CN1330763C - 使用属于埃希氏菌属的细菌生产l－苏氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用属于埃希氏菌属的细菌生产L-苏氨酸的方法，其中该细菌具有L-苏氨酸生产能力并经过改性而提高了天冬氨酸转氨酶的活性。

Description

使用属于埃希氏菌属的细菌生产L-苏氨酸的方法
技术领域
本发明涉及生物技术，特别涉及一种通过发酵生产L-氨基酸的方法以及更加特别地涉及一个源自大肠杆菌(Escherichia coli)的基因。该基因对于提高L-氨基酸，例如L-苏氨酸的生产率是有益的。
背景技术
传统上L-氨基酸一直是利用微生物菌株通过发酵的方法进行工业生产的，这些菌株得自自然来源或相同菌株经特别修饰以提高L-氨基酸生产率的突变体。
为了提高L-氨基酸的生产率曾经使用过，例如，通过由重组DNA对微生物进行转化而扩增生物合成基因(参见例如美国专利号4,278,765)。这些技术是基于增强参与氨基酸合成的酶的活性和/或使靶酶对于由所产生的L-氨基酸或其副产品的反馈抑制不敏感(参见例如日本公开申请号56-18596(1981)，WO95/16042或美国专利号5,661,012和6,040,160)。
用作通过发酵生产L-苏氨酸的各种菌株是已知的。存在具有增强活性的参与L-苏氨酸生物合成的酶的菌株(美国专利5,175,107；5,661,012；5,705,371；5,939,307；EP0219027)、耐一些化合物如L-苏氨酸及其类似物的菌株(WO0114525A1、EP301572A2、US5,376,538)、具有对于由所产生的L-氨基酸或其副产物的反馈抑制不敏感的靶酶的菌株(美国专利5,175,107；5,661,012)、具有失活的苏氨酸降解酶的菌株(美国专利5,939,307、6,297,031)。
已知的苏氨酸生产菌VKPM B-3996(美国专利5,175,107和5,705,371)是目前最好的苏氨酸生产菌。为了构建菌株VKPM B-3996，在亲本菌株E.coli K-12(VKPM B-7)中引入了几个突变和一个如下所述的质粒。突变的thrA基因(突变thrA442)编码耐苏氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I。突变的ilvA基因(突变ilvA442)编码低活性的苏氨酸脱氨酶从而导致低的异亮氨酸生物合成速率以及异亮氨酸饥饿渗漏表型。在具有ilvA442突变的细菌中thrABC操纵子的转录并不被异亮氨酸所抑制，因而对于苏氨酸生产非常有效。tdh基因的失活导致苏氨酸降解的阻抑。将蔗糖同化的遗传决定子转移至所述菌株中(scrKYABR基因)。将含有突变苏氨酸操纵子thrA442BC的质粒PVIC40导入中间菌株TDH6中，以提高控制苏氨酸生物合成的基因的表达。菌株发酵过程中积累的L-苏氨酸量达到85克/L。
本发明人针对E.coli K-12获得了具有一个突变的突变体，与高浓度苏氨酸或高丝氨酸耐性相关的thrR(这里指rhtA23)(Astaurova，O.B.等，Appl.Bioch.AND Microbiol.，21，611-616(1985))。突变通过各个大肠杆菌生产菌株如菌株VKPM B-3996提高了L-苏氨酸(前苏联专利号974817)、高丝氨酸和谷氨酸(Astaurova，O.B.等，Appl.Bioch.AND Microbiol.，27，556-561，1991，EP 1013765)的生产。另外，本发明人揭示了rhtA基因存在于大肠杆菌染色体上编码谷氨酰胺转移系统组分的glnHPQ操纵子附近的18min处，以及rhtA基因等同于位于pexB和ompX基因之间的ORF1(ybiF基因，GenBank登记号AAA218541，gi：440181764至1651号)。表达由ORF1编码的蛋白的单位已被指定为rhtA(rht：耐高丝氨酸和苏氨酸)基因。本发明人也发现rhtA23突变是针对ATG起始密码子在-1位处用一个A替换G(第17届生物化学和分子生物学国际会议暨美国生物化学和分子生物学协会1997年会摘要，旧金山，加利福尼亚8月24-29，1997，摘要No.457，EP1013765A)。
