CN104878034B - L-赖氨酸基因工程生产菌 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株L‑赖氨酸基因工程菌，保藏号为CCTCC M 2015232。本发明所构建的L‑赖氨酸基因工程菌能够实现发酵过程中发酵液中L‑赖氨酸的有效积累，提高了L‑赖氨酸的产量及糖酸转化率，具有广泛的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，是关于一种L-赖氨酸基因工程生产菌。
背景技术
L-赖氨酸作为人类和动物必需的氨基酸之一，在饲料添加剂、食品强化剂和医药产品等方面被广泛使用，其中约90％用于饲料工业，10％用于食品和医药行业。目前，L-赖氨酸已是世界上第二大氨基酸品种。
L-赖氨酸的生产方法主要有四种，分别是提取法、化学合成法、酶法和微生物发酵法，前三种方法由于前体物成本高、工艺复杂等缺点，难以达到工业化生产的目的，发酵法制备L-赖氨酸是当前的主要生产方式。发酵法生产L-赖氨酸的微生物主要是谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌，黄色短杆菌、枯草芽孢杆菌等也有使用。
利用谷氨酸棒杆菌或黄色短杆菌生产L-赖氨酸，多采用诱变方法获得高产菌株。1960年日本的木下祝郎、中山清等经紫外诱变获得了一株谷氨酸棒杆菌营养缺陷型菌株，开始了发酵法生产L-赖氨酸。Chaudhuri A(Chaudhuri A,Mishra AK,Nanda G.Lysineexcretion by S-(2-aminoethyl)L-cysteine resistant mutants of Bacillussubtilis.Acta Microbiol Pol.1983；32(1):37-45.)等以枯草芽孢杆菌为出发菌株，经MNNG诱变处理后，利用AEC平板进行抗反馈抑制天冬氨酸激酶突变株的筛选，再利用紫外诱变，获得了产酸达21g/L的突变株。但是由于谷氨酸棒杆菌和短杆菌的最适生长温度是30度，生产效率在一定程度上制约了大规模发酵生产赖氨酸的需求，另外传统诱变方法由于其局限性，获取高产菌株的难度非常大。
随着基因工程技术的发展，大肠杆菌作为背景研究得最为清楚的模式微生物，具有生长速度快，遗传操作方法成熟的特点，适合作为宿主菌发酵生产赖氨酸。大肠杆菌合成赖氨酸通过天冬氨酸途径，从天冬氨酸开始，经过九步酶催化途径合成赖氨酸。天冬氨酸激酶(lysC编码)作为合成途径中的第一个关键酶，受该途径的末端产物赖氨酸反馈抑制，Brigitte Dauce-Le Reverend(Brigitte Dauce-Le Reverend,Michèle Boitel,AlainM.Deschamps,et al.Improvement of Escherichia coli strains overproducinglysine using recombinant DNA techniques.European J Appl Microbiol Biotechnol(1982)15:227-231.)等报道的高产赖氨酸的大肠杆菌TOC R21中的lysC发生了突变，天冬氨酸激酶活力较野生型提高了10倍。二氢吡啶二羧酸合酶(dapA编码)作为赖氨酸生物合成分支途径中的第一个酶，也是控制L-赖氨酸产量的最主要酶，在大肠杆菌中，dapA被赖氨酸抑制；而在黄色短杆菌或谷氨酸棒杆菌中，dapA不被末端产物赖氨酸抑制，Jong-Won Oh(Jong-Won Oh,Jin-Ho Lee Kap-Soo Noh,Hyune-Hwan Lee,et al.Improved L-lysineproduction by the amplification of the Corynebacterium glutamicum dapA geneencoding dihydrodipicolinate synthetase in E.coli.Biotechnology letters Vol13No10,727-737(1991).)等将谷氨酸棒杆菌的dapA基因在大肠杆菌中进行过表达，提高了赖氨酸产量。日本味之素申请的专利US6040160中，报道了解除dapA、lysC反馈抑制作用的突变位点，增强了大肠杆菌L-赖氨酸合成途径相关基因的表达，过表达了来源于谷氨酸棒杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)，可直接催化四氢二吡啶二羧酸转化为二氨基庚二酸，提高了L-赖氨酸产量，糖酸转化率达到了30％；在EP0796912A1专利中，同时失活L-赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldcC，减少了L-赖氨酸降解，使赖氨酸产量增加了约2.3倍。
发明内容
本发明利用基因工程技术改造大肠杆菌，并根据代谢流分析，增强L-赖氨酸合成途径的相关基因，弱化分支代谢途径，筛选获得一株L-赖氨酸高产菌株CCTCC M 2015232，能有效的积累L-赖氨酸，具有广泛的工业应用价值。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种L-赖氨酸基因工程生产菌的构建方法。
本发明的第二个目的在于提供一种L-赖氨酸基因工程生产菌。
本发明的第三个目的在于提供一种L-赖氨酸的生产方法。
本发明的第四个目的在于提供所述L-赖氨酸基因工程生产菌用于生产L-赖氨酸的应用。
为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
根据本发明的第一个方面，一种L-赖氨酸基因工程生产菌的构建方法，包括以下步骤：
A、敲除原始菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因，获得基因敲除菌株，所述敲除的基因选自：cadA、ldcC、gltI、thrC、cynT、thrL和maeB中的一个或多个；
B、增强步骤A中所述基因敲除菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因，获得基因增强菌株，所述增强的基因选自：ybjE和cyo operon中的一个或多个；
C、构建包含过表达原始菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因的重组质粒，所述过表达的基因选自dapA*(H118Y)、lysC*(M318I,G323D)、dapB*(I114T)、ddh、ppc、aspA、pntAB和asd中的一个或多个；
