JP4032441B2 - L−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、L−アミノ酸の製造方法に関し、詳しくは、甘味料アスパルテームの原料(L−フェニルアラニン)、飼料添加物(L−トリプトファン、L−スレオニン)、輸液等の医薬品原料(L−トリプトファン、L−フェニルアラニン、L−チロシン、L−スレオニン及びL−イソロイシン)として需要が急増しているアミノ酸を効率よく製造する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
微生物を利用したアミノ酸の製造方法は多数知られている。
たとえば、L−フェニルアラニンの製造法としては、組換え体エシェリヒア・コリ(Escherichia coli (E. coli))を用いるものに、特公平2−4276号、特表平4−501813号、特開平5−244956号、国際公開WO87/00202がある。
【0003】
またL−フェニルアラニンまたはL−チロシンの製造法としては、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属の変異株を用いるものに、特開昭61−128897号があり、組換え体コリネバクテリウムを用いるものに、特開昭60−34197号、特開昭60−24192号、特開昭61−260892号、特開昭61−124375号が知られている。
【0004】
L−トリプトファンの製造法としては、組換え体エシェリヒア・コリを用いるものに、特開昭57−71397号、米国特許4371614号があり、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)の変異株を用いるものに特公昭53−39517号、同62−34399号があり、組換え体バチルス・ズブチリスを用いるものに、特開昭61−104790号、特開平1−67179号があり、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属の変異株を用いるものに、特開昭57−174096号があり、更に組換え体ブレビバクテリウム属を用いるものに特開昭62−51980号が報告されている。
【0005】
L−スレオニンの製造法としては、エシェリヒア属細菌の変異株を用いるものに特開平5−304969号があり、組換え体エシェリヒア・コリを用いるものに特公平1−29559号、特開平2−109985号、特開昭56−15696号、および特表平3−501682号がある。コリネバクテリウム属細菌の変異株を用いるものには、特開昭62−239996号があり、組換え体コリネバクテリウム属細菌を用いるものには特開昭61−195695号が報告されている。
【0006】
また、L−イソロイシンの製造法としては、エシェリヒア・コリを用いるものに特開平5−130882号があり、エシェリヒア・コリの組換え体を用いるものには特開平2−458号がある。また、コリネバクテリウム属細菌の変異株を用いるものとしては特公平3−62395号があり、コリネバクテリウム属の組換え体を用いるものには特公平5−47196号が報告されている。
【0007】
これらのアミノ酸の製造法において用いられてきた微生物の育種は、主として各種アミノ酸生合成の共通経路、及びそれに続く各々のアミノ酸の生合成の固有の経路における反応を触媒する酵素の増強、あるいは、最終産物等による調節(フィードバック阻害や抑制)を回避することにより行われてきた。具体的には、微生物への栄養要求性の付与、薬剤耐性の付与、組換えDNA手法による生合成系酵素遺伝子の増幅や調節解除を目的とした変異の導入などが行われてきた。
【0008】
芳香族アミノ酸生合成の共通経路の最初の反応を司る酵素は、3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロン酸−7−リン酸(DAHP)合成酵素(DS)である。エシェリヒア・コリのDSには、3種類のアイソザイムが存在し、aroF、aroG、aroHと呼ばれる遺伝子にコードされ、それぞれL−チロシン、L−フェニルアラニン、L−トリプトファンによるフィードバック阻害を受ける。これらのうち、酵素活性の高いaroF、aroG由来の脱感作型酵素(フィードバック阻害を実質的に受けない酵素)をコードする遺伝子と、L−トリプトファン生合成固有系の脱感作型アントラニル酸合成酵素(AS)をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンとを組合せてエシェリヒア・コリに導入することによって、芳香族アミノ酸の生産性を向上させる技術が知られている。
【0009】
DAHPの合成反応では、ホスホエノールピルビン酸(以下、「PEP」ともいう)とD−エリスロース 4−リン酸(E4P)が基質として用いられている。このPEPは、L−アスパラギン酸、L−スレオニン、L−イソロイシン等の生合成前駆体でもある。これらの基質は、解糖経路やペントースリン酸経路を経て、グルコース等の炭素源から供給されるが、これまでアミノ酸生産菌株の育種においては、これらの基質の供給能力を高め、アミノ酸の生産性を改善した例は、知られていない。
【0010】
ホスホエノールピルビン酸合成酵素(以下、「PPS」と略すことがある)は、微生物に広く見い出されている酵素であり、糖新生におけるピルビン酸からのPEPの供給に重要な役割を果たしている。エシェリヒア属細菌であるエシェリヒア・コリでは、PPSをコードする遺伝子(pps)のクローニング、該遺伝子の塩基配列の決定、及び酵素の機能解析が行われてきた他、デヒドロキナ酸合成酵素欠損株でのpps遺伝子及びトランスケトラーゼ遺伝子との同時増幅により、DAHPが理論収率に近い値で生成することが報告されている(Patnaik, R. et al., Appl. Environ. Microbiol., Vol.60, No.11, 3903-3908 (1994))。しかしながら、pps遺伝子の増幅が、芳香族アミノ酸やその他のアミノ酸の生産性を高めた例は知られていない。
【0011】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、芳香族アミノ酸をはじめとする種々のアミノ酸を高収率で、安価に製造する方法を提供することを課題とするものである。
【0012】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、L−アミノ酸生成能を有する微生物細胞中のホスホエノールピルビン酸生産能を高めることにより、L−アミノ酸の生産性を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0013】
