ES2305445T3 - Procedimiento para la produccion de l-treonina con la utilizacion de una bacteria que pertenece al genero escherichia. - Google Patents
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Abstract
Bacteria productora de L-treonina perteneciente al género Escherichia, en la que la bacteria se ha modificado para aumentar la actividad de la aspartato aminotransferasa, en la que dicho gen de la aspartato aminotransferasa se origina a partir de una bacteria perteneciente al género Escherichia y codifica las proteínas (A) o (B) siguientes: (A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID nº 2 en el listado de secuencias; (B) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que incluye la eliminación, sustitución, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID nº 2 en el listado de secuencias, y que tiene actividad de la aspartato aminotransferasa.
Description
Procedimiento para la producción de
L-treonina con la utilización de una bacteria que
pertenece al genero Escherichia.
La presente invención se refiere a la
biotecnología, específicamente a un procedimiento para producir
L-aminoácidos por fermentación, y más
específicamente a un gen derivado de la bacteria Escherichia
coli. Dicho gen es útil para la mejora de la productividad de
L-aminoácidos, por ejemplo, de
L-treonina.
Convencionalmente, los
L-aminoácidos han sido producidos industrialmente
mediante procedimientos de fermentación que utilizan cepas de
microorganismos obtenidos de fuentes naturales o mutantes de los
mismos particularmente modificados para aumentar las productividad
de L-aminoácido.
Para aumentar la productividad de
L-aminoácidos, se ha utilizado, por ejemplo, la
amplificación de genes biosintéticos mediante la transformación de
un microorganismo por ADN recombinante (véase, por ejemplo, la
patente US nº 4.278.765). Estas técnicas se basan en el aumento de
actividad de las enzimas involucradas en la biosíntesis de
aminoácidos y/o en la desensibilización de las enzimas diana a la
inhibición por retroalimentación por parte del
L-aminoácido o sus productos secundarios (véase, por
ejemplo, la solicitud japonesa abierta al público nº
56-18596 (1981), WO 95/16042 o las patentes US nº
5.661.012 y nº 6.040.160).
Son conocidas diversas cepas utilizadas para la
producción de L-treonina por fermentación. Existen
cepas con actividades aumentadas de las enzimas involucradas en la
biosíntesis de L-treonina (patentes US nº 5.175.107;
nº 5.661.012; nº 5.705.371; nº 5.939.307; EP0 219
027), cepas resistentes a algunas sustancias químicas, tal como
L-treonina y sus análogos (WO0114525A1, EP 301
572A2, US nº 5.376.538), cepas con las enzimas diana
desensibilizadas a la inhibición por retroalimentación por parte del
L-aminoácido o sus productos secundarios (patentes
US nº 5.175.107; nº 5.661.012), cepas con enzimas de degradación de
treonina inactivadas (patentes US nº 5.939.307; nº
6.297.031).
La cepa conocida productora de treonina VKPM
B-3996 (patentes US nº 5.175.107, y nº 5.705.371) es
actualmente la mejor productora de treonina. Para la construcción
de la cepa VKPM B-3996, se introdujeron diversas
mutaciones y un plásmido descrito a continuación en la cepa
original E. coli K-12 (VKPM
B-7). El gen mutante thrA (mutación
thrA442) codifica la aspartoquinasa homoserina deshidrogenasa
I, resistente a la inhibición por retroalimentación por la
treonina. El gen mutante ilvA (mutación ilvA442)
codifica la treonina desaminasa con baja actividad, lo que conlleva
una tasa baja de biosíntesis de isoleucina y a un fenotipo
rezumante de inanición de isoleucina. En bacterias con la mutación
ilvA442, la transcripción del operón thrA BC no está
inhibida por la isoleucina y, en consecuencia, es muy eficaz para la
producción de treonina. La inactivación del gen tdh provoca
la supresión de la degradación de la treonina. El determinante
genético de la asimilación de sacarosa (genes scrKYABR) se
transfirió a dicha cepa. Con el fin de aumentar la expresión de
genes que controlan la biosíntesis de treonina, se introdujo el
plásmido pVIC40 que contiene el operón mutante de treonina
thrA442BC en la cepaintermediariaTDH6. La cantidad de
L-treonina acumulada durante la fermentación de la
cepa alcanza los 85 g/l.