D、将步骤C中所述重组质粒导入步骤A中所述基因敲除菌株和/或步骤B中所述基因增强菌株中，获得L-赖氨酸基因工程生产菌。
根据本发明的优选实施例，所述的L-赖氨酸基因工程生产菌的构建方法包括以下步骤：
A、敲除原始菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因，获得基因敲除菌株，所述敲除的基因为cadA、ldcC、gltI、thrC、cynT、thrL和maeB；
B、增强步骤A中所述基因敲除菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因，获得基因增强菌株，所述增强的基因为ybjE和cyo operon；
C、构建包含过表达原始菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因的重组质粒，所述过表达的基因为dapA*(H118Y)、lysC*(M318I,G323D)、dapB*(I114T)、ddh、ppc、aspA、pntAB和asd；
D、将步骤C中所述重组质粒导入步骤B中所述基因增强菌株中，获得L-赖氨酸基因工程生产菌。
根据本发明，所述原始菌株为大肠杆菌。
根据本发明的优选实施例，所述大肠杆菌为大肠杆菌MG1655。
根据本发明的第二个方面，根据如上所述的方法构建获得的L-赖氨酸基因工程生产菌。
根据本发明，一种L-赖氨酸基因工程生产菌，保藏号为CCTCC M 2015232。
根据本发明的第三个方面，一种L-赖氨酸的生产方法，通过发酵如上所述的L-赖氨酸基因工程生产菌生产。
根据本发明的优选实施例，所述发酵的发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO4 16g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·7H2O0.01g/L，酵母粉2g/L，CaCO3 30g/L，KOH调pH7.0。
根据本发明的第四个方面，如上所述的L-赖氨酸基因工程菌可用于生产L-赖氨酸。
本发明所构建的L-赖氨酸基因工程菌CCTCC M 2015232能够实现发酵过程中发酵液中L-赖氨酸的有效积累，提高了L-赖氨酸的产量及糖酸转化率，具有广泛的工业应用前景。
附图说明
图1为重组质粒pTet的示意图。
图2为重组质粒pKan的示意图。
图3为MG1655及两株基因工程菌CIBTS1412和CIBTS1640的赖氨酸产量的示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而并非用于限定本发明的范围。
本发明构建的L-赖氨酸高产基因工程菌大肠杆菌CIBTS1640已于2015年4月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，菌种的拉丁学名是Escherichia coli，中文名称是大肠杆菌，保藏号为CCTCC M 2015232。
本发明中涉及的基因名称解释如下：
cadA：赖氨酸脱羧酶；
ldcC：赖氨酸脱羧酶2；
gltI：谷氨酸、天冬氨酸周质结合蛋白；
thrC：苏氨酸合成酶；
cynT：碳酸酐酶；
thrL：苏氨酸操纵子前导肽；
maeB：苹果酸脱氢酶；
ybjE：转运蛋白；
cyo operon：细胞色素o型氧化酶；
yihF：DU945家族蛋白；
dapA：二氢吡啶二羧酸合成酶；
lysC：天冬氨酸激酶III；
dapB：二氢吡啶二羧酸还原酶；
ddh：二氨基庚二酸脱氢酶；
ppc：磷酸烯醇式羧化酶；
aspA：天冬氨酸氨裂解酶；
pntAB：吡啶核苷酸转氢酶；
asd：天门冬氨酸半醛脱氢酶。
根据大肠杆菌中L-赖氨酸的代谢途径，本发明在菌株MG1655的基础上构建了一系列突变体，如：cadA、ldcC、gltI、thrC、cynT、thrL和maeB等的敲除或失活及ybjE和cyooperon等的增强，其中cadA和ldcC的敲除阻断了L-赖氨酸的分解代谢，gltI、thrC、thrL、maeB的敲除切断了分支代谢从而有利于L-赖氨酸的积累，cynT的敲除和cyo operon的增强可以提高抗逆能力，ybjE的过表达增强了L-赖氨酸的外排。在这些突变体中在合适的载体上组合表达dapA*、lysC*、dapB*、ddh、ppc、pntAB、aspA、asd等，构建了一系列的L-赖氨酸基因工程菌。
大肠杆菌MG1655突变菌株的构建，参考Carolina A.Contador等的文献(Ensemblemodeling for strain development of L-lysine-producing Escherichia coli,Carolina A.Contador,MatthewL.Rizk,et al.Metabolic Engineering,2009)，利用JiangY等的文献的Crispr-Cas9方法(Multigene Editing in the Escherichia coli Genomevia the CRISPR-Cas9System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl Environ Microbiol,2015)进行大肠杆菌基因组中cadA、ldcC、gltI、thrC和maeB等基因的敲除及ybjE等基因的增强。
以下实施例中，所述卡那霉素在培养基中的终浓度为50μg/ml，所述壮观霉素在培养基中的终浓度为50μg/ml，所述氨苄霉素在培养基中的终浓度为100μg/ml，所述氯霉素在培养基中的终浓度为34μg/ml，所述四环素在培养基中的终浓度为7.5μg/ml。
以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示。
表1、引物序列信息
实施例1：敲除cadA基因的菌株MG1655(ΔcadA)的制备
(1)PCR扩增：以cadA-F(S)/cadA-R(S)为引物和模板，PCR扩增cadA(HR)片段，约100bp，胶回收；
(2)感受态细胞制备：将pCas质粒(来源于文献：Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.ApplEnviron Microbiol,2015)转化入MG1655(购于CGSC(E.coli Genetic Stock Center,YaleUniversity,New Haven,Connecticut,USA))感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》第1章96页)，挑取MG1655/pCas单菌落于4ml含卡那霉素的LB试管中，30℃220r/min培养，在菌浓OD600为0.4前一小时加入终浓度为10mM阿拉伯糖进行诱导至OD600为0.4；
