HU224895B1 - Process for producing l-amino acids - Google Patents
Process for producing l-amino acids Download PDFInfo
- Publication number
- HU224895B1 HU224895B1 HU9901198A HUP9901198A HU224895B1 HU 224895 B1 HU224895 B1 HU 224895B1 HU 9901198 A HU9901198 A HU 9901198A HU P9901198 A HUP9901198 A HU P9901198A HU 224895 B1 HU224895 B1 HU 224895B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- gene
- pps
- microorganism
- dna
- plasmid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 48
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 title claims description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 75
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 71
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 47
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 35
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 26
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 19
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 18
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 10
- 108010062110 water dikinase pyruvate Proteins 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 2
- 241000186254 coryneform bacterium Species 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 83
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 70
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 58
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 37
- 101150043515 pps gene Proteins 0.000 description 36
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 25
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 24
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 22
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 17
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 16
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 14
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 13
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 12
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 11
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 9
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 8
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 7
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 7
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 6
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 6
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 6
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 4
- NGHMDNPXVRFFGS-IUYQGCFVSA-N D-erythrose 4-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O NGHMDNPXVRFFGS-IUYQGCFVSA-N 0.000 description 4
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 4
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 101150043028 ilvD gene Proteins 0.000 description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 4
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- PJWIPEXIFFQAQZ-PUFIMZNGSA-N 7-phospho-2-dehydro-3-deoxy-D-arabino-heptonic acid Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC(=O)C(O)=O PJWIPEXIFFQAQZ-PUFIMZNGSA-N 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 3
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108010006873 Threonine Dehydratase Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L manganese(II) chloride tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Mn+2] CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N (-)-chorismic acid Natural products OC1C=CC(C(O)=O)=CC1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 101100435903 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) aroG gene Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101100002724 Thermus thermophilus aroH gene Proteins 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 101150042732 aroC gene Proteins 0.000 description 2
- 101150019536 aroF gene Proteins 0.000 description 2
- 101150076125 aroG gene Proteins 0.000 description 2
- 101150010999 aroP gene Proteins 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 150000005693 branched-chain amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N chorismic acid Chemical compound O[C@@H]1C=CC(C(O)=O)=C[C@H]1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229960004275 glycolic acid Drugs 0.000 description 2
- 101150099953 ilvE gene Proteins 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010080376 3-Deoxy-7-Phosphoheptulonate Synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 108010037870 Anthranilate Synthase Proteins 0.000 description 1
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 1
- 108010088278 Branched-chain-amino-acid transaminase Proteins 0.000 description 1
- 241001517047 Corynebacterium acetoacidophilum Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000617681 Escherichia coli M1 Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical compound [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102100033451 Thyroid hormone receptor beta Human genes 0.000 description 1
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 1
- 101150095029 W gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N anthranilic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150018055 aroH gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 1
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 1
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 1
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 101150109823 ds gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 108010071598 homoserine kinase Proteins 0.000 description 1
- 101150095957 ilvA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150105723 ilvD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150020087 ilvG gene Proteins 0.000 description 1
- 101150003892 ilvM gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- RVUXIPACAZKWHU-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid;heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.OS(O)(=O)=O RVUXIPACAZKWHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 1
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A találmány L-aminosavak előállítására vonatkozik. Közelebbről a találmány tárgyát képezik eljárások L-aminosavak előállítására megnövelt foszfoenol-piruvátszintáz-aktivitású mikroorganizmus alkalmazásával.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható különböző aminosavak, például L-treonin és L-izoleucin termelésére magas hozammal.
Aminosavakra gyorsan növekvő igény mutatkozik. Alkalmazzák őket aszpartám-édesítőszer alapanyagaként (L-fenil-alanin), tápanyag-kiegészítőkként (L-triptofán, L-treonin), valamint gyógyászati termékek, mint infúziós oldatok alapanyagaként (L-triptofán, L-fenil-alanin, L-tirozin, L-treonin és L-izoleucin).
Számos, mikroorganizmusok alkalmazásán alapuló eljárás létezik aminosavak előállítására.
