KR101208480B1

KR101208480B1 - 말산 효소 활성이 감쇠된 에스케리키아 세균을 사용하는ｌ-라이신 또는 ｌ-트레오닌의 생산방법

Info

Publication number: KR101208480B1
Application number: KR1020057024543A
Authority: KR
Inventors: 디엔 스티븐 반; 신타로 이와타니; 요시히로 우스다; 가즈히코 마쓰이; 유타 나카이; 도모코 스즈키; 미카 모리야; 유치로 쓰지; 다쿠지 우에다
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 2003-07-29
Filing date: 2005-12-21
Publication date: 2012-12-05
Also published as: BRPI0413007A; RU2337140C2; WO2005010175A1; BRPI0413007B1; KR20060026436A; KR101073370B1; CN100577799C; BRPI0413030A; EP1649403A2; US20060154289A1; CN1829792A; EP1651758B1; RU2006101328A; JP2005058227A; WO2005010794A2; DK1651758T3; EP1651758A1; PL1651758T3; ATE397059T1; ZA200510144B

Abstract

본원에서는 L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 능력을 갖고 말산 효소가 세포내에서 정상적으로 작용하지 않도록 변형된 에스케리키아 속에 속하는 세균, 및 당해 세균을 배지에서 배양하여 L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하여 이를 축적시키고, 상기 배지로부터 L-라이신 또는 L-트레오닌을 수거함을 포함하는, L-라이신 또는 L-트레오닌의 생산 방법이 기술된다.

L-라이신, L-트레오닌, 말산 효소, 에스케리키아 콜라이, 하이브리드화, PCR, 재조합, 대사 흐름 분포

Description

말산 효소 활성이 감쇠된 에스케리키아 세균을 사용하는 Ｌ-라이신 또는 Ｌ-트레오닌의 생산방법{Method for producing L-lysine or L-threonine using Escherichia bacteria having attenuated malic enzyme activity}

본 발명은 에스케리키아(Escherichia) 세균을 사용하여 L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다. L-라이신 또는 L-트레오닌은 필수 아미노산으로 알려져 있으며, 약제학적 조성물과 동물 사료에 대한 첨가제와 같은 다양한 영양 혼합물의 성분으로 유용하다.

L-트레오닌 및 L-라이신과 같은 L-아미노산은 L-아미노산을 생산할 수 있는 능력을 가진 코리네형 세균 또는 에스케리키아 세균과 같은 L-아미노산 생산 세균을 사용하여 발효시킴으로써 공업적으로 생산된다. 생산성을 개선시키기 위해, 천연으로부터 분리된 균주, 이의 인공 돌연변이체 또는 유전자 재조합에 의해 L-아미노산 생합성 효소 활성을 증가시킨 재조합체를 L-아미노산 생산 세균으로 사용하여왔다. L-라이신 생산 방법은 특허 문헌 1 내지 4에 예시되어 있다. L-트레오닌 생산 방법은 특허 문헌 5 내지 8에 예시되어 있다.

L-트레오닌 및 L-라이신과 같은 아미노산을 생산하는 능력을 증가시키는 방법에는 호흡사슬 경로를 변형시킴으로써 에너지 효율을 증가시키는 방법(특허 문헌 13) 및 니코틴아미드 뉴클레오타이드 전이탈수소효소를 증폭시켜 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드 포스페이트를 생산하는 능력을 증가시키는 방법(특허 문헌 9)과 내인성 생합성 경로의 효소의 발현량을 증가시키는 방법이 포함된다.

추가로, 아미노산 생합성 시스템의 일반적인 경로를 변형시키는 방법이 공지되어 있으며 이는 피루베이트 카복실라제 활성이 증가된 L-라이신-생산 코리네형 세균(특허 문헌 10), 피루베이트 키나아제가 결핍된 L-라이신-생산 에스케리키아 세균(특허 문헌 11), 및 말레이트 퀴닌 산화환원효소가 결핍된 L-라이신-생산 코리네형 세균(특허 문헌 12)과 같은 L-아미노산 생산 세균의 보충대사 경로를 변형시키는 과정을 포함한다.

말산 효소는 보충대사 경로 효소 중의 하나이다. 에스케리키아 세균에서, sfcA 및 b2463 유전자 각각은 말산 효소를 암호화하는 것으로 공지되어 있다(비특허 문헌 9). 그러나, sfcA 및 b2463 유전자에 의해 암호화된 말산 효소의 활성의 감소가 L-라이신 또는 L-트레오닌 생산을 증강시키는데 효과적인가의 여부는 보고된 바 없다.

흐름 균형 분석으로도 지칭되는 대사 흐름 분석은 세포내 생화학 반응 및 선형 최적화의 화학양론적 모델을 구축함으로써 세포내 대사 흐름 분포를 예측하는 기법이다. 당해 기법은 미생물 내에서의 생화학 반응 시스템의 능력을 조사하거나 상이한 외부 조건하에서 세포내 대사 흐름 분포를 예측하는 데 사용되어 왔다(비특 허 문헌 1 내지 3). 또한 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에 대한 화학양론적 모델이 작제되었다고 보고되어 있다(비특허 문헌 제4호 및 제5호). 또한 아미노산 생산에 사용되는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 라이신 생산에 대한 대사 조작에서 이러한 화학양론적 모델을 사용하는 예가 공지되어 있다(비특허 문헌 6). 추가로, 대사 흐름 분석 및 이의 적용에 대한 수많은 이론적 또는 실험적 방법이 보고되어 있다(비특허 문헌 7, 8, 특허 문헌 14 내지 16). 특허 문헌 14에는 화학양론적 모델을 기반으로 하여 성장에 필요한 유전자를 예측하는 방법이 개시되어 있다. 특허 문헌 15에는 세포에 최적의 기능을 부여할 수 있도록 세포를 유전적으로 및 진화적으로 변화시키는 기법이 개시되어 있다. 추가로, 특허 문헌 16에는 화학양론적 모델에 대한 상이한 조건 하에서의 정성적 동역학 정보의 한계, 정성적 제어 정보의 한계 및 DNA 마이크로어레이(microarray) 실험 데이터에 근거한 한계를 적용시키는 방법이 개시되어 있다. 이들 모두가 보다 바람직한 세포내 대사 흐름 분포를 예측하는 방법이지만, 세포 물질 생산을 직접적으로 향상시키는 표적으로서의 특정한 흐름을 이론적으로 예측하는 어떠한 방법도 개시되어 있지 않다.

<특허 문헌 1>

일본 공개특허공보 제10-165180호

<특허 문헌 2>

일본 공개특허공보 제11-192088호

<특허 문헌 3>

일본 공개특허공보 제2000-253879호

<특허 문헌 4>

일본 공개특허공보 제2001-57896호

<특허 문헌 5>

일본 공개특허공보 제5-304969호

<특허 문헌 6>

국제특허공보 제WO 98/04715호

<특허 문헌 7>

일본 공개특허공보 제5-227977호

<특허 문헌 8>

미국 특허 공보 제2002/0110876호

<특허 문헌 9>

일본 특허 제2817400호

<특허 문헌 10>

일본 공개특허공보 제2002-508921호

<특허 문헌 11>

국제특허공보 제WO 03/008600호

<특허 문헌 12>

미국 특허 공보 제2003/0044943호

<특허 문헌 13>

일본 공개특허공보 제2002-17363호

<특허 문헌 14>

국제특허공보 제WO 00/46405호

<특허 문헌 15>

국제특허공보 제WO 02/061115호

<특허 문헌 16>

국제특허공보 제WO 02/055995호

<비특허 문헌 1>

Varma, A. and Palsson, B.O. Appl. Environ. Microbiol. 60:3724-3731, 1994

<비특허 문헌 2>

Schilling, C.H. et al., Biotechnol. Prog., 15:288-295, 1999

<비특허 문헌 3>

Schilling, C.H. et al., Biotechnol. Prog., 15:296-303, 1999

<비특허 문헌 4>

Pramanik, J. and Keasling, J.D., Biotechnol. Bioeng., 56:398-421, 1997

<비특허 문헌 5>

Ibarra, R.U. et al., Nature, 420:186-189, 2002

<비특허 문헌 6>

Vallino, J.J. and Stephanopoulos, G., Biotechnol. Bioeng., 41:633-646, 1993

<비특허 문헌 7>

Wiechert, W., Journal of Biotechnology, 94:37-63, 2002

<비특허 문헌 8>

Wiechert, W., Metabolic Engineering, 3:195-205, 2001

<비특허 문헌 9>

van der Rest, M.E., Frank C., Molenaar, D.J., J. Bacteriol., 182(24):6892-6899, 2000

본 발명은 L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 능력이 개선된 에스케리키아 세균 및 당해 세균을 사용하여 L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 발명자들은 본 문제를 해결하기 위해 예의 연구하였으며 그 결과로서, 물질 생산에 영향을 미치는 대사 흐름의 생산이 (1) 목적하는 제조된 물질을 통한 기질의 생화학적 반응식에 기초하여 계산된 화학양론적 행렬의 자유도와 동일한 수의 자유 흐름을 선택하고, (2) 화학양론적 행렬을 기초로 한 통계 분석에 충분한 수의 자유 흐름의 무작위적 조합으로부터 대사 흐름 분포를 계산하고, (3) 통계 분석을 기초로 하여 계산된 대사 흐름 분포로부터 물질 제조와 상관관계가 있는 최소한의 자유 흐름을 포함하는 회귀방정식을 도출함으로써 결정될 수 있음을 발견하였다.

당해 방법에 의한 L-라이신 또는 L-트레오닌-생산 세균의 대사 흐름의 결정은 말산 효소가 정상적으로 작용하지 못하도록 한 변형이 당해 세균의 생산성을 증가시키는데 효과적임을 나타내었다. 본 발명은 전술한 발견을 기초로 하여 완성되었으며 다음을 제공한다:

(1) 말산 효소가 세포 내에서 정상적으로 작용하지 않도록 변형된, L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 능력을 갖는 에스케리키아(Escherichia) 세균,

(2) (1)에 있어서, 당해 세균의 염색체 상의 말산 효소를 암호화하는 유전자가 돌연변이되고/되거나 이의 발현 제어 서열이 돌연변이되어 말산 효소가 세포 내에서 정상적으로 작용하지 않는 에스케리키아 세균,

(3) (1)에 있어서, 당해 세균의 염색체 상의 말산 효소를 암호화하는 유전자의 파괴에 의해 당해 말산 효소가 정상적으로 작용하지 않는 에스케리키아 세균,

(4) (1)에 있어서, 말산 효소를 암호화하는 유전자가 sfcA를 포함하는 에스케리키아 세균,

(5) (1)에 있어서, 말산 효소를 암호화하는 유전자가 b2463을 포함하는 에스케리키아 세균,

(6) (1)에 있어서, 말산 효소가 (A) 서열번호 6에 나타내어진 아미노산 서열을 갖는 단백질, 및 (B) 서열번호 6에 나타내어진 아미노산 서열내 하나 또는 수개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 갖고 말산 효소 활성을 갖는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 에스케리키아 세균,

(7) (1)에 있어서, 말산 효소가 (C) 서열번호 8에 나타내어진 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 (D) 서열번호 8에 나타내어진 아미노산 서열내 하나 또는 수개 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 갖고 말산 효소 활성을 갖는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 에스케리키아 세균,

(8) (1)에 있어서, 말산 효소를 암호화하는 유전자가 (a) 서열번호 5에 나타내어진 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 및 (b) 서열번호 5에 나타내어진 뉴클레오타이드 서열 또는 당해 뉴클레오타이드 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에 하이브리드화되고 말산 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 DNA인 에스케리키아 세균,

(9) (1)에 있어서, 말산 효소를 암호화하는 유전자가 (c) 서열번호 7에 나타내어진 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 및 (d) 서열번호 7에 나타내어진 뉴클레오타이드 서열 또는 당해 뉴클레오타이드 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에 하이브리드화되고 말산 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 DNA인 에스케리키아 세균,

(10) (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 세균을 배지에서 배양하여 L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산 및 분비시키고, 상기 배지로부터 L-라이신 또는 L-트레오닌을 수거함을 포함하는, L-라이신 또는 L-트레오닌의 생산 방법.

도 1은 5000개의 무작위 흐름 분포의 데이타 세트를 사용하여 자유 흐름의 상이한 수치의 함수로서 라이신 생산을 나타낸 플롯이다. 라이신 수율이 (1) 이소시트레이트 리아제 흐름, (b) 말산 효소 흐름 및 (c) PEP 카복실라제 흐름에 대해 나타내어져 있다.

도 2는 5000개의 무작위 흐름 분포의 데이타 세트에 대한 제2 방정식의 함수값으로서 라이신 생산을 나타내는 플롯이다. 입력값은 시간당 10mmol 글루코스 흐름을 기준으로 한 mmol/시간 단위의 흐름이다.

도 3은 pMW118-attL-Tc-attR 및 pMW118-attL-Cm-attR의 구조를 나타낸다.

도 4는 pMW-intxis-ts의 구조를 나타낸다.

본 발명의 실시를 위한 최상의 방식

이후로, 본 발명을 상세히 설명할 것이다.

<1> 본 발명의 에스케리키아 세균

본 발명의 에스케리키아 세균은 L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 능력을 가지며 말산 효소가 정상적으로 작용하지 못하도록 변형시킨 에스케리키아 속에 속하는 세균이다. 본 발명의 에스케리키아 세균은 L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산할 수 있는 능력을 가질 수 있거나, L-라이신 및 L-트레오닌 둘 다를 생산할 수 있는 능력을 가질 수 있다.

본 발명의 에스케리키아 세균을 수득하는데 사용된 에스케리키아 속에 속하 는 모 균주는 니드하르트(Neidhardt) 등에 의해 저술된 문헌에 기술된 균주에 포함되기는 하지만, 이에 제한되지는 않는다[참조: Neidhardt, F. C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1029, 표 1]. 예를 들면, 당해 모 균주는 에스케리키아 콜라이일 수 있다. 에스케리키아 콜라이는 에스케리키아 콜라이 W3110(ATCC 27325) 또는 에스케리키아 콜라이 MG1655(ATCC 47076)일 수 있으며, 둘 다 원형 야생 균주 K12로부터 유래한 것이다.

이들 균주는 예를 들면, 기관[American Type Culture Collection (주소: 미국 매릴랜드주 20852 록빌 파크런 드라이브 12301)]으로부터 입수할 수 있다. 등록 번호가 각각의 균주에 할당되어 있다. 이의 등록 번호로 목적하는 균주를 요청할 수 있다. 균주에 상응하는 등록 번호는 기관[American Type Culture Collection]의 일람표에 기재되어 있다.

<1>-1. L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 능력의 부여

에스케리키아 세균에 L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 능력을 부여하는 방법이 아래에 기술되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은 구 "L-라이신을 생산하는 능력"은 당해 세균을 배지에서 배양하는 경우 L-라이신을 생산하고 축적하거나, 배지로 L-라이신을 분비할 수 있는, 즉 세포외 L-라이신을 유리시킬 수 있는 능력을 의미한다. 특히, 구 "L-라이신을 생산하는 능력"은 야생형 또는 모 균주와 비교하여 보다 많은 L-라이신을 축적할 수 있는 능력을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 "L-트레오닌을 생산하는 능력"은 L-트레오닌을 생 산하고 축적하거나 당해 세균을 배지에서 배양하는 경우, 배지로 L-트레오닌, 즉, 유리된 세포외 L-트레오닌을 분비할 수 있는 능력을 의미한다. 특히, 당해 구는 야생형 또는 모 균주와 비교하여 보다 많은 L-트레오닌을 축적할 수 있는 능력을 의미한다.

