresión de un gen puede confirmarse comparando la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen con la de una cepa de tipo natural o no modificada. La cantidad de expresión puede confirmarse mediante hibridación de tipo Northern, RT-PCR (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA, 2001)), etc.

La disminución de la cantidad de una proteína codificada por un gen puede confirmarse mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA, 2001).

Con el fin de introducir un gen que codifica para DDH (ddh) en Escherichia coli, por ejemplo, puede transformarse Escherichia coli con un gen ddh mediante el uso de un vector tal como un plásmido y un fago. Los ejemplos de tales vectores incluyen pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218, etc. Aunque puede usarse un promotor inherente del gen ddh, siempre que el gen pueda expresarse en Escherichia coli con él, también puede usarse un promotor que funciona eficazmente en Escherichia coli. Los ejemplos de tales promotores incluyen promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor PR y promotor PL del fago , promotor tet, etc. El gen ddh también puede incorporarse en el cromosoma de Escherichia coli mediante un método que usa transducción, un transposón (Berg, D.E. y Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)), el fago Mu (patente japonesa abierta a consulta por el público n.º 2-109985) o recombinación homóloga (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)). Además, el número de copias del gen ddh puede aumentarse transfiriendo los genes ddh incorporados en el cromosoma.

La incorporación del gen ddh puede confirmarse mediante, por ejemplo, hibridación de tipo Southern. Además, puede confirmarse si Escherichia coli en la que se ha introducido el gen ddh tiene la actividad en DDH o no, por ejemplo, midiendo la actividad de DDH según el método descrito en Haruo Misono, Fermentation and Industry, 45, 964 (1987). Además, también puede detectarse DDH mediante inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo.

<2> Método para producir L-lisina

El método para producir L-lisina de la presente invención comprende hacer crecer en cultivo la bacteria de la presente invención en un medio para producir y acumular L-lisina en el medio o las células, y recoger L-lisina del medio o las células.

Como el medio que va a usarse, pueden usarse medios usados de manera convencional en la producción de L-lisina mediante fermentación usando microorganismos. Es decir, pueden usarse medios convencionales que contienen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, iones inorgánicos y opcionalmente otros componentes orgánicos según se requiera. Como fuente de carbono, pueden usarse sacáridos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, galactosa, fructosa e hidrolizado de almidón; alcoholes tales como glicerol y sorbitol; y ácidos orgánicos tales como ácido fumárico, ácido cítrico y ácido succínico. Como fuente de nitrógeno, pueden usarse sales de amonio inorgánicas tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio y fosfato de amonio, nitrógeno orgánico tal como hidrolizado de soja, gas amoniaco, amoniaco acuoso, etc. En cuanto a las fuentes de nutrientes traza orgánicas, es deseable que el medio contenga sustancias requeridas tales como vitamina B1 y L-homoserina, extracto de levadura

o similares en cantidades apropiadas. Además de los anteriores, se añaden fosfato de potasio, sulfato de magnesio, iones hierro, iones manganeso etc. en pequeñas cantidades, según se requiera. Además, el medio usado en la presente invención puede ser o bien un medio natural o bien un medio sintético, siempre que se use un medio que contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno e iones inorgánicos, y que contenga otros componentes traza orgánicos según se requiera.

En la presente invención, se usa glicerol de manera particularmente preferible como fuente de carbono. Aunque el glicerol puede ser glicerol como reactivo, es deseable usar glicerol producido industrialmente que contiene impurezas. Por ejemplo, es deseable usar glicerol producido industrialmente mediante la reacción de esterificación para la producción de combustible biodiésel (Mu Y, et al, Biotechnol Lett., 28, 1755-91759 (2006); Haas M.J., et al., Bioresour. Technol., 97, 4, 671-8678 (2006)).

El glicerol contenido en el medio usado en la presente invención puede ser una única fuente de carbono, o también puede usarse un medio mixto al que se añaden otras fuentes de carbono además de glicerol. Otras fuentes de carbono preferibles son sacáridos tales como glucosa, fructosa, sacarosa, lactosa, galactosa, melaza residual, hidrolizado de almidón, disolución de azúcar obtenida mediante hidrólisis de biomasa, alcoholes tales como etanol, y ácidos orgánicos tales como ácido fumárico, ácido cítrico y ácido succínico. Cuando se usa un medio mixto, es deseable que el glicerol esté contenido en el medio en una razón del 50% o más, preferiblemente del 60% o más, más preferiblemente del 70% o más, todavía más preferiblemente del 80% o más, de manera especialmente preferible del 90% o más, basado en la fuente de carbono total contenida en el medio.