Például az L-fenil-alanin előállítására szolgáló eljárások között ismeretesek olyanok, amelyek Escherichia coli (E. coli) rekombináns változatainak alkalmazásán alapulnak, mint azt például az alábbi iratok feltárják: 2-4276-os számú japán szabadalmi irat,
4- 501803-as számú közzétett japán szabadalmi leírás,
5- 244956-os számú közzétett japán szabadalmi leírás, valamint a W087/00202-es számú nemzetközi közzétételi irat.
Eljárások L-fenil-alanin vagy L-tirozin előállítására szintén ismertek, köztük olyanok is, amelyek Corynebacterium nemzetséghez tartozó mutáns törzs alkalmazásán alapulnak, mint azt a 61-128897-es számú közzétett japán szabadalmi bejelentés feltárja, valamint olyanok, amelyek rekombináns Corynebacterium törzsek alkalmazásán alapulnak, ilyeneket tárnak fel a
60- 34197-es, a 60-24192-es, a 61-260892-es és a
61- 124375-ös közzétett japán szabadalmi leírások.
L-triptofán előállítására szolgáló eljárások is ismertek már, köztük olyanok, amelyek rekombináns Escherichia coli alkalmazásán alapulnak, például amelyeket az 57-71397-es számú közzétett japán szabadalmi leírás, valamint a 4371614-es számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismertet, valamint olyanok, amelyek Bacillus subtilis mutáns törzsének alkalmazásán alapulnak, például amelyeket az 53-39517-es, illetve a 62-34399-es japán szabadalmi leírások ismertetnek, továbbá olyanok, amelyek rekombináns Bacillus subtilis alkalmazásán alapulnak, például amelyeket a 61-104790-es és az 1-67079-es közzétett japán szabadalmi leírások tárnak fel, valamint olyanok, amelyek Brevibacterium nemzetséghez tartozó mutáns törzsek alkalmazásán alapulnak, például amely eljárást az 57-174096-os számú közzétett japán szabadalmi bejelentés tár fel, továbbá Brevibacterium nemzetséghez tartozó rekombináns baktériumok alkalmazásán alapuló eljárások, ilyet ismertet például a 62-51980-as számú közzétett japán szabadalmi leírás.
Közöltek eljárásokat L-treonin előállítására is, amelyek között szerepelnek olyanok, amelyek Escherichia nemzetséghez tartozó mutáns törzs alkalmazásán alapulnak (ilyeneket tár fel az 5-304969-es számú közzétett japán szabadalmi leírás), továbbá olyanok, amelyek rekombináns Escherichia coli alkalmazásán alapulnak, és amelyek az 1-29559-es számú japán szabadalmi leírásban, a 2-109985-ös és az 56-15696-os számú közzétett japán szabadalmi leírásban, valamint a 3-501682-es számú (PCT) közzétett japán szabadalmi leírásban vannak ismertetve. Közöltek továbbá Corynebacterium nemzetséghez tartozó baktérium mutáns törzsének alkalmazásán alapuló eljárásokat is, ilyenre található kitanítás a 61-195695-ös számú közzétett japán szabadalmi leírásban.
L-izoleucin előállítására szolgáló eljárások szintén ismeretesek, közöttük például olyanok, amelyek Escherichia coli alkalmazásán alapulnak, ilyet tár fel az 5-130882-es számú közzétett japán szabadalmi leírás, továbbá olyanok, amelyek rekombináns Escherichia coli alkalmazásán alapulnak, egy ilyen eljárást ismertet a 2-428-as számú közzétett japán szabadalmi leírás. Ismertek ezenkívül olyan eljárások is, amelyek Corynebacterium nemzetséghez tartozó baktérium mutáns törzsének alkalmazásán alapulnak, amint azt a 3-62395-ös számú japán szabadalmi leírás feltárja, valamint olyanok, amelyek Corynebacterium nemzetséghez tartozó rekombináns törzs alkalmazásán alapulnak, amint arra például az 5-47191-es számú japán szabadalmi leírás kitanítása nyújt példát.