L-라이신 또는 L-트레오닌-생산 능력을 부여하기 위해, 영양요구성 돌연변이주, 유사체에 내성을 갖는 균주 또는 L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 능력을 갖는 대사 제어 돌연변이주를 수득하는 방법 및 L-라이신 또는 L-트레오닌 생합성 효소 활성을 증가시킨 재조합 균주를 생산하는 방법과 같은, 에스케리키아 세균 및 코리네형 세균을 생육하는 통상적인 방법을 사용할 수 있다. L-라이신 또는 L-트레오닌-생산 세균의 생육시, 영양요구성, 유사체 내성 및 대사 제어 돌연변이와 같은 특성을 단독으로 또는 조합하여 부여할 수 있다.

증가시킨 L-라이신 또는 L-트레오닌 생합성 효소 활성은 단독이거나 조합적일 수 있다. 추가로, 영양요구성, 유사체 내성 및 대사 제어 돌연변이와 같은 특성을 부여하면서 L-라이신 및/또는 L-트레오닌 생합성 효소 활성을 함께 증가시킬 수도 있다.

L-라이신 또는 L-트레오닌 생합성 효소 활성을 증가시킴으로써 L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 능력을 부여 또는 증가시키는 방법의 예가 아래에 기술되어 있다. 당해 효소 활성의 증가는 예를 들면, 당해 효소를 암호화하는 유전자에 돌연변이를 유도하거나 당해 유전자를 증폭시켜 효소의 세포내 활성을 증가시킴으로써 수행될 수 있다. 이들은 유전자 재조합에 의해 수행될 수 있다.

L-트레오닌 생합성 효소를 암호화하는 유전자는 아스파르토키나제 III 유전자(lysC), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소효소 유전자(asd), thr 오페론에 의해 암호화된 아스파르토키나제 I(thrA), 호모세린 키나제 유전자(thrB), 및 트레오닌 신타제 유전자(thrC)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 유전자의 약어는 괄호 안에 표시되어 있다. 이들 유전자 중 2개 이상을 도입할 수 있다. L-트레오닌 생합성 효소 유전자를 트레오닌 분해가 억제된 에스케리키아 세균으로 도입할 수 있다. 트레오닌 분해가 억제된 에스케리키아 세균은 트레오닌 탈수소효소 활성이 결핍된 균주 TDH6로 예시되어 있다[참조: 일본 공개특허공보 제2001-346578호].

L-라이신 생합성 효소를 암호화하는 유전자는 디하이드로다이피콜리네이트 신타제 유전자(dapA), 아스파르토키나제 유전자(lysC), 디하이드로다이피콜리네이트 환원효소 유전자(dapB), 디아미노피멜레이트 탈탄산효소 유전자(lysA), 디아미노피멜레이트 탈수소효소 유전자(ddh)(전술한 유전자 모두; 국제특허공보 제96/40934호), 포스포에놀피루브산 카복실라제 유전자(ppc)(일본 공개특허공보 제60-87788호), 아스파르테이트 아미노전이효소 유전자(aspC)(일본 특허공보 제6-102028호), 디아미노피멜레이트 에피머라제 유전자(dapF)(일본 공개특허공보 제2003-135066호), 및 아스파르트산 세미알데하이드 탈수소효소 유전자(asd)(국제특허공보 제00/61723호)와 같은 디아미노피멜레이트 경로 효소 및 호모아코니트산 수산화효소 유전자(일본 공개특허공보 제2000-157276호)와 같은 아미노아디페이트 경로 효소를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

추가로, 본 발명의 세균은 L-라이신의 생합성 경로로부터 분기됨으로써 L-라이신 외의 다른 화합믈을 생성시키는 반응을 촉매하는 효소의 활성을 감소시킬 수 있거나 이러한 효소가 결핍되어 있을 수 있다. L-라이신의 생합성 경로로부터 분기됨으로써 L-라이신 외의 다른 화합물을 생성시키는 반응을 촉매하는 효소에는 호모세린 탈수소효소 및 라이신 탈탄산효소가 포함된다. 효소 활성이 감소된 균주는 국제특허공보 제WO 95/23864호 및 제WO 96/178930호에 기술되어 있다.

L-라이신 또는 L-트레오닌 생합성 유전자를 예를 들면, 에스케리키아 세균 내에서 자율적으로 복제가능한 플라스미드로 증폭시킴으로써 당해 유전자에 의해 암호화된 유전자의 활성을 증가시킬 수 있다. 생합성 유전자를 당해 세균의 염색체 내로 삽입시킬 수 있다. 또한 당해 유전자에 의해 암호화된 효소의 활성을 증가시키는 돌연변이를 포함하는 유전자를 도입함으로써 성취할 수도 있다. 이러한 돌연변이의 예에는 당해 유전자의 전사량을 증가시키는 프로모터 서열의 돌연변이 및 당해 효소 단백질의 특이적 활성을 증가시키는, 당해 유전자의 암호화 영역 내의 돌연변이가 포함된다.

상기한 바와 같은 유전자 증폭 외에, 염색체 DNA 또는 플라스미드 상의 유전자의 프로모터와 같은 발현 제어 서열을 보다 강력한 발현 제어 서열로 대체시킴으로써 유전자 발현을 증폭시킬 수 있다(국제특허공보 제WO 00/18935호). 강력한 프로모터가 공지되어 있으며, 예를 들면, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터 및 람다 파지의 P_R 프로모터가 포함된다. 염색체 또는 플라스미드 상의 내인성 프로모터를 보다 강한 프로모터로 대체시키거나 내인성 프로모터를 변형시킴으로써 당해 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 발현 제어 서열을 변형시킴과 함께 당해 유전자의 복사체 수를 증가시킬 수 있다.

본 발명에 사용될 수 있는, L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 능력이 부여된 에스케리키아 세균이 아래에 제시한다. 그러나, 본 발명의 세균은 이들 예에만 제한되는 것이 아니며, L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 능력을 갖는 어떠한 세균도 포함된다.

L-라이신 생산 능력을 갖는, 유사체에 내성을 갖는 균주 또는 대사 제어 돌연변이주의 구체적 예에는 에스케리키아 콜라이 AJ11442(FERM BP-1543, NRRL B-12185; 일본 공개특허공보 제56-18596호 및 미극 특허 제4,346,170호) 및 에스케리키아 콜라이 VL611이 포함된다. 균주 WC196은 에스케리키아 콜라이의 L-라이신 생산 세균으로서 사용될 수 있다(국제특허공보 제WO96/17930호). WC196 균주는 에스케리키아 콜라이 K-12로부터 유래한 균주 W3110에 AEC (S-(2-아미노에틸)시스테인) 내성을 부여함으로써 생육되었다. 당해 균주는 에스케리키아 콜라이 AJ13069로 명명되었으며, 기관[National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (최근의 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 국제 특허 생물 기탁부, 일본 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-초메, 1반 1고, 츠쿠바 센트럴 6, 우편번호: 305-8566)]에 1994년 12월 6일자로 기탁되었고 FERM P-14690의 수탁번호를 부여받았다. 1995년 9월 29일자로 부다페스트 조약하에 국제 기탁으로 전환되었으며 FERM BP-5252의 수탁번호를 부여받았다.

L-트레오닌을 생산하는 능력을 갖는 에스케리키아 세균의 예에는 6-다이메틸아미노퓨린에 대한 내성을 갖는 L-트레오닌-생산 돌연변이주(일본 공개특허공보 제5-304969호), L-트레오닌 생합성 효소의 과생산을 유발하는 돌연변이가 도입된 트레오닌 생합성 유전자를 플라스미드 상에 증폭시킨 균주(일본 공개특허공보 제1-29559호 및 일본 공개특허공보 제5-227977호)와 같은 재조합 에스케리키아 콜라이 균주, 트레오닌 오페론을 플라스미드 상에서 증폭시킨 균주(일본 공개특허공보제2-109985호) 및 피루브산 카복실라제 및 니코틴아미드 뉴클레오타이드 전이수소효소를 암호화하는 유전자를 증폭시킨 균주(일본 공개특허공보 제2002-51787호)가 포함된다.

에스케리키아 콜라이 VKPM B-3996(미국 특허 제5,175,107호) 또한 본 발명에 포함된다. VKPM B-3996 균주는 기관[Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika]에 1987년 11월 19일자로 기탁되었으며 수탁번호 제VKPM B-3996호를 부여받았다. VKPM B-3996은 트레오닌 생합성 유전자(트레오닌 오페론: thrABC)를 광범위 숙주 범위의 벡터, 예를 들면, 플라스미드 pAYC32[참조: Chistoserdov, A. Y., Tsygankov, Y. D., Plasmid, 1986, 16, 161-167] 내로 삽입함으로써 제조한 플라스미드 pVIC40(국제특허공보 제WO 90/04636호)을 내포한다. pVIC40에서, 트레오닌 오페론내 thrA에 의해 암호화된 아스파르토키나제 I-호모세린 탈수소효소 I의 L-트레오닌에 의한 피드백 억제는 탈감작화되어 있다.

추가로, 에스케리키아 콜라이 B-5318(유럽 특허 제0593792호)가 본 발명에 포함된다. 상기 B-5318 균주는 기관[Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika]에 1987년 11월 19일자로 기탁되었으며 수수탁번호 VKPM B-5318을 부여받았다. VKPM B-5318은 이소루이신에 대한 자가영양성이며 재조합 플라스미드 DNA를 내포한다. 당해 플라스미드는 트레오닌 생합성 유전자를 포함하는 트레오닌 오페론에서 감쇠 영역, 예를 들면, 내인성 전사 조절 영역이 결핍되도록 작제되어 있다. 당해 오페론은 람다-파지 온도 민감성 C1 억제자, P_R 프로모터 및 Cro 단백질의 N-말단으로부터 하류에 위치해 있으며, 트레오닌 생합성 유전자의 발현이 람다-파지 억제자 및 프로모터의 제어하에 있도록 작제되어 있다.

<2> 본 발명의 에스케리키아 세균의 작제

본 발명의 에스케리키아 세균은 L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 능력을 가지며, 말산 효소가 정상적으로 작용하지 않도록 변형된 에스케리키아 속에 속하는 세균이다.

본 발명의 에스케리키아 세균의 생육 중, L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 능력의 부여 또는 말산 효소(EC 1.1.1.38, EC 1.1.1.40)가 정상적으로 작용하지 않게 하는 돌연변이를 초기에 수행할 수 있다. 또한, L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 능력을 갖는 에스케리키아 세균을 말산 효소가 정상적으로 작용하지 않도록 변형시킬 수 있고, 말산 효소가 정상적으로 작용하지 않는 에스케리키아 세균에 L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 능력을 부여할 수 있다.

구 "말산 효소의 활성"은 말산으로부터 이산화탄소 및 피루베이트를 생산하는 가역 반응을 촉매하는 활성을 의미한다. 조효소로서 NAD(EC 1.1.38) 및 NADP(EC 1.1.1.40)을 사용하는 말산 효소가 공지되어 있다(EC 1.1.1.38 (S)-말레이트 + NAD+ = 피루브산 + CO₂ + NADH + H⁺) (EC 1.1.1.40 (S)-말레이트 + NADP⁺ = 피루브산 + CO₂ + NADPH + H⁺). 말산 효소는 또한 "말레이트 탈수소효소" 또는 "말레이트 산화환원효소"로 지칭된다.

구 "말산 효소가 세포 내에서 정상적으로 작용하지 않도록 변형시킨"은 말산 효소의 기능이 제거되거나 말산 효소의 활성이 야생형(모) 균주와 같은 변형되지 않은 균주와 비교하여 감소되거나 감쇠되도록 변형시킴을 의미한다. 말산 효소가 정상적으로 작용하지 않는 상태는 예를 들면, 말산 효소를 암호화하는 유전자의 전사 또는 번역이 억제되고, 따라서 이의 유전자 생성물인 말산 효소가 생산되지 않거나 생산이 감소되는 상태, 또는 당해 세균의 염색체 상의 말산 효소를 암호화하는 유전자가 돌연변이되고/되거나 이의 발현 제어 서열이 돌연변이되어, 말산 효소의 활성이 감소 또는 제거된 상태일 수 있다. 말산 효소가 정상적으로 작용하지 않는 에스케리키아 세균의 예에는 통상 당해 세균의 염색체 상의 말산 효소를 암호화하는 유전자를 유전자 재조합 기법으로 파괴시킨 유전자-파괴 균주, 및 말산 효소 유전자의 발현 조절 서열 또는 암호화 영역을 돌연변이시켜 작용성 말산 효소를 더 이상 생산하지 못하도록 한 돌연변이 균주가 포함된다.

구 "말산 효소의 활성이 감쇠되도록 변형시킨"은 말산 효소의 활성이 변형되 지 않은 균주, 예를 들면, 에스케리키아 세균의 야생형(모) 균주와 비교하여 감소함을 의미한다. 말산 효소의 활성은 변형되지 않은 균주와 비교하여 바람직하게는 세포 당 50% 미만, 보다 바람직하게는 30% 미만, 보다 더욱 바람직하게는 10% 미만으로 감소된다.

대조군으로 사용할 수 있는 에스케리키아 세균의 예에는 에스케리키아 콜라이 W3110(ATCC 27325) 및 에스케리키아 콜라이 MG1655(ATCC 47076)가 포함된다. 이들 야생형 균주는 원형 야생형 균주 K12로부터 유래하였다. 조효소로서 NAD를 사용하는 말산 효소 활성은 Korkes, S. 등의 방법에 따라 측정할 수 있다[참조: Korkes, S. et al., (1950) J. Biol. Chem. 187, 891-905]. 조효소로서 NADP를 사용하는 말산 효소 활성은 Ochoa, S. 등의 방법에 따라 측정할 수 있다[참조: Ochoa, S. et al (1947) J. Biol. Chem. 167, 871-872].

용어 "감쇠"는 활성의 완벽한 제거를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 조효소로서 NAD 또는 NADP를 사용하는 말산 효소 활성은 각각 개별적으로 또는 함께 감쇠시킬 수 있다. 본 발명에서는 에스케리키아 세균이 야생형 또는 변형되지 않은 세균과 비교하여 감쇠된 말산 효소 활성을 갖는다면 충분하다. 그러나, 본 발명의 에스케리키아 세균은 또한 야생형 또는 변형되지 않은 균주와 비교하여 L-라이신 또는 L-트레오닌을 축적 또는 분비하는 능력이 증가되어 있고/거나 우수한 성장으로 인한 개선된 L-라이신 또는 L-트레오닌 생산성, 즉, 개선된 세포-감산률을 갖는다.

본 발명의 말산 효소는 서열번호 6 또는 서열번호 8에 나타내어져 있는 아미 노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 당해 말산 효소는 서열번호 6 또는 서열번호 8에 나타내어져 있는 아미노산 서열의 변이체일 수 있으며, 이 변이체는 서열번호 6 또는 서열번호 8에 나타내어져 있는 아미노산 서열내 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함할 수 있으며, 단, 이는 말산 효소 활성을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같은 "수개"는 예를 들면, 2개 내지 20개, 바람직하게는 2개 내지 10개, 보다 바람직하게는 2개 내지 5개를 의미한다.