El cultivo se realiza preferiblemente durante de 1 a 7 días en condiciones aerobias. La temperatura de cultivo es preferiblemente de 24 a 37ºC y el pH durante el cultivo es preferiblemente de entre 5 y 9. Para ajustar el pH, pueden usarse sustancias alcalinas o ácidas orgánicas o inorgánicas, gas amoniaco, etc. Para recoger la L-lisina del medio de fermentación, puede usarse una combinación de métodos conocidos, tal como mediante el uso de una resina de intercambio iónico y precipitación. Cuando se acumula la L-lisina en las células, pueden usarse ondas supersónicas, por ejemplo, o similares para alterar las células y puede recogerse la L-lisina mediante el uso de una resina de intercambio iónico o similar, del sobrenadante obtenido retirando las células de la suspensión con células alteradas mediante centrifugación.

La producción también puede realizarse mediante un método en el que se realiza la fermentación controlando que el pH del medio durante el cultivo sea de 6,5 a 9,0 y que el pH del medio al final del cultivo sea de 7,2 a 9,0 y controlando que la presión en el tanque de fermentación durante la fermentación sea positiva, o suministrando dióxido de carbono o un gas mixto que contiene dióxido de carbono al medio de modo que estén presentes iones bicarbonato y/o iones carbonato en el medio de cultivo en una cantidad de al menos 2 g/l durante el cultivo, y estos iones bicarbonato y/o iones carbonato sirven como contraiones de cationes que consisten principalmente en aminoácidos básicos, y entonces se recoge lisina (véase la patente japonesa abierta a consulta por el público n.º 2002-065287, solicitud de patente publicada estadounidense n.º 2002/025564).

Ejemplos

A continuación en el presente documento, la presente invención se explicará todavía más específicamente con referencia a los ejemplos.

Ejemplo 1: Construcción de la bacteria productora de L-lisina con alteración de dapD

<1-1> Construcción de la cepa con alteración del gen dapD

En primer lugar, se construyó una cepa con alteración de dapD usando la cepa de tipo natural Escherichia coli, la cepa MG1655.

Usando el plásmido pMW118 ( attL-Kmr- attR) (véase la publicación de patente internacional WO2006/093322) como molde y oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 19 y 20 que tienen secuencias correspondientes a ambos extremos de las secuencias de los sitios de unión del fago , attL y attR, en los extremos 3’ y secuencias correspondientes a partes del gen dapD como el gen diana en los extremos 5’ como cebadores, se realizó una PCR para construir la cepa MG1655 dapD::att-Km según el método -red descrito en la solicitud publicada de patente estadounidense n.º 2006/0160191 y en el documento WO2005/010175. Se obtuvo un recombinante resistente a Kmsegún el método -red haciendo crecer en cultivo la bacteria a 37ºC en un medio de L-agar que contiene Km (kanamicina, 50 mg/l) como cultivo en placa y seleccionando un recombinante resistente a Km.

<1-2> Transducción de la cepa WC196LC/pCABD2 de la bacteria productora de L-lisina con dapD::att-kan

descrito en la solicitud publicada de patente estadounidense n.º 2006/0160191 como huésped para construir la cepa WC196 cadA ldcChdapD::att-Km/pCABD2 según el método de transducción de P1. Se obtuvo la cepa WC196 cadA ldc a partir de la cepa WC196 de Escherichia coli mediante la alteración de genes de lisina descarboxilasa, cadA y ldc según el método usando el método de integración de conducido por Red (Datsenko K.A., Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645) y el sistema de escisión derivado del fago (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., J. Bacteriol., 184:5200-5203 (2002)) en combinación (véase el documento WO2005/010175). Una cepa obtenida introduciendo pCABD2 en esta cepa es la cepa WC196 cadA ldcC/pCABD2.

Se obtuvo la cepa transducida objetivo realizando un cultivo en placa a 37ºC en un medio de L-agar que contenía Km (kanamicina, 50 mg/l) y Sm (estreptomicina, 20 mg/l), y seleccionando una cepa recombinante resistente a Km y resistente a Sm.