Los presentes inventores obtuvieron, con
respecto a E. coli K-12, un mutante con una
mutación thrR (designado en el presente documento
rhtA23) relacionado con la resistencia a altas
concentraciones de treonina u homoserina en un medio mínimo
(Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 21,
611-616 (1985)). La mutación mejoró la producción
de L-treonina (patente SU nº 974817), homoserina y
glutamato (Astaurova, O.B. et al, Appl. Bioch. And
Microbiol., 27, 556-561, 1991, EP 1 013 765 A) por
la respectiva cepa productora de E. coli, tal como la
cepaVKPM-3996. Además, los presentes inventores han
puesto de manifiesto que el gen rhtA existe a 18 min en el
cromosoma de E. coli, próximo al operón glnHPQ que
codifica componentes del sistema de transporte de glutamina, y que
el gen rhtA es idéntico al ORF1 (gen ybiF, números
764 a 1.651 en el número de acceso GenBank AAA218541, gi:440181),
localizado entre los genes pexB y ompX. La unidad que
expresa una proteína codificada por el ORF1 se ha designado gen
rhtA (rht: resistencia a homoserina y treonina). Además, los
presentes inventores han descubierto que la mutación rhtA23
es una sustitución A-por-G en la
posición -1 con respecto al codón iniciador ATG (ABSTRACTS del 17
International Congress of Biochemistry and Molecular Biology en
conjunción con el Annual Meeting de 1997 de la American Society for
Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California,
24-29 de agosto, 1997, resumen nº 457, EP 1 013 765
A).
En condiciones para estudiar el recorrido
principal de biosíntesis de la treonina y optimizarlo en gran
medida, la mejora adicional de la cepa productora de treonina
podría llevarse a cabo suplementando la bacteria con una mayor
cantidad de precursores distantes de treonina, tales como el
aspartato.
Es conocido que el aspartato es un dador de
carbono para la síntesis de los aminoácidos de la familia aspartato
(treonina, metionina, lisina), y diaminopimelato, un compuesto que
constituye la pared celular de la bacteria. Esta síntesis se lleva
a cabo a través de un recorrido complejo con diversos puntos de
ramificación y un esquema regulador extremadamente sensible. En el
punto de ramificación de aspartato, aspartato semialdehído,
homoserina, existen tantas isozimas como aminoácidos que se derivan
de esta etapa biosintética. La aspartoquinasa homoserina
deshidrogenasa I, codificada por (parte del operón thrABC),
lleva a cabo la primera y la tercera reacciones de la biosíntesis
de la treonina. La treonina y la isoleucina regulan la expresión de
la aspartoquinasa homoserina deshidrogenasa I, y la treonina inhibe
las dos actividades para catalizar las reacciones mencionadas
anteriormente (Escherichia coli and Salmonella,
segunda edición, editor jefe: F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington
D.C., 1996).
Dos genes están involucrados en la formación del
aspartato: aspartato aminotransferasa (aspartato transaminasa),
codificada por el gen aspC, y la aspartasa, que es un
producto del gen aspA. La aspartato aminotransferasa
convierte el oxaloacetato en aspartato. La aspartasa convierte el
fumarato en aspartato.
Se dio a conocer el efecto de la amplificación
del gen aspC sobre la producción de L-lisina,
un aminoácido de la familia aspartato. La amplificación del gen
aspC se utilizó para la producción de
L-lisina por parte de E. coli (patente US nº
6.040.160). Se utilizaron bacterias corineformes que incorporan una
aspartoquinasa y una secuencia de ADN mejorada que codifica
diversas enzimas, incluyendo la aspartato aminotransferasa, para la
producción de L-lisina (patente US nº
6.004.773).
Se puso de manifiesto que la aspartato
aminotransferasa podía ser útil para la producción de
L-treonina y L-lisina por parte de
bacterias corineformes (patente US nº
4.980.285).
Hasta el momento, no existe ninguna referencia
que haga referencia a la utilización de la bacteria perteneciente
al género Escherichia con una actividad aumentada de
aspartato aminotransferasa para la producción de
L-treonina.
Un objetivo de la presente invención consiste en
aumentar la productividad de las cepas productoras de
L-treonina y dar a conocer un procedimiento para
producir L-treonina utilizando dichas cepas.
Dicho objetivo se alcanzó con el descubrimiento
de que el gen aspC, que codifica la aspartato
aminotransferasa, clonado en un vector de copia baja, puede
aumentar la producción de L-treonina. De este modo
se ha completado la presente invención.