수개 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가는 말산 효소 활성이 유지되도록 하는 보존적 돌연변이(들)여야 한다. 대표적인 보존적 돌연변이는 보존적 치환이다. 보존적 치환의 예에는 Ala의 Ser 또는 Thr으로 치환, Arg의 Gln, His 또는 Lys으로 치환, Asn대신 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp으로 치환, Asp의 Asn, Glu 또는 Gln으로 치환, Cys대신 Ser 또는 Ala으로 치환, Gln의 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg으로 치환, Glu의 Asn, Gln, Lys 또는 Asp으로 치환, Gly의 Pro으로 치환, His의 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr으로 치환, Ile의 Leu, Met, Val 또는 Phe으로 치환, Leu의 Ile, Met, Val 또는 Phe으로 치환, Lys의 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg으로 치환, Met의 Ile, Leu, Val 또는 Phe으로 치환, Phe의 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu으로 치환, Ser의 Thr 또는 Ala으로 치환, Thr의 Ser 또는 Ala으로 치환, Trp의 Phe 또는 Tyr으로 치환, Tyr의 His, Phe 또는 Trp으로 치환 및 Val의 Met, Ile 또는 Leu으로의 치환을 포함한다.

구 "말산 효소가 정상적으로 작용하지 않도록 변형시킨"은 세포 당 말산 효소 분자의 수를 감소시키거나 분자 당 말산 효소 활성을 감소시킴을 의미한다. 구 체적으로는, 당해 염색체 상의 말산 효소를 암호화하는 유전자를 결실시키거나, 프로모터 또는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno(SD)) 서열과 같은 발현 제어 서열을 변형시킴으로써 변형시킬 수 있다. 또한, 암호화 영역에 아미노산의 치환(미스센스돌연변이) 또는 종결 코돈(넌센스 돌연변이)을 도입하거나, 암호화 영역에 1개 내지 2개의 염기의 삽입 또는 결실을 도입하거나(프레임시프트(frameshift) 돌연변이) 또는 유전자의 일부를 결실시킴으로써 변형시킬 수 있다[참조: Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997)].

염색체 상의 말산 효소 유전자(mez 유전자)의 예에는 서열번호 5에 나타내어져 있는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA와 같은 sfcA 유전자가 포함된다. 당해 DNA는 조효소로서 NAD를 사용하는 효소를 암호화한다. 다른 예는 서열번호 7에 나타내어져 있는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA와 같은 b2463 유전자이다. 당해 DNA는 조효소로서 NADP를 사용하는 효소를 암호화한다.

mez 유전자는 서열번호 5 또는 7에 나타내어져 있는 뉴클레오타이드 서열 또는 당해 뉴클레오타이드 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건 하에서 하이브리드화되는 DNA일 수 있으며, 단, 당해 DNA는 말산 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화한다. "엄격한 조건"은 특이적 하이브리드가 형성되며 비특이적인 하이브리드는 형성되지 않는 조건을 포함한다. 예를 들면, 엄격한 조건은 60℃에서 1x SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1x SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도에서 1회의 세척, 바람직하게는 2회 또는 3회의 세척으로 예시된다. 프로브의 길이는 하이브리드화 조건에 따라 적합하게 선택될 수 있으며, 일반적으로 100bp 내지 1kbp이다.

말산 효소를 암호화하는 유전자(sfcA, b2643)은 주형으로서 에스케리키아 콜라이의 염색체를 사용하고 프라이머로서 GenBank에 등록되어 있는 에스케리키아 콜라이의 다음의 서열을 기초로 하여 합성한 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 PCR을 수행하여 수득할 수 있다: sfcA: AAC74552. NAD-연결된 말레이트...[gi:1787754], AE000245. 1:1208..2932의 상보체, b2643: AAC75516. 추정 멀티모드(multimod)...[gi:1788806], AE000333.1:141..2420의 상보체.

염섹체 DNA는 예를 들면 Saito와 Miura의 방법[참조: Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp. 97-98, Baifukan, 1992] 등에 따라 DNA 공여체용으로 사용되는 세균으로부터 제조할 수 있다.

상기한 바와 같이 제조한 sfcA 또는 b2643 유전자 또는 이의 일부를 유전자 파괴를 위해 사용할 수 있다. 유전자 파괴용으로 사용된 유전자는 에스케리키아 세균의 염색체 상의 sfcA 또는 b2463 유전자와 상동 재조합이 가능한 정도의 상동성을 가지면 충분하다. 따라서, 이러한 상동 유전자를 사용할 수 있다. 상동 재조합이 가능한 상동성 정도는 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상이며, 특히 바람직하게는 95% 이상이다. 또한, 엄격한 조건 하에서 유전자와 하이브리드화 가능한 DNA를 사용하는 경우 상동 재조합이 발생할 수 있다. "엄격한 조건"은 특이적 하이브리드는 형성되고, 비특이적 하이브리드는 형성되지 않는 조건이다. 예를 들면, 엄격한 조건은 60℃에서 1x SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1x SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도에서 1회의 세척, 바람직하게는 2회 또는 3회의 세척으로 예시된다.

sfcA 또는 b2463 유전자는 예를 들면, 상기한 바와 같은 유전자로부터 정상적으로 작용하는 말산 효소가 생산되지 않도록 부분적 서열을 결실시킨 결실형 sfcA 또는 b2463 유전자를 제조함으로써 파괴시킬 수 있다. 이어서 당해 결실형 유전자 또는 당해 유전자를 포함하는 DNA를 에스케리키아 세균 내로 형질전환시키고 결실형 유전자와 염색체 상의 유전자를 재조합시킬 수 있다. 상동성 재조합을 사용한 유전자 변환에 의한 유전자 파괴는 이미 확립되어 있으며, 이의 예에는 "적색-유도 통합(Red-driven integration)"으로도 지칭되는 Datsenko K.A.과 Wanner B.L.에 의해 개발된 방법, 및 온도-민감성 복제 오리진을 보유하는 플라스미드를 사용하는 방법[참조: 미국 특허 제6,303,383호 및 일본 공개특허공보 제5-7491호]으로 대표되는 선형 DNA를 사용하는 것이 있다. 상동성 재조합을 사용하는 유전자 변환에 의한 유전자 파괴는 또한 숙주 내에서 복제 능력을 갖지 않는 플라스미드를 사용함으로써 수행할 수 있다.

추가로, "적색-유도 통합"으로 지칭되는 방법과 람다 파지로부터 유래한 절단 시스템[참조: J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3 Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF]의 병용을 기초로 한 방법을 염색체 상의 유전자를 파괴시키기 위한 방법으로서 사용할 수 있다.

적색-유도 통합 방법에 따르면, 유전자-파괴 균주는 프라이머로서 5' 말단에 표적 유전자의 일부를, 3' 말단에 항생제 내성 유전자의 일부를 포함하도록 설계한 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수득한 PCR 생성물을 사용하여 한단계로 작제할 수 있다. 추가로, 삽입된 항생제 내성 유전자를 람다 파지의 부착 위치인 attL 및 attR 및 PCR 생성물을 도입하고, 람다 파지로부터 유래한 절단 시스템과 적색-유도 통합 방법을 조합하여 제거할 수 있다.

구체적으로는, 표적 유전자가 파괴되고 항생제 내성 유전자가 제거된 균주를 다음의 방법에 따라 수득할 수 있다.

항생제 내성 유전자, 람다 파지의 부착 위치 및 표적 유전자를 포함하는 선형 DNA 카세트(cassette)를 초기에 제조한다. 이는 일반적으로 적합하게 제조된 주형을 사용하여 PCR로 제조한다.

람다 파지의 부착 위치인 attL 및 attR{서열번호 9(GenBank 승인번호 M12458) 및 서열번호 10(승인번호 M12459)}가 항생제 내성 유전자의 각각의 말단에 삽입되어져 있는 주형을 선형 DNA 카세트의 주형으로서 사용한다. 당해 주형은 플라스미드, 염색체 상에 삽입된 유전자 또는 합성 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 항생제 내성 유전자는 바람직하게는 클로람페니콜 내성 유전자, 스트렙토마이신 내성 유전자 또는 암피실린 내성 유전자일 수 있는 반면, 에스케리키아 세균 내에서 항생제 내성 유전자로서 작용하고 하기한 바와 같은 2개의 보조 플라스미드 내에 포함될 수 있는 마커 유전자와 상이하다면, 어떠한 유전자라도 항생제 내성 유전자로 사용할 수 있다. 항생제 내성의 획득을 용이하게 확인하기 위해, 사용되는 항생제 내성 유전자에서 프로모터 서열 등을 대체함으로써 발현량을 증가시키거나, 이의 구조 유전자 서열 내에 돌연변이를 도입하여 효소 활성이 증가시킬 수 있다. 선형 DNA 카세트를 5' 말단으로부터 다음의 순서대로 제조한다: (표적 유전자 5' 서열)-(attL)-(항생제 내성 유전자)-(attR)-(표적 유전자 3' 서열).

선형 DNA 카세트를 염색체 내로 통합시킨다. 염색체 내로 선형 DNA 카세트를 통합시키기 위한 보조 플라스미드로서, pKD46을 사용할 수 있다[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645]. pKD46은 온도-민감성 복제 및 암피실린 내성을 나타내며 람다 파지(GenBank/EMBL 승인번호 J02459, 31088-33241)의 2,154nt DNA 단편을 포함하며, 이는 λ 적색 상동 재조합 시스템의 적색 재조합효소를 암호화하는 유전자(γ, β 및 엑소 유전자)를 함유하며 아라비노스-유발성 P_araB 프로모터의 제어 하에 있다.

pKD46은 전기천공에 의해 숙주 내로 도입될 수 있다. pKD46-증폭 균주를 아라비노스와 함께 배양한다. 선형 DNA 카세트를 대수증식기에서 도입하고 고온에서 항온처리하여 선형 DNA 카세트 내의 항생제 내성 유전자에 의해 항생제에 대해 내성인 유전자-파괴 균주를 수득한다. PCR을 이용하거나 당해 균주에 의해 생산된 L-라이신 또는 L-트레오닌의 농도를 측정하여 유전자 파괴를 확인할 수 있다.

이어서 항생제 내성 유전자의 절단를 위한 보조 플라스미드를 도입한다. 보조 플라스미드는 인테그라제(Int)를 암호화하는 유전자(서열번호 13, GenBank 승인번호 J02459, B[gi:215104] 및 람다 파지의 절단 효소(Xis)를 암호화하는 유전자(서열번호 15, GenBank 승인번호 J02459, [gi:215104])를 내포하며 온도-민감성 복제를 나타낸다. 보조 플라스미드를 도입함으로써, 염색체 상의 attL(서열번호 11) 및 attR(서열번호 12)의 인식에 의해 재조합이 발생한다. attL 및 attR 사이의 항생제 내성 유전자를 절단하면 그 결과로서, 염색체 상에 오직 attL 또는 attR 서열만을 함유하는 구조가 남게 된다. 고온에서 항온처리함으로써, 보조 플라스미드를 소실시킨다. 따라서, 표적 유전자가 파괴되고 항생제 유전자가 제거된 균주를 수득할 수 있다.

유전자 공학 방법 외에, 말산 효소가 정상적으로 작용하지 않도록 세균을 변형시키는 방법의 예에는 에스케리키아 세균에 UV 방사선을 조사하거나 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 및 질산과 같은 일반적으로 돌연변이유발용으로 사용되는 돌연변이유발제로 처리한 후, 말산 효소의 활성이 감쇠된 세균을 선별하는 방법이 있다.

본 발명은 대사 흐름 정보에 기초하여 달성되었다. 당해 정보는 세포를 사용하여 물질 생산에 영향을 주는 대사 흐름을 측정하는 다음의 방법으로 계산하였다. 그러나, 본 발명은 이러한 정보를 수득하는 방법, 즉, 측정 방법에 제한되지 않는다.

세포를 사용하여 물질 생산에 영향을 주는 대사 흐름을 측정하는 방법은

1) 목적하는 물질을 통한 기질의 생화학적 반응식에 근거한 화학양론적 행렬을 도출하고,

2) 모든 대사 흐름으로부터 자유 흐름으로서 화학양론적 행렬의 자유도와 같은 수의 독립적 대사 흐름을 선택하고,

3) 통계 분석에 충분한 수의 자유 흐름의 무작위적 조합을 도출하고 화학양 론적 행렬을 기준으로 하여 각각의 도출된 조합으로부터 대사 흐름 분포를 계산하고,

4) 다변수 통계 분석에 의해 계산된 대사 흐름 분포로부터 물질 생산과 상관관계를 나타내는 최소의 수의 자유 흐름을 포함하는 회귀방정식을 도출하고,

5) 도출된 회귀방정식의 계수를 기준으로 하여 물질 생산에 영향을 주는 하나 이상의 대사 흐름을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명에 사용된 대사 흐름은 세포내 생화학적 반응의 화학양론적 모델로부터 유래한 대사 반응속도(흐름) 및 대사산물 사이의 질량 작용의 법칙으로 표현되는 반면, 본원에 사용된 대사 흐름 분포는 모든 대사 흐름으로 이루어져 있으며, 여기서, 각각의 대사 흐름은 각각의 생화학적 반응에 할당되어 있다.

측정 방법의 첫 단계에서, 목적하는 물질 생성물을 통해 기질의 생화학적 반응식을 기준으로 하여 화학양론적 행렬을 도출해낸다.

생화학적 반응은 세포내 대사 산물이 세포 내에서 효소 반응에 의해 전환되는 과정을 의미하며, 이는 개체 유형에 따라 각종 데이타베이스로 집계된다. 예를 들면, 사이트[ Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG, www.genome.ad.jp/kegg/)]에 참조를 위해 접속할 수 있다.

기질은 통상 탄소원으로 세포가 사용하는 물질이며, 이의 예에는 글루코스, 슈크로스, 프럭토스 등이 포함된다.

기질 생성물에는 단일 종류의 대사산물 뿐 아니라, 바이오매스(세포체)와 같은 대사 산물의 집합체도 포함된다. 물질 생산은 통상 물질의 생산률로서 측정된 다. 특히, 목적하는 물질이 바이오매스일 경우, 바이오매스 수율로서 측정된다. 바이오매스 수율은 글루코스과 같은 기질로부터 단백질, 탄수화물, 핵산 또는 지질과 같은 세포 성분으로의 전환 효율을 나타낸다.

화학양론적 행렬은 통상 대사 흐름 분석에 사용되는 행렬이며, 대사 산물 흐름 분석에 사용되는 통상적 방법에 의해 목적하는 생성물 물질을 통해 기질의 생화학적 반응식을 기입함으로써 도출할 수 있다. 세포내 대사 중간체의 준-정상(steady) 상태를 가정하는 이러한 방법이 널리 공지되어 있다[참조: Savinell, J.M. and Palsson, B.O.J., Theor. Biol., 154:421-454, 1992; Vallino, J.J. and Stephanopoulos, G., Biotechnol. Bioeng., 41:633-646, 1993]. 반응식이 기입된 경우, 분기되지 않은 일련의 반응을 하나의 반응으로 가정하거나, 반응 전후에 높은 대사율로 반응에 의해 전환된 대사 산물들을 하나의 대사 산물로 가정하는 등으로써 반응 경로를 단순화시킬 수 있다. 물질 생성물이 바이오매스일 경우, 세포 성분을 유도하는 생화학적 반응을 기입함으로써 화학양론적 행렬을 기술할 수 있다.

측정 방법의 제2 단계에서, 모든 대사 흐름으로부터 전술한 화학양론적 행렬의 자유도와 같은 수의 독립적 대사 흐름을 대사 흐름으로 선택한다.

독립적 흐름은 화학양론적 방정식에 의해 정의된 바와 같은 대사 네트워크 시스템에서 흐름을 특이적으로 정의하도록 상술될 수 있는 한 세트의 흐름이다.