在研究苏氨酸生物合成途径主要路径和优化至一个很高程度的条件下，可以通过给细菌补充增加量的苏氨酸远前体如天冬氨酸来进一步改进生产苏氨酸的菌株。
已知天冬氨酸为天冬氨酸家族(苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸)，以及作为细菌细胞壁的一种组分化合物二氨基庚二酸合成的碳供体。这些合成可以通过一个有几个分枝点和具有一个极敏感的调节模式的复杂途径来进行。在天冬氨酸、天冬氨酸半醛、高丝氨酸的分枝点处，有与得自这一生物合成步骤的氨基酸等量的同工酶。由thrABC操纵子的-部分编码的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I进行苏氨酸生物合成的第一和第三反应。苏氨酸和异亮氨酸调节天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的表达，苏氨酸抑制催化上述两个反应的活性[大肠杆菌和沙门氏菌(Salmonella)，第二版，主编：F.C.Neidhardt，ASM出版社，华盛顿特区，1996]。
两个基因参与天冬氨酸的形成-由aspC基因编码的天冬氨酸转氨酶以及aspA基因的产物天冬氨酸酶。天冬氨酸转氨酶将草酰乙酸酯转变为天冬氨酸。天冬氨酸酶将延胡索酸转变为天冬氨酸。
aspC基因的扩增对于L-赖氨酸-天冬氨酸家族的一种氨基酸生产的影响已经被披露。aspC基因的扩增用于大肠杆菌生产L-赖氨酸上(美国专利6,040,160)。具有天冬氨酸激酶以及编码包括天冬氨酸转氨酶在内的几种酶的增强的DNA序列的棒状细菌(Coryneformbacteria)被用于L-赖氨酸的生产(美国专利6,004,773)。
已经注意到天冬氨酸转氨酶对于由棒状菌生产L-苏氨酸和L-赖氨酸可以是有益的(美国专利4,980,285)。
到目前为止还没有报道使用具有增强的天冬氨酸转氨酶活性的属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌来进行L-苏氨酸的生产。
发明内容
本发明的一个目标是提高L-苏氨酸生产菌株的生产率并提供一种使用这些菌株生产L-苏氨酸的方法。
通过发现克隆于一个低拷贝质粒上的编码天冬氨酸转氨酶的aspC基因能够提高L-苏氨酸的生产而使该目标得以实现。因此本发明已经完成。
本发明如下：
(1)一种属于埃希氏菌属的L-苏氨酸生产细菌，其中细菌已被改性而提高了天冬氨酸转氨酶的活性。
(2)根据(1)的细菌，其中通过提高天冬氨酸转氨酶基因的表达量而使天冬氨酸转氨酶的活性得以增强。
(3)根据(1)的细菌，其中通过增加天冬氨酸转氨酶基因的拷贝数或修饰基因的表达控制序列而增强基因表达，从而使天冬氨酸转氨酶的活性得以提高。
(4)根据(3)的细菌，其中通过用一种含所述基因的低拷贝质粒转化细菌而使拷贝数得到提高。
(5)根据(2)到(4)的细菌，其中所述的天冬氨酸转氨酶基因源于一种属于埃希氏菌属的细菌。
(6)根据(5)的细菌，其中所述的天冬氨酸转氨酶基因编码下列蛋白(A)或(B)：
(A)一种包含序列表中SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质；
(B)一种包含包括在序列表SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中删除、替换、插入或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质，并且其具有天冬氨酸转氨酶活性。
(7)根据(5)的细菌，其中所述的天冬氨酸转氨酶基因包含下列DNA(a)或(b)：
(a)一种包含SEQ ID NO：1中核苷酸1-1191的核苷酸序列的DNA；或
(b)一种可与SEQ ID NO：1中核苷酸1-1191的核苷酸序列杂交或与可在严格条件下从该核苷酸序列制得的探针杂交并编码一种具天冬氨酸转氨酶活性蛋白的DNA。
(8)根据(7)的细菌，其中所述的严格条件是指其中在60℃及相应于1×SSC和0.1％SDS的盐浓度下进行洗涤的条件。
(9)根据(1)到(8)的细菌，其中所述的细菌已被进一步的改性以增强一个或多个选自下列的基因的表达：