Las presentes invenciones son las
siguientes:
- (1)
- Una bacteria productora de L-treonina perteneciente al género Escherichia, en la que la bacteria se ha modificado con el fin de aumentar la actividad de aspartato aminotransferasa, en la que el gen de aspartato aminotransferasa se origina a partir de una bacteria perteneciente al género Escherichia, y codifica las siguientes proteínas (A) o (B):
- (A)
- una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID nº 2 del listado de secuencias;
- (B)
- una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que incluye la eliminación, sustitución, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID nº 2 del listado de secuencias, y que tiene actividad de la aspartato aminotransferasa.
- (2)
- La bacteria según (1), en la que la actividad de la aspartato aminotransferasa se aumenta incrementando la cantidad de expresión de un gen de la aspartato aminotransferasa.
- (3)
- La bacteria según (1), en la que la actividad de aspartato aminotransferasa se incrementa incrementando el número de copias del gen de aspartato aminotransferasa o Modificando una secuencia de control de expresión del gen, de tal modo que aumente la expresión del mismo.
- (4)
- La bacteria según (3), en la que el número de copias se aumenta transformando la bacteria con un vector con bajas copias que contiene el gen.
- (5)
- La bacteria según (1) a (4), en la que el gen de aspartato aminotransferasa comprende el ADN (a) o (b) siguiente:
- (a)
- un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 1 a 1.191 en la SEC ID nº 1; o
- (b)
- un ADN que se puede hibridar con una secuencia de nucleótidos que los nucleótidos 1 a 1.191 en la SEC ID nº 1; o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos bajo condiciones estrictas y que codifica una proteína que tiene actividad de aspartato aminotransferasa.
- (6)
- La bacteria según (5), en la que las condiciones estrictas son condiciones en las que el lavado se lleva a cabo a 60ºC, y a una concentración salina correspondiente a 1 x SSC y 0,1% SDS.
- (7)
- La bacteria según los puntos (1) a (6), en la que la bacteria se ha modificado adicionalmente con el fin de aumentar la expresión de uno o más genes seleccionados de entre el grupo constituido por:
- el gen mutante thrA, que codifica la aspartoquinasa homoserina deshidrogenasa I, resistente a la inhibición por retroalimentación por treonina;
- el gen thrB, que codifica la homoserina quinasa;
- el gen thrC, que codifica la treonina sintasa; y
- el gen rhtA, que codifica la proteína putativa transmembrana.
- (8)
- La bacteria según el punto (7), en la que la bacteria se ha modificado con el fin de aumentar la cantidad de expresión de los gen thrA mutante, gen thrB, thrC y gen rhtA.
- (9)
- Procedimiento para producir L-treonina, que comprende cultivar la bacteria según los puntos (1) a (8) en un medio de cultivo con el fin de producir y acumular la L-treonina en el medio de cultivo, y recolectar la L-treonina del medio de cultivo.
La presente invención se describe en detalle a
continuación.
La bacteria según la presente invención es una
bacteria productora de L-treonina perteneciente al
género Escherichia, en la que la bacteria se ha modificado
con el fin de aumentar la actividad de aspartato
aminotransferasa.
La bacteria perteneciente al género
Escherichia que puede utilizarse en la presente invención no
está particularmente limitada. Sin embargo, por ejemplo, se
incluyen las bacterias descritas por Neidhardt, F.C. et al
(Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American
Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, tabla 1).
En la presente invención, "bacteria productora
de L-treonina" hace referencia a una bacteria que
tiene capacidad para acumular L-treonina en un
medio, cuando la bacteria según la presente invención se cultiva en
dicho medio. La capacidad productora de L-treonina
puede ser inducida o aumentada mediante reproducción.
La expresión "actividad de aspartato
aminotransferasa" hace referencia a la actividad de catálisis de
la reacción de formación de aspartato a partir de oxaloacetato y
L-glutamato, con liberación de
\alpha-cetoglutarato, utilizando piridoxal
5'-fosfato.
La expresión "modificada con el fin de
aumentar la actividad de aspartato aminotransferasa" se refiere a
que la actividad por célula ha aumentado con respecto a la de una
cepa no modificada, por ejemplo, una cepa de tipo salvaje. Por
ejemplo, se incluyen un caso en el que el número de moléculas de
aspartato aminotransferasa por célula aumenta, un caso en el que la
actividad específica por molécula de aspartato aminotransferasa por
célula aumenta, etc. Además, como cepa de tipo salvaje que actúa
como objeto de comparación, por ejemplo, se incluye la
Escherichia coli K-12. Como resultado del
aumento de la actividad intracelular de aspartato aminotransferasa,
se obtiene un efecto tal que la cantidad de acumulación de
L-treonina en un medio aumenta.