자유 흐름을 설정하는 방법은 분석할 시스템의 자유도와 동일한 수의 독립적 대사 흐름이 선택되도록 특별히 제한되지는 않는다. 임의로 선택된 흐름의 독립성이 확증될 수 있더라도, Reder에 의해 제안된 SIMS 행렬(항정상태 내부 대사 화학양론적 행렬) 또한 사용될 수 있다[참조: Reder, C.J., Theor. Biol., 135:175-201, 1988]. 당해 방법에서, 전술한 화학양론적 행렬의 자유도와 동일한 수의 대사 흐름의 특정 그룹을 전술한 생화학적 반응식을 기준으로 하여 결정한 대사 흐름 그룹들 간에 결정하고, 대사 흐름을 각각의 결정된 대사 흐름 그룹으로부터 자유 흐름으로서 선택한다. 흐름 그룹 중 특이적 그룹을 결정하기 위해, 그룹 중 임의의 흐름을 다른 그룹의 흐름에 영향을 주지 않으면서 변경할 수 있다. 따라서, 독립적 자유 흐름으로서 각각의 그룹으로부터 하나의 흐름을 선택할 수 있다. 자유 흐름을 흐름 그룹으로부터 선택하고, 바람직하게는 분기점에 근접한 흐름을 선택한다.

결정 방법의 제3 단계에서, 통계 분석에 충분한 수의 자유 흐름의 조합을 도출하고, 대사 흐름 분포를 전술한 화학양론적 행렬을 기준으로 한 각각의 도출된 조합으로부터 계산한다.

상이한 흐름 분포의 조합의 데이타 세트를 도출하기 위해 이전 단계에서 선택한 자유 흐름에 무작위 수치를 대입함으로써 자유 흐름의 무작위적 조합을 도출할 수 있다. 자유 흐름에 무작위 수치를 대입하는 방법은 특이적 경계 내에서 자유 흐름의 조합을 산출하는 방법을 선택하도록 제한되지는 않는다. 언급한 특이적 경계는 이후의 계산에 생물학적으로 실현 가능한 수치를 대입하기 위한 세트이다. 자유 흐름의 수가 명기된 화학양론적 행렬의 자유도와 동일한 경우, 독특한 대사 흐름 분포를 풀 수 있다. 풀이를 위해, 통상 역행렬을 사용하는 행렬 연산을 실행 하고, 모든 흐름을 바람직하게는 예를 들면, 특정한 기질량으로 표준화한다. 기질이 글루코스인 경우, 모든 흐름 값을 글루코스 10mmol 흡수 당의 수치로 나타낼 수 있다. 상기한 바와 같은 무작위 자유 흐름 수치로부터 도출한 대사 흐름 분포의 해는 생물학적으로 유의미해야 한다. 즉, 비가역적 반응의 모든 흐름은 0 이상이어야 하며, 바이오매스 형성 흐름은 0 이상이어야 한다. 보다 바람직한 자유 흐름의 조합을 얻기 위해, 세포를 사용하는 물질 생산에서 이론적 및/또는 경험적 지식을 근거로 한 조건 또한 첨가할 수 있다. 도출되어야 하는 조합의 수, 즉, 계산되어야 하는 생물학적으로 유의적인 흐름 분포의 수는 특별히 통계적 분석에 충분한 만큼으로 제한되지는 않는다. 일반적으로 3개 또는 5개의 수치가 1개의 자유 흐름에 사용된다. 따라서, n개의 자유 흐름이 있는 경우, 1개의 자유 흐름에 대한 수치의 수의 약 n제곱의 조합이 가능하다. 예를 들면, 3개의 수치가 1개의 자유 흐름에 사용된 경우, 3개 내지 n제곱(3ⁿ)의 조합이 가능하다. 즉, 7개의 자유 흐름(n=7)에 약 2,200개의 조합이 사용될 수 있다. 대안적으로, 생물학적으로 유의적인 흐름 분포의 데이타 세트에서 각각의 자유 흐름에 대한 수치의 수는 선택된 자유 흐름 또는 부가적인 조건에 따라 변경될 수 있으며, 사용될 수 있는 조합의 수는 자유 흐름의 n에 대하여 총 약 3 내지 n제곱(3ⁿ), 또는 약 5 내지 약 n제곱(5ⁿ)이다. 이러한 수에서 생물학적으로 유의적인 흐름 분포의 해를 얻기 위해, 통상 1개의 자유 흐름에 대해 6 내지 10의 수치를 사용하는 무작위적 자유 흐름의 조합, 즉, 6 내지 n제곱(6ⁿ) 또는 10 내지 n제곱(10ⁿ)의 자유 흐름의 조합으로부터 출발한 다.

측정 방법의 제4 단계에서, 물질 생산과 상관관계를 나타내는 최소의 수의 자유 흐름을 포함하는 회귀방정식을 다변수 통계 분석에 의한 대사 흐름 분포(대사 흐름 분포의 데이타 세트)로부터 수득한다.

이전 단계에서 도출한 자유 흐름의 무작위 조합으로부터 계산된 흐름 분포의 데이타 세트에 대한 다변수 통계 분석을 수행함으로써, 물질 생산과 상관관계를 나타내는 최소의 수의 자유 흐름을 포함하는 회귀방정식을 얻을 수 있다. 다변수 통계 분석(다변수 비선형 회귀 분석 및 다변수 선형 회귀 분석)을 물질 생산과 자유 흐름 조합의 관련성을 시험할 수 있기 때문에 선택된 임의의 기법을 사용하여 수행할 수 있다. 그러나, 다변수 선형 회귀 분석이 유용하다. 당해 방법은 예를 들면, 문헌[참조: Kachigan, S.K., Chapter 4, Regression Analysis in Multivariate Statistical Analysis 2nd Ed., Radius Press, New York, pp.160-193]에 기술되어 있다.

표현 "물질 생산과 상관관계를 나타내는"은 결정 계수가 유의적으로 크며, "유의적으로 큼"은 일반적으로 결정 계수 R²가 0.8 이상, 바람직하게는 0.9 이상임을 의미한다.

물질 생산과 상관관계를 나타내는 최소의 수의 자유 흐름(항)을 포함하는 회귀방정식은 회귀방정식을 도출하기 위해 항의 수를 연속적으로 변경시킴으로써 도출할 수 있다. 각각의 항들의 수를 포함하는, 최대 결정 계수를 나타내는 방정식과 현저히 큰 결정 계수를 나타내는 최소의 수의 항을 포함하는 회귀방정식을 선택 할 수 있다. 대안적으로, 항의 축출에 기인한 결정 계수의 감소 정도를 시험하기 위해 한 항을 제외한 총 항을 사용하여 회귀방정식을 도출할 수 있으며; 총 항으로서, 결정 계수에 소규모의 감소를 나타내는 항을 제외한 항들을 사용하여 동일한 과정을 반복할 수 있고; 물질 생산과 상관관계를 나타내는 회귀방정식이 더 이상 수득되지 않는 경우, 바로 직전에 얻은 회귀방정식을 선택할 수 있다.

이러한 수학적 과정을 개별적으로 프로그래밍할 수 있지만, 이들은 MatLab^R(상표명, MathWorks) 및 Mathematica^R(상표명, Wolfram Research)과 같은 시판되는 수학적 계산 프로그램을 사용하여 용이하게 수행할 수도 있다.

측정 방법의 제5 단계에서, 물질 생산에 영향을 주는 대사 흐름은 도출된 회귀방정식의 계수를 기준으로 하여 결정한다.

미생물과 같은 세포를 사용하는 물질 생산에 대한 자유 흐름의 기여, 특히 물질 생산에 중요한 바이오매스 수율 또는 생성 물질 수율은 이전 단계에서 도출한 회귀방정식을 사용하여 결정할 수 있다. 즉, 회귀식에 나타난 자유 흐름을 물질 생산에 영향을 주는 자유 흐름으로서 결정할 수 있다. 추가로, 회귀방정식의 계수가 기여의 규모를 나타낼 수 있기 때문에, 충분히 큰 계수를 갖는 자유 흐름(흐름을 표준화시킨 경우, 상대 계수의 큰 절대값을 갖는 자유 흐름)을 물질 생산에 중대한 영향을 주는 대사 흐름으로 결정할 수 있다.

본 발명의 측정 방법은 세균 균주를 개선시키는데 중요한 정보, 즉, 어떤 자유 흐름이 표적 물질의 생산에 중대한 영향을 주는지, 자유 흐름이 표적 물질의 생 산에 양성적 또는 음성적 영향을 주는지에 대한 정보를 제공한다. 표적 생성물의 수율 및 생산성에 유리하게 영향을 주도록 변형시킬 필요가 있는 흐름 또한 예측가능하다.

예를 들면, 본원에 기술한 예에서 볼 수 있는 바와 같이, 에스케리키아 콜라이를 사용하는 라이신 생산에서 포스포에놀피루브산 카복실라제의 활성을 증강시킴으로써 개선된 라이신-생산 능력을 갖는 세균성 균주를 제조할 수 있음을 기대할 수 있다. 국제특허공보 제WO 01/53459호에는 포스포에놀피루브산 카복실라제 활성의 증강에 의한 라이신 생산의 개선에 대한 예가 개시되어 있다. 따라서, 물질-생산 능력을 갖는 세균성 균주를 결정 방법을 기초로 하여 제조할 수 있음이 확증된다.

<3> L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하기 위한 생산 방법

본 발명의 방법은 L-라이신 또는 L-트레오닌의 생산 방법이며, 본 방법은 배지에서 L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 능력을 갖는 세균을 배양하고, 배지 또는 세균의 세포 내에 L-라이신 또는 L-트레오닌을 축적시키고, 배지 또는 세포로부터 L-라이신 또는 L-트레오닌을 수거하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 사용된 배양 배지는 통상 미생물을 사용하는 L-라이신 또는 L-트레오닌의 발효 생산용으로 사용되는 배지일 수 있다. 필요에 따라 탄소원, 질소원, 무기 이온 및 다른 유기 성분을 포함하는 통상의 배지를 사용할 수 있다. 탄소원으로서, 글루코스, 슈크로스, 락토스, 갈락토오스, 프럭토스 및 전분 가수분해물과 같은 각종 당, 글리세롤 및 소르비톨과 같은 각종 알콜, 푸마르산, 시트르산 및 숙신산과 같은 각종 유기산을 사용할 수 있다. 질소원으로서, 황산암모늄, 염화암모늄 및 인산암모늄과 같은 각종 무기 암모늄 염, 대두 가수분해물, 암모니아 가스 및 액체 암모니아와 같은 유기 질소 등을 사용할 수 있다. 미량 유기 영양물로서, 비타민 B₁, 호모세린 또는 효모 추출물 등과 같은 요구 물질을 첨가하는 것이 바람직하다. 추가로, 미량의 인산칼륨, 황산마그네슘, 철 이온, 망간 이온을 첨가할 수 있다. 배양용으로 사용되는 배지는 합성 배지 또는 천연 배지일 수 있으며, 당해 배지는 탄소원, 질소원 및 무기 이온과 필요에 따라, 미량의 유기 영양물을 포함한다.

배양은 일반적으로 24 내지 37℃의 온도 및 pH 5 내지 9에서 1일 내지 7일 동안 호기성 조건하에서 수행한다. 배양 pH는 무기 또는 유기산 또는 알칼리성 물질, 예를 들면, 암모니아 가스 등으로 적정한다. 배양 배지로부터의 L-라이신 또는 L-트레오닌의 수거는 이온 교환 수지 방법, 침전 및 다른 공지된 방법과 같은 통상의 방법 및 이의 조합에 의해 수행될 수 있다. L-라이신 또는 L-트레오닌이 세포 내에 축적된 경우, 초음파 등으로 세포를 파쇄시키고 원심분리에 의해 세포 잔여물을 제거함으로써 수득한 상층액으로부터 이온 교환 수지 방법 등으로 L-라이신 또는 L-트레오닌을 수거할 수 있다.

본 발명은 실시예에 관련하여 추가로 상세히 기술되어 있다.

실시예 1

L-라이신에 관한 대사 흐름의 측정

(1) 화학양론적 행렬의 도출

대사 흐름의 계산을 위한 화학양론적 방정식을 세포내 대사 중간체의 준-정상 상태를 가정함으로써 구성하였다[참조: Savinell, J.M. and Palsson, B.O.J., Theor. Biol., 154:421-454, 1992; Vallino, J.J. and Stephanopoulos, G., Biotechnol. Bioeng., 41:633-646, 1993]. 당해 모델에 포함되어 있는 반응식은 표 2에 나타내어져 있다. 본 발명에 사용된 약어에 대한 설명은 표 1에 기재되어 있다. 분기되지 않은 일부 반응은 공식을 단순화하기 위해 통합하였다. 인산오탄당 경로는 복잡하기 때문에, 2개의 공식으로 나타내었다. 보고된 데이타는 바이오매스의 성분 비율에 대해 사용하였고[참조: Neidhardt, F.C. et al., Physiology of the Bacterial Cell., Sinauer Associates, Massachusetts, 1990], 당해 바이오매스는 반응식을 사용함으로써 나타내었다[68]. 당해 모델에서 화학양론적 행렬의 자유도는 7이었다.

(2) 자유 흐름의 선택 및 이들의 무작위 조합의 도출

특이적 흐름 그룹은 Reder의 방법에 따라 결정하였다[참조: Reder, C.J., Theor. Biol., 135:175-201, 1988]. 분기점에 근접한 흐름을 각각의 그룹으로부터 선택하였다. 7개의 선택된 자유 흐름은 표 3에 제시한다. 흐름 균형에 대한 유일한 해는 이들 7개의 흐름을 규정함으로써 수득할 수 있다.

무작위 흐름 분포를 수득하기 위한 자유 흐름의 목록

반응 번호	효소 명칭 또는 반응 경로 명칭
2	글루코스-6-포스페이트 탈수소효소
15	PEP 카복실라제
16	아세트산 분비
60	이소시트레이트 리아제(글리옥실레이트 회로)
62	말산 효소
64	포름산 분비
66	ATPase

7개의 무작위 자유 흐름에 대한 값들의 약 300,000개의 조합으로부터, 역반응성에 관한 임의의 한계를 위반하는 것들 및 각각의 최대값의 20%에서 역치 수준을 초과하지 않는 라이신 및 바이오매스 둘 다에 대한 수치를 나타내는 것들은 제외하였다. 결과적으로, 데이타 세트는 생물학적으로 유의한 특이적 영역 내에서 5000개의 대사 흐름 분포를 도출하였다. 당해 결과는 10mmol 글루코스 흡수를 기준으로 한 수치로 나타내었으며, 무작위 흐름 분포에 상응하는 5000개의 열과 각각의 반응 흐름에 상응하는 68개의 행을 갖는 행렬을 도출하였다.

(3) 다변수 분석에 의한 상관 분석 및 물질 생산에 영향을 주는 대사 흐름의 측정

7개의 자유 흐름에 상응하는 Z-선의 행만을 포함하는 축약 행렬의 다변수 선형 회귀를 수행하였다. 다변수 선형 회귀를 위해 MatLab 통계 도구함의 단계별 회귀 함수를 사용하였다. 당해 기법을 사용한 경우, 7개의 자유 흐름의 선형 함수와 함께 바이오매스 또는 라이신 생산이 유도될 수 있다. 이들 7개의 흐름을 확인하여 당해 시스템의 상태에 유일한 정의를 내릴 수 있다. 따라서, 7개 항 모두를 매개변수로 사용하는 경우, 상관 계수는 완전한 적합도를 나타내는 1이 된다. 그러나, 일반적으로 당해 방정식보다 적은 수의 항을 사용하여 상대적으로 양호한 적합도를 얻을 수 있다. 항들의 다양한 조합을 시도하기 위해, 포함된 항들의 각각의 수에 대한 최적의 적합도를 나타내는 방정식을 MatLab 프로그램의 단계별 함수를 사용하여 선택하였다. 바이오매스 수율에 대하여, 오직 4개의 항, 이소시트르산 리아제(ICL), 말산 효소(MEZ), PEP 카복실라제(PEPC) 및 ATPase를 사용하여 R² = 0.980의 적합도가 수득되었다. 항의 수가 추가로 감소되는 경우, R² 수치는 현저히 감소하며, 어떠한 합리적인 적합도도 얻을 수 없다. 반응 흐름을 10mmol 글루코스 당 수치로 표준화시키고 투입값으로 사용한 경우, 정확한 방정식은 다음과 같이 제시된다.