(3)电转：将cadA(HR)片段及pTargetF-cadA质粒(来源于文献：MultigeneEditing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9System,Jiang Y,ChenB,et al.Appl Environ Microbiol,2015)电转入MG1655/pCas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用cadAFOU/cadAROU引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.5kb；
(4)质粒丢失：挑取菌落PCR验证为阳性单菌落，接种于含卡那霉素(终浓度为50ug/ml)的LB试管中，同时加入终浓度为1mM IPTG，30℃过夜培养；次日试管中菌液直接划线于含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养；次日挑取单菌落转接于含壮观霉素的LB平板上，若不能生长，表明pTargetF-cadA质粒已丢失。挑取pTargetF-cadA质粒丢失阳性菌落，接种于LB试管中，37℃过夜培养；次日菌液划线接种于LB平板上，37℃过夜培养；次日挑取单菌落转接于含卡那霉素LB平板上，若不能生长，表明pCas质粒丢失，得到MG1655(ΔcadA)菌株。
实施例2：敲除ldcC基因的菌株MG1655(ΔcadA,ΔldcC)的制备
(1)PCR扩增：以ldcC-F(S)/ldcC-R(S)为引物和模板，PCR扩增ldcC(HR)片段，约100bp；
(2)感受态细胞制备：将pCas质粒转化入实施例1获得的MG1655(ΔcadA)感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》第1章96页)，挑取MG1655(ΔcadA)/pCas单菌落于4ml含卡那霉素的LB试管中，制备感受态方法同实施例1(2)；
(3)ldcC-N20-Spec质粒构建：以实施例1中的pTargetF-cadA质粒为模板，ldcC-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增ldcC-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，获得ldcC-N20-Spec质粒；
(4)电转：将ldcC(HR)片段及ldcC-N20-Spec质粒电转入MG1655(ΔcadA)/pCas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用ldcCup/ldcCROU引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.2kb；
(5)质粒丢失：方法同实施例1(4)，去除ldcC-N20-Spec/pCas双质粒，得到MG1655(ΔcadA,ΔldcC)。
实施例3：过表达ybjE基因的菌株MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE)的制备
(1)PCR扩增：以MG1655基因组为模板，ybjEup/ybjE-R(Ptac)为引物，PCR扩增Ptac-ybjE1片段，约500bp；
(2)PCR扩增：以Ptac-ybjE1片段为模板，ybjEup/ybjE-R(40)为引物，PCR扩增Ptac-ybjE(HR)片段，约600bp；
(3)ybjE-N20-Spec质粒构建：以实施例1中的pTargetF-cadA质粒为模板，ybjE-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增ybjE-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，获得ybjE-N20-Spec质粒；
(3)感受态细胞制备：将pCas质粒转化入实施例2获得的MG1655(ΔcadA,ΔldcC)感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》第1章96页)，挑取MG1655(ΔcadA,ΔldcC)/pCas单菌落于4ml含卡那霉素的LB试管中，制备方法同实施例1(2)；
(4)电转：将Ptac-ybjE(HR)片段及ybjE-N20-Spec质粒电转入MG1655(ΔcadA,ΔldcC)/pCas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜；长出单菌落利用ybjE-V-F/Ptac-I-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.1kb；
(5)质粒丢失：方法同实施例1(4)，去除ybjE-N20-Spec/pCas双质粒，得到MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE)。
实施例4：敲除cynT基因的菌株MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT)的制备(1)PCR扩增：以cyn-F(N)/cyn-R(N)为引物和模板，PCR扩增cynT(HR)片段，约100bp；
(2)感受态细胞制备：将pCas质粒转化入实施例3获得的MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE)感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》第1章96页)，挑取MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE)/pCas单菌落于4ml含卡那霉素的LB试管中，制备感受态方法同实施例1(2)；
(3)cynT-N20-Spec质粒构建：以实施例1中的pTargetF-cadA质粒为模板，cynT-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增cynT-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，获得cynT-N20-Spec质粒；