Además, se hicieron crecer en cultivo cada una de estas cepas a 37ºC en un medio de L que contenía 20 mg/l de estreptomicina hasta que la DO600 final alcanzó aproximadamente 0,6, entonces se añadió el cultivo un volumen igual de disolución de glicerol al 40% y se agito la mezcla, se dividió en volúmenes apropiados y se almacenaron a 80ºC. Estas mezclas se denominarán disoluciones madre de glicerol.

Ejemplo 2: Evaluación de la capacidad de producción de L-lisina de bacterias productoras de L-lisina con alteración de dapD Se descongelaron las disoluciones madre de glicerol de las cepas obtenidas en el ejemplo 1 y se aplicaron uniformemente a una L-placa que contenía 20 mg/l de estreptomicina en un volumen de 100 l cada una y se realizó el cultivo a 37ºC durante 24 horas. Se suspendieron las células en una cantidad de aproximadamente 1/8 de las células obtenidas en una placa en 0,5 ml de solución salina fisiológica y se midió la turbidez de la suspensión a 600 nm usando un espectrofotómetro (U-2000, Hitachi). Se inoculó la suspensión que contenía las células obtenidas en 20 ml de un medio de fermentación (medio MS, la composición se muestra más adelante) que contenía 20 mg/l de estreptomicina en un matraz Sakaguchi de 500 ml en un volumen tal que la turbidez de la mezcla llegó a ser de 0,15 a 600 nm, y se realizó el cultivo a 37ºC y 114 rpm durante 24 horas en una máquina de cultivo con agitación a vaivén. Tras el cultivo, se midieron las cantidades de L-lisina acumulada y la glucosa que quedaba en el medio usando en analizador Biotec AS210 (SAKURA SEIKI). También se midió el glicerol acumulado en el medio usando el analizador Biotec BF-5 (Oji Scientific Instruments).

Composición del medio de fermentación, g/l

Glicerol o glucosa 40

(NH4)2SO4 24

KH2PO4 11,0

MgSO4 • 7H2O 1,0

FeSO4 • 7H2O 0,01

MnSO4 • 5H2O 0,01

Extracto de levadura 2,0

Se ajustó el medio a pH 7,0 con KOH, se sometió a la autoclave a 115ºC durante 10 minutos (siempre que el glicerol

o la glucosa y MgSO4•7H2O se esterilizaran por separado) y luego se añadieron 30 g/l de CaCO3 (Farmacopea Japonesa) (se sometió a esterilización con aire caliente a 180ºC durante 2 horas). Se añadió estreptomicina en una cantidad de 20 mg/l.

Los resultados se muestran en la tabla 1 (DO significa la cantidad de células indicada en lo que se refiere a la absorbancia a 660 nm medida para el cultivo diluido 26 veces, Lys (g/l) significa la cantidad de L-lisina acumulada en el matraz, glucosa (g/l) y glicerol (g/l) significan las cantidades de glucosa y glicerol que quedan en el medio, respectivamente, y rendimiento (%) significa el rendimiento de L-lisina basándose en el sustrato). Tal como se observa a partir de los resultados mostrados en la tabla 1, la cepa WC196 cadA ldcC dapD::att-Km/pCABD2 acumuló L-lisina en una cantidad mayor en comparación con la obtenida con la cepa WC196 cadA ldcC/pCABD2 en la que el gen dapD no estaba alterado.

Tabla 1

Medio de glucosa MS Medio de glicerol MS

Cepa: D.O. (x26) Lys (g/l) Glucosa (g/l) Rendimiento (%)

Cepa WC196 cadA ldcC/pCABD2: 0,361 8,28 18,67 38,82

Cepa WC196 cadA ldcCAdapD::att-Km/pCABD2: 0,377 8,75 18,13 40,01

Cepa: D.O. (x26) Lys (g/l) Glicerol (g/l) Rendimiento (%)