방정식 1) 바이오매스 수율 = 1.552 - 0.194 (ICL) + 0.184(MEZ) - 0.194(PEPC) - 0.011(ATPase)

라이신 수율을 동일한 4개의 매개변수를 포함하는 모델에 적합할 수 있었으며, R² = 0.997의 결과를 얻었다. 추가로, ATPase에 대한 항을 제외시키는 경우, R²는 단지 0.856으로 감소하였으며, 적합도는 여전히 양호하였다. 따라서, 다음의 3개의 매개변수를 라이신의 모델에 대하여 사용하였다.

방정식 2) 라이신 수율 = -1.694 + 1.176(ICL) - 1.095(MEZ) + 1.162(PEPC)

마지막으로, 바이오매스 및 라이신에 대한 총 탄소 원자수로 정의되는 총 탄소 수율(C 원자)은 다음의 방정식과 ATPase에 대한 항만을 사용하여 R² = 0.956와 적합할 수 있었다.

방정식 3) C 원자 = 34.3 - 0.314(ATPase)

이들 결과는 바이오매스 수율이 말산 효소의 흐름에 양성적으로 관련되어 있으며, 라이신 생산은 PEP 카복실라제 및 이소시트르산 리아제(글리옥실산 회로)와 양성적 상관관계가 있음을 나타내었다. 당해 회귀 분석의 유용성을 도 1 및 도 2에 나타내었다. 이소시트레이트 리아제 및 말산 효소의 흐름을 개별적으로 고려하는 경우에는, 도 1의 (a) 및 (b)에서 볼 수 있는 바와 같이, 라이신 생산과의 어떠한 상관관계도 관찰되지 않는다. 그러나, 이들 흐름을 회귀 방정식 2)의 일부로서 고려하는 경우, 도 2에 제시된 바와 같은 상관관계를 관찰할 수 있으며, 그 효과는 명백해진다. 따라서, 대사 흐름 사이의 비가시적인 관계는 이러한 기법으로 나타낼 수 있다. 양성적 상관관계를 나타내는 흐름에 관계된 활성을 증강시키고, 음성적 상관관계를 나타내는 흐름에 관계된 활성은 감쇠시킴으로써 표적 생성물의 수율을 개선할 수 있다. 즉, 이러한 결과로부터, 세균 균주의 개선에 대한 지침을 얻을 수 있으며 PEP 카복실라제 또는 이소시트레이트 리아제 활성의 증강 또는 음성적 상관관계를 나타내는 말산 효소의 활성의 감쇠는 라이신 생산에 효과적이다. 사실, 에스케리키아 콜라이를 사용하는 라이신 생산에서 PEP 카복실라제의 활성을 증강시킴으로써 개선된 라이신 생산 능력을 나타내는 세균 균주를 제조하는 예가 국제특허공보 제WO 01/53459호에 개시되어 있으며, 이에 따라 본 발명의 유용성이 뒷받침되었다.

실시예 2

L-트레오닌에 관한 대사 흐름의 측정

실시예 1에서와 동일한 방법으로, 포함된 항 각각의 수에 대한 최적의 적합도를 나타내는 방정식을 L-트레오닌에 관하여 선택하였다. 바이오매스 수율에 대하여, 단지 4개의 항, 이소시트르산 리아제(ICL), 말산 효소(MEZ), PEP 카복실라제(PEPC) 및 ATPase을 사용하여 R² = 0.986의 적합도를 도출하였다.

방정식 4) 바이오매스 수율 = 1.206 - 0.101(ICL) + 0.093(MEZ) - 0.101(PEPC) - 0.009(ATPase)

트레오닌 수율은 동일한 3개의 매개변수를 포함하는 모델에 적합할 수 있으며, R² = 0.937의 결과를 얻었다.

방정식 5) 트레오닌 수율 = -1.432 + 1.090(ICL) - 1.080(MEZ) + 1.087(PEPC)

이들 결과는 바이오매스 수율이 말산 효소의 흐름과 양성적 상관관계가 있으며, 트레오닌 생산은 PEP 카복실라제 및 이소시트르산 리아제(글리옥실산 회로)의 흐름과 양성적 상관관계가 있음을 나타내었다. 따라서, 트레오닌 생산과 관련하여, 세균 균주의 개선에 대한 지침을 또한 얻을 수 있었으며, PEP 카복실라제 또는 이소시트르산 리아제 활성의 증강 또는 음성적 상관관계를 나타내는 말산 효소의 활성의 감쇠는 라이신 생산에 효과적이다.

실시예 3

말산 효소-결핍 L-라이신 생산 세균의 작제

균주 WC196을 AEC (S-(2-아미노에틸)시스테인)에 내성을 갖는 에스케리키아 콜라이의 L-라이신-생산 균주로 사용하였다(국제특허공보 제 WO 96/17930호).

에스케리키아 콜라이로부터의 말산 효소는 조효소로서 NAD를 사용하는 효소(EC 1.1.1.38)와 조효소로서 NADP를 사용하는 효소(EC 1.1.1.40)가 포함된다. 이들 효소는 sfcA 및 b2463 유전자 각각에 의해 암호화된다.

sfcA 및 b2463 유전자는 본래 Datsenko와 Wanner에 의해 개발된 방법인 "적색-유도 통합" 방법[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645] 및 람다 파지로부터 유래한 절단 시스템 방법[참조: J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF.]을 병용하여 결실시킨다. 적색-유도 통합 방법에 따라서, 5' 말단에 표적 유전자의 일부를, 3' 말단에 항생제 내성 유전자의 일부를 포함하도록 설계된 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용함으로써 수득한 PCR 생성물을 사용하여 한단계로 유전자-파괴 균주를 작제할 수 있다. 추가로, 삽입된 항생제 내성 유전자를 적색-유도 통합 방법과 람다 파지로부터 유래한 절단 시스템을 조합함으로써 제거할 수 있다.

(1) sfcA 유전자의 파괴

PCR 주형으로서, 플라스미드 pMW118-attL-Cm-attR(이의 제조법은 아래에 기술되어 있다)을 사용하였다. pMW118-attL-Cm-attR은 pmW118(제조원: TaKaRa Bio)에 람다 파지의 부착 위치인 attL 및 attR 유전자 및 항생제 내성 유전자인 cat 유전자를 삽입함으로써 수득한 플라스미드이다. 상기 유전자들을 attL-cat-attR 순으로 삽입한다. attL 서열은 서열번호 11에 나타내어져 있으며 attR 서열은 서열번호 12에 나타내어져 있다.

서열번호 1 및 서열번호 2로 나타내어져 있으며, 각각 3' 말단에 attL 및 attR에 상응하는 서열을 갖고 5' 말단에 sfcA 유전자의 일부에 상응하는 서열을 가지는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.

증폭된 PCR 생성물을 아가로스 겔 상에서 정제하였고 온도-민감성 복제를 나타내는 플라스미드 pKD46을 포함하는 에스케리키아 콜라이 WC196 내로 전기천공법으로 도입하였다. pKD46[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645]은 아라비노스-유도성 P_araB 프로모터의 제어하에 λ 적색 상동성 재조합 시스템의 적색 재조합효소를 암호화하는 유전자(γ, β 및 엑소 유전자)를 포함하는 람다 파지(GenBank/EMBL 승인번호 제J02459호, 31088-33241)의 2,154nt DNA 단편을 포함한다. pKD46은 균주 WC196의 염색체 내로 PCR 생성물을 통합하기 위해 필요하다.

전기천공을 위한 적격성 세포는 다음과 같이 제조하였다. 암피실린 100mg/l를 함유하는 LB 배지에서 30℃에서 밤새 배양한 에스케리키아 콜라이 WC196을 암피실린(50mg/l) 및 L-아라비노스(1mM)를 함유하는 SOB 배지[참조: Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 5㎖로 100배 희석하였다. 희석된 생성물을 OD₆₀₀이 약 0.6이 될 때까지 통기 하에 30℃에서 배양한 후, 100배 농축시켰다. 세포를 10% 글리세롤로 3회 세척하여 전기천공용으로 준비된 세포를 제조하였다. 70㎕ 적격성 세포 및 PCR 생성물 약 100ng을 사용하여 전기천공을 수행하였다. SOC 배지[참조: Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 1㎖를 전기천공시킨 세포에 첨가하였다. 당해 세포를 37℃에서 2.5시간 동안 배양한 후, 37℃에서 Cm(클로람페니콜) 25mg/l를 함유하는 L-아가 배지 상에서 플레이트-배양하여 Cm-내성 재조합체를 선별하였다. 이어서, 플라스미드 pKD46을 소실시키기 위해, 세포를 Cm-함유 L-아가 배지 상에서 42℃에서 2회 계대배양하였다. 수득한 콜로니는 암피실린 내성에 대하여 시험하였다. pKD46이 없는 암피실린-민감성 균주를 수득하였다.

클로람페니콜 내성 유전자에 의해 동정된 돌연변이체의 sfcA 유전자의 결실은 PCR로 확인하였다. 수득한 sfcA-결실 균주를 WC196ΔsfcA::att-cat로 명명하였다.

sfcA 유전자 내로 통합된 att-cat 유전자를 제거하기 위해, 보조 플라스미드 pMW-intxis-ts(이의 제조법은 아래에 기술되어 있다)를 사용하였다. pMW-intxis-ts는 람다 파지의 인테그라제(Int)를 암호화하는 유전자(서열번호 13) 및 절단효소(Xis)를 암호화하는 유전자(서열번호 15)를 내포하며 온도-민감성 복제를 나타낸다. pMW-intxis-ts를 도입하면, 염색체 상의 attL(서열번호 11) 및 attR(서열번호 12)의 인식에 기인한 재조합이 발생하며, attL 및 attR 사이의 항생제 내성 유전자는 절단되어, 염색체 상에 오직 attL 또는 attR 서열만 잔존하는 구조가 수득된다.

균주 WC196ΔsfcA::att-cat의 적격성 세포는 보조 플라스미드 pMW-intxis-ts로 형질전환시키고, 암피실린 50mg/l을 함유하는 L-아가 배지 상에서 30℃에서 플레이트-배양하여 암피실린-내성 균주를 선별하는 일반적인 방법에 따라 제조하였다.

플라스미드 pMW-intxis-ts를 소실시키기 위해, 세포를 L-아가 배지 상에서 42℃에서 2회 계대 배양하였다. 수득한 콜로니를 암피실린 내성 및 클로람페니콜 내성에 대해 시험하였다. att-cat 및 pMW-intxis-ts가 없는 암피실린- 및 클로람페니콜-민감성 균주를 수득하였다. 당해 균주를 WC196ΔsfcA로 명명하였다.

(2) b2463 유전자의 파괴

균주 WC196 및 WC196ΔsfcA 내의 b2463 유전자의 결실은 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 b2463의 파괴용 프라이머로 사용한 것만 제외하고 (1)의 방법에 따라 수행하였다. 이에 따라, 균주 WC196Δb2463 및 WC196ΔsfcAΔb2463을 수득하였다. 수득한 균주 WC196ΔsfcAΔb2463을 WC196Δmez로 명명하였다.

(3) PCR 주형 및 보조 플라스미드의 제조

PCR 주형 pMW118-attL-Cm-attR 및 보조 플라스미드 pMW-intxis-ts을 다음과 같이 제조하였다.

(3-1) pMW118-attL-Cm-attR

플라스미드 pMW118-attL-Cm-attR의 작제를 위해, pMW118-attL-Tc-attR을 먼저 사용하였다. 4개의 DNA 단편을 결합하였다:

1) BglII-EcoRI - 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 P1 및 P2(서열번호 17 및 서열번호 18)(이들 프라이머는 BglII 및 EcoRI 엔도뉴클레아제의 보조 인식 부위를 포함하였다)를 사용하여 이.콜라이 W3350(λ 프로파지를 포함하는) 염색체의 상응하는 서열을 PCR 증폭시켜 수득한 attL을 보유한 DNA 단편(120bp)(서열번호 11);

2) PstI-HindIII - 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 P3 및 P4(서열번호 19 및 서열번호 20)(이들 프라이머는 PstI 및 HindIII 엔도뉴클레아제의 보조 인식 부위를 포함하였다)를 사용하여 이.콜라이 W3350(λ 프로파지를 포함하는) 염색체의 상응하는 서열을 PCR 증폭시켜 수득한 attR을 보유한 DNA 단편(182bp)(서열번호 12);

3) pMW118-ter_rrnB의 대형(3916bp) BglII-HindIII 단편. pMW118-ter_rrnB를 3개의 DNA 단편을 연결시켜 수득하였다:

ㆍpMW118의 AatII-EcoRIpol 단편을 보유한 대형(2359bp) 단편, pMW118을 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 분해시키고, DNA 폴리머라제 I의 클레노우(Klenow) 단편으로 처리한 후, AatII 제한 엔도뉴클레아제로 분해시켰다;

ㆍ암피실린 내성(Ap^R)에 대한 bla 유전자를 보유하는 pUC19의 소형 단편(1194bp)을 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 P5 및 P6(서열번호 21 및 서열번호 22)(이들 프라이머는 AatII 및 BglII 엔도뉴클레아제의 보조 인식 부위를 포함한다)를 사용하여 pUC19 플라스미드의 상응하는 서열을 PCR 증폭시켜 수득하였다;

ㆍ전사 종결자 ter_rrnB의 BglII-PstIpol의 소형 단편(363bp)을 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 P7 및 P8(서열번호 23 및 서열번호 24)(이들 프라이머는 BglII 및 PstI 엔도뉴클레아제의 보조 인식 부위를 포함하였다)를 사용하여 이. 콜라이 MG1655 염색체의 상응하는 영역을 PCR 증폭시켜 수득하였다;

4) 테트라사이클린 내성에 대한 유전자 및 전사 종결자 ter_thrL을 포함하는 pML-Tc-ter_thrL의 소형 단편(1388bp) EcoRI-PstI (서열번호 29), pML-Tc-ter_thrL을 다음의 방법으로 수득하였다:

ㆍpML-MSC(2001 #5)를 XbaI 및 BamHI 제한 엔도뉴클레아제로 절단한 후 대형(3342bp) 단편을 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 P9 및 P10(서열번호 25 및 서열번호 26)(이들 프라이머는 XbaI 및 BamHI 엔도뉴클레아제의 보조 인식 부위를 포함한다)를 사용하여 이. 콜라이 MG1655 염색체의 상응하는 영역을 PCR 증폭시켜 수득한, 종결자 ter_thrL을 수반하는 단편(68bp) XbaI-BamHI과 결합하였고, 당해 반응의 생성물은 플라스미드 pML-ter_thrL이었다;

ㆍ이어서, pML-ter_ thrL을 KpnI 및 XbaI 제한 엔도뉴클레아제로 분해시키고 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 처리한 후, 테트라사이클린 내성에 대한 유전자를 포함하는 pBR322의 소형(1317bp) EcoRI-Van91I 단편과 연결시키고(pBR322를 EcoRI 및 Van91I 제한 엔도뉴클레아제로 절단한 후 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 처리하였다), 당해 반응의 생성물은 플라스미드 pML-Tc-ter_thrL이었다; 이렇게 하여 pMW118-attL-Tc-attR을 수득하였다.

pMW118-attL-Cm-attR을 pMW118-attL-Tc-attR의 대형(4413bp) BamHI-XbaI 단편 및 프로모터 P_A2(파지 T7의 조기 프로모터), 클로로암페니콜 내성에 대한 cat 유전자(Cm^R), 전사 종결자 ter_thrL 및 attR을 포함하는 인공 DNA 단편(1162bp), vBglII-XbaI을 연결시켜 작제하였다. 인공 DNA 단편(서열번호 30)을 다음의 방법으로 수득하였다:

1. pML-MSC(2001 #5)를 KpnI 및 XbaI 제한 엔도뉴클레아제로 분해시키고 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 P11 및 P12(서열번호 27 및 서열번호 28)(이들 프라이머는 KpnI 및 XbaI 엔도뉴클레아제에 대한 보조 인식 부위를 포함한다)를 사용하여 파지 T7 DNA의 상응하는 영역을 PCR 증폭시켜 수득한 프로모터 P_A2(파지 T7의 조기 프로모터)를 포함하는 소형(120bp) KpnI-XbaI 단편과 결합시켰고, 당해 반응의 생성물은 플라스미드 pML-P_A2-MCS이었다;

2. 이어서 XbaI 부위를 pML-P_A2-MCS으로부터 결실시켰고, 당해 반응의 생성물은 플라스미드 pML-P_A2-MCS(XbaI^-)이었다;

3. 프로모터 P_A2(파지 T7의 조기 프로모터) 및 클로람페니콜 내성(Cm^R)에 대한 유전자 cat를 포함하는 pML-P_A2-MCS(XbaI^-)의 소형 단편(928bp) BglII-HindIII를 전사 종결자 ter_thrL 및 attR을 포함하는 pMW118-attL-Tc-attR의 소형(234bp) 단편 HindIII-HindIII와 결합시켰다;

4. 필요한 인공 DNA 단편(1156bp)은 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 P9 및 P4(서열번호 25 및 서열번호 20)(이들 프라이머는 HindIII 및 XbaI 엔도뉴클레아제에 대한 보조 인식 부위를 포함하였다)를 사용하여 결합 반응 혼합물을 PCR 증폭시켜 수득하였다.