El aumento de la actividad de aspartato
aminotransferasa en una célula bacteriana puede alcanzarse
aumentando la cantidad de expresión de un gen que codifica la
aspartato aminotransferasa. Cualquiera de los genes derivados de
bacterias pertenecientes al género Escherichia y de los genes
derivados de otras bacterias, tal como las bacterias corineformes,
pueden utilizarse como gen de aspartato aminotransferasa. De entre
estos, resultan preferidos los genes derivados de bacterias
pertenecientes al género Escherichia.
Como gen que codifica la aspartato
aminotransferasa de Escherichia coli, ya se ha descrito el
aspC (números de nucleótidos 983.742 a 984.932 en la
secuencia de acceso GenBank NC_000913.1, gi:16128895). En
consecuencia, el gen aspC puede obtenerse por PCR (reacción
en cadena de polimerasa; véase White, T. J. et al,,
Trends Genet., 5, 185 (1989)), utilizando cebadores
preparados sobre la base de la secuencia de nucleótidos del gen.
Los genes que codifican la aspartato aminotransferasa de otros
microorganismos pueden obtenerse de un modo similar.
El gen aspC originado a partir de
Escherichia coli se ejemplifica mediante un ADN que codifica
la siguiente proteína (A) o (B):
- (A)
- una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID nº 2 del listado de secuencias;
- (B)
- una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que incluye la eliminación, sustitución, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID nº 2 del listado de secuencias, y que tiene actividad de aspartato aminotransferasa.
El número de estos "varios" aminoácidos
varía en función de la posición o el tipo de residuos aminoácido en
la estructura tridimensional de la proteína. Puede ir de 2 a 30,
preferentemente entre 2 y 15, y más preferentemente entre 2 y 5
para la proteína (A). Esto es debido a la siguiente razón. Algunos
aminoácidos tienen una elevada homología entre sí, y la diferencia
en dicho aminoácido no afecta mayormente a la estructura
tridimensional de la proteína y a su actividad. En consecuencia, la
proteína (B) puede ser una proteína que tiene una homología no
inferior a entre el 30 y el 50%, preferentemente no inferior a entre
el 50 y el 70%, con respecto al conjunto de residuos aminoácido
para constituir la aspartato aminotransferasa, y la cual tiene la
actividad de aspartato aminotransferasa.
El ADN, que codifica sustancialmente la misma
proteína que la aspartato aminotransferasa descrita anteriormente,
se puede obtener, por ejemplo, modificando la secuencia de
nucleótidos del ADN que codifica la aspartato aminotransferasa (SEC
ID nº 1), por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio, de
tal modo que uno o más residuos aminoácido en un sitio específico
experimentan eliminación, sustitución, inserción o adición. El ADN
modificado tal como se ha descrito anteriormente puede obtenerse
mediante el tratamiento de mutación conocido convencionalmente.
Dicho tratamiento incluye el tratamiento del ADN que codifica las
proteínas según la presente invención con hidroxilamina o el
tratamiento de la bacteria que contiene el ADN con radiación UV o un
reactivo, tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
o ácido nitroso.
Un ADN que codifica sustancialmente la misma
proteína que la aspartato aminotransferasa se puede obtener
expresando un ADN que presenta una mutación tal como la descrita
anteriormente en una célula apropiada, e investigando la actividad
de un producto expresado. Un ADN que codifica sustancialmente la
misma proteína que la aspartato aminotransferasa también puede
obtenerse aislando un ADN que se puede hibridar con una sonda que
presenta una secuencia de nucleótidos que comprende, por ejemplo,
la secuencia de nucleótidos representada en el listado de
secuencias como SEC ID nº 1, en condiciones estrictas, y que
codifica una proteína que tiene actividad de aspartato
aminotransferasa, a partir de ADN que codifica aspartato
aminotransferasa que presenta una mutación, o a partir de una
célula que lo contiene. Las "condiciones estrictas" a las que
se hace referencia en la presente memoria son una condición bajo la
cual se forma un así designado híbrido específico, y no se forma
híbrido no específico. Es difícil expresar claramente esta
condición utilizando valores numéricos. Sin embargo, por ejemplo,
las condiciones estrictas se ejemplifican mediante una condición
bajo la cual los ADN con elevada homología, por ejemplo, ADN que
presentan una homología no inferior a 50%, preferentemente no
inferior a 70%, más preferentemente no inferior a 90%, se hibridan
entre sí, pero bajo la cual los ADN que presentan una homología
menor que la anterior no se hibridan entre sí. Alternativamente, las
condiciones estrictas se ejemplifican mediante una condición bajo
la cual los ADN se hibridan entre sí para una concentración salina
que se corresponde con una condición ordinaria de lavado en la
hibridación Southern, es decir, 1 x SSC, 0,1% SDS, preferentemente
0,1 x SSC, 0,1% SDS, a 60ºC.