Cepa WC196 cadA ldcC/pCABD2: 0,248 2,79 28,64 24,57

Cepa WC196 cadA ldcC dapD::att-Km/pCABD2: 0,320 5,10 23,69 31,12

Explicación de la lista de secuencias SEQ ID NO: 1: Secuencia de nucleótidos de dapD de E. coli SEQ ID NO: 2: Secuencia de aminoácidos de DapD de E. coli SEQ ID NO: 3: Secuencia de nucleótidos de dapC de E. coli SEQ ID NO: 4: Secuencia de aminoácidos de DapC de E. coli SEQ ID NO: 5: Secuencia de nucleótidos de dapE de E. coli SEQ ID NO: 6: Secuencia de aminoácidos de DapE de E. coli SEQ ID NO: 7: Secuencia de nucleótidos de dapF de E. coli SEQ ID NO: 8: Secuencia de aminoácidos de DapF de E. coli SEQ ID NO: 9: Secuencia de nucleótidos del gen ddh de C. glutamicum SEQ ID NO: 10: Secuencia de aminoácidos de DDH de C. glutamicum SEQ ID NO: 11: Secuencia de nucleótidos de gen ddh de B. lactofermentum SEQ ID NO: 12: Secuencia de aminoácidos de DDH de B. lactofermentum SEQ ID NO: 13: Secuencia de nucleótidos de gen ddh de C. efficiens SEQ ID NO: 14: Secuencia de aminoácidos de DDH de C. efficiens SEQ ID NO: 15: Secuencia de nucleótidos de gen ddh de H. arsenicoxydans SEQ ID NO: 16: Secuencia de aminoácidos de DDH de H. arsenicoxydans SEQ ID NO: 17: Secuencia de nucleótidos de gen ddh de B. thetaiotaomicron SEQ ID NO: 18: Secuencia de aminoácidos de DDH de B. thetaiotaomicron SEQ ID NO 19: Cebador para la deleción del gen dapD SEQ ID NO: 20: Cebador para la deleción del gen dapD SEQ ID NO: 21: Secuencia de nucleótidos de lysC de E. coli SEQ ID NO: 22: Secuencia de aminoácidos de LysC de E. coli SEQ 10 NO: 23: Secuencia de nucleótidos de dapA de E. coli SEQ ID NO: 24: Secuencia de aminoácidos de DapA de E. coli SEQ ID NO: 25: Secuencia de nucleótidos de dapB de E. coli SEQ ID NO: 26: Secuencia de aminoácidos de DapB de E. coli Aplicabilidad industrial

Según la presente invención, en la producción de L-lisina mediante fermentación usando Escherichia coli, puede mejorarse la cantidad de producción y/o el rendimiento de fermentación de L-lisina. Además, la presente invención puede usarse para obtener una bacteria productora de L-lisina de Escherichia coli.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Ajinomoto Co., Inc.

<120> Método para producir L-lisina

<130> C919-C8129

<150> JP2007-190795

<151> 2007-07-23

<160> 26

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 825

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(825)

<400> 1

5: <210> 2 <211> 274 <212> PRT <213> Escherichia coli

10: <400> 2

15

<210> 3

<211> 1221 5 <212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1221)

<400> 3

<210> 4

<211> 406

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 4

<210> 5

<211> 1128 5 <212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1128)

<400> 5

5: <210> 6 <211> 375 <212> PRT <213> Escherichia coli

<400> 6

10

20

<210> 7

<211> 825 5 <212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(825)

<400> 7

<210> 8

<211> 274

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 8

<210> 9

<211> 963 5 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(963)

<400> 9

<210> 10

<211> 320

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 10

<210> 11

<211> 963 5 <212> ADN

<213> Brevibacterium lactofermentum

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(963)

<400> 11

<210> 12

<211> 320

<212> PRT

<213> Brevibacterium lactofermentum

<400> 12

<210> 13

<211> 963 5 <212> ADN

<213> Corynebacterium efficiens

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(963)

<400> 13

<210> 14

<211> 320

<212> PRT

<213> Corynebacterium efficiens

<400> 14

<210> 15

<211> 987 5 <212> ADN

<213> Herminiimonas arsenicoxydans

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(987)

<400> 15

<210> 16

<211> 328

<212> PRT

<213> Herminiimonas arsenicoxydans

<400> 16

<210> 17

<211> 900 5 <212> ADN

<213> Bacteroides thetaiotaomicron

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(900)

<400> 17

<210> 18

<211> 299

<212> PRT

<213> Bacteroides thetaiotaomicron

<400> 18

<210> 19

<211> 69

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 19

<210> 20

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 20

<210> 21

<211> 1350

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1350)

<400> 21

<210> 22

<211> 449

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 22

<210> 23

<211> 879 5 <212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(879)

<400> 23

<210> 24

<211> 292

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 24

<210> 25

<211> 822 5 <212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(822)

<400> 25

<210> 26

<211> 273

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 26

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para producir L-lisina, que comprende hacer crecer en cultivo en un medio una Escherichia coli que tiene capacidad productora de L-lisina y recoger L-lisina del medio,

en el que la Escherichia coli se ha modificado para disminuir la actividad o actividades de una o más clases de enzimas de la ruta de síntesis del ácido meso-, -diaminopimélico, y

en el que se ha introducido un gen que codifica para diaminopimelato deshidrogenasa en la Escherichia coli.
2.