(3-2) pMW-intxis-ts

처음에, 주형으로 람다 λ DNA(제조원: "Fermentas")를 2개의 단편을 사용하여 증폭시켰다. 제1 단편은 nt 37168번 내지 38046번(서열번호 39)의 영역을 포함하였고 또한 cI 억제자, 프로모터 Prm 및 Pr을 암호화하는 유전자 및 cro 유전자의 리더 서열을 포함하였다. 당해 단편은 프라이머로서 P1' 및 P2' 올리고뉴클레오타이드(서열번호 31 및 서열번호 32)를 사용하여 수득되었다. 제2 단편은 파지 λ의 xis-int 유전자를 보유하였으며 nt 27801번 내지 29100번(서열번호 40)의 영역으로 구성되었다. 올리고뉴클레오타이드 P3' 및 P4'(서열번호 33 및 서열번호 34)을 이의 증폭을 위한 프라이머로 사용하였다. 모든 프라이머는 적합한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함하였다.

cI 억제자를 보유하는 수득한 PCR-증폭 단편을 제한 엔도뉴클레아제 ClaI으로 절단하고, DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 처리한 후, EcoRI 제한 엔도뉴클레아제로 분해하였다. 제2 PCR-증폭 단편을 EcoRI 및 PstI 제한 엔도뉴클레아제로 분해하였다. 이어서, pMWPlaclacI-ts 플라스미드를 BglII 엔도뉴클레아제로 분해시켰고, DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 처리한 후, PstI 제한 엔도뉴클레아제로 절단하였다. pMWPlaclacI-ts의 벡터 단편을 아가로스 겔로부터 용출시키고 분해된 PCR-증폭 단편과 연결시켰다.

플라스미드 pMWPlaclacI-ts는 다음의 부분들로 이루어진 pMWPlaclacI의 유도체이다: 1) BglII-HindIII - P_lacUV5 프로모터의 제어 하의 lacI 유전자 및 박테리오파지 T7 유전자 10의 RBS를 포함하는 인공 DNA 단편; 2) AatII-BglII - 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 P5' 및 P6'(서열번호 35 및 서열번호 36)(이들 프라이머는 AatI 및 BglII 엔도뉴클레아제에 대한 보조 인식 부위를 포함한다)를 사용하여 pUC19 플라스미드의 상응하는 서열을 PCR 증폭시켜 수득한 암피실린 내성(Ap^R)에 대한 유전자를 보유하는 DNA 단편; 3) AatII-HindIII - 미리 작제해 놓은 재조합체 플라스미드 - pMW118-ter_rrnB의 AatII-PvuI 단편을 포함하는 단편. 후자 플라스미드는 다음의 방식으로 작제하였다: 종결자 ter_rrnB을 보유하는 PstI-HindIII DNA 단편을 프라이머로서 적합한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 P7' 및 P8'(서열번호 37 및 서열번호 38)를 사용하여 이. 콜라이 MG1655 염색체의 상응하는 영역을 PCR 증폭시켜 수득하였다. 연결시키기 전에, pMW118 플라스미드 및 ter_rrnB DNA 단편(상보체, 서열번호 41)을 각각 PvuI 또는 PstI 엔도뉴클레아제로 제한하고, DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 처리하여 평활 말단을 수득한 후, AatII 또는 HindIII 엔도뉴클레아제로 제한하였다. pMWPlaclacI-ts 변이체를 작제하기 위해, pMWPlaclacI 플라스미드의 AatII-EcoRV 단편을 pSC101 복제단위의 유전자좌 par, ori 및 repA^ts 유전자를 포함하는 플라스미드 pMAN997의 AatII-EcoRV 단편으로 치환시켰다.

실시예 4

말산 효소-결핍 L-트레오닌 생산 세균의 작제

sfcA- 및 b2463-결핍 균주를 균주 VKPM B-5318로부터 작제하였다. 균주 VKPM B-5318 균주는 기관[Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika]에 1987년 11월 19일자로 수탁되었으며, VKPM B-5318의 수탁번호를 부여받았다.

말산 효소(mez) 유전자(sfcA, b2463) 중 하나가 결핍된 균주를 "적색-유도 통합" 방법을 사용하여 실시예 3과 동일한 방법으로 수득하였다. 즉. 균주 B-5318을 균주 WC196 대신 사용한 것을 제외하고 "적색-유도 통합" 방법을 사용하여 실시예 3에서와 동일한 방식으로 수행하여 클로람페니콜 내성 유전자에 의해 동정된 돌연변이체로서 sfcA- 또는 b2463-결핍 균주를 수득하였다. sfcA가 파괴된 균주 B-5318을 B-5318ΔsfcA로 명명하였다. b2463이 파괴된 균주 B-5318을 B-5318Δb2463으로서 명명하였다. sfcA 및 b2463 유전자가 파괴된 균주 B-5318, 즉 B-5318ΔsfcAΔb2463을 "적색-유도 통합" 및 절단 시스템을 사용하여 실시예 3에서와 동일한 방법으로 수득하였다. 균주 B-5318ΔsfcAΔb2463을 B-5318Δmez로 명명하였다.

실시예 5

말산-효소 결핍 균주의 평가

<5-1> b2463-결핍 균주인 L-트레오닌-생산 세균의 평가

균주 B5318Δb2463 및 B-5318을 각각 황산스트렙토마이신 20mg/L 및 황산카나마이신 25mg/L을 함유하는 LB 아가 배지(트립톤 10g/L, 효모 추출물 5/L, NaCl 5g/L 및 아가 15g/L) 상에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였고, 세균 세포를 플레이트의 1/5로부터 취하고 황산스트렙토마이신 20mg/L 및 황산카나마이신 25mg/L을 함유하는 LB 액체 배지 50㎖(트립톤 10g/L, 효모 추출물 5/L 및 NaCl 5g/L)로 접종하여 40℃에서 3.5시간 동안 144rpm으로 예비배양하였다.

예비배양을 완료한 후, 예비배양 브로스를 주 배양 배지의 10% 용적량으로 1L 들이 발효조에 담긴 주 배양 배지 300㎖ 내로 접종시켜 40℃ 및 pH 7.0에서 주 배양을 수행하였다. 주 배양 배지의 조성이 아래에 나타내어져 있다.

배양 중의 pH는 암모니아 가스를 첨가하여 7.0으로 조정하였다.

첨가된 당이 소비된 후, L-트레오닌의 양은 액체 크로마토그래피로 측정하였다. 결과는 표 5에 나타내었다.

b2463-결핍 균주 B-5318Δb2463을 사용한 경우, 트레오닌 수율이 대조군 균주 B-5318에 비교하여 증가하였다.

균주	L-트레오닌의 발효 수율(%)
B-5318 B-5318Δb2463	31.4 32.1

<5-2> sfcA-결핍 균주인 L-트레오닌-생산 세균의 평가

균주 B-5318ΔsfcA 및 B5318을 <5-1>에서와 동일한 방법으로 배양하였다.

첨가된 당이 소비된 후, L-트레오닌의 양을 액체 크로마토그래피로 측정하였다. 결과는 표 6에 나타내었다.

sfcA-결핍 균주 B-5318ΔsfcA을 사용한 경우, 트레오닌 수율이 대조군 균주 B-5318에 비교하여 증가하였다.

균주	L-트레오닌의 발효 수율(%)
B-5318 B-5318ΔsfcA	31.4 32.2

<5-3> sfcA- 및 b2463-결핍 균주인 L-라이신-생산 균주의 검정

WC196/pCABD2, WC196ΔsfcA/pCABD2 및 WC196Δb2463/pCABD2를 수득하기 위해 균주 WC196, WC196ΔsfcA 및 WC196Δb2463을 dapA, dapB 및 dapC 유전자를 내포하는 라이신 생산용 플라스미드, pCABD2(국제특허공보 제WO 01/53459호)를 사용하는 통상의 방법에 따라 수득하였다.

균주 WC196/pCABD2, WC196ΔsfcA/pCABD2 및 WC196Δb2463/pCABD2를 스트렙토마이신 20mg/l을 함유하는 L 배지(하기한 바와 같은)에서 37℃에서 배지 상의 OD₆₀₀이 약 0.6이 될 때까지 배양하였다. 이어서, 배양물과 동량의 40% 글리세롤 용액을 배양물에 첨가하였다. 교반한 후, 혼합물을 적합한 분취액으로 분배시키고 -80℃에 저장한다. 저장된 분취액을 글리세롤 스톡으로 지칭한다.

당해 균주의 글리세롤 스톡을 해동시키고, 각각 100㎕를 스트렙토마이신 20mg/l를 함유하는 L 플레이트 상에 균일하게 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세균 세포를 수득한 플레이트의 1/8로부터 취하고 스트렙토마이신 20mg/l을 함유하는 발효 배지(하기한 바와 같은) 20㎖ 내로 접종하여 37℃에서 약 16시간 동안 왕복진탕기로 배양하였다. 배양 후, 배지 내에 축적된 라이신과 잔류 글루코스의 양을 Biotech Analyzer AS210(제조원: Sakura Seiki)으로 측정하였다.

L-라이신 축적 및 세포-감산률의 결과를 표 7에 나타내었다. 세균 세포 형성에 사용된 당의 양을 감함으로써 계산된 수율인 세포-감산률은 소비된 당의 50%가 세균 세포 형성에 사용된다는 가정하에 계산된다. 결과로부터 알 수 있듯이, 균주 WC196ΔsfcA/pCABD2 및 WC196Δb2463/pCABD2의 세포-감산률은 대조 균주 WC196/pCABD2의 세포-감산률에 비교하여 증가한다.

균주		건조 세포 중량(g/L)	세포-감산률(%)
숙주	플라스미드	건조 세포 중량(g/L)	세포-감산률(%)
WC196	pCABD2	2.5	100.0
WC196ΔsfcA	pCABD2	2.3	101.6
WC196Δb2463	pCABD2	2.2	104.7

sfcA- 또는 b2463-결핍 L-라이신-생산 균주의 평가용으로 사용되는 배지가 아래에 기술되어 있다. 사용된 시약은 달리 언급하지 않는 한 제조원 [Wako Pure Chemicals] 또는 [Nakarai Tesque]로부터 입수하였다. 사용된 배지의 조성은 아래에 나타내어져 있다. pH는 모든 배지에 대해 NaOH 또는 HCl로 조정하였다.

(L 배지)
박토 트립톤(DIFCO)	10g/L
효모 추출물(DIFCO)	5g/L
NaCl	5g/L
pH 7.0
120℃에서 20분 동안 스팀-멸균함

(L 아가 배지)
L 배지
박토 아가(DIFCO)	15g/L
120℃에서 20분 동안 스팀-멸균함

(에스케리키아 세균용 L-라이신 생산 배지)
글루코스	40g/L
황산암모늄	24g/L
인산이수소칼륨	1.0g/L
황산마그네슘 칠수화물	1.0g/L
황산철(II) 칠수화물	0.01g/L
황산망간 사수화물	0.01g/L
효모 추출물	2.0g/L
탄산칼슘(약전)	30g/L
[수산화칼륨으로 pH 7.0으로 조정하고 115℃에서 10분 동안 스팀-멸균하며, 단, 글루코스 및 MgSO₄?7H₂O는 개별 멸균하였다.

실시예 6

말산 효소-결핍 균주(Δmez)의 검정

<6-1> 말산 효소 결핍 균주인 L-트레오닌-생산 세균의 검정

균주 B5318Δmez 및 B-5318 각각을 황산스트렙토마이신 20mg/L 및 황산카나마이신 25mg/L을 함유하는 LB 아가 배지(트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, NaCl 5g/L 및 아가 15g/L) 상에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였고, 세균 세포를 플레이트 중 하나로부터 취하여 LB 액체 배지(트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L 및 NaCl 5g/L)에 현탁시켰다. 현탁액 0.5㎖을 황산스트렙토마이신 20mg/L 및 황산카나마이신 25mg/L을 함유하는 LB 액체 배지 50㎖에 접종하고 39℃에서 144rpm으로 4시간 동안 예비 배양하였다.

예비배양을 완료한 후, 예비배양 브로스를 주 배양 배지의 10% 용적량으로 1L 들이 발효조에 담긴 주 배양 배지 300㎖로 접종시켜 39℃ 및 pH 7.0에서 주 배양을 수행하였다. 주 배양 배지의 조성이 아래에 나타내어져 있다.

배양 중의 pH는 암모니아 가스를 첨가하여 7.0으로 적정하였다.

첨가된 당이 소모 및 고갈된 후, 글루코스 수용액 600g/l을 첨가하였다.

24시간 주 배양 후, L-트레오닌의 양을 액체 크로마토그래피로 측정하였다. 결과는 표 10에 나타내었다.

말산 효소-결핍 균주 B-5318Δmez를 사용한 경우, 트레오닌 수율이 대조군 균주 B-5318에 비교하여 증가하였다.

균주	L-트레오닌의 발효 수율(%)
B-5318 B-5318Δmez	35.9 38.3

<6-2> 말산 효소-결핍 균주인 L-라이신-생산 세균의 평가

균주 WC196/pCABD2 및 WC196Δmez/pCABD2를 수득하기 위해 균주 WC196 및 WC196Δmez를 라이신 생산용 플라스미드, pCABD2(국제특허공보 제WO 01/53459호)를 사용하여 일반적인 방법에 따라 형질전환시켰다.