编码耐苏氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因；
编码高丝氨酸激酶的thrB基因；
编码苏氨酸合酶的thrC基因；和
编码推定的跨膜蛋白质的rhtA基因。
(10)根据(9)的细菌，其中细菌已经被改性以提高突变thrA基因、thrB基因、thrC基因和rhtA基因的表达量。
(10)一种生产L-苏氨酸的方法，包括在培养基中培养根据(1)至(10)的细菌以在培养基中生产并积累L-苏氨酸，以及从培养基中收集L-苏氨酸。
下面对本发明进行详细地解释。
本发明的细菌是一种属于埃希氏菌属的生产L-苏氨酸的细菌，其中该细菌已经被改性而提高了天冬氨酸转氨酶的活性。
但是能够用于本发明的属于埃希氏菌属的细菌并不受特别限制，例如，包括Neidhardt，F.C.等描述的细菌[大肠杆菌和鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)，美国微生物协会，华盛顿特区，1208，表1]。
在本发明中，“生产L-苏氨酸的细菌”意指一种细菌，当该细菌在一种培养基中培养时，具有在这种培养基中积累L-苏氨酸的能力。生产L-苏氨酸的能力可以通过培育获得或提高。
短语“天冬氨酸转氨酶活性”意指催化使用吡哆醛5’-磷酸由草酰乙酸酯和谷氨酸形成天冬氨酸并释放α-酮戊二酸的反应的活性。
短语“经改性而提高了天冬氨酸转氨酶的活性”意即每个细胞的活性变得高于未改性的菌株，例如野生型菌株。例如，一种情况下每个细胞中的天冬氨酸转氨酶分子数增加了，一种情况下每个天冬氨酸转氨酶的特定活性增加了等等这样的情况被包括在内。此外，作为一个用作参照物的野生型菌株，大肠杆菌K-12被包括在其中。作为细胞内天冬氨酸转氨酶活性提高的结果，获得了在培养基中L-苏氨酸累积量增加的效应。
可以通过提高编码天冬氨酸转氨酶基因的表达量来获得在细菌细胞中天冬氨酸转氨酶活性的提高。任何源自属于埃希氏菌属细菌的基因和源自其它细菌如棒状细菌的基因都能够用作天冬氨酸转氨酶的基因。其中，优选源自属于埃希氏菌属细菌的基因。
作为大肠杆菌的编码天冬氨酸转氨酶的基因，aspC基因已得到阐明(GenBank登记号NC_000913.1，gi：16128895中核苷酸号983742至984932)。因此，aspC基因可以通过PCR(polymerase chainreaction；参考White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))利用基于该核酸序列制得的引物而获得。其它微生物的编码天冬氨酸转氨酶的基因可以用相似的方式得到。
源自大肠杆菌的aspC基因例如为编码下列蛋白质(A)或(B)的DNA：
(A)一种包含序列表中SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质；
(B)一种包含包括在序列表SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中删除、替换、插入或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质，并且其具有天冬氨酸转氨酶活性。
“几个”氨基酸的数量因所述蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置及类型而异。对于所述蛋白质(A)，“几个”可以是2至30个，优选2至15个，更加优选地为2至5个。这是因为下列原因。一些氨基酸相互之间具有高度的同源性并且在这样的氨基酸上的差异并不显著地影响蛋白质的三维结构及其活性。因而，蛋白质(B)可以是对于组成天冬氨酸转氨酶的完整氨基酸残基具有不少于30至50％同源性，优选不少于50至70％同源性的蛋白质，并且其具有天冬氨酸转氨酶活性。
编码与上述天冬氨酸转氨酶基本相同的蛋白质的DNA，可以例如通过例如定点诱变的方式修饰编码天冬氨酸转氨酶(SEQ ID NO：1)的DNA核酸序列来获得，从而在一个特定位点上涉及一个或多个氨基酸残基的删除、替换、插入或添加。上述修饰的DNA可以通过传统公知的突变处理获得。这些处理包括以羟胺处理编码本发明所述蛋白的DNA或以紫外线辐照或用试剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍或亚硝酸处理含有所述DNA的细菌。