A fentiekben leírt módon aminosavtermelésre szolgáló eljárások során alkalmazott mikroorganizmusok létrehozása során azt az alapelvet alkalmazták, hogy különböző aminosavak közös (bioszintetikus) reakcióútja és az egyes aminosavak azt követő saját reakcióútja egyes lépéseit katalizáló enzimek aktivitását fokozták, vagy a végtermékek vagy hasonló vegyületek szabályozóhatását (visszacsatolásos gátlást vagy szuppressziót) küszöbölték ki. Közelebbről, azok között a módszerek és eljárások között, amelyeket a mikroorganizmusok létrehozása során alkalmaztak, szerepeltek például a mikroorganizmus auxotróffá tétele, drogrezisztencia bejuttatása, a bioszintetikus rendszerrel kapcsolatos enzimgének amplifikálása és szabályozással szembeni érzékenységet csökkentő mutációk bejuttatása rekombináns DNS-eljárások segítségével.
Az az enzim, amelyik felelős az aromás aminosavak közös bioszintetikus reakcióútjának (közös reakcióút) első lépéséért, a 3-dezoxi-D-arabino-hepturonát-7-foszfát (DAHP)-szintáz (DS). Az Escherichia coli DS-enzimjének három izoenzimtípusa van, amelyeket rendre az aroF-nek, aroG-nek és aroH-nak nevezett gének kódolnak, és amelyekre az L-tirozin, az L-fenil-alanin és az L-triptofán rendre visszacsatolásos gátlást fejt ki. Ismeretes egy ezen génekkel kapcsolatos eljárás aromás aminosav termelődésének javítására, amely azon alapul, hogy Escherichia coli-ba a következő gének kombinációját juttatják be: egy aroF- vagy aroG-eredetű gén által kódolt csökkentett érzékenységű enzimet (azaz amely enzimre lényegében nem hat a visszacsatolásos gátlás), amelynek nagy enzimatikus aktivitása van, valamint egy triptofán-operont, amely csökkentett érzékenységű, az L-triptofán-bioszintézis saját bioszintetikus rendszeréhez tartozó antranilátkinázt (AS) kódoló gént tartalmaz.
Foszfoenol-piruvát (a továbbiakban ezt PEP-nek jelöljük) és D-eritróz-4-foszfát (E4P) a szubsztrátok a
HU 224 895 Β1
DAHP szintézisére irányuló reakció során. A PÉP az L-aszparaginsav, az L-treonin, az L-izoleucin és hasonlók bioszintézisében is prekurzor szerepet tölt be. A fenti szubsztrátok szénforrásokból keletkeznek, például glükózból a glükolízis útján, valamint a pentóz-foszfát-reakcióúton. Mindeddig azonban az aminosavtermelő törzsek előállítása tekintetében nem volt ismeretes olyan eset, amelyben az aminosavtermelékenység javítása érdekében a törzs fenti szubsztrátok előállítására irányuló képességét növelték volna meg.
A foszfoenol-piruvát-szintáz (a továbbiakban „PPS”-nek rövidítjük) egy, mikroorganizmusokban széles körben előforduló enzim. Kulcsszerepet játszik a megfelelő PEP-mennyiség biztosításában, piroszőlősavból kiindulva a glükoneogenezis útján. Az Escherichia nemzetséghez tartozó Escherichia coli baktériumot alkalmazták a PPS-t kódoló gén (pps) klónozása, a gén nukleotidszekvenciájának meghatározása, valamint az enzim funkcionális analízise során. Leírták emellett, hogy a DAHP a hozam elméleti értékét megközelítő mennyiségben termelődik a pps-gén és a transzketorázgén egyidejű amplifikálása révén egy dehidroquinát- („dehidroquinate”) szintázban hiányos törzsben [Patnaik, R. és munkatársai, Appl. Environ. Microbiol., 60(11), 3903-3908 (1994)].
Az US 4 969 609 iratban szintén aromás aminosavak fokozott mértékű előállítására szolgáló eljárásokra tesznek javaslatot. Az eljárás során DAHP-szintáz enzimet kódoló rekombináns DNS-molekulát hordozó korineform baktériumokat tenyésztenek.
Mindeddig nem volt azonban ismert olyan eset, amelyben a pps-gén amplifikálása vagy működésének fokozása növelte volna az aromás aminosavaktól különböző aminosavak termelődését.
A találmány szerinti megoldás megalkotása során célunk egy, különböző aminosavak olcsó és magas hozamú előállítására szolgáló eljárás kidolgozása volt.