균주 WC196/pCABD2 및 WC196Δmez/pCABD2를 스트렙토마이신 20mg/l을 함유하는 L 배지(실시예 5 <5-3>에서 사용한 바와 같은)에서 37℃에서 배지 상의 OD₆₀₀이 약 0.6이 될 때까지 배양하였다. 이어서, 배양액과 동량의 40% 글리세롤 용액을 배양액에 첨가하였다. 교반한 후, 혼합물을 적합한 분취액으로 분배시키고 -80℃에 저장한다. 저장된 분취액을 글리세롤 스톡으로 지칭한다.

당해 균주의 글리세롤 스톡을 해동시키고, 각각 100㎕를 스트렙토마이신 20mg/l를 함유하는 L 플레이트 상에 균일하게 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세균 세포를 수득한 플레이트의 1/8로부터 취하고 스트렙토마이신 20mg/l을 함유하는 발효 배지(실시예 5 <5-3>에서 사용한 바와 같은) 20㎖ 내로 접종하여 37℃에서 약 48시간 동안 왕복진탕기로 배양하였다. 배양 후, 배지 내에 축적된 라이신과 잔류 글루코스의 양을 Biotech Analyzer AS210(제조원: Sakura Seiki)으로 측정하였다.

L-라이신 축적 및 세포-감산률의 결과를 표 11에 나타내었다. 세포-감산률은 소비된 당의 50%가 세균 세포 형성에 사용된다는 가정하에 계산된다. 결과로부터 알 수 있듯이, 균주 WC196Δmez/pCABD2의 세포-감산률은 대조 균주 WC196/pCABD2의 세포-감산률에 비교하여 증가한다.

균주		무수 세포 중량(g/L)	세포-감산률(%)
숙주	플라스미드	무수 세포 중량(g/L)	세포-감산률(%)
WC196	pCABD2	5.2	100.0
WC196Δmez	pCABD2	5.8	103.4

본 발명에 따라서, 에스케리키아 세균을 사용하여 발효시킴으로써 L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 방법에서 L-라이신 및/또는 L-트레오닌의 발효 수율이 증가된다. 추가로, 본 발명은 에스케리키아 속에 속하는 L-라이신 및/또는 L-트레오닌-생산 세균을 증식하기 위해 사용할 수 있다.