También puede utilizarse una secuencia parcial
de la secuencia de nucleótidos de SEC ID nº 1 como sonda. Una sonda
de este tipo puede prepararse por PCR, utilizando polinucleótidos
producidos sobre la base de la secuencia de nucleótidos de SEC ID
nº 1 como cebadores, y un fragmento de ADN que contiene la secuencia
de nucleótidos de SEC ID nº 1 como patrón. Cuando se utiliza un
fragmento de ADN con una longitud de aproximadamente 300 bp como
sonda, las condiciones de lavado para la hibridación consisten, por
ejemplo, en 50ºC, 2 x SSC y 0,1% SDS.
La sustitución, eliminación, inserción o adición
de nucleótido tal como se describe anteriormente también incluye la
mutación, que tiene lugar de forma natural (mutante o variante), por
ejemplo, sobre la base de la diferencia individual o la diferencia
en la especie o género de la bacteria que incluye aspartato
aminotransferasa.
La transformación de una bacteria con ADN que
codifica una proteína significa la introducción del ADN en la
célula bacteriana, por ejemplo, por los métodos convencionales, con
el fin de aumentar la expresión del gen que codifica la proteína
según la presente invención, y con el fin de aumentar la actividad
de la proteína en la célula bacteriana.
Los métodos para aumentar la expresión de genes
incluyen el aumento del número de copias del gen. La introducción
de un gen en un vector que puede funcionar en una bacteria
perteneciente al género Escherichia aumenta el número de
copias del gen. Para estos propósitos, se pueden utilizar
preferentemente vectores de copia baja. Los vectores de copia baja
se ejemplifican con pSC101, pMW118, pMW119 y similares.
El aumento de la expresión de genes también
puede alcanzarse mediante la introducción de múltiples copias del
gen en un cromosoma bacteriano, por ejemplo, mediante un método de
recombinación homóloga, o similares. Como método de transformación,
puede utilizarse cualquier método conocido que se haya dado a
conocer hasta el momento. Por ejemplo, puede utilizarse un método
de tratamiento de las células receptoras con cloruro de calcio con
el fin de aumentar la permeabilidad del ADN, que se ha dado a
conocer para Escherichia coli K-12 (Mandel,
M. y Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).
Por otro lado, el aumento de la expresión de
genes también puede alcanzarse colocando el ADN según la presente
invención bajo control de un promotor potente. Por ejemplo, se
conocen como promotores potentes el promotor lac, promotor
trp, promotor trc, y promotores P_{R}, P_{L} de
bacteriófago lambda. La utilización del promotor potente puede
combinarse con la multiplicación de copias de genes.
Alternativamente, un promotor puede aumentarse,
por ejemplo, introduciendo una mutación en el promotor con el fin
de aumentar un nivel de transcripción de un gen situado corriente
abajo del promotor. Además, es conocida la sustitución de diversos
nucleótidos en el espaciador entre el sitio de unión al ribosoma
(RBS) y el codón iniciador, y particularmente las secuencias
inmediatamente anteriores al codón iniciador afectan profundamente
la traducibilidad del ARNm. Por ejemplo, se encontró un intervalo de
20 veces en los niveles de expresión, en función de la naturaleza
de los tres nucleótidos que preceden al codón iniciador (Gold et
al, Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981;
Hui et al,, EMBO J., 3, 623-629, 1984).
Anteriormente, los inventores de la presente invención mostraron
que la mutación rhtA23 es una sustitución
A-por-G en la posición -1 con
respecto al codón iniciador ATG (ABSTRACTS del 17 International
Congress of Biochemistry and Molecular Biology en conjunción con el
Annual Meeting de 1997 de la American Society for Biochemistry and
Molecular Biology, San Francisco, California, 24-29
de agosto, 1997, resumen nº 457). En consecuencia, puede proponerse
que la mutación rhtA23 aumenta la expresión del gen
rhtA y, como consecuencia, aumenta el nivel de resistencia a
treonina, homoserina y algunas otras sustancias transportadas fuera
de las células.
Además, también es posible introducir una
sustitución de nucleótidos en una región del promotor del gen de
aspartato aminotransferasa en el cromosoma bacteriano, de tal modo
que se modifique para obtener uno más potente. La modificación de
la secuencia de control de la expresión puede llevarse a cabo, por
ejemplo, del mismo modo que la sustitución de genes utilizando un
plásmido sensible a la temperatura, tal como se da a conocer en la
publicación de patente internacional WO00/18935 y en la publicación
de patente japonesa nº 1-215280.