すなわち本発明は、L−アミノ酸生産能力を有する微生物を培地中に培養し、その培地中にL−アミノ酸を生成蓄積させ、該L−アミノ酸を採取することを含む、L−アミノ酸の製造法において、
前記微生物のホスホエノールピルビン酸の生産能を上昇させることを特徴とするL−アミノ酸の製造法である。
【0014】
上記製造法により製造されるL−アミノ酸としては、L−トリプトファン、L−フェニルアラニン、L−チロシン、L−スレオニン又はL−イソロイシンが好適なものとして挙げられる。
【0015】
L−アミノ酸生産能力を有する微生物としては、エシェリヒア属細菌、又はコリネ型細菌が挙げられる。ここでいうコリネ型細菌とは、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合された細菌(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981))を含み、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。
【0016】
微生物のホスホエノールピルビン酸生産能を上昇させる手段としては、微生物細胞内のPPS活性を上昇させることが挙げられる。また、微生物細胞内のPPS活性を上昇させる手段としては、微生物細胞内のpps遺伝子の発現量を上昇させることの他、比活性の高いPPSをコードする遺伝子を細胞に導入する等の方法がある。
【0017】
微生物細胞内のpps遺伝子の発現量を上昇させる手段として具体的には、微生物細胞内のpps遺伝子のコピー数を上昇させることの他、pps遺伝子のプロモーターの転写活性を高めること等が挙げられる。
【0018】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
本発明において好適に利用される微生物としては、その微生物において、プラスミドの複製開始起点を含むDNA断片が取得されていて、pps遺伝子が機能し、pps遺伝子のコピー数を上昇させることが可能な微生物であって、かつL−アミノ酸生産能力を有する微生物(例えば、L−フェニルアラニンの場合は、L−フェニルアラニンアナログ耐性等の付与によりL−フェニルアラニン生産性を獲得したもの)であれば、エシェリヒア属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、シュードモナス属等に属する微生物等、特に制限されない。これらの中では、エシェリヒア属細菌及びコリネ型細菌が好ましい。
【0019】
具体的には、L−トリプトファンの場合は、エシェリヒア・コリAGX17(pGX44)〔NRRL B-12263〕及びAGX6(pGX50)aroP〔NRRL B-12264〕(いずれも米国特許第 4,371,614号参照)、ブレビバクテリウム・フラバムAJ11667(特開昭57−174096参照)が、
L−フェニルアラニンの場合は、エシェリヒア・コリ AJ 12604(FERM BP-3579)(欧州特許出願公開第 488,424号参照)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12637(FERM BP-4160)(フランス特許出願公開第 2,686,898号参照)が、
L−チロシンの場合は、コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11655(FERM P-5836)(特公平2−6517参照)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12081(FERM P-7249)(特開昭60−70093参照)が、
L−スレオニンの場合はエシェリヒア・コリ VKPM B-3996(RIA 1867)(米国特許第5,175,107号参照)、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ12318(FERM BP-1172)(米国特許第5,188,949号参照)等が、
L−イソロイシンの場合はエシェリヒア・コリKX141(VKPM B-4781)(欧州特許出願公開第519,113号参照)、ブレビバクテリウム・フラバム AJ12149(FERM BP-759)(米国特許第4,656,135号参照)等が挙げられる。
【0020】
上記のような微生物のPEP生産能を上昇させる手段としては、微生物細胞内のPPS活性を上昇させることが挙げられる。
PPS活性を上昇させる手段としては、微生物細胞内のpps遺伝子の発現量を上昇させることが挙げられる。また、pps遺伝子を改変し、活性の上昇したPPSを創造することも、PPS活性を上昇させる手段の一つである。
【0021】
微生物細胞内のpps遺伝子の発現量を上昇させる手段には、微生物細胞内のpps遺伝子のコピー数を上昇させることが挙げられる。pps遺伝子のコピー数を上昇させるには、同遺伝子を含むDNA断片が必要である。ところで、エシェリヒア属細菌として、エシェリヒア・コリではpps遺伝子がクローニングされ、塩基配列が決定されている(Mol. Gen. Genet., 231, 332 (1992))。そこで、同遺伝子を含むDNA断片の調製は、上記文献に開示されている方法を用いて達成される。また、上記塩基配列を参考にして作製した合成DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション法、あるいは同塩基配列を参考にして作製した合成DNAプライマーを用いたPCR(ポリメラーゼ・チェイン・リアクション)法を用いて所望のDNA断片を取得することができる。pps遺伝子を含むDNA断片を目的微生物で自律複製可能なベクターDNAに連結して同微生物に導入すればpps遺伝子のコピー数を上昇させることができる。
【0022】