编码与天冬氨酸转氨酶基本相同的蛋白质的DNA能够通过使具有上述突变的DNA在一种适当的细胞中表达，并研究表达产物的活性而获得。编码与天冬氨酸转氨酶基本相同蛋白质的DNA也能够通过从具有突变的编码天冬氨酸转氨酶的DNA或含有它的细胞中分离一种DNA而获得，该DNA可与具有包含例如，序列表中如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核苷酸序列的探针在严格的条件下杂交，并编码一种具天冬氨酸转氨酶活性的蛋白。这里所提到的“严格的条件”是一种在其下形成所谓的特异杂交，而不形成非特异杂交的条件。难以通过任何数值来清楚地表示这种条件。然而，例如这种严格条件可以通过一种条件举例说明，在该条件下，例如具有不小于50％同源性的DNA，优选不小于70％，更加优选不小于90％的DNA相互杂交，但具有小于上述同源性的DNA相互间不杂交。或者，这种严格条件可以以一种条件举例说明，在该条件下DNA在与Southern杂交一般洗涤条件相应的盐浓度下相互杂交，即1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS，于60℃下。
SEQ ID NO：1核酸序列的部分序列也能够用作探针。这样的探针可以使用基于SEQ ID NO：1核酸序列生产的寡核苷酸作为引物，用包含SEQ ID NO：1的核酸序列的DNA片段作为模板，通过PCR来制备。当使用一个长度为300bp的DNA片段为探针时，杂交的洗涤条件由，例如，50℃，2×SSC和0.1％SDS构成。
上述核酸的取代、删除、插入或添加也包括自然发生的突变(突变体或变异体)，例如，在具有天冬氨酸转氨酶的细菌的个体差异或物种或属的差异的基础上。
用编码蛋白的DNA转化细菌意味着例如通过传统方法将DNA导入细菌细胞中，以提高编码本发明蛋白的基因表达并增强细菌细胞中该蛋白的活性。
增强基因表达的方法包括提高基因拷贝数。将一个基因导入能够在属于埃希氏菌属的细菌中发挥作用的载体内提高了该基因的拷贝数。为了这样的目的可以优选使用低拷贝载体。低拷贝载体的例子为pSC101、pMW118、pMW119及诸如此类。
增强基因表达也能够通过用例如，同源重组法或诸如此类的方法，将基因的多个拷贝导入细菌染色体中而实现。作为转化的方法，任何迄今为止曾报道的公知方法都可以使用。例如，可以使用一种以氯化钙处理受体细胞以提高DNA通透性的方法，此方法曾被报道过用于大肠杆菌K-12(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))。
另一方面，增强基因表达也能够通过将本发明的DNA置于一个强启动子的控制下而实现。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、λ噬菌体的PR、PL启动已知为强启动子。强启动子的使用可以结合以基因拷贝的增加。
或者，启动子可以通过例如，将一个突变导入启动子上以提高位于该启动子下游基因的转录水平来增强。此外，已知在核糖体的结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔区和特别是紧接起始密码子上游的序列的几个核苷酸的取代深远地影响mRNA的翻译能力。例如，发现20倍的表达水平范围依赖于起始密码子之前的三个核苷酸的本性(Gold等，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-403，1981；Hui等，EMBOJ，3，623-629，1984)。更早地，本发明的发明人显示了rhtA23突变为在相对于ATG起始密码子-1位上的一个A替换了G(第17届生物化学和分子生物学国际会议暨美国生物化学和分子生物学协会1997年会摘要，旧金山，加利福尼亚8月24-29，1997，摘要号457)。因此，可以提示rhtA23突变增强了rhtA基因的表达并且，因而提高对苏氨酸、高丝氨酸和一些其它运输到细胞外物质的耐性。