A találmány szerinti megoldás alapját az a felismerés képezi, hogy az L-aminosavak termelődését fokozni lehet azáltal, hogy L-aminosavak termelésére képes mikroorganizmusok sejtjeinek megnöveljük a foszfoenol-piruvát-termelő képességét. A találmány szerinti megoldást ezen felismerés alapján dolgoztuk ki.
A találmány tárgyát képezi tehát egy eljárás L-aminosavak előállítására L-aminosav-termelő mikroorganizmus tápközegben történő tenyésztése, az L-aminosav előállítása és tápközegben való felhalmozódásának kiváltása, valamint az L-aminosav elkülönítése útján, azzal jellemezve, hogy L-aminosavként L-treonint és L-izoleucint állítunk elő, és mikroorganizmusként vad típusú törzshöz képest mikrobiális sejtjeiben megnövelt foszfoenol-piruvát-szintáz-aktivitású mikroorganizmust használunk.
Az L-aminosav, amelyet előnyösen a fent leírt eljárással állítunk elő, előnyösen L-treonin és L-izoleucin.
Az L-aminosav-termelő mikroorganizmus tartozhat például az Escherichia nemzetségbe, vagy a korineform baktériumok közé. A korineform baktériumok a leírás szerinti értelemben magukban foglalják azokat a mind ez ideig a Brevibacterium nemzetségbe sorolt baktériumokat is, amelyeket jelenleg a Corynebacterium nemzetségbe tartozó baktériumokkal együvé soroltak be [Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 266 (1991)]. A leírás szerinti értelemben a korineform baktériumok magukban foglalják továbbá a Corynebacteríum nemzetségbe tartozó baktériumokkal különösen közeli rokonságban levő Brevibacterium nemzetségbe tartozó baktériumokat.
A mikroorganizmus foszfoenol-piruvát-termelő képessége növelésének egyik módja az, hogy növeljük a mikroorganizmusok sejtjeiben a PPS aktivitását. A PPS aktivitása növelését megvalósíthatjuk például úgy, hogy a pps-gén expressziós szintjét növeljük a mikroorganizmusok sejtjeiben, valamint úgy, hogy nagy specifikus aktivitású PPS-t kódoló gént juttatunk be a sejtekbe.
Közelebbről, a pps-gén mikroorganizmusok sejtjeiben expressziós szintjét növelhetjük a pps-gén kópiaszámának növelése révén a mikroorganizmusok sejtjeiben, továbbá a pps-gén promotere transzkripciós aktivitásának növelésével.
Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezik eljárások, amelyekre az jellemző, hogy megnövelt foszfoenol-piruvát-termelő képességű mikroorganizmusként olyan mikroorganizmust alkalmazunk, amelynek sejtjeiben a foszfoenol-piruvát-szintáz aktivitása, illetve génjének expressziós szintje vagy kópiaszáma meg van növelve.
Az alábbiakban a találmány szerinti megoldást részletesebben is ismertetjük.
A találmány szerinti megoldásban előnyösen például a következő mikroorganizmusokat alkalmazhatjuk: Escherichia, Brevibacterium, Corynebacteríum, Bacillus, Serratia, Pseudomonas nemzetségekhez tartozó mikroorganizmusok, feltéve, hogy: beszerezhető egy megfelelő DNS-fragmens, amely tartalmazza egy plazmidnak a mikroorganizmusban alkalmazható replikációs origóját; a pps-gén működőképes a mikroorganizmusban; a pps-gén kópiaszáma a mikroorganizmusban növelhető; és a mikroorganizmus képes az L-aminosav előállítására (például az L-fenil-alanin esetében a fentiek úgy tettek szert L-fenil-alanin előállítására irányuló képességre, hogy rezisztensek lettek L-fenil-alanin-analóggal szemben). A fentiek közül előnyösen alkalmazható mikroorganizmusok azok, amelyek az Escherichia nemzetséghez és a korineform baktériumokhoz tartoznak.
Közelebbről, L-triptofán előállítására előnyösen alkalmazható mikroorganizmusok például a következők: Escherichia coli AGX17 (pGX44) [NRRL B-12 263] és AGX6 (pGX50)aroP [NRRL B-12 264] (lásd 4 371 614-es számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), valamint Brevibacterium flavum AJ11667 (lásd 57-11667-es számú közzétett japán szabadalmi leírás).