Método según la reivindicación 1, en el que las enzimas de la ruta de síntesis del ácido mesodiaminopimélico se seleccionan de 2,3,4,5-tetrahidropiridina-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferasa, succinildiaminopimelato transaminasa, succinildiaminopimelato desuccinilasa y diaminopimelato epimerasa.
3.

Método según la reivindicación 2, en el que la 2,3,4,5-tetrahidropiridina-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferasa, succinildiaminopimelato transaminasa, succinildiaminopimelato desuccinilasa y diaminopimelato epimerasa se codifican por el gen dapD, gen dapC, gen dapE y gen dapF, respectivamente.
4. Método según la reivindicación 3, en el que las actividades de las enzimas de la ruta de síntesis del ácido meso

, -diaminopimélico se disminuyen mediante la disminución de la expresión de los genes o mediante la alteración de los genes.
5.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la Escherichia coli se ha modificado para disminuir al menos la actividad de 2,3,4,5-tetrahidropiridina-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferasa.
6.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el gen que codifica para diaminopimelato deshidrogenasa es el gen ddh de una bacteria corineforme.
7.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que la 2,3,4,5-tetrahidropiridina-2,6dicarboxilato N-succiniltransferasa es una proteína definida en (A) o (B) siguientes:

(A)

una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,

(B)

una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos y que tiene la actividad de 2,3,4,5tetrahidropiridina-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferasa.
8.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que la succinildiaminopimelato transaminasa es una proteína definida en (C) o (D) siguientes:

(C)

una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4,

(D)

una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos y que tiene la actividad de succinildiaminopimelato transaminasa.
9.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que la succinildiaminopimelato desuccinilasa es una proteína definida en (E) o (F) siguientes:

(E)

una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6,

(F)

una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos y que tiene la actividad de succinildiaminopimelato desuccinilasa.
10.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que la diaminopimelato epimerasa es una proteína definida en (G) o (H) siguientes:

(G)

una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8,

(H)

una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos y que tiene la actividad de diaminopimelato epimerasa.
11.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en el que el gen dapD es un ADN definido en (a) o

(b)

siguientes:

(a)

un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o

(b)

un ADN que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que codifica para una proteína que tiene la actividad de 2,3,4,5-tetrahidropiridina-2,6-dicarboxilato N-succiniltransferasa.
12.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en el que el gen dapC es un ADN definido en (c) o

(d)

siguientes:

(c)

un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, o

(d)

un ADN que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que codifica para una proteína que tiene la actividad de succinildiaminopimelato transaminasa.
13.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12, en el que el gen dapE es un ADN definido en (e) o

(f)

siguientes:

(e)

un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, o

(f)

un ADN que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que codifica para una proteína que tiene la actividad de succinildiaminopimelato desuccinilasa.
14.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 13, en el que el gen dapF es un ADN definido en (g) o

(h)

siguientes:

(g)

un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, o

(h)

un ADN que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que codifica para una proteína que tiene la actividad de diaminopimelato epimerasa.
15.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la diaminopimelato deshidrogenasa es una proteína definida en (I) o (J) siguientes:

(I)

una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16 ó 18,

(J)

una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16 ó 18 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos y que tiene la actividad de diaminopimelato deshidrogenasa.
16.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, en el que el gen ddh es un ADN definido en (i) o (j) siguientes:

(i)

un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 ó 17, o

(j)

un ADN que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 ó 17 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que codifica para una proteína que tiene la actividad de diaminopimelato deshidrogenasa.
17.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la Escherichia coli tiene además una dihidrodipicolinato sintasa que está desensibilizada para la retroinhibición por L-lisina y una aspartocinasa que está desensibilizada para la retroinhibición por L-lisina y tiene actividad potenciada de dihidrodipicolinato reductasa.