此外，将核苷酸取代引入天冬氨酸转氨酶的启动子区从而将其改性为一个更强的启动子也是可能的。对表达控制序列的改造能够例如，利用如在国际专利公开WO00/18935和日本专利公开号1-215280中公开的一个温度敏感质粒，以与基因取代相同的方式来进行。
增加天冬氨酸转氨酶基因的拷贝数也能够通过将天冬氨酸转氨酶基因的多个拷贝导入细菌染色体DNA中而实现。为了将天冬氨酸转氨酶基因的多个拷贝导入细菌染色体中，通过使用一个有多个拷贝存在于染色体DNA中的序列作为靶对象来进行同源重组。作为有多个拷贝存在于染色体DNA中的序列，可以使用重复的DNA、存在于转座元件未端的反向重复序列。同样，如在日本专利公开号2-109985中披露的，可以将天冬氨酸转氨酶基因整合至转座子中，并使其转移以将该基因的多个拷贝导入染色体DNA中。
质粒DNA的制备方法、DNA的消化和连接、转化、选择一个寡核苷酸作为引物及诸如此类的方法对于本领域技术人员来说是普通的方法。这些方法例如，在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.，“分子克隆实验指南(Molecular Cloning A LaboratoryManual)，第二版”，冷泉实验室出版社(1989)中得到了描述。
本发明的细菌能够通过将上述DNA导入天然具有生产L-苏氨酸能力的细菌中而获得。或者，本发明的细菌能够通过给予已具有这些DNA的细菌生产L-苏氨酸的能力而获得。
对于aspC基因编码的天冬氨酸转氨酶活性得以提高的亲本菌株，可以使用属于埃希氏菌属的生产苏氨酸的细菌如大肠杆菌株VKPM B-3996(美国专利5,175,107，美国专利5,705,371)、大肠杆菌株NRRL-21593(美国专利5,939,307)、大肠杆菌株FERM BP-3756(美国专利5,474,918)、大肠杆菌株FERM BP-3519和FERM BP-3520(美国专利5,376,538)、大肠杆菌株MG442(Gusyatiner等，Genetika(俄语)，14，947-956(1978))、大肠杆菌株VL643和VL2055(EP 1149911A)及诸如此类。
菌株B-3996缺少thrC基因并同化蔗糖，其中ilvA基因具有一个渗漏突变。该菌株在rhtA基因上具有一个突变，此基因赋予了对高浓度苏氨酸或高丝氨酸的耐性。菌株B-3996含有pVIC40质粒，该质粒通过将thrA*BC操纵子插入到RSF1010源载体中而获得，所述的操纵子包括编码对苏氨酸反馈抑制基本脱敏的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因。菌株B-3996于1987年4月7日以编号B-3996保藏于俄罗斯工业微生物国家保藏中心(VKPM)(Dorozhnyproezd.1，Moscow 113545，俄罗斯联邦)。
优选地将本发明的细菌改性以增强一个或多个下列基因和aspC基因的表达：
编码耐苏氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因；
编码高丝氨酸激酶的thrB基因；
编码苏氨酸合成酶的thrC基因；
该细菌的另一个优选实施方案是除了增强aspC基因之外还增强rhtA基因，该基因编码推定的跨膜蛋白。细菌的最优选实施方案是经改性而提高了aspC基因、thrA基因、thrB基因、thrC基因和rhtA基因的表达量。
本发明的生产L-苏氨酸的方法包括在培养基中培养本发明的细菌以使L-苏氨酸得以生产并在培养基中积累，以及从培养中收集L-苏氨酸的步骤。
在本发明中，从培养基中培养、收集和纯化L-氨基酸以及诸如此类可以用一种与其中用一种微生物生产一种氨基酸的传统的发酵方法相似的方式进行。
培养用的培养基可以是一种合成培养基或是一种天然培养基，只要该培养基包括碳源和氮源和矿物质以及如果必要的话，微生物生长所需要的适量营养物质。碳源可以包括各种糖类如葡萄糖和蔗糖以及各种有机酸。依赖于所用微生物同化作用的模式，可以使用醇类包括乙醇和丙三醇。作为氮源，使用各种铵盐如氨和硫酸铵、其它氮化合物如胺、天然氮源如蛋白胨、大豆水解产物以及经消化的发酵微生物。作为矿物质，使用磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙以及诸如此类。作为维生素，使用硫胺素、酵母提取物以及诸如此类。