PCR法を用いてエシェリヒア属細菌よりpps遺伝子をクローニングする時に使用するDNAプライマーとしては、例えばエシェリヒア・コリにおいて既知となっている配列(Mol. Gen. Genet., 231, 332 (1992))を基にして適宜作製できる。具体的には、pps遺伝子を含む約3.3kbの領域を増幅できる、5'-CCCGTCGACGGATCCAGTTTCATCTCTTG-3'(配列番号1)、5'-CCCGTCGACGATCATGCGCTTATGTCGTG-3'(配列番号2)の2種のプライマーが適当である。これらのプライマーは、両末端にSalI切断末端を有する形でpps遺伝子を増幅することができる。このようにしてPCR産物の末端に制限酵素切断末端を導入すると、増幅されたDNA断片をこれらの制限酵素を用いてクローニングしたり、さらに他のベクターDNAに移し代えるときに便利である。プライマーDNAの合成は、例えば、アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)社製DNA合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法(Tetrahedron Letters,22,1859(1981)参照)法に従って行うことができる。PCR反応は、例えば、宝酒造(株)製DNAサーマルサイクラー PJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従って行うことができる。
【0023】
pps遺伝子を含むDNA断片としては、エシェリヒア属細菌以外の微生物からも取得することができる。その取得方法として、前記文献(Mol. Gen. Genet., 231, 332 (1992))が開示する塩基配列を参考にして作製した合成DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション法、同塩基配列を参考にして作製した合成DNAプライマーを用いたPCR法が挙げられる。ハイブリダイゼーション法に用いるDNAプローブも、PCR法に使用するDNAプライマーと同様に、既知の配列を基にして適宜作製できる。各微生物ごとに遺伝子の塩基配列は異なっていることが予想されるため、各微生物由来のPPS間で保存されている箇所と対合する合成DNAを準備することが望ましい。
【0024】
PCR法により増幅されたpps遺伝子は、エシェリヒア属細菌に導入する場合にはエシェリヒア属細菌細胞内において自律複製可能なベクターDNAに接続され、エシェリヒア属細菌細胞に導入される。
【0025】
取得されたpps遺伝子を含むDNA断片を、エシェリヒア属細菌以外の微生物に導入するには、同DNA断片を同DNA断片が導入される微生物細胞内において自律複製可能なベクターDNAに接続し、同細胞に導入する。
【0026】
本発明において用いるベクターDNAとしては、プラスミドベクターDNAが好ましく、遺伝子が導入される微生物がエシェリヒア・コリの場合には、例えばpTWV228、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等が挙げられる。他にもファージDNAのベクターも利用できる。PPSの発現を効率的に達成するために、lac、trp、PL等の微生物内で働くプロモーターを用いてもよい。尚、pps遺伝子のコピー数を上昇させるには同遺伝子を含むDNAをトランスポゾン(Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(1983))、Muファージ(特開平2−109985号公報)または相同性組換え(Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972))を用いた方法で染色体に組み込んでもよい。
【0027】
本発明において用いるベクターDNAとして、遺伝子が導入される微生物がコリネ型細菌の場合には、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドベクター、例えばpAM330(特公平1−11280号公報参照)や、pHM1519(特開昭58−77895号公報参照)等がある。
【0028】
本発明のDNA配列を上記ベクターに挿入して得られる組換えベクターで大腸菌を形質転換するには、例えば細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を高める方法(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1977))等、通常大腸菌の形質転換に用いられる方法を用いることができる。
【0029】
また、バチルス属の形質転換法としては、細胞がDNAを取込可能な特定の成長時期に取り込む方法(Duncan, C. H. et al.によるバチルス・ズブチリスに関する報告)がある。さらに、プラスミドDNAを容易に取り込むDNA受容体のプロトプラストまたはスフェロプラストを成形することによって細菌細胞内に取り込むことが可能である。これらは、バチルス・ズブチリス、アクチノマイセス及び酵母について知られている(Chang, S. et al. Molec. Gen. Genet., 168, 111, (1979)、Bibb et al., Nature, 274, 398, (1978)、Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978))。
【0030】
また、高電圧の電気パルスにより細胞壁に瞬間的に穴を生じさせDNAを取り込ませるエレクトロポレーション法(Hanahan, D. et al., Plasmid Transformation of Escherichia coli and other bacteria, Meth. Enzymol., 204, 63 (1991))も広範囲の微生物細胞に有効である。その他、特開平2−207791号公報にコリネ型細菌のエレクトロポレーション法による形質転換法が開示されている。
【0031】
pps遺伝子が導入された可能性のある候補ベクターの中から実際にpps遺伝子が組み込まれたベクターを選択するためには、例えばPPS欠損株を用いた相補性試験を行えばよい。PPS欠損株はピルビン酸を炭素源とする最小培地で生育できないので、この培地で生育可能となった形質転換体を選択すればよい。エシェリヒア・コリのPPS欠損株としてはAT2572-1株(J. Bacteriol., 96, 2185 (1968)参照)が挙げられる。AT2572-1株は、E. coli Genetic Stock Center(米国コネチカット州ニューヘブン(New Haven)06511-7444、エール大学生物学 部オズボーン記念研究所(Yale University, Dept. Biology, Osborn Memorial Labs.)、P.O.Box 6666、菌株番号:CGSC5242)から入手できる。
【0032】