(4)电转：将cynT(HR)片段及cynT-N20-Spec质粒电转入MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE)/pCas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用cyn-F/cyn-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约3kb；
(5)质粒丢失：方法同实施例1(4)，去除cynT-N20-Spec/pCas双质粒，得到MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT)。
实施例5：敲除gltI基因的菌株MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI)的制备
(1)PCR扩增：以gltI-F(S)new/gltI-R(S)new为引物和模板，PCR扩增gltI(HR)片段，约100bp；
(2)感受态细胞制备：将pCas质粒转化入实施例4获得的MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT)感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》第1章96页)，挑取MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT)/pCas单菌落于4ml含卡那霉素的LB试管中，制备感受态方法同实施例1(2)；
(3)gltI-N20-Spec质粒构建：以实施例1中的pTargetF-cadA质粒为模板，gltI-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增gltI-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，获得gltI-N20-Spec质粒；
(4)电转：将gltI(HR)片段及gltI-N20-Spec质粒电转入MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT)/pCas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用gltI-F/gltI-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.2kb；
(5)质粒丢失：方法同实施例1(4)，去除gltI-N20-Spec/pCas双质粒，得到MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI)。
实施例6：敲除thrC基因的菌株MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI,ΔthrC)的制备
(1)PCR扩增：以thrC-F(HH)/thrC-R(HH)为引物和模板，PCR扩增thrC(HR)片段，约100bp；
(2)感受态细胞制备：将pCas质粒转化入实施例5获得的MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI)感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》第1章96页)，挑取MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI)/pCas单菌落于4ml含卡那霉素的LB试管中，制备感受态方法同实施例1(2)；
(3)thrC-N20-Spec质粒构建：以实施例1中的pTargetF-cadA质粒为模板，thrC-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增thrC-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，获得thrC-N20-Spec质粒；
(4)电转：将thrC(HR)片段及thrC-N20-Spec质粒电转入MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI)/pCas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用ThrC-veri-s/ThrC-veri-as引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1kb；
(5)质粒丢失：方法同实施例1(4)，去除thrC-N20-Spec/pCas双质粒，得到MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI,ΔthrC)。
实施例7：敲除thrL基因的菌株MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI,ΔthrC,ΔthrL)的制备
(1)PCR扩增：以thrL-F/thrL-R为引物和模板，PCR扩增thrL(HR)片段，约100bp；
(2)感受态细胞制备：将pCas质粒转化入实施例6获得的MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI,ΔthrC)感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》第1章96页)，挑取MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI,ΔthrC)/pCas单菌落于4ml含卡那霉素的LB试管中，制备感受态方法同实施例1(2)；
(3)thrL-N20-Spec质粒构建：以实施例1中的pTargetF-cadA质粒为模板，thrL-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增thrL-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，获得thrL-N20-Spec质粒；
(4)电转：将thrL(HR)片段及thrL-N20-Spec质粒电转入MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI,ΔthrC)/pCas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用thrLFOU/thrLROU引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1kb；