L-fenil-alanin előállítására előnyösen alkalmazható mikroorganizmusok például a következők: Escherichia coli AJ 12604 (FERM BP-3579) (lásd a 488 424-es számú európai szabadalmi leírást), valamint Brevibacterium lactofermentum AJ12637 (FERM BP-4160) (lásd a 2 686 898-as számú francia szabadalmi leírást).
HU 224 895 Β1
L-tirozin előállítására előnyösen alkalmazható mikroorganizmusok például a következők: Corynebacterium glutamicum AJ11655 (FERM P-5836) (lásd a 2-6517-es számú japán szabadalmi leírást) és a Brevibacterium lactofermentum AJ12081 (FERM P-7249) (lásd a 60-70093-as számú közzétett japán szabadalmi leírást).
L-treonin előállítására előnyösen alkalmazható mikroorganizmusok például a következők: Escherichia coli VDPM B-3996 (RIA 1867) (lásd az 5 175 107-es számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást) és a Corynebacterium acetoacidophilum AJ 12318 (FERM BP-1172) (lásd az 5 188 949-es számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást).
L-izoleucin előállítására előnyösen alkalmazható mikroorganizmusok például a következők: Escherichia coli KX141 (BKPM B-4781) (lásd 519 113-as számú európai szabadalmi leírást) és a Brevibacteríum flavum AJ12149 (FERM BP-759) (lásd 4 656 135-ös számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást).
A mikroorganizmusok PEP-termelő képessége növelésének fent leírt megvalósítási módja magában foglalja a PPS-aktivitás növelését mikroorganizmusok sejtjeiben.
A PPS-aktivitást növelhetjük például a pps-gén expressziós szintjének növelésével a mikroorganizmusok sejtjeiben. A PPS-aktivitás növelésére az egyik lehetőség az, hogy a pps-gént módosítjuk megnövelt aktivitású PPS előállítása érdekében.
A pps-gén expressziós szintjének növelése a mikroorganizmusok sejtjeiben történhet például a pps-gén kópiaszámának növelésével a mikroorganizmusok sejtjeiben. A pps-gén kópiaszámának növelése érdekében szükség van a gént tartalmazó DNS-fragmensre. A pps-gént az Escherichia nemzetséghez tartozó Escherichia coli baktériumból klónozással előállították, és meghatározták a nukleotidszekvenciáját [Mól. Gén. Génét., 231, 332 (1992)]. Ennek megfelelően a gént tartalmazó DNS-fragmens előállítását az ebben az iratban feltárt eljárás szerint végeztük. A kívánt DNS-fragmenst hibridizálási eljárás alkalmazásával úgy kaphatjuk meg, hogy a fenti irodalmi helyen közölt nukleotidszekvencia alapján előállított szintetikus DNS-próbát vagy PCR-t (polimeráz-láncreakció) alkalmazunk, amely utóbbi során ugyancsak a fent hivatkozott nukleotidszekvencia alapján készített láncindítókat alkalmazunk. A pps-gén kópiaszámát megnövelhetjük úgy, hogy a pps-gént tartalmazó DNS-fragmenst egy vektorba ligáljuk, amely a célzott mikroorganizmusban autonóm módon replikálódni képes, és a kapott rekombináns DNS-t bejuttatjuk ugyanabba a mikroorganizmusba.
A DNS-láncindítók, amelyeket a pps-gén Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból PCR-eljárással történő klónozásához használtunk, minden nehézség nélkül előállíthatok például az Escherichia coli esetében ismert szekvencia alapján [Mól. Gén. Génét., 231, 332 (1992)]. Közelebbről, az alábbi láncindítók:
5’-CCCGTCGACGGATCCAGTTTCATCTCTTG-3’ (a szekvencialistában az 1-es azonosító számon megadott szekvencia) és
5’-CCCGTCGACGATCATGCGCTTATGTCGTG-3’ (a szekvencialistában a 2-es azonosító számon megadott szekvencia) megfelelnek a fenti célnak, és lehetővé teszik egy, a pps-gént tartalmazó, kb. 3,3 kb hosszúságú régió amplifikálását. Ezek a láncindítók teszik lehetővé a pps-génnek olyan formában történő amplifikálását, hogy a végein Sáli restrikciós helyet, illetve hasított végeket tartalmazzon. Ha a PCR-termék terminálisain restrikciós enzimmel hasított végeket építünk ki, az amplifikált DNS-fragmens a megfelelő restrikciós enzim alkalmazásával könnyűszerrel klónozható, és a DNS-fragmenst minden nehézség nélkül átvihetjük egy másik vektor-DNS-be is. A láncindítókat megszintetizálhatjuk például egy, Applied Biosystems által előállított DNA synthesizer model 380B segítségével, a foszforamidit-módszerrel [Tetrahedron Letters, 22, 1859, (1981)]. A PCR-t elvégezhetjük például egy Thermal Cycler PJ2000 (Takara Shuzo) alkalmazásával Taq-polimerázt használva a forgalmazó utasításai szerint.