また、PPS活性が上昇した可能性のある候補株の中から、実際にPPS活性が上昇した株を選択するためには、例えば既知の方法(Cooper,R.A.and H.L.Kornberg, Meth. Enzymol., 13, 309 (1969))を用いてPPSの酵素活性の上昇を確認する方法がある。
【0033】
本発明に用いる微生物は、もともとL−アミノ酸生産能を有する微生物のPEP生産能を上昇させたものでもよく、また、PEP生産能を上昇させた後に、L−アミノ酸生産能を付与したものでもよい。さらに、もともとL−アミノ酸生産能を有する微生物であっても、PEP生産能を上昇させることに加えて、そのアミノ酸生合成の固有の経路を司る酵素遺伝子の増強、あるいはフィードバック阻害を受ける酵素の脱感作型(阻害解除型)酵素をコードする遺伝子あるいはオペロンを導入すると、一層L−アミノ酸生産能が向上する場合がある。
【0034】
このような遺伝子あるいはオペロンとしては、例えば、L−フェニルアラニンやL−チロシンの場合は脱感作型コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ(CM−PDT)遺伝子(特開平5−236947号、特開昭62−130693号公報参照)、脱感作型DS(3−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−7−リン酸シンターゼ)遺伝子(特開平5−236947号、特開昭61−124375号公報参照)が、
L−トリプトファンの場合には脱感作型アントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロン(特開昭57−71397号、特開昭62−244382号、米国特許第4,371,614)が、
L−スレオニンの場合にはL−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有するスレオニンオペロン(特公平1−29559号公報)、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(特開昭60−012995号)、又はホモセリンキナーゼ及びホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(特開昭61−195695号)が、
L−イソロイシンの場合には前記スレオニンオペロン、及びL−イソロイシンによるフィードバック阻害が解除されたスレオニンデアミナーゼをコードする遺伝子(特開平2−458号公報)又は同遺伝子を含む ilvGMEDA オペロン等が挙げられる。
【0035】
また、芳香族アミノ酸(L−フェニルアラニン、L−トリプトファン及びL−チロシン)については、PPSに加えて、細胞中のトランスケトラーゼ(TK)の生産能を上昇させることにより、一層生産性を向上させることができることが期待される。微生物のTK生産能を上昇させる手段としては、微生物細胞内のTK活性を上昇させることが挙げられる。TK活性を上昇させる手段としては、微生物細胞内のトランスケトラーゼ遺伝子(tkt)の発現量を上昇させることが挙げられる。また、tkt遺伝子を改変し、活性の上昇したTKを創造することも、TK活性を上昇させる手段の一つである。
【0036】
微生物細胞内のtkt遺伝子の発現量を上昇させる手段には、微生物細胞内のtkt遺伝子のコピー数を上昇させることが挙げられる。tkt遺伝子のコピー数を上昇させるには、同遺伝子を含むDNA断片が必要である。ところで、エシェリヒア属細菌として、エシェリヒア・コリではtkt遺伝子がクローニングされ、塩基配列が決定されている(Biochim. Biophys. Acta., 1216, 367 (1993) )。そこで、同遺伝子を含むDNA断片の調製は、上記文献に開示されている方法を用いて達成される。また、上記塩基配列を参考にして作製した合成DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション法、あるいは同塩基配列を参考にして作製した合成DNAプライマーを用いたPCR(ポリメラーゼ・チェイン・リアクション)法を用いて所望のDNA断片を取得することができる。tkt遺伝子を含むDNA断片を目的微生物で自律複製可能なベクターDNAに連結して同微生物に導入すればトランスケトラーゼ遺伝子のコピー数を上昇させることができる。
【0037】
PCR法を用いてエシェリヒア属細菌よりトランスケトラーゼ遺伝子をクローニングする時に使用するDNAプライマーとしては、例えばエシェリヒア・コリにおいて既知となっている配列(Biochim. Biophys. Acta., 1216, 307 (1993) )を基にして適宜作製できる。具体的には、tkt遺伝子を含む約2.2kbの領域を増幅できる、5'-AGAGGATCCAGAGATTTCTGAAGC-3'(配列番号3)、5'-TCTGGATCCGCAAACGGACATTATCA-3'(配列番号4)の2種のプライマーが適当である。これらのプライマーは、両末端にBamHI切断末端を有する形でtkt遺伝子を増幅することができる。このようにしてPCR産物の末端に制限酵素切断末端を導入すると、増幅されたDNA断片をこれらの制限酵素を用いてクローニングしたり、さらに他のベクターDNAに移し代えるときに便利である。プライマーDNAの合成は、例えば、アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)社製DNA合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法(Tetrahedron Letters,22,1859(1981)参照)法に従って行うことができる。PCR反応は、例えば、宝酒造(株)製DNAサーマルサイクラー PJ2000型を用い、Taq DNAポリメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従って行うことができる。
【0038】
tkt遺伝子を含むDNA断片としては、エシェリヒア属細菌以外の微生物からも取得することができる。その取得方法として、前記文献(Biochim. Biophys. Acta., 1216, 367 (1993))が開示する塩基配列を参考にして作製した合成DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション法、同塩基配列を参考にして作製した合成DNAプライマーを用いたPCR法が挙げられる。ハイブリダイゼーション法に用いるDNAプローブも、PCR法に使用するDNAプライマーと同様に、既知の配列を基にして適宜作製できる。各微生物ごとに遺伝子の塩基配列は異なっていることが予想されるため、各微生物由来のTK間で保存されている箇所と対合する合成DNAを準備することが望ましい。