El aumento del número de copias del gen de
aspartato aminotransferasa también puede alcanzarse introduciendo
múltiples copias del gen de aspartato aminotransferasa en el ADN
cromosómico de la bacteria. Con el fin de introducir múltiples
copias del gen de aspartato aminotransferasa en el cromosoma
bacteriano, se lleva a cabo una recombinación homóloga utilizando
una secuencia cuyas múltiples copias existen en el ADN cromosómico
como dianas. Como secuencias cuyas múltiples copias existen en el
ADN cromosómico, pueden utilizarse ADN repetitivos, existiendo
repeticiones invertidas en el extremo de un elemento transponible.
Además, tal como se da a conocer en la patente japonesa abierta al
público nº 2-109985, es posible incorporar el gen de
aspartato aminotransferasa en un transposón y permitir que sea
transferido con el fin de introducir múltiples copias del gen en el
ADN cromosómico.
Los métodos para la preparación de ADN plásmido,
digestión y ligación de ADN, transformación, selección de un
oligonucleótido como cebador, y similares, pueden ser métodos
ordinarios bien conocidos por el experto en la materia. Estos
métodos están descritos, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch,
E.F., y Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual,
Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
La bacteria según la presente invención puede
obtenerse por introducción de los ADN mencionados anteriormente en
una bacteria que presenta inherentemente la capacidad de producir
L-treonina. Alternativamente, la bacteria según la
presente invención puede obtenerse dotando de la capacidad de
producir L-treonina a la bacteria que ya incluye
los ADN.
Como cepa original cuya actividad de aspartato
aminotransferasa codificada por el gen aspC se debe aumentar,
pueden utilizarse las bacterias productoras de treonina
pertenecientes al género Escherichia, tales como la cepa
E. coli VKPM B-3996 (patente US nº 5.175.107,
patente US nº 5.705.371), la cepa E. coli
NRRL-21593 (patente US nº 5.939.307), la cepa E.
coli FERM BP-3756 (patente US nº 5.474.918), las
cepas E. coli FERM BP-3519 y FERM
BP-3520 (patente US nº 5.376.538), la cepa E.
coli MG442 (Gusyatiner et al, Genetika (en ruso), 14,
947-956 (1978)), las cepas E. coli VL643 y
VL2055 (EP 1 149 911A).
La cepa B-3996 es deficiente en
gen thrC y es asimilativa de sacarosa, presentando el gen
ilvA una mutación rezumante. La cepa presenta una mutación
en el gen rhtA, lo que le confiere resistencia a una alta
concentración de treonina u homoserina. La cepa
B-3996 incluye el plásmido pVIC40 obtenido por
inserción del operón thrA*BC que incluye el gen mutante
thrA, que codifica la aspartoquinasa homoserina
deshidrogenasa I, que está sustancialmente desensibilizada a la
inhibición por retroalimentación en el vector derivado de RSF1010.
La cepa B-3996 se depositó el 7 de abril de 1987 en
la Russian National Collection of Industrial Microorganismus (VKPM)
(Dorozhny proezd. 1, Moscú 113545, Federación Rusa) bajo el número
de acceso B-3996.
Preferentemente, la bacteria según la presente
invención se modifica además para aumentar la expresión de uno o
más de los genes siguientes, así como del gen aspC:
- -
- el gen mutante thrA, que codifica la aspartoquinasa homoserina deshidrogenasa I, resistente a la inhibición por retroalimentación de treonina;
- -
- el gen thrB, que codifica la homoserina quinasa;
- -
- el gen thrC, que codifica la treonina sintasa;
Otra forma de realización preferida de la
bacteria se modifica con el fin de aumentar el gen rhtA, que
codifica la proteína putativa transmembrana, además del aumento del
gen aspC. La forma de realización más preferida de la
bacteria se modifica con el fin de aumentar la cantidad de expresión
del gen aspC, el gen mutante thrA, el gen
thrB, el gen thrC y el gen rhtA.
El procedimiento para producir
L-treonina según la presente invención comprende las
etapas que consisten en cultivar la bacteria según la presente
invención en un medio de cultivo con el fin de permitir que la
L-treonina sea producida y acumulada en dicho medio
de cultivo, y recoger la L-treonina del medio de
cultivo.