优选地培养在有氧环境下，如摇动的培养，以及通风搅拌的培养，在20到40℃下，优选30-38℃的温度下进行。培养物的pH通常在5和9之间，优选在6.5和7.2之间。培养物的pH可以用氨、碳酸钙、各种酸、各种碱以及缓冲剂进行调节。典型地，1到5天的培养物导致目标L-氨基酸在液体培养基中的累积。
培养后，可以通过离心或膜过滤从液体培养基中除去固体如细胞，随后可以通过离子交换、浓缩以及结晶方法收集并纯化L-苏氨酸。
实施本发明的最佳方式
下面将结合实施例对本发明进行更加具体的解释。
实施例1：从大肠杆菌中克隆aspC基因至pMW119载体
通过PCR使用序列表中SEQ ID NOs：3和4所示的引物从大肠杆菌株K-12的染色体DNA获得aspC基因。将获得的DNA片段以限制性内切酶PvuII和EcoRI处理并连接至事先以限制性内切酶HincII和EcoRI处理的在Plac启动子控制下的稳定的低拷贝质粒pMW119(复制子pSC101)。这样，就获得了pMW-Plac-aspC质粒。
同样地，将aspC基因置于λ噬菌体的强PR启动子而非Plac启动子的控制下。使用序列表中SEQ ID NO：5和6中所示的化学合成的5’-磷酸化的寡核苷酸形成含PR启动子的DNA双链。随后，将DNA双链连接至事先以限制性内切酶PvuII和HindII处理的pMW-Plac-aspC质粒。这样就构建了pMW-PR-aspC质粒。
非调控的aspC基因的高水平表达能够用这些质粒来实现。质粒pMW-Plac-aspC和pMW-PR-aspC与质粒Pvic40(复制子1010)兼容，因而两个质粒Pvic40和pMW-Plac-aspC或Pvic40和pMW-PR-aspC能够同时保持在细菌中。
将pMW-Plac-aspC和pMW-PR-aspC质粒中的每一个都导入耐链霉素的苏氨酸生产者大肠杆菌株B-3996(美国专利5,175,107)中。这样就获得了菌株B-3996(pMW-Plac-aspC)和B-3996(pMW-PR-aspC)。
实施例2aspC基因扩增对苏氨酸生产的影响
将大肠杆菌株B-3996(pMW-Plac-aspC)和B-3996(pMW-PR-aspC)在含链霉素(100μg/ml)的L-琼脂培养盘上于37℃生长18-24小时。随后将一环细胞转移至50ml的具有下列成分的L-肉汤中：色氨酸-10g/l、酵母提取物-5g/l、NaCl-5g/l。在摇床上(240rpm)于37℃下让细胞生长(50ml，OD540-20.u.)5小时，用于为450ml发酵培养基接种。批发酵在具有1.0L容积的实验室发酵罐中于37℃在通风下(1/1vvm)在1200rpm的搅拌速度下进行。用8％氨水将pH值自动保持在6.6。
结果见表1.
发酵培养基的成分(g/l)：
蔗糖             100.0
NH4Cl            1.75
KH2PO4           1.0
MgSO4.7H2O       0.8
FeSO4.7H2O       0.01
MnSO4.5H2O       0.01
Mameno(TN)       0.15
甜菜碱           1.0
L-异亮氨酸       0.2
单独对蔗糖和硫酸镁进行灭菌。将pH调至6.6。
表1
菌株 额外的aspC基因 时间，小时 OD540 苏氨酸g/l
B-3996 -   19.118.4  34.633.8  45.043.8
B-3996(pMW-Plac-aspC) +   17.518.518.518.3  29.830.630.830.0  45.245.845.946.2
  18.2±0.5  30.3±0.5  45.9±0.4
B-3996(pMW-PR-aspC) +   16.018.017.818.3  32.030.829.430.0  45.446.545.845.2
  17.9±1.0  30.4±1.1  45.6±0.6
工业适用性
根据本发明，可以有效地生产苏氨酸。
SEQUENCE LISTING
<110>Ajinomoto Co.，Inc.