(5)质粒丢失：方法同实施例1(4)，去除thrL-N20-Spec/pCas双质粒，得到MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI,ΔthrC,ΔthrL)。
实施例8：过表达cyo operon基因的菌株MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI,ΔthrC,ΔthrL,ΔyihF::cyo)的制备
(1)PCR扩增：以MG1655基因组为模板，cyo-F(yihF)/yihF-R(cyo)为引物，PCR扩增yihF-1片段，约600bp；以MG1655基因组为模板，cyo-R(yihF)/yihF-F(cyo)为引物，PCR扩增yihF-2片段，约500bp；以MG1655基因组为模板，cyo-F(MG)/cyo-R(MG)为引物，PCR扩增MG1655-cyo片段，约5kb；以yihF-1/yihF-2/MG1655-cyo三片段为模板，cyo-F(yihF)/cyo-R(yihF)为引物，over-lap PCR扩增MG1655-cyo(yihF)片段，约6.1kb；
(2)感受态细胞制备：将pCas质粒转化入实施例7获得的MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI,ΔthrC,ΔthrL)感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》第1章96页)，挑取MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI,ΔthrC,ΔthrL)/pCas单菌落于4ml含卡那霉素的LB试管中，制备感受态方法同实施例1(2)；
(3)yihF-N20-Spec质粒构建：以实施例1中的pTargetF-cadA质粒为模板，yihF-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增yihF-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，获得yihF-N20-Spec质粒；
(4)电转：将MG1655-cyo(yihF)片段及yihF-N20-Spec质粒电转入MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI,ΔthrC,ΔthrL)/pCas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用yihF-V-F/cyo-I-V引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.3kb；
(5)质粒丢失：方法同实施例1(4)，去除yihF-N20-Spec/pCas双质粒，得到MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI,ΔthrC,ΔthrL,ΔyihF::cyo)。
实施例9：敲除maeB基因的菌株MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI,ΔthrC,ΔthrL,ΔyihF::cyo,ΔmaeB)的制备
(1)PCR扩增：以maeB-MG-F/maeB-MG-R为引物和模板，PCR扩增maeB(HR)片段，约100bp；
(2)感受态细胞制备：将pCas质粒转化入实施例8获得的MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI,ΔthrC,ΔthrL,ΔyihF::cyo)感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》第1章96页)，挑取MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI,ΔthrC,ΔthrL,ΔyihF::cyo)/pCas单菌落于4ml含卡那霉素的LB试管中，制备感受态方法同实施例1(2)；
(3)maeB-N20-Spec质粒构建：以实施例1中的pTargetF-cadA质粒为模板，mae-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增maeB-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，获得maeB-N20-Spec质粒；
(4)电转：将maeB(HR)片段及maeB-N20-Spec质粒电转入MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI,ΔthrC,ΔthrL,ΔyihF::cyo)/pCas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用maeBUP2/maeBDN2引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.5kb；
(5)质粒丢失：方法同实施例1(4)，去除maeB-N20-Spec/pCas双质粒，得到MG1655(ΔcadA,ΔldcC,Ptac-ybjE,ΔcynT,ΔgltI,ΔthrC,ΔthrL,ΔyihF::cyo,ΔmaeB)。
实施例10：重组质粒pTet的构建
10.1、pBR322-dapA*的构建
(1)以MG1655基因组为模板，dapA(EcoRI)-F/dapA-M-R为引物，PCR扩增dapA-1片段，约600bp；同时以MG1655基因组为模板，dapA-M-F/dapA(KpnI)-R为引物，PCR扩增dapA-2片段，约550bp；再以dapA(EcoRI)-F/dapA(KpnI)-R为引物，dapA-1/dapA-2片段为模板，over-lap PCR扩增dapA*片段(即将dapA进行了定点突变H118Y)，约1.2kb；
(2)利用EcoRI/KpnI酶切dapA*片段补平，插入到pBR322(购自Takara公司)的BamHI位点(pBR322酶切线性化后补平)，得到pBR322-dapA*；pBR322-dapA*转化子利用Pbr322-dapA-V-F/dapA-M-R进行菌落PCR验证，正确连接应得到约1kb大小片段。