En la presente invención, el cultivo, la
recogida y la purificación de L-aminoácido a partir
del medio y similares pueden llevarse a cabo de una manera similar
al método de fermentación convencional, en el que se produce un
aminoácido utilizando un microorganismo.
El medio utilizado para el cultivo puede ser un
medio sintético o un medio natural, siempre y cuando dicho medio
incluya una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno y minerales
y, si es necesario, las cantidades apropiadas de nutrientes que el
microorganismo requiere para su crecimiento. La fuente de carbono
puede incluir diversos hidratos de carbono, tales como glucosa y
sacarosa, y diversos ácidos orgánicos. En función del modo de
asimilación del microorganismo utilizado, puede utilizarse alcohol,
incluyendo etanol y glicerol. Como fuente de nitrógeno, se utilizan
diversas sales de amonio, tales como amoniaco y sulfato de amonio,
otros compuestos de nitrógeno, tales como aminas, una fuente
natural de nitrógeno, tal como peptona, hidrolizado de soja, y
microorganismos fermentativos digeridos. Como minerales, se utilizan
monofosfato de potasio, sulfato de magnesio, cloruro sódico,
sulfato ferroso, sulfato de manganeso, cloruro de calcio y
similares. Como vitaminas, se utilizan tiamina, extracto de
levadura y
similares.
similares.
Preferentemente, el cultivo se lleva a cabo en
condiciones aeróbicas, tales como un cultivo agitado, o un cultivo
agitado con aireación, a una temperatura comprendida entre 20 y
40ºC, preferentemente entre 30 y 38ºC. El pH del cultivo está
comprendido habitualmente entre 5 y 9, preferentemente entre 6,5 y
7,2. El pH del cultivo puede ajustarse con amoniaco, carbonato de
calcio, diversos ácidos, diversas bases, y tampones. Típicamente,
un cultivo de entre 1 y 5 días conduce a la acumulación del
L-aminoácido diana en el medio líquido.
Tras el cultivo, los sólidos, tales como las
células, se pueden eliminar del medio líquido por centrifugación o
filtración mediante membranas, y posteriormente la
L-treonina se puede recoger y purificar por los
métodos de intercambio iónico, concentración y cristalización.
La presente invención se explica con mayor
detalle a continuación haciendo referencia a los ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se obtuvo el gen aspC a partir de ADN
cromosómico de la cepa E. coli K-12 mediante
PCR, utilizando los cebadores mostrados en las SEC ID nº 3 y 4 del
listado de secuencias. El fragmento de ADN obtenido se trató con
las enzimas de restricción PvuII y EcoRI, y se ligaron
al plásmido estable de copia baja pMW119 (replicón pSC101),
previamente tratado con las enzimas de restricción HincII y
EcoRI bajo control del promotor P_{lac}. Por lo tanto, el
plásmido pMW-P_{1AC}-aspC fue
obtenido.
Asimismo, el gen aspC se dispuso bajo control
del promotor P_{R} fuente del fago lambda en lugar del promotor
P_{lac}. Se formó ADN dúplex que contenía el promotor P_{R}
utilizando los oligonucleótidos 5'-fosforilados
sintetizados químicamente que se indican en las SEC ID nº 5 y 6 del
listado de secuencias. A continuación, el ADN dúplex se ligó al
plásmido pMW-P_{lac}-aspC,
previamente tratado con las enzimas de restricción PvuII y
HindIII. De este modo se construyó el plásmido
pM-P_{R}-aspC.
Se pudo alcanzar un nivel elevado no regulado de
expresión del gen aspC utilizando estos plásmidos. Los
plásmidos pMW-P_{lac}-aspC y
pM-P_{R}-aspC son compatibles con
el plásmido pVIC40 (replicón RSF1010); en consecuencia, se pudieron
mantener en las bacterias simultáneamente dos plásmidos pVIC40 y
pMW-P_{lac}-aspC o pVIC40 y
pM-P_{R}-aspC.
Cada uno de los plásmidos
pMW-P_{lac}-aspC y
pM-P_{R}-aspC se introdujeron en
una cepa de E. coli productora de treonina y resistente a la
estreptomicina B-3996 (patente US nº 5.175.107). De
este modo, se obtuvieron las cepas B-3996
(pMW-P_{lac}-aspC) y
B-3996
(pM-P_{R}-aspC).
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Ejemplo
2
Las cepas de E. coli
B-3996
(pMW-P_{lac}-aspC) y
B-3996
(pM-P_{R}-aspC) se cultivaron
durante 18-24 horas a 37ºC sobre placas de
L-agar que contenían estreptomicina (100 \mug/ml).