<120>使用属于埃希氏菌属的细菌生产L-苏氨酸的方法
<130>C042AYOP1313
<140>
<141>2003-02-25
<150>RU 2002104983
<151>2002-02-27
<160>6
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1191
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1191)
<400> 1
atg ttt gag aac att acc gcc gct cct gcc gac ccg att ctg ggc ctg   48
Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile Leu Gly Leu
  1               5                  10                  15
gcc gat ctg ttt cgt gcc gat gaa cgt ccc ggc aaa att aac ctc ggg   96
Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asn Leu Gly
             20                  25                  30
att ggt gtc tat aaa gat gag acg ggc aaa acc ccg gta ctg acc agc   144
Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Thr Ser
         35                  40                  45
gtg aaa aag gct gaa cag tat ctg ctc gaa aat gaa acc acc aaa aat   192
Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Asn
     50                  55                  60
tac ctc ggc att gac ggc atc cct gaa ttt ggt cgc tgc act cag gaa   240
Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gln Glu
 65                  70                  75                  80
ctg ctg ttt ggt aaa ggt agc gcc ctg atc aat gac aaa cgt gct cgc   288
Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu Ile Asn Asp Lys Arg Ala Arg
                 85                  90                  95
acg gca cag act ccg ggg ggc act ggc gca cta cgc gtg gct gcc gat   336
Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp
            100                 105                 110
ttc ctg gca aaa aat acc agc gtt aag cgt gtg tgg gtg agc aac cca   384
Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro
        115                 120                 125
agc tgg ccg aac cat aag agc gtc ttt aac tct gca ggt ctg gaa gtt   432
Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val
    130                 135                 140
cgt gaa tac gct tat tat gat gcg gaa aat cac act ctt gac ttc gat   480
Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp
145                 150                 155                 160
gca ctg att aac agc ctg aat gaa gct cag gct ggc gac gta gtg ctg   528
Ala Leu Ile Asn Ser Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Val Val Leu
                165                 170                 175
ttc cat ggc tgc tgc cat aac cca acc ggt atc gac cct acg ctg gaa   576
Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Leu Glu
            180                 185                 190
caa tgg caa aca ctg gca caa ctc tcc gtt gag aaa ggc tgg tta ccg   624
Gln Trp Gln Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro
        195                 200                 205
ctg ttt gac ttc gct tac cag ggt ttt gcc cgt ggt ctg gaa gaa gat   672
Leu Phe Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp
    210                 215                 220
gct gaa gga ctg cgc gct ttc gcg gct atg cat aaa gag ctg att gtt   720
Ala Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu Ile Val
225                 230                 235                 240
gcc agt tcc tac tct aaa aac ttt ggc ctg tac aac gag cgt gtt ggc   768
Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly
                245                 250                 255
gct tgt act ctg gtt gct gcc gac agt gaa acc gtt gat cgc gca ttc   816
Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg Ala Phe
            260                 265                 270
agc caa atg aaa gcg gcg att cgc gct aac tac tct aac cca cca gca   864
Ser Gln Met Lys Ala Ala Ile Arg Ala Asn Tyr Ser Asn Pro Pro Ala
        275                 280                 285
cac ggc gct tct gtt gtt gcc acc atc ctg agc aac gat gcg tta cgt   912
His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Ile Leu Ser Asn Asp Ala Leu Arg
    290                 295                 300
gcg att tgg gaa caa gag ctg act gat atg cgc cag cgt att cag cgt   960
Ala Ile Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg Ile Gln Arg
305                 310                 315                 320
atg cgt cag ttg ttc gtc aat acg ctg cag gaa aaa ggc gca aac cgc   1008
Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly Ala Asn Arg
                325                 330                 335
gac ttc agc ttt atc atc aaa cag aac ggc atg ttc tcc ttc agt ggc   1056
Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly
            340                 345                 350
ctg aca aaa gaa caa gtg ctg cgt ctg cgc gaa gag ttt ggc gta tat   1104
Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr
        355                 360                 365
gcg gtt gct tct ggt cgc gta aat gtg gcc ggg atg aca cca gat aac   1152
Ala Val Ala Ser Gly Arg Val Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn
    370                 375                 380