【0039】
上記のような各々の遺伝子を微生物に導入する際に、それらの遺伝子は、pps遺伝子と同じく宿主の染色体上に存在しても、同一のプラスミド上に存在してもよい。また、各々別個のプラスミド上に存在してもよい。
【0040】
以上の方法で取得したpps遺伝子を含む組換えDNAで形質転換された微生物を培養し、培養液に目的のアミノ酸を生成蓄積せしめ、これを採取することにより、目的のアミノ酸を製造することができる。
【0041】
培養に使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、スクロースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【0042】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【0043】
有機微量栄養源としては、ビタミンB1、ビタミンB6などの要求物質を必要に応じて、または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。
これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【0044】
培養は、用いる微生物に応じた条件で行えばよいが、具体的には、好気的条件下で16〜72時間実施するのがよく、培養温度は30℃〜45℃に、培養中pHは5〜7に制御する。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【0045】
発酵液からのL−アミノ酸の採取は、通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【0046】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【0047】
【実施例1】
エシェリヒア・コリのpps遺伝子の取得
エシェリヒア・コリ K-12由来のW3110株から、斎藤、三浦の方法(Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963))により染色体DNAを抽出した。一方、pps遺伝子をPCR法により染色体DNAから増幅するために用いるオリゴヌクレオチドプライマーを、公知のpps遺伝子の塩基配列(Mol. Gen. Genet., 231, 332 (1992))に基づいて合成した。
【0048】
(1)5'-CCCGTCGACGGATCCAGTTTCATCTCTTG-3'(配列番号1)
(2)5'-CCCGTCGACGATCATGCGCTTATGTCGTG-3'(配列番号2)
【0049】
上記のプライマーは、それぞれpps遺伝子の上流側及び下流側の配列に相同あるいは相補的な配列を含むと共に、PCR産物のクローニングを容易にするために、SalI認識配列を含んでいる。
【0050】
上記の染色体DNA及びプライマーを用いて、エルリッチの方法(PCR Technology, Stockton press (1989))に従ってPCR反応を行った。反応条件は、熱変成93℃1分、アニーリング55℃1.5分、ポリメラーゼ反応72℃3分とし、この反応サイクルを30回繰り返した。
【0051】
PCR反応により得られた3.3kbpのDNA断片を制限酵素SalIで切断した後、プラスミドベクターpTWV228(アンピシリン耐性(Apr)、宝酒造(株)製)のSalI部位にDNAリガーゼを用いて連結した。このリガーゼ反応混合物を用いて、エシェリヒア・コリのPPS欠損株AT2572-1(J. Bacteriol., 96, 2185 (1968)参照、E. coli Genetic Stock Center(所在地前掲)より入手)を形質転換した。形質転換株をアンピシリンを含むプレートにまき、生育したアンピシリン耐性株を選択し、その中から、最小培地上でピルビン酸を炭素源として生育可能な株を選択し、その株から組換えプラスミドDNAを抽出し、得られたプラスミドをpTWV−ppsと命名した。
【0052】
上記のようにして得られたpTWV−ppsの挿入DNA断片の制限酵素切断地図及び得られた形質転換体のPPS活性を測定した結果から、このDNA断片がppc遺伝子を含んでいることを確認した。
【0053】
【実施例2】
L−フェニルアラニンの製造
<1>L−フェニルアラニン生産菌の創製
L−フェニルアラニン生合成固有系の脱感作型コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ(CM−PDT)遺伝子を含有するDNA断片を、プラスミドベクターpACYC184(Cmr)のBamHI、HindIII切断部位に挿入して得たプラスミドpACMABプラスミド(クロラムフェニコール耐性(Cmr)、特開平5−236947号公報参照)をSalIで切断し、これとpTWV−ppsからSalIで切り出したpps遺伝子断片とをDNAリガーゼを用いて連結し、pACMAB−pps(8.9kb)を得た。
【0054】
一方、脱感作型DS(3−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−7−リン酸シンターゼ)遺伝子(aroG4)を含有するDNA断片をプラスミドベクターpBR322のEcoRI、HindIII切断部位に挿入して得たプラスミドpBR−aroG4(Apr、特開平5−236947号公報参照)でエシェリヒア・コリ W3110(tyrA)株を形質転換し、さらにこの形質転換株に上記pACMAB−ppsを導入し、Apr及びCmrを示す形質転換体を選択してW3110(tyrA)/pACMAB−pps,pBR−aroG4を得た。
【0055】
尚、pBR−aroG4及びpACMABで形質転換したエシェリヒア・コリのtyrA欠損株W3110(tyrA)(AJ12604と命名されている)は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P−11975として寄託されている。pBR−aroG4及びpACMABは、この株から通常の方法によって取得することができる。
【0056】
<2>L−フェニルアラニン生産性の評価