10.2、pBR322-lysC*的构建
(1)以lysC-F/lysC*-M-R为引物，MG1655基因组为模板，PCR扩增lysC*-1片段，约950bp；同时以lysC*-M-F/lysC-R为引物，MG1655基因组为模板，PCR扩增lysC*-2片段，约400bp；以lysC-F/lysC-R为引物，lysC*-1/lysC*-2片段为模板，over-lap PCR扩增lysC*片段(即将lysC进行了定点突变M318I、G333D)，约1.6kb；
(2)胶回收lysC*片段，同时利用BamHI酶切并补平，插入到pUC18(购自Takara公司)的SmaI位点，得到pUC18-lysC*质粒；转化子利用M13F-47/lysC*-M-R进行菌落PCR验证，正确片段大小约为800bp；
(3)pUC18-lysC*利用BamHI/SacI酶切补平，插入到pBR322的EcoRV位点，得到pBR322-lysC*；转化子利用Pbr322-dapA-V-F/lysC-M-R进行菌落PCR验证，正确验证片段大小约为900bp。
10.3、pBR322-dapB*的构建
(1)以MG1655基因组为模板，thrA-F/thrA-R为引物，PCR扩增PthrA片段，约350bp；
(2)胶回收PthrA片段并利用HindIII酶切，酶切后插入到pBR322的HindIII/EcorV位点，得到pBR322-PthrA；转化子可利用Pbr322-dapA-V-F/thrA-R进行菌落PCR验证，阳性片段约为400bp；
(3)以MG1655基因组为模板，dapB-F/dapB-M-R为引物，PCR扩增dapB-1片段，约500bp；同时以MG1655基因组为模板，dapB-M-F/dapB-R为引物，PCR扩增dapB-2片段，约600bp；以dapB-F/dapB-R为引物，dapB-1/dapB-2片段为模板，over-lap PCR扩增dapB*片段(即将dapB进行了定点突变I114T)，约1.1kb；
(4)dapB*片段利用DraI酶切，酶切片段插入到pMW119(购自Nippon Gene公司)载体的SmaI位点，得到pMW119-dapB*质粒，转化子利用M13F-47/dapB-M-F进行菌落PCR验证，正确验证片段约为700bp；
(5)pMW119-dapB*利用BamHI/EcoRI酶切补平，连接到pBR322-PthrA的SmaI位点，得到pBR322-dapB*；转化子利用Pbr322-dapA-V-F/dapB-M-R进行菌落PCR验证，正确验证片段大小约为850bp。
10.4、pBR322-ddh的构建
(1)以谷氨酸棒杆菌CICC10227(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)基因组为模板，以ddh-F/ddh-R为引物，PCR扩增ddh片段，约1.1kb；
(2)胶回收ddh片段，同时利用EcoT221/AvaI酶切片段，插入到pMW119载体的SmaI位点，得到pMW119-ddh质粒，转化子利用M13F-47/ddh-M-F进行菌落PCR验证，正确片段大小约为500bp；
(3)pMW119-ddh利用XbaI/KpnI酶切补平，连接到pBR322-PthrA的SmaI位点，得到pBR322-ddh，转化子利用Pbr322-dapA-V-F/ddh-M-R进行菌落PCR验证，正确验证片段大小约为1kb。
10.5、pACYC-lys的构建
(1)以MG1655基因组为模板，thrCup-kpnI/thrC-R为引物，PCR扩增thrC片段，约1.5kb；
(2)thrC片段胶回收后利用KpnI/EcoRV酶切，插入到pUC19(购自Takara公司)的KpnI/HincII位点，得到pUC19-thrC；转化子利用M13F-47/M13R-48进行菌落PCR验证，正确验证片段约1.5kb左右；
(3)以pACYC184质粒(NEB(New England Biolabs)惠赠)为模板，pACYC184-F/pACYC184-R为引物，PCR扩增Pacyc184，约4.2kb；同时以pCL1920质粒(中科院上海植物生理生态研究所王勇老师惠赠)为模板，pSC101-F/pSC101-R为引物，PCR扩增UN片段，约420bp；利用Gibson方法，将Pacyc184与UN片段连接，连接片段转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于氯霉素平板，得到pACYC-UN，转化子可利用pACYC-UN-V-F/pACYC-UN-V-R进行菌落PCR验证，阳性片段约600bp；同时阳性质粒可用AvaI酶切验证，得到约2kb/2.7kb片段；
(4)pUC19-thrC利用BbeI/HindIII酶切，胶回收约1.7kb大小片段，并利用T4polymerase补平；同时pACYC184-UN质粒利用HindIII酶切并补平并去磷；两片段进行平端连接，连接产物pACYC-lys转入DH5α感受态细胞，涂布于氯霉素平板筛选，可用pACYC-UN-V-F/Puc-thrC-V-R验证，阳性片段约2kb；同时阳性质粒可用EcoRI酶切验证，得到约2kb/4kb片段。
10.6、pTet-dapA*的构建
(1)pBR322-dapA*利用EcoRI/BamHI酶切，胶回收约1.6kb片段，利用T4polymerase补平；同时pBR322利用AvaI酶切补平并去磷；
(2)两片段平端连接，连接产物pTet-dapA*转入DH5α感受态细胞，涂布于四环素平板筛选，可用tet-V-F/dapA-M-R进行菌落PCR验证，正确片段约1.7kb；同时阳性质粒可用EcoRV酶切验证，得到约1.5kb/4.5kb片段。
10.7、pTet-dapA*-lysC*的构建
(1)以pBR322-lysC*质粒为模板，PtetlysC-F/PtetlysC-R为引物，PCR扩增PtetlysC*片段，约1.7kb；
(2)胶回收片段，并利用EcoRI/PvuI酶切后补平；同时pTet-dapA*利用SacI酶切后补平并去磷；两片段连接，得到pTet-dapA*-lysC*，转入DH5α感受态细胞，四环霉素平板筛选，可用dapA-M-F/lysC-V-R进行菌落PCR验证，正确片段约1.5kb；同时阳性质粒可用SalI/SacI酶切验证，得到约1.2kb/3kb/3.6kb片段。
10.8、pBR-dapB*-ddh的构建