atg gct ccg ctg tgc gaa gcg att gtg gca gtg ctg taa               1191
Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala Ile Val Ala Val Leu
385                 390                 395
<210>2
<211>396
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>2
Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile Leu Gly Leu
  1               5                  10                  15
Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asn Leu Gly
             20                  25                  30
Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Thr Ser
         35                  40                  45
Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Asn
     50                  55                  60
Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gln Glu
 65                  70                  75                  80
Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu Ile Asn Asp Lys Arg Ala Arg
                 85                  90                  95
Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp
            100                 105                 110
Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro
        115                 120                 125
Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val
    130                 135                 140
Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp
145                 150                 155                 160
Ala Leu Ile Asn Ser Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Val Val Leu
                165                 170                 175
Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Leu Glu
            180                 185                 190
Gln Trp Gln Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro
        195                 200                 205
Leu Phe Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp
    210                 215                 220
Ala Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu Ile Val
225                230                  235                  240
Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly
                245                 250                 255
Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg Ala Phe
            260                 265                 270
Ser Gln Met Lys Ala Ala Ile Arg Ala Asn Tyr Ser Asn Pro Pro Ala
        275                 280                 285
His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Ile Leu Ser Asn Asp Ala Leu Arg
    290                 295                 300
Ala Ile Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg Ile Gln Arg
305                 310                 315                 320
Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly Ala Asn Arg
                325                 330                 335
Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly
            340                 345                 350
Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr
        355                 360                 365
Ala Val Ala Ser Gly Arg Val Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn
    370                 375                 380
Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala Ile Val Ala Val Leu
385                 390                395
<210>3
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>3
gctacttacg aattccgtt tgtcatcagtc tcagcc         36
<210>4
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>4
cctagatcac agctgatgtt tgagaacatt accgcc     36
<210>5
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ttgactattt tacctctggc ggtgataatg gtccca     36
<210>6
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
agcttgggac cattatcacc gccagaggta aaatagtcaa 40

Claims (10)

1.一种生产L-苏氨酸的方法，包括在培养基中培养一种细菌以在培养基中生产并积累L-苏氨酸，以及从培养基中收集L-苏氨酸，其中所述细胞是属于埃希氏菌属的生产L-苏氨酸的细菌，其中该细菌已经被改性而增强了天冬氨酸转氨酶的活性。
2.权利要求1的方法，其中通过提高天冬氨酸转氨酶基因的表达量来增强所述天冬氨酸转氨酶的活性。
3.权利要求1的方法，其中通过提高天冬氨酸转氨酶基因的拷贝数或通过修饰该基因的表达控制序列以增强所述基因的所述表达来提高所述天冬氨酸转氨酶的活性。
4.权利要求3的方法，其中通过用含有所述基因的低拷贝载体转化所述细菌来提高所述的拷贝数。
5.权利要求2的方法，其中所述的天冬氨酸转氨酶基因源自一种属于埃希氏菌属的细菌。
6.权利要求5的方法，其中所述的天冬氨酸转氨酶基因编码下列蛋白(A)或(B)：
(A)一种由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(B)一种由包括在序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中删除、替换、插入或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列组成的蛋白质，并且其具有天冬氨酸转氨酶活性。
7.权利要求5的方法，其中所述的天冬氨酸转氨酶基因是下列DNA(a)或(b)：
(a)一种由SEQ ID NO：1中核苷酸1-1191的核苷酸序列组成的DNA；或
(b)一种可与SEQ ID NO：1中核苷酸1-1191的核苷酸序列杂交或可与在严格条件下从所述核苷酸序列制得的探针杂交并编码一种具天冬氨酸转氨酶活性蛋白的DNA。
8.权利要求7的方法，其中所述的严格条件是指其中在60℃及相应于1×SSC和0.1％SDS的盐浓度下进行洗涤的条件。
9.权利要求1至8中任意一项的方法，其中所述细菌已经被进一步改性而增强了一个或多个选自下列的基因的表达：
编码耐苏氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因；
编码高丝氨酸激酶的thrB基因；
编码苏氨酸合酶的thrC基因；
编码推定的跨膜蛋白质的rhtA基因。
10.权利要求9的方法，其中所述细菌已经被改性而提高了所述的突变thrA基因、thrB基因、thrC基因和rhtA基因的表达量。
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