A continuación, un lazo (loop) de las células se transfirió a 50 ml
de caldo L con la siguiente composición: triptona - 10 g/l, extracto
de levadura - 5 g/l, NaCl - 5 g/l. Las células (50 ml, OD_{540} -
2 o.u.) cultivadas a 37ºC durante 5 horas con agitación (240 rpm)
se utilizaron para sembrar 450 ml del medio para fermentación. La
fermentación en lote se llevó a cabo en fermentadores de
laboratorio con una capacidad de 1,0 l bajo aireación (1/1 vvm) con
agitación a una velocidad de 1.200 rpm a 37ºC. El valor de pH se
mantuvo automáticamente a 6,6 utilizando licor de amoniaco al 8%.
Los resultados se indican en la tabla 1.
Composición del medio de fermentación (g/l):
| Sacarosa | 100,0 | |
| NH_{4}Cl | 1,75 | |
| KH_{2}PO_{4} | 1,0 | |
| MgSO_{4} \cdot 7H_{2}O | 0,8 | |
| FeSO_{4} \cdot 7H_{2}O | 0,01 | |
| MnSO_{4} \cdot 5H_{2}O | 0,01 | |
| Mameno(TN) | 0,15 | |
| Betaína | 1,0 | |
| L-isoleucina | 0,2 |
La sacarosa y el sulfato de magnesio se
esterilizan por separado. El pH se ajusta a 6,6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Según la presente invención, se puede producir
eficazmente L-treonina.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE
L-TREONINA CON LA UTILIZACIÓN DE UNA BACTERIA QUE
PERTENECE AL GÉNERO ESCHERICHIA
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> C042AYOP1313
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-02-25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> RU 2002104983
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-02-27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1191
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (1191)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 36
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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<210> 6
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<211> 40
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Bacteria productora de
L-treonina perteneciente al género
Escherichia, en la que la bacteria se ha modificado para
aumentar la actividad de la aspartato aminotransferasa, en la que
dicho gen de la aspartato aminotransferasa se origina a partir de
una bacteria perteneciente al género Escherichia y codifica
las proteínas (A) o (B) siguientes:
- (A)
- una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID nº 2 en el listado de secuencias;
- (B)
- una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que incluye la eliminación, sustitución, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID nº 2 en el listado de secuencias, y que tiene actividad de la aspartato aminotransferasa.
2. Bacteria según la reivindicación 1, en la que
dicha actividad de aspartato aminotransferasa se aumenta
incrementando la cantidad de expresión del gen de la aspartato
aminotransferasa.
3. Bacteria según la reivindicación 1, en la que
dicha actividad de la aspartato aminotransferasa se aumenta
incrementando el número de copias del gen de la aspartato
aminotransferasa, o modificando una secuencia de control de
expresión del gen, de manera que dicha expresión de dicho gen
aumenta.
4. Bacteria según la reivindicación 3, en la que
el número de copias se incrementa mediante la transformación de
dicha bacteria con un vector con bajas copias que contiene dicho
gen.
5. Bacteria según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que el gen de la aspartato
aminotransferasa comprende los ADN (a) o (b) siguientes:
- (a)
- un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 1 a 1.191 en la SEC ID nº 1; o
- (b)
- un ADN que se puede hibridar con una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 1 a 1.191 en la SEC ID nº 1 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos bajo condiciones estrictas y que codifica una proteína que tiene actividad de la aspartato aminotransferasa.
6. Bacteria según la reivindicación 5, en la que
las condiciones estrictas son condiciones en las que el lavado se
lleva a cabo a 60ºC, y a una concentración salina correspondiente a
1 x SSC y 0,1% SDS.
7. Bacteria según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha bacteria se ha modificado
además para aumentar la expresión de uno o más genes seleccionados
de entre el grupo constituido por:
el gen mutante thrA, que codifica la
aspartoquinasa homoserina deshidrogenasa I, resistente a la
inhibición por retroalimentación mediante treonina;
el gen thrB, que codifica la homoserina
quinasa;
el gen thrC, que codifica la treonina
sintasa; y
el gen rhtA, que codifica la proteína
transmembrana putativa.
8. Bacteria según la reivindicación 7, en la que
dicha bacteria se ha modificado para incrementar la cantidad de
expresión de dichos gen thrA mutante, gen thrB, gen
thrC y gen rhtA.
9. Procedimiento para producir
L-treonina, que comprende cultivar la bacteria según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en un medio de cultivo con
el fin de producir y acumular la L-treonina en el
medio de cultivo, y recoger la L-treonina del medio
de cultivo.
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