(1)以PthrA-ddh-F/PthrA-ddh-R为引物，pBR322-ddh质粒为模板，PCR扩增PthrA-ddh片段，约1.5kb；胶回收片段并利用PstI/PvuI酶切后补平；pBR322-dapB*利用SacI酶切后补平并去磷；
(2)两片段平端连接，连接产物为pBR-dapB*-ddh，涂布于Amp平板筛选，可用dapB-M-F/ddh-M-R进行菌落PCR验证，阳性片段约为1.6kb；阳性质粒可用HindIII酶切验证，得到约500bp/1.5kb/5kb片段。
10.9、pTet-dapA*-lysC*-dapB*-ddh的构建
(1)pTet-dapA*-lysC*利用SacI酶切线性化后补平；同时pBR-dapB*-ddh利用EcoRI/SacI酶切，胶回收约2.8kb片段并补平；
(2)两片段平端连接，得到pTet-dapA*-lysC*-dapB*-ddh，连接产物转入DH5α感受态细胞，四环霉素抗性平板筛选，可用lysC-V-F/dapB-M-R进行菌落PCR验证，正确片段约1.7kb。
10.10、pTet的构建
(1)以pTet-dapA*-lysC*-dapB*-ddh质粒为模板，Ptet-F/PthrA-ddh-R为引物，PCR扩增dapA*-lysC*-dapB*-ddh大片段，约7.6kb，胶回收片段利用SacI酶切补平；同时以pACYC-lys质粒为模板，Pacyc-thrC-F/Pacyc-thrC-R为引物，PCR扩增Pacyc-thrC片段，约4kb，胶回收片段并利用NcoI/HindIII酶切补平；
(2)两片段平端连接，连接产物转入DH5α感受态细胞，四环霉素抗性平板筛选，可用ddh-M-F/thrC-V-F进行菌落PCR验证，正确片段约为1.3kb；阳性质粒可用SalI酶切验证，得到约1.2kb/1.3kb/3kb/5.9kb片段；即得pTet质粒，其过表达dapA*(H118Y)、lysC*(M318I,G323D)、dapB*和ddh基因。
实施例11：重组质粒pKan的构建
11.1、pMWK的构建
以pPIC3.5K载体(购自Invitrogen公司)为模板，Kandn/Kanup为引物，PCR扩增Kan片段，约0.9kb；pMW118载体(购自Nippon Gene公司)利用ApaLI/EcoO109I双酶切，回收2.7kb片段并补平；上述片段连接，涂布于含卡那霉素的LB平板，转化子利用KanF/M13F-47验证，能获得500bp片段者，即为正确连入方向，得到pMWK质粒。
11.2、pMW-ppc的构建
(1)以MG1655基因组为模板，ppcdn/ppcup为引物，PCR扩增ppc片段，约3kb，ppc片段利用AflII酶切补平；pBR322载体利用EcoO109I酶切补平并去磷；两片段连接，涂布于含氨苄霉素LB平板上，转化子利用ampR/ppcF验证，得到500bp片段则为正确连入方向，命名为pBR-ppc；
(2)pBR-ppc利用SmaI/ScaI酶切，回收3.6kb片段；插入到pMW118载体的SmaI位点，转化子利用ppcF/M13F-47验证，得到pMW-ppc质粒。
11.3、pMW-aspA的构建
以MG1655基因组为模板，aspAup/aspAdn为引物，PCR扩增aspA片段，约2.1kb；aspA片段插入到pMW118载体的SmaI位点，涂布于含氨苄霉素LB平板上，转化子利用aspAR/M13R-48引物验证，扩增出约500bp片段，即为正确，得到pMW-aspA质粒。
11.4、pMW-pntAB的构建
以MG1655基因组为模板，pntABdn/pntABup为引物，PCR扩增pntAB片段，约3.2kb，pntAB片段利用HindIII/BamHI插入到pMW118载体的HindIII/BamHI位点，涂布于含氨苄霉素LB平板筛选，转化子利用pntB-F/M13F-47验证，能扩增出约400bp片段即为正确，得到pMW-pntAB质粒。
11.5、pMW-ppc-aspA的构建
pMW-aspA质粒先利用SacI酶切并补平，再用HindIII酶切，获得2kb片段；pMW-ppc质粒先利用XbaI酶切并补平，再用HindIII酶切，获得6kb片段；两片段连接，涂布于含氨苄霉素LB平板上，转化子利用aspAR/ppcF验证，能扩增出1.5kb片段，即得到pMW-ppc-aspA质粒。
11.6、pMW-ppc-aspA-pntAB的构建
pMW-ppc-aspA质粒先利用XbaI酶切并补平，再利用HindIII酶切，回收约9kb片段；pMW-pntAB质粒利用HindIII/SmaI酶切，回收约3.2kb片段；两片段连接，涂布于含氨苄霉素LB平板上，得到pMW-ppc-aspA-pntAB质粒。
11.7、pMWK-ppc-aspA-pntAB的构建
pMW-ppc-aspA-pntAB质粒利用HindIII/SmaI酶切，回收约9kb片段并补平；pMWK质粒利用EcoRI酶切并补平、去磷；两片段连接，涂布于含卡那霉素LB平板上，转化子利用pntB-F/M13F-47验证，能扩增出约400bp片段，即得到pMWK-ppc-aspA-pntAB质粒。
11.8、pACYC-asd-dapA*的构建
(1)pACYC184载体利用SalI酶切后补平去磷；同时pUC19载体利用HaeII酶切，胶回收约445bp片段并补平；两片段连接，涂布于氯霉素LB平板上，转化子利用M13R-48/Cm-V-R验证，能扩增出约1.7kb片段，即得到pACYC-19载体；
(2)以asddn200/asdup100为引物，MG1655基因组为模板，PCR扩增asd片段，asd片段利用BamHI/SacI酶切，与同样利用BamHI/SacI酶切的pACYC-19连接，连接片段涂布于氯霉素LB平板上，转化子利用M13F-47/M13R-48验证，能扩增出约1.5kb片段，即得到pACYC-asd质粒；
(3)实施例10.1中的pBR322-dapA*质粒利用SacI/EcoRI酶切，胶回收约1.6kb片段并补平；pAYCY-asd质粒利用BamHI酶切、补平并去磷；两片段连接，连接片段涂布于氯霉素LB平板上，转化子利用M13F-47/dapA-M-R验证，能扩增出约2.3kb片段，即得到pACYC-asd-dapA*质粒。
11.9、pKan的构建
pAYCYC-asd-dapA*质粒利用SpeI/XbaI酶切，胶回收约3.2kb片段；pMWK-ppc-aspA-pntAB质粒利用XbaI酶切并去磷；两片段连接，连接片段涂布于含卡那霉素LB平板上，转化子利用RepA-F/dapA*-V-F验证，能扩增出约1.8kb片段，即得到pKan质粒，其过表达dapA*(H118Y)、ppc、aspA、pntAB和asd基因。