<110> AJINOMOTO CO., INC. <120> Method for producing L-lysine or L-threonine using Escherichia bacteria having attenuated malic enzyme activity <130> C271OPC4106 <150> JP 2003-202842 <151> 2003-07-29 <160> 41 <160> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aatatctttc agttccggca gtaccatacc ttcgcctgaa gcctgctttt ttat 54 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agcatggaag aacgccgtaa cttcaacctg ctggggcgct caagttagta taaa 54 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgacgggcag tcagaagaac caaagttgga gtgcgatgaa gcctgctttt ttat 54 <210> 4 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gacattgaag ttgacgaact cgacccggac aaatttcgct caagttagta taaa 54 <210> 5 <211> 1725 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(1725) <400> 5 atg gat att caa aaa aga gtg agt gac atg gaa cca aaa aca aaa aaa 48 Met Asp Ile Gln Lys Arg Val Ser Asp Met Glu Pro Lys Thr Lys Lys 1 5 10 15 cag cgt tcg ctt tat atc cct tac gct ggc cct gta ctg ctg gaa ttt 96 Gln Arg Ser Leu Tyr Ile Pro Tyr Ala Gly Pro Val Leu Leu Glu Phe 20 25 30 ccg ttg ttg aat aaa ggc agt gcc ttc agc atg gaa gaa cgc cgt aac 144 Pro Leu Leu Asn Lys Gly Ser Ala Phe Ser Met Glu Glu Arg Arg Asn 35 40 45 ttc aac ctg ctg ggg tta ctg ccg gaa gtg gtc gaa acc atc gaa gaa 192 Phe Asn Leu Leu Gly Leu Leu Pro Glu Val Val Glu Thr Ile Glu Glu 50 55 60 caa gcg gaa cga gca tgg atc cag tat cag gga ttc aaa acc gaa atc 240 Gln Ala Glu Arg Ala Trp Ile Gln Tyr Gln Gly Phe Lys Thr Glu Ile 65 70 75 80 gac aaa cac atc tac ctg cgt aac atc cag gac act aac gaa acc ctc 288 Asp Lys His Ile Tyr Leu Arg Asn Ile Gln Asp Thr Asn Glu Thr Leu 85 90 95 ttc tac cgt ctg gta aac aat cat ctt gat gag atg atg cct gtt att 336 Phe Tyr Arg Leu Val Asn Asn His Leu Asp Glu Met Met Pro Val Ile 100 105 110 tat acc cca acc gtc ggc gca gcc tgt gag cgt ttt tct gag atc tac 384 Tyr Thr Pro Thr Val Gly Ala Ala Cys Glu Arg Phe Ser Glu Ile Tyr 115 120 125 cgc cgt tca cgc ggc gtg ttt atc tct tac cag aac cgg cac aat atg 432 Arg Arg Ser Arg Gly Val Phe Ile Ser Tyr Gln Asn Arg His Asn Met 130 135 140 gac gat att ctg caa aac gtg ccg aac cat aat att aaa gtg att gtg 480 Asp Asp Ile Leu Gln Asn Val Pro Asn His Asn Ile Lys Val Ile Val 145 150 155 160 gtg act gac ggt gaa cgc att ctg ggg ctt ggt gac cag ggc atc ggc 528 Val Thr Asp Gly Glu Arg Ile Leu Gly Leu Gly Asp Gln Gly Ile Gly 165 170 175 ggg atg ggc att ccg atc ggt aaa ctg tcg ctc tat acc gcc tgt ggc 576 Gly Met Gly Ile Pro Ile Gly Lys Leu Ser Leu Tyr Thr Ala Cys Gly 180 185 190 ggc atc agc ccg gcg tat acc ctt ccg gtg gtg ctg gat gtc gga acg 624 Gly Ile Ser Pro Ala Tyr Thr Leu Pro Val Val Leu Asp Val Gly Thr 195 200 205 aac aac caa cag ctg ctt aac gat ccg ctg tat atg ggc tgg cgt aat 672 Asn Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Pro Leu Tyr Met Gly Trp Arg Asn 210 215 220 ccg cgt atc act gac gac gaa tac tat gaa ttc gtt gat gaa ttt atc 720 Pro Arg Ile Thr Asp Asp Glu Tyr Tyr Glu Phe Val Asp Glu Phe Ile 225 230 235 240 cag gct gtg aaa caa cgc tgg cca gac gtg ctg ttg cag ttt gaa gac 768 Gln Ala Val Lys Gln Arg Trp Pro Asp Val Leu Leu Gln Phe Glu Asp 245 250 255 ttt gct caa aaa aat gcg atg ccg tta ctt aac cgc tat cgc aat gaa 816 Phe Ala Gln Lys Asn Ala Met Pro Leu Leu Asn Arg Tyr Arg Asn Glu 260 265 270 att tgt tct ttt aac gat gac att cag ggc act gcg gcg gta aca gtc 864 Ile Cys Ser Phe Asn Asp Asp Ile Gln Gly Thr Ala Ala Val Thr Val 275 280 285 ggc aca ctg atc gca gca agc cgc gcg gca ggt ggt cag tta agc gag 912 Gly Thr Leu Ile Ala Ala Ser Arg Ala Ala Gly Gly Gln Leu Ser Glu 290 295 300 aaa aaa atc gtc ttc ctt ggc gca ggt tca gcg gga tgc ggc att gcc 960 Lys Lys Ile Val Phe Leu Gly Ala Gly Ser Ala Gly Cys Gly Ile Ala 305 310 315 320 gaa atg atc atc tcc cag acc cag cgc gaa gga tta agc gag gaa gcg 1008 Glu Met Ile Ile Ser Gln Thr Gln Arg Glu Gly Leu Ser Glu Glu Ala 325 330 335 gcg cgg cag aaa gtc ttt atg gtc gat cgc ttt ggc ttg ctg act gac 1056 Ala Arg Gln 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atc 1392 Val Ala Thr Gly Ser Pro Phe Asn Pro Val Val Trp Lys Asp Lys Ile 450 455 460 tac cct atc gcc cag tgt aac aac gcc ttt att ttc ccg ggc atc ggc 1440 Tyr Pro Ile Ala Gln Cys Asn Asn Ala Phe Ile Phe Pro Gly Ile Gly 465 470 475 480 ctg ggt gtt att gct tcc ggc gcg tca cgt atc acc gat gag atg ctg 1488 Leu Gly Val Ile Ala Ser Gly Ala Ser Arg Ile Thr Asp Glu Met Leu 485 490 495 atg tcg gca agt gaa acg ctg gcg cag tat tca cca ttg gtg ctg aac 1536 Met Ser Ala Ser Glu Thr Leu Ala Gln Tyr Ser Pro Leu Val Leu Asn 500 505 510 ggc gaa ggt atg gta ctg ccg gaa ctg aaa gat att cag aaa gtc tcc 1584 Gly Glu Gly Met Val Leu Pro Glu Leu Lys Asp Ile Gln Lys Val Ser 515 520 525 cgc gca att gcg ttt gcg gtt ggc aaa atg gcg cag cag caa ggc gtg 1632 Arg Ala Ile Ala Phe Ala Val Gly Lys Met Ala Gln Gln Gln Gly Val 530 535 540 gcg gtg aaa acc tct gcc gaa gcc ctg caa cag gcc att gac gat aat 1680 Ala Val Lys Thr Ser Ala Glu Ala Leu Gln Gln Ala Ile Asp Asp Asn 545 550 555 560 ttc tgg caa gcc gaa tac cgc gac tac cgc cgt acc tcc atc taa 1725 Phe Trp Gln Ala Glu Tyr Arg Asp Tyr Arg Arg Thr Ser Ile 565 570 <210> 6 <211> 574 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 6 Met Asp Ile Gln Lys Arg Val Ser Asp Met Glu Pro Lys Thr Lys Lys 1 5 10 15 Gln Arg Ser Leu Tyr Ile Pro Tyr Ala Gly Pro Val Leu Leu Glu Phe 20 25 30 Pro Leu Leu Asn Lys Gly Ser Ala Phe Ser Met Glu Glu Arg Arg Asn 35 40 45 Phe Asn Leu Leu Gly Leu Leu Pro Glu Val Val Glu Thr Ile Glu Glu 50 55 60 Gln Ala Glu Arg Ala Trp Ile Gln Tyr Gln Gly Phe Lys Thr Glu Ile 65 70 75 80 Asp Lys His Ile Tyr Leu Arg Asn Ile Gln Asp Thr Asn Glu Thr Leu 85 90 95 Phe Tyr Arg Leu Val Asn Asn His Leu Asp Glu Met Met Pro Val Ile 100 105 110 Tyr Thr Pro Thr Val Gly Ala Ala Cys Glu Arg Phe Ser Glu Ile Tyr 115 120 125 Arg Arg Ser Arg Gly Val Phe Ile Ser Tyr Gln Asn Arg His Asn Met 130 135 140 Asp Asp Ile Leu Gln Asn Val Pro Asn His Asn Ile Lys Val Ile Val 145 150 155 160 Val Thr Asp Gly Glu Arg Ile Leu Gly Leu Gly Asp Gln Gly Ile Gly 165 170 175 Gly Met Gly Ile Pro Ile Gly Lys Leu Ser Leu Tyr Thr Ala Cys Gly 180 185 190 Gly Ile Ser Pro Ala Tyr Thr Leu Pro Val Val Leu Asp Val Gly Thr 195 200 205 Asn Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Pro Leu Tyr Met Gly Trp Arg Asn 210 215 220 Pro Arg Ile Thr Asp Asp Glu Tyr Tyr Glu Phe Val Asp Glu Phe Ile 225 230 235 240 Gln Ala Val Lys Gln Arg Trp Pro Asp Val Leu Leu Gln Phe Glu Asp 245 250 255 Phe Ala Gln Lys Asn Ala Met Pro Leu Leu Asn Arg Tyr Arg Asn Glu 260 265 270 Ile Cys Ser Phe Asn Asp Asp Ile Gln Gly Thr Ala Ala Val Thr Val 275 280 285 Gly Thr Leu Ile Ala Ala Ser Arg Ala Ala Gly Gly Gln Leu Ser Glu 290 295 300 Lys Lys Ile Val Phe Leu Gly Ala Gly Ser Ala Gly Cys Gly Ile Ala 305 310 315 320 Glu Met Ile Ile Ser Gln Thr Gln Arg Glu Gly Leu Ser Glu Glu Ala 325 330 335 Ala Arg Gln Lys Val Phe Met Val Asp Arg Phe Gly Leu Leu Thr Asp 340 345 350 Lys Met Pro Asn Leu Leu Pro Phe Gln Thr Lys Leu Val Gln Lys Arg 355 360 365 Glu Asn Leu Ser Asp Trp Asp Thr Asp Ser Asp Val Leu Ser Leu Leu 370 375 380 Asp Val Val Arg Asn Val 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ggc cgt gag cca aac atg gcg gaa acc aaa gcc gca tat 720 Ile Tyr Gln Gly Arg Glu Pro Asn Met Ala Glu Thr Lys Ala Ala Tyr 225 230 235 240 gcg gtg gtg gat gac ggc aaa cgt acc ctc gat gat gtg att gaa ggc 768 Ala Val Val Asp Asp Gly Lys Arg Thr Leu Asp Asp Val Ile Glu Gly 245 250 255 gcg gat att ttc ctg ggc tgt tcc ggc ccg aaa gtg ctg acc cag gaa 816 Ala Asp Ile Phe Leu Gly Cys Ser Gly Pro Lys Val Leu Thr Gln Glu 260 265 270 atg gtg aag aaa atg gct cgt gcg cca atg atc ctg gcg ctg gcg aac 864 Met Val Lys Lys Met Ala Arg Ala Pro Met Ile Leu Ala Leu Ala Asn 275 280 285 ccg gaa ccg gaa att ctg ccg ccg ctg gcg aaa gaa gtg cgt ccg gat 912 Pro Glu Pro Glu Ile Leu Pro Pro Leu Ala Lys Glu Val Arg Pro Asp 290 295 300 gcc atc att tgc acc ggt cgt tct gac tat ccg aac cag gtg aac aac 960 Ala Ile Ile Cys Thr Gly Arg Ser Asp Tyr Pro Asn Gln Val Asn Asn 305 310 315 320 gtc ctg tgc ttc ccg ttc atc ttc cgt ggc gcg ctg gac gtt ggc gca 1008 Val Leu Cys Phe Pro Phe Ile Phe Arg Gly Ala Leu Asp Val Gly Ala 325 330 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Ile Cys Gly Thr Val Gly Asp Tyr 545 550 555 560 cat gaa cat ttt agc gtg gtg aaa aat gtc ttt ggt tat cgc gat ggc 1728 His Glu His Phe Ser Val Val Lys Asn Val Phe Gly Tyr Arg Asp Gly 565 570 575 gtt cac acc gca ggt gcc atg aac gcg ctg ctg ctg ccg agt ggt aac 1776 Val His Thr Ala Gly Ala Met Asn Ala Leu Leu Leu Pro Ser Gly Asn 580 585 590 acc ttt att gcc gat aca tat gtt aat gat gaa ccg gat gca gaa gag 1824 Thr Phe Ile Ala Asp Thr Tyr Val Asn Asp Glu Pro Asp Ala Glu Glu 595 600 605 ctg gcg gag atc acc ttg atg gcg gca gaa act gtc cgt cgt ttt ggt 1872 Leu Ala Glu Ile Thr Leu Met Ala Ala Glu Thr Val Arg Arg Phe Gly 610 615 620 att gag ccg cgc gtt gct ttg ttg tcg cac tcc aac ttt ggt tct tct 1920 Ile Glu Pro Arg Val Ala Leu Leu Ser His Ser Asn Phe Gly Ser Ser 625 630 635 640 gac tgc ccg tcg tcg agc aaa atg cgt cag gcg ctg gaa ctg gtc agg 1968 Asp Cys Pro Ser Ser Ser Lys Met Arg Gln Ala Leu Glu Leu Val Arg 645 650 655 gaa cgt gca cca gaa ctg atg att gat ggt gaa atg cac ggc gat gca 2016 Glu Arg 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tca gga cac aaa cac aag cct ctg 192 Ile Gln Ala Asn Ile Glu Leu Phe Ser Gly His Lys His Lys Pro Leu 50 55 60 aca gcg aga atc aac agt gat aat tcc gtt acg tta cat tca tgg ctt 240 Thr Ala Arg Ile Asn Ser Asp Asn Ser Val Thr Leu His Ser Trp Leu 65 70 75 80 gat cgc tac gaa aaa atc ctg gcc agc aga gga atc aag cag aag aca 288 Asp Arg Tyr Glu Lys Ile Leu Ala Ser Arg Gly Ile Lys Gln Lys Thr 85 90 95 ctc ata aat tac atg agc aaa att aaa gca ata agg agg ggt ctg cct 336 Leu Ile Asn Tyr Met Ser Lys Ile Lys Ala Ile Arg Arg Gly Leu Pro 100 105 110 gat gct cca ctt gaa gac atc acc aca aaa gaa att gcg gca atg ctc 384 Asp Ala Pro Leu Glu Asp Ile Thr Thr Lys Glu Ile Ala Ala Met Leu 115 120 125 aat gga tac ata gac gag ggc aag gcg gcg tca gcc aag tta atc aga 432 Asn Gly Tyr Ile Asp Glu Gly Lys Ala Ala Ser Ala Lys Leu Ile Arg 130 135 140 tca aca ctg agc gat gca ttc cga gag gca ata gct gaa ggc cat ata 480 Ser Thr Leu Ser Asp Ala Phe Arg Glu Ala Ile Ala Glu Gly His Ile 145 150 155 160 aca aca aac cat gtc gct gcc act cgc gca gca aaa tca gag gta agg 528 Thr Thr Asn His Val Ala Ala Thr Arg Ala Ala Lys Ser Glu Val Arg 165 170 175 aga tca aga ctt acg gct gac gaa tac ctg aaa att tat caa gca gca 576 Arg Ser Arg Leu Thr Ala Asp Glu Tyr Leu Lys Ile Tyr Gln Ala Ala 180 185 190 gaa tca tca cca tgt tgg ctc aga ctt gca atg gaa ctg gct gtt gtt 624 Glu Ser Ser Pro Cys Trp Leu Arg Leu Ala Met Glu Leu Ala Val Val 195 200 205 acc ggg caa cga gtt ggt gat tta tgc gaa atg aag tgg tct gat atc 672 Thr Gly Gln Arg Val Gly Asp Leu Cys Glu Met Lys Trp Ser Asp Ile 210 215 220 gta gat gga tat ctt tat gtc gag caa agc aaa aca ggc gta aaa att 720 Val Asp Gly Tyr Leu Tyr Val Glu Gln Ser Lys Thr Gly Val Lys Ile 225 230 235 240 gcc atc cca aca gca ttg cat att gat gct ctc gga ata tca atg aag 768 Ala Ile Pro Thr Ala Leu His Ile Asp Ala Leu Gly Ile Ser Met Lys 245 250 255 gaa aca ctt gat aaa tgc aaa gag att ctt ggc gga gaa acc ata att 816 Glu Thr Leu Asp Lys Cys Lys Glu Ile Leu Gly Gly Glu Thr Ile Ile 260 265 270 gca tct act cgt cgc gaa ccg ctt tca tcc ggc aca gta tca agg tat 864 Ala Ser Thr Arg Arg Glu Pro Leu Ser Ser Gly Thr Val Ser Arg Tyr 275 280 285 ttt atg cgc gca cga aaa gca tca ggt ctt tcc ttc gaa ggg gat ccg 912 Phe Met Arg Ala Arg Lys Ala Ser Gly Leu Ser Phe Glu Gly Asp Pro 290 295 300 cct acc ttt cac gag ttg cgc agt ttg tct gca aga ctc tat gag aag 960 Pro Thr Phe His Glu Leu Arg Ser Leu Ser Ala Arg Leu Tyr Glu Lys 305 310 315 320 cag ata agc gat aag ttt gct caa cat ctt ctc ggg cat aag tcg gac 1008 Gln Ile Ser Asp Lys Phe Ala Gln His Leu Leu Gly His Lys Ser Asp 325 330 335 acc atg gca tca cag tat cgt gat gac aga ggc agg gag tgg gac aaa 1056 Thr Met Ala Ser Gln Tyr Arg Asp Asp Arg Gly Arg Glu Trp Asp Lys 340 345 350 att gaa atc aaa taa 1071 Ile Glu Ile Lys 355 <210> 14 <211> 356 <212> PRT <213> lambda phage <400> 14 Met Gly Arg Arg Arg Ser His Glu Arg Arg Asp Leu Pro Pro Asn Leu 1 5 10 15 Tyr Ile Arg Asn Asn Gly Tyr Tyr Cys Tyr Arg Asp Pro Arg Thr Gly 20 25 30 Lys Glu Phe Gly Leu Gly Arg Asp Arg 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tcctctacgc cggacgcatc gtggccggca tcaccggcgc 420 cacaggtgcg gttgctggcg cctatatcgc cgacatcacc gatggggaag atcgggctcg 480 ccacttcggg ctcatgagcg cttgtttcgg cgtgggtatg gtggcaggcc ccgtggccgg 540 gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg tgctcaacgg 600 cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag agcgtcgacc 660 gatgcccttg agagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat 720 cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc 780 gctctgggtc attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc gcgacgatga tcggcctgtc 840 gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac 900 caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg gcggccgacg cgctgggcta 960 cgtcttgctg gcgttcgcga cgcgaggctg gatggccttc cccattatga ttcttctcgc 1020 ttccggcggc atcgggatgc ccgcgttgca ggccatgctg tccaggcagg tagatgacga 1080 ccatcaggga cagcttcaag gatcgctcgc ggctcttacc agcctaactt cgatcactgg 1140 accgctgatc gtcacggcga tttatgccgc ctcggcgagc acatggaacg ggttggcatg 1200 gattgtaggc gccgccctat accttgtctg cctccccgcg ttgcgtcgcg gtgcatggag 1260 ccgggccacc tcgacctgaa tggaagccgg cggcacctcg ctaacggatt caccactcca 1320 actagaaagc ttaacacaga aaaaagcccg cacctgacag tgcgggcttt ttttttcgac 1380 cactgcag 1388 <210> 30 <211> 1162 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cloned DNA fragment containing artificial DNA fragment including promoter PA2 (early promoter of phage T7), cat gene for chloramphenicol resistance (CmR), transcription terminator ter_thrL and attR <400> 30 agatctccgg ataagtagac agcctgataa gtcgcacgaa aaacaggtat tgacaacatg 60 aagtaacatg cagtaagata caaatcgcta ggtaacacta gcagcgtcaa ccgggcgctc 120 tagctagagc caagctagct tggccggatc cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa 180 tggagaaaaa aatcactgga tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac 240 attttgaggc atttcagtca gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata 300 ttacggcctt tttaaagacc gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc 360 acattcttgc ccgcctgatg aatgctcatc cggaattccg tatggcaatg aaagacggtg 420 agctggtgat atgggatagt gttcaccctt gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa 480 cgttttcatc gctctggagt gaataccacg acgatttccg gcagtttcta cacatatatt 540 cgcaagatgt ggcgtgttac ggtgaaaacc tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga 600 atatgttttt cgtctcagcc aatccctggg tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg 660 ccaatatgga caacttcttc gcccccgttt tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg 720 acaaggtgct gatgccgctg gcgattcagg ttcatcatgc cgtctgtgat ggcttccatg 780 tcggcagaat gcttaatgaa ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaat 840 ttttttaagg cagttattgg tgcccttaaa cgcctggtgc tacgcctgaa taagtgataa 900 taagcggatg aatggcagaa attcgtcgaa gcttaacaca gaaaaaagcc cgcacctgac 960 agtgcgggct ttttttttcg accactgcag tctgttacag gtcactaata ccatctaagt 1020 agttgattca tagtgactgc atatgttgtg ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat 1080 gcaaaatcta atttaatata ttgatattta tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt 1140 tatactaact tgagcgtcta ga 1162 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide P1' <400> 31 ctaatatcga tgaagattct tgctcaa 27 <210> 32 <211> 34 <212> DNA 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<223> cloned DNA fragment containing cI repressor gene and promoter regions <400> 39 tcgatgaaga ttcttgctca attgttatca gctatgcgcc gaccagaaca ccttgccgat 60 cagccaaacg tctcttcagg ccactgacta gcgataactt tccccacaac ggaacaactc 120 tcattgcatg ggatcattgg gtactgtggg tttagtggtt gtaaaaacac ctgaccgcta 180 tccctgatca gtttcttgaa ggtaaactca tcacccccaa gtctggctat gcagaaatca 240 cctggctcaa cagcctgctc agggtcaacg agaattaaca ttccgtcagg aaagcttggc 300 ttggagcctg ttggtgcggt catggaatta ccttcaacct caagccagaa tgcagaatca 360 ctggcttttt tggttgtgct tacccatctc tccgcatcac ctttggtaaa ggttctaagc 420 tcaggtgaga acatccctgc ctgaacatga gaaaaaacag ggtactcata ctcacttcta 480 agtgacggct gcatactaac cgcttcatac atctcgtaga tttctctggc gattgaaggg 540 ctaaattctt caacgctaac tttgagaatt tttgcaagca atgcggcgtt ataagcattt 600 aatgcattga tgccattaaa taaagcacca acgcctgact gccccatccc catcttgtct 660 gcgacagatt cctgggataa gccaagttca tttttctttt tttcataaat tgctttaagg 720 cgacgtgcgt cctcaagctg ctcttgtgtt aatggtttct tttttgtgct catacgttaa 780 atctatcacc gcaagggata aatatctaac accgtgcgtg ttgactattt tacctctggc 840 ggtgataatg gttgcatgta ctaaggaggt tgtatggaa 879 <210> 40 <211> 1290 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cloned DNA fragment containing int-xis genes <400> 40 attatttgat ttcaattttg tcccactccc tgcctctgtc atcacgatac tgtgatgcca 60 tggtgtccga cttatgcccg agaagatgtt gagcaaactt atcgcttatc tgcttctcat 120 agagtcttgc agacaaactg cgcaactcgt gaaaggtagg cggatcccct tcgaaggaaa 180 gacctgatgc ttttcgtgcg cgcataaaat accttgatac tgtgccggat gaaagcggtt 240 cgcgacgagt agatgcaatt atggtttctc cgccaagaat ctctttgcat ttatcaagtg 300 tttccttcat tgatattccg agagcatcaa tatgcaatgc tgttgggatg gcaattttta 360 cgcctgtttt gctttgctcg acataaagat atccatctac gatatcagac cacttcattt 420 cgcataaatc accaactcgt tgcccggtaa caacagccag ttccattgca agtctgagcc 480 aacatggtga tgattctgct gcttgataaa ttttcaggta ttcgtcagcc gtaagtcttg 540 atctccttac ctctgatttt gctgcgcgag tggcagcgac atggtttgtt gttatatggc 600 cttcagctat tgcctctcgg aatgcatcgc tcagtgttga tctgattaac ttggctgacg 660 ccgccttgcc ctcgtctatg tatccattga gcattgccgc aatttctttt gtggtgatgt 720 cttcaagtgg agcatcaggc agacccctcc ttattgcttt aattttgctc atgtaattta 780 tgagtgtctt ctgcttgatt cctctgctgg ccaggatttt ttcgtagcga tcaagccatg 840 aatgtaacgt aacggaatta tcactgttga ttctcgctgt cagaggcttg tgtttgtgtc 900 ctgaaaataa ctcaatgttg gcctgtatag cttcagtgat tgcgattcgc ctgtctctgc 960 ctaatccaaa ctctttaccc gtccttgggt ccctgtagca gtaatatcca ttgtttctta 1020 tataaaggtt agggggtaaa tcccggcgct catgacttcg ccttcttccc atttctgatc 1080 ctcttcaaaa ggccacctgt tactggtcga tttaagtcaa cctttaccgc tgattcgtgg 1140 aacagatact ctcttccatc cttaaccgga ggtgggaata tcctgcattc ccgaacccat 1200 cgacgaactg tttcaaggct tcttggacgt cgctggcgtg cgttccactc ctgaagtgtc 1260 aagtacatcg caaagtctcc gcaattacac 1290 <210> 41 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ter_rrnB fragment (complement) <400> 41 caaaaagagt ttgtagaaac gcaaaaaggc catccgtcag gatggccttc tgcttaattt 60 gatgcctggc agtttatggc gggcgtcctg cccgccaccc tccgggccgt tgcttcgcaa 120 cgttcaaatc cgctcccggc ggatttgtcc tactcaggag agcgttcacc gacaaacaac 180 agataaaacg aaaggcccag tctttcgact gagcctttcg ttttatttga tgcctggcag 240 ttccctactc tcgcatgggg agaccccaca ctaccatcgg cgctacggcg tttcacttct 300 gagttcggca tggggtcagg tgggaccacc gcgctactgc cgccaggcaa a 351

Claims

L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산하는 능력을 갖는 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) 세균을 배지에서 배양하여 L-라이신 또는 L-트레오닌을 생산 및 분비시키는 단계 및 상기 배지로부터 L-라이신 또는 L-트레오닌을 수거하는 단계를 포함하고,

여기서, 상기 세균의 염색체상의 말산 효소를 암호화하는 유전자가 제거되거나, 또는 상기 세균의 염색체상의 말산 효소를 암호화하는 유전자 또는 이의 프로모터 또는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno(SD)) 서열 또는 이들 모두가 비변형 균주에 비해 말산 효소 활성이 감소되도록 변형되고, 이때 상기 말산 효소를 암호화하는 유전자가 sfcA, b2463 또는 이둘 모두임을 특징으로 하는, L-라이신 또는 L-트레오닌의 생산 방법.
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제1항에 있어서, 말산 효소가

(A) 서열번호 6에 나타내어진 아미노산 서열을 갖는 단백질 및

(B) 서열번호 6에 나타내어진 아미노산 서열 내 1개 내지 5개 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 갖고 말산 효소 활성을 갖는 단백질

로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 L-라이신 또는 L-트레오닌의 생산 방법.
제1항에 있어서, 말산 효소가

(C) 서열번호 8에 나타내어진 아미노산 서열을 갖는 단백질 및

(D) 서열번호 8에 나타내어진 아미노산 서열 내 1개 내지 5개 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 갖고 말산 효소 활성을 갖는 단백질

로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 L-라이신 또는 L-트레오닌의 생산 방법.
제1항에 있어서, 말산 효소를 암호화하는 유전자가 서열번호 5에 나타내어진 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA임을 특징으로 하는 L-라이신 또는 L-트레오닌의 생산 방법.
제1항에 있어서, 말산 효소를 암호화하는 유전자가 서열번호 7에 나타내어진 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA임을 특징으로 하는 L-라이신 또는 L-트레오닌의 생산 방법.
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