上記で得られたエシェリヒア・コリ W3110(tyrA)/pACMAB−pps,pBR−aroG4株を、L−フェニルアラニン生産用培地(グルコース20g、リン酸水素2ナトリウム29.4g、リン酸2水素カリウム6g、塩化ナトリウム1g、塩化アンモニウム2g、クエン酸ナトリウム10g、グルタミン酸ナトリウム0.4g、硫酸マグネシウム7水和物3g、塩化カルシウム0.23g、サイアミン塩酸塩2mg、L−チロシン100mgを水1Lに含む。pH=7.0)を用いて、37℃で40時間培養した。対照として、W3110(tyrA)/pACMAB,pBR−aroG4株を同様にして培養した。培地中のL−フェニルアラニンを高速液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を表1に示す。
【0057】
【表1】
【0058】
【実施例3】
L−トリプトファンの製造
<1>L−トリプトファン生産菌の創製
脱感作型DS遺伝子(aroG4)及びカナマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片を、プラスミドpACYC177のXhoI部位をEcoRIに改変したプラスミドpACYC177Eに挿入して得たプラスミドpACKG4(アンピシリン及びカナマイシン耐性(Apr、Kmr)、6.4kbp、特開平5−236947号 公報参照)を、HindIIIで部分消化し、DNAポリメラーゼ・クレノーフラグメントを用いて平滑末端化した。一方、実施例1で得られたpps遺伝子を含む3.3kbpのSalI断片を同様に平滑末端化し、上記pACKG4断片と連結した。この連結反応液を用いてエシェリヒア・コリのPPS欠損株を形質転換し、Apr、Kmr及びpps+を示す形質転換体を選択し、この形質転換体から組換えプラスミドを抽出し、pACKG4−pps(9.4kb)と命名した。
【0059】
L−フェニルアラニン及びL−チロシン要求性の形質を有する菌株エシェリヒア・コリ AGX17(pGX44)株(宿主AGX17株自体は、L−フェニルアラニン、L−チロシン及びL−トリプトファン要求性)から、プラスミドpGX44を脱落させ、AGX17を得た。一方、トリプトファンオペロンを担うプラスミドpGX50(Apr)を保有するエシェリヒア・コリK−12のAGX6(pGX50)aroP株(米国特許4371614号記載、寄託番号;NRRL B−12264)からpGX50を抽出し、上記AGX17株に導入し、Apr及びTrp+を指標として形質転換体を選択した。この形質転換体にさらにpACKG4−ppsを導入し、Apr及びKmrを指標として形質転換体を選択し、AGX17/pGX50,pACKG4−ppsと命名した。
一方、上記AGX17にpGX50とpACKG4を、Apr、Trp+及びKmrを指標に導入して、AGX17/pGX50,pACKG4を得た。
【0060】
<2>L−トリプトファン生産性の評価
AGX17/pGX50,pACKG4−ppsを、L−トリプトファン生産用培地(グルコース40g、硫酸アンモニウム16g、リン酸一カリウム1g、硫酸マグネシウム7水和物1g、硫酸第一鉄7水和物0.01g、塩化マンガン4水和物、0.01g、酵母抽出物2g、炭酸カルシウム40g、L−フェニルアラニン100mg、L−チロシン100mgを水1L中に含む。pH=7.0)を用いて、31℃で48時間培養した。対照として、AGX17/pGX50,pACKG4を同様にして培養した。培地中のL−トリプトファンを高速液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を表2に示す。
【0061】
【表2】
【0062】
【実施例4】
L−スレオニンの製造
<1>L−スレオニン生産菌の創製
L−スレオニン生産菌エシェリヒア・コリ VKPM B-3996株(米国特許5175107号記載、USSR アンチバイオティクス・リサーチ・インスティテュート(the USSR Antibiotis Research Institute)の微生物培養寄託機関に登録番号1867のもとに寄託されている)に、実施例1で得たpTWV−ppsを導入し、形質転換体をSmr及びAprで選択し、B-3996/pTWV−ppsを得た。尚、VKPM B-3996株は、L−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有するスレオニンオペロンを含むプラスミドpVIC40(ストレプトマイシン耐性(Smr))を保持している。
【0063】
<2>L−スレオニン生産性の評価
B-3996株及びB-3996/pTWV−ppsを、L−スレオニン生産培地(グルコース40g、硫酸アンモニウム16g、リン酸一カリウム1g、硫酸マグネシウム7水和物1g、硫酸第一鉄7水和物0.01g、塩化マンガン4水和物0.01g、酵母抽出物2g、炭酸カルシウム40gを水1L中に含む。pH=7.0)を用いて37℃で24時間培養した。培地中のL−スレオニンを高速液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を表3に示す。
【0064】
【表3】
【0065】
【実施例5】
L−イソロイシンの製造
<1>L−イソロイシン生産菌の創製
(1)スレオニンオペロン及びpps遺伝子を含むプラスミドの構築
L−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有するスレオニンオペロンを含むプラスミドpVIC40(米国特許5175107号記載)をBamHIで切断し、クレノーフラグメントを用いて平滑末端化した。一方、実施例1で得られたpps遺伝子を含む3.3kbpのSalI断片を同様に平滑末端化し、上記pVIC40断片と連結した。この連結反応液を用いてエシェリヒア・コリのPPS欠損株を形質転換し、Smr及びpps+を示す形質転換体を選択し、この形質転換体から組換えプラスミドを抽出し、pVIC40−pps(17.9kb)と命名した。
【0066】
(2)ilvGMEDAオペロンを含むプラスミドの構築
エシェリヒア・コリMI162株より、染色体DNAを抽出した。該染色体DNAを制限酵素HindIIIで切断した。ilvGM遺伝子を含むHindIII−HindIII DNA断片は4.8kbの長さであることが判明している。そこで4.8kb前後の長さを有するHindIII−HindIII DNA断片と、プラスミドベクターpBR322(宝酒造(株)より購入)をHindIIIで切断して得られるDNA断片とを連結した。
【0067】