实施例12：L-赖氨酸重组表达菌株的获得
将实施例1-9获得的敲除/过表达基因的大肠杆菌宿主菌MG1655突变体制成感受态细胞，然后用化学转化方法或电击转化方法将实施例10-11获得的pTet、pKan重组表达质粒转入感受态细胞(感受态细胞制备及转化具体方法参考《分子克隆III》第1章96页)，获得了L-赖氨酸发酵生产基因工程菌，如表2所示：
表2、本发明获得的基因工程菌
实施例13：L-赖氨酸基因工程菌发酵生产L-赖氨酸
无菌牙签挑取单菌落接种于400μl含四环素和卡那霉素发酵培养基的96孔板中，37℃，290rpm培养24小时。
发酵结束，利用赖氨酸分析仪测定发酵液上清中的L-赖氨酸含量，如表2所示。
其中，发酵培养基组成：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO4 16g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·7H2O 0.01g/L，酵母粉2g/L，CaCO3 30g/L，KOH调pH7.0。
表3、基因工程菌L-赖氨酸产量比较
从表3可得MG1655空白菌96孔板发酵L-赖氨酸产量为零，将重组质粒pTet/pKan转入MG1655后CIBTS1412菌株96孔板发酵L-赖氨酸产量最高为4.86g/L，表明构建的pTet/pKan质粒实现了利用大肠杆菌发酵法生产L-赖氨酸；当cadA、ldcC、gltI、thrC、cynT、thrL和maeB基因缺失及ybjE和cyo operon基因增强后，CIBTS1640菌株96孔板发酵L-赖氨酸产量最高达9.65g/L，是CIBTS1412的近2倍，表明对基因的缺失和增强起到了明显的效果。
综上所述，本发明所构建的L-赖氨酸基因工程菌CCTCC M 2015232能够实现发酵过程中发酵液中L-赖氨酸的有效积累，提高了L-赖氨酸的产量及糖酸转化率，具有广泛的工业应用前景。
Claims (8)
1.一种L-赖氨酸基因工程生产菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、敲除原始菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因，获得基因敲除菌株，所述敲除的基因为：cadA、ldcC、gltI、thrC、cynT、thrL和maeB；
B、增强步骤A中所述基因敲除菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因，获得基因增强菌株，所述增强的基因为：ybjE和cyo operon；
C、构建包含过表达原始菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因的重组质粒，所述过表达的基因为：第118位H突变为Y的dapA、第318位M突变为I和第323位G突变为D的lysC、第114位I突变为T的dapB、ddh、ppc、aspA、pntAB和asd；
D、将步骤C中所述重组质粒导入步骤A中所述基因敲除菌株和/或步骤B中所述基因增强菌株中，获得L-赖氨酸基因工程生产菌，
所述原始菌株为大肠杆菌。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、敲除原始菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因，获得基因敲除菌株，所述敲除的基因为cadA、ldcC、gltI、thrC、cynT、thrL和maeB；
B、增强步骤A中所述基因敲除菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因，获得基因增强菌株，所述增强的基因为ybjE和cyo operon；
C、构建包含过表达原始菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因的重组质粒，所述过表达的基因为第118位H突变为Y的dapA、第318位M突变为I和第323位G突变为D的lysC、第114位I突变为T的dapB、ddh、ppc、aspA、pntAB和asd；
D、将步骤C中所述重组质粒导入步骤B中所述基因增强菌株中，获得L-赖氨酸基因工程生产菌。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌MG1655。
4.如权利要求1-3中任一项方法构建获得的L-赖氨酸基因工程生产菌。
5.如权利要求4所述的L-赖氨酸基因工程生产菌，其特征在于，保藏号为CCTCC M2015232。
6.一种L-赖氨酸的生产方法，其特征在于，通过发酵如权利要求4或5所述的L-赖氨酸基因工程生产菌生产。
7.如权利要求6所述的生产方法，其特征在于，所述发酵的发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO4 16g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·7H2O 0.01g/L，酵母粉2g/L，CaCO3 30g/L，KOH调pH7.0。
8.如权利要求4或5所述的L-赖氨酸基因工程生产菌用于生产L-赖氨酸的应用。
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| Distinct Paths for Basic Amino Acid Export in Escherichia coli: YbjE(LysO) Mediates Export of L-Lysine;Amit Pathania et al.;《Journal of Bacteriology》;20150406;全文 * |
| Enhanced cadaverine production from l-lysine using recombinant Escherichia coli co-overexpressing CadA and CadB;Weichao Ma et al.;《Biotechnology Letters》;20141217;全文 * |
| 赖氨酸高产基因工程菌的构建;谢玉清等;《新疆农业科学》;20031231;1-9 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104878034A (zh) | 2015-09-02 |
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