得られたDNA連結反応混合物を、アセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損株であるエシェリヒア・コリMI262(CGSC5769)株に導入した。形質転換されてアセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損の形質が相補された株を選択し、その株が保有するプラスミドを単離した。同プラスミドの構造を解析した結果、pBR322のHindIII部位にilvGM遺伝子及びilvE遺伝子の5’末端側の一部を含む4.8kbのDNA断片が挿入されていた。同プラスミドをpBRGM7と命名した。
【0068】
Gene 97, 21, (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 922, (1981) と J. Bacteriol. 149, 294, (1982) に報告されているilvGM遺伝子の塩基配列を参考にして、配列表配列番号6と配列番号7に記載した合成オリゴヌクレオチドを合成した。ilvGM遺伝子の塩基配列のうち、プロモーター、アテニュエーター、及びilvG遺伝子コード領域を含む配列を、コード領域のアミノ酸配列とともに配列番号5に示す。前記の両オリゴヌクレオチドをプライマーとして、MI162株の染色体DNAを鋳型として、PCR法にてDNAの増幅を行った。増幅されるDNA断片は配列表配列番号5に記載される塩基配列のうち25番目から952番目の配列を有するDNA断片である。同断片を断片(A)とする。
【0069】
同様にして、Gene 97, 21, (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 922, (1981) と J. Bacteriol. 149, 294, (1982) に報告されている塩基配列を参考にして、配列表配列番号8と配列番号9に記載した合成オリゴヌクレオチドを合成した。両DNAをプライマーとして、MI162株の染色体DNAを鋳型として、PCR法にてDNAの増幅を行った。増幅されるDNA断片は配列表配列番号5に記載される塩基配列のうち1161番目から2421番目の配列を有するDNA断片である。同断片を断片(B)とする。
【0070】
断片(A)をSmaIで消化して得られる大断片と、ベクターpUC18(宝酒造)をSmaIで消化して得られるDNA断片とを連結してプラスミドpUCAを作製した。断片(B)をKpnIで消化して得られる大断片と、pHSG399(宝酒造)をHincII及びKpnIで消化して得られる大断片とを連結してプラスミドpHSGBを作製した。
【0071】
プラスミドpUCAをKpnIで消化し、DNAポリメラーゼIの大フラグメント(クレノーフラグメント)を用いて切断端を平滑末端化し、さらにPstIで消化し、最終的に断片(A)を含むDNA断片を単離した。プラスミドpHSGBをHindIIIで消化し、DNAポリメラーゼIの大フラグメント(クレノーフラグメント)を用いて切断端を平滑末端化し、さらにPstIで消化し、最終的に断片(B)を含むDNA断片を単離した。両DNA断片を連結し、プラスミドpHSGSKを作製した。
【0072】
pHSGSKに搭載される、断片(A)及び断片(B)に由来するSmaI−KpnI断片を断片(C)と命名した。断片(C)は、ilvGM遺伝子を含む4.8kbのHindIII−HindIII断片をSmaIとKpnIで切断して得られる断片に相当し、プロモーター、SD配列及びilvG遺伝子上流域を含むが、リーダー配列からアテニュエーター領域に至る配列約0.2kbを欠いている。以上、pHSGSKを構築する手順を図1にまとめた。
【0073】
プラスミドpHSGSKをSmaIとKpnIで消化することにより断片(C)を得、プラスミドpBRGM7をSmaIとKpnIで消化することにより大DNA断片を得、両者を連結した。得られたプラスミドをpdGM1と命名した。pdGM1に搭載される、ilvGM遺伝子を含む4.6kbのHindIII −HindIII断片は、アテニュエーションに必要な領域を欠いている。アテニュエーションに必要な領域を欠いたilvGM遺伝子を、本実施例及び図面において「ΔattGM」と表現する。以上、pdGM1を構築する手順を図2にまとめた。
【0074】
特開平2−458号公報に記載されているプラスミドpDRIA4は、エシェリヒア属細菌で自律複製可能でありかつブレビバクテリウム属細菌で自律複製可能なシャトルベクターpDR1120と、E. coli K-12由来のスレオニンデアミナーゼをコードするilvA遺伝子及びilvD遺伝子の3’末端側の一部を含むBamHI−BamHI断片とが結合されて調製される。なお同BamHI−BamHI断片は、特開平2−458号公報では、2.3kbと記載されているが、現在では2.75kbであることが判明している。プラスミドpDRIA4はブレビバクテリウム・フラバムAJ12358(FERM P−9764)あるいはブレビバクテリウム・フラバムAJ12359(FERM P−9765)の染色体DNA外に存在する。これらの株から常法によりプラスミドpDRIA4を調製できる。
【0075】
プラスミドpDRIA4上のBamHI−BamHI 2.75kbのDNA断片中、L−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするilvA遺伝子を含むHindIII−BamHI断片を調製し、ベクターpMW119(ニッポンジーン社製)をHindIII及びBamHIで切断して得られるDNA断片と連結した。こうして作製されたプラスミドをpMWA1と命名した。
【0076】
プラスミドpMWA1をHindIIIで切断して得られるDNA断片と、プラスミドpdGM1をHindIIIで切断して得られるilvGM遺伝子を含むDNA断片とを連結した。プラスミド上に存在する制限酵素認識部位の位置を解析することによって、ilvGM遺伝子の転写方向とilvA遺伝子の転写方向とが同方向となったものを選択し、これをプラスミドpMWGMA2と命名した。pMWGMA2は、アテニュエーターを除去されたilvGM遺伝子、ilvE遺伝子の5’末端側の一部、及びilvD遺伝子の3’末端側の一部を有している。以上、pMWGMA2を構築する手順を図3にまとめた。
【0077】
エシェリヒア・コリMI162株の染色体DNAを調製し、これをSalI及びPstIで切断してDNA断片混合物を調製した。一方、ベクターpUC19(宝酒造社)をSalI及びPstIで切断してDNA断片を調製した。DNA断片混合物とpUC19が切断されて得られるDNA断片とを連結し、DNA混合物を得た。同DNA混合物を、トランスアミナーゼB欠損株であるAB2070株(J. Bacteriol. 109, 703, 1972、エシェリヒア・コリ ジェネティックス トックセンターから分譲。CGSC2070)に導入し、形質転換されて分岐鎖アミノ酸要求性が回復した株を選択した。同株よりプラスミドを調製したところ、プラスミドpUC19がSalI及びPstIで切断して得られるDNA断片と、ilvE遺伝子を含むSalI−PstI DNA断片が連結されていた。このプラスミドをpUCE1と命名した。pUCE1は、ilvM遺伝子の3’末端側の一部、ilvE遺伝子、及びilvD遺伝子の5’末端側の一部を有している。
【0078】
pMWGMA2をHindIIIで部分消化してDNA断片混合物を調製した。一方、pUCE1をHindIIIで切断し、ilvE遺伝子の一部とilvD遺伝子の5’末端側の一部とを含む1.7kbのHindIII−HindIII DNA断片を調製した。両者を連結して得られるDNA混合物を用いてジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(ilvD遺伝子産物)欠損株AB1280株を形質転換し、形質転換された株のうち分岐鎖アミノ酸要求性が消失したものを選択した。同形質転換株から、プラスミドを調製したところ、pMWGMA2がΔattGMとilvAとの間に存在するHindIII部位でのみ切断されて得られるDNA断片と、pUCE1に由来するilvE遺伝子の一部とilvD遺伝子の一部とを含む1.7kbのHindIII−HindIII DNA断片が連結されており、ilvGMEDAオペロンが再生されていた。こうして得られるプラスミドをpMWD5と命名した。以上、pMWD5を構築する手順を図4にまとめた。
【0079】
以上の様にして得られたプラスミドpMWD5(Apr)は、pMW119をベクターとしており、アテニュエーションに必要な領域が除去されたilvGMEDAオペロンを搭載したプラスミドである。
【0080】
(3)L−イソロイシン生産菌の創製
エシェリヒア・コリ VNIIGenetika TDH-6(前記エシェリヒア・コリ VKPM B-3996株よりプラスミドpVIC40を脱落させた宿主菌がTDH-6株である。)にpVIC40−ppsを導入し、Smrを指標として形質転換体を選択し、さらに、pMWD5を導入して、Smr及びAprを示す形質転換体TDH-6/pVIC40−pps,pMWD5を得た。一方、上記TDH-6にpVIC40とpMWD5を、Smr及びAprを指標に導入して、TDH-6/pVIC40,pMWD5を得た。
【0081】
<2>L−イソロイシン生産性の評価
TDH-6/pVIC40−pps,pMWD5をL−イソロイシン生産用培地(グルコース40g、硫酸アンモニウム16g、リン酸一カリウム1g、硫酸マグネシウム7水和物1g、硫酸第一鉄7水和物0.01g、塩化マンガン4水和物、0.01g、酵母抽出物2g、炭酸カルシウム40gを水1L中に含む。pH=7.0)培地を用いて、37℃で24時間培養した。対照として、TDH-6/pVIC40,pMWD5を同様にして培養した。培地中のL−イソロイシンを高速液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を表4に示す。
【0082】
【表4】
【0083】
【発明の効果】
本発明により、芳香族アミノ酸をはじめとする種々のアミノ酸、特にL−フェニルアラニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−スレオニン及びL−イソロイシンを高収率で製造することができる。また、これらのL−アミノ酸の生産性が高い微生物に本発明を適用することにより、さらにその生産性を高めることができる。
【0084】
【配列表】
【0085】
【0086】
【0087】
【0088】
【0089】
【0090】
【0091】
【0092】
【図面の簡単な説明】
【図1】 プラスミドpHSGSKを構築する手順を示す図である。
【図2】 プラスミドpdGM1を構築する手順を示す図である。
【図3】 プラスミドpMWGMA2を構築する手順を示す図である。
【図4】 プラスミドpMWD5を構築する手順を示す図である。
Claims (9)
- L−スレオニン及びL−イソロイシンから選ばれるL−アミノ酸の生産能力を有する微生物を培地中に培養し、その培地中に該L−アミノ酸を生成蓄積させ、該L−アミノ酸を採取することを含む、L−スレオニン及びL−イソロイシンから選ばれるL−アミノ酸の製造法において、前記微生物のホスホエノールピルビン酸の生産能を野生株と比べて上昇させることを特徴とするL−スレオニン及びL−イソロイシンから選ばれるL−アミノ酸の製造法。
- 前記微生物はL−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有するスレオニンオペロンを保持する請求項1に記載のL−アミノ酸の製造法。
- 前記L−アミノ酸がL−スレオニンである請求項2に記載のL−アミノ酸の製造法。
- 前記L−アミノ酸がL−イソロイシンであり、前記微生物はL−イソロイシンによるフィードバック阻害が解除されたスレオニンデアミナーゼをコードする遺伝子または同遺伝子を含むilvGMEDAオペロンをさらに保持する請求項2に記載のL−アミノ酸の製造法。
- 微生物がエシェリヒア属細菌である請求項1〜4のいずれか一項に記載のL−アミノ酸の製造法。
- 微生物がコリネ型細菌である請求項1〜4のいずれか一項に記載のL−アミノ酸の製造法。
- 微生物のホスホエノールピルビン酸生産能を上昇させる手段が、微生物細胞内のホスホエノールピルビン酸合成酵素活性を上昇させるものである請求項1〜6のいずれか一項に記載のL−アミノ酸の製造法。
- 微生物のホスホエノールピルビン酸生産能を上昇させる手段が、微生物細胞内のホスホエノールピルビン酸合成酵素遺伝子の発現量を上昇させるものである請求項1〜6のいずれか一項に記載のL−アミノ酸の製造法。
- 微生物のホスホエノールピルビン酸生産能を上昇させる手段が、微生物細胞内のホスホエノールピルビン酸合成酵素遺伝子のコピー数を上昇させるものである請求項1〜6のいずれか一項に記載のL−アミノ酸の製造法。
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