A pps-gént tartalmazó DNS-fragmenst megkaphatjuk más, Escherichia nemzetséghez tartozó baktériumoktól eltérő mikroorganizmusokból is. A DNS-fragmens kinyerésére irányuló eljárás során szintetikus DNS-próbák alkalmazásán alapuló hibridizálást végzünk, ahol a DNS-próbákat a fent idézett irodalmi helyen (Mól. Gén. Génét., mint fent) feltárt nukleotidszekvenciák alapján készítjük el, vagy más lehetőségként ugyanezen nukleotidszekvencián alapuló szintetikus DNS-láncindítók alkalmazásával PCR-t végzünk. A hibridizálási eljárás során alkalmazott DNS-próbát ugyanolyan módon készíthetjük el az ismert szekvencia alapján, mint a PCR-eljárás során alkalmazott DNS-láncindítókat. Feltételezhető, hogy a gén nukleotidszekvenciája az adott mikroorganizmustól függően különböző lehet. így tehát kívánatos olyan szintetikus DNS-t készíteni, amelyik olyan génszakaszhoz hibridizál, amely bármely mikroorganizmusból származó PPS esetében konzervált.
Amikor a PCR-eljárással amplifikált pps-gént juttatunk be egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumba, ezt úgy végezzük, hogy az amplifikált gént ligáljuk egy, Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumban autonóm módon replikálódni képes vektorba, és a kapott rekombináns DNS-t bejuttatjuk egy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumba.
Amikor a pps-gént tartalmazó, kapott DNS-fragmenst más, nem az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok közé tartozó mikroorganizmusba juttatjuk be, a DNS-fragmenst bejuttatása előtt olyan vektorba ligáljuk, amely autonóm módon replikálódni képes annak a mikroorganizmusnak a sejtjeiben, és a kapott rekombináns DNS-t bejuttatjuk a sejtekbe.
A találmány szerinti megoldás megvalósítása során vektor-DNS-ként előnyösen plazmidvektor-DNS-t alkalmazhatunk. Amennyiben a gént Escherichia coli mikroorganizmusba juttatjuk be, alkalmazható vektor-DNS-ek például a következők: pTW228, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, valamint az RSF1010. Ezeken kívül fág-DNS-eredetű vektorok is
HU 224 895 Β1 alkalmazhatók. A PPS hatékony expresszáltatásának elérése érdekében előnyösen a mikroorganizmusban működőképes promotert is alkalmazunk, mint például lac-, trp- vagy PL-promotert. A pps-gén kópiaszámának növelése céljából ugyancsak előnyösen a pps-gént tartalmazó DNS-t beépíthetjük a kromoszómába például transzpozon [Berg, D. E. és Berg, C. M., Bio/Technol., 1, 417, (1983)], m-fág (2-109985-ös számú közzétett japán szabadalmi leírás) vagy homológ rekombináció [„Experiments in Molecular Genetics”, Cold Spring Harbor Láb. (1972)] alkalmazásán alapuló eljárással.
Ami a találmány szerinti megoldás során alkalmazott vektor-DNS-t illeti, amikor a gént korineform baktériumok közé tartozó mikroorganizmusba juttatjuk be, az például a következő lehet: pAM330 (lásd 1-11280-as számú japán szabadalmi leírás), valamint pHM1519 (58-77895-ös számú közzétett japán szabadalmi bejelentés).
Escherichia coli-t transzformálhatunk egy olyan rekombináns vektorral, amelyet a találmány szerinti DNS-szekvenciának például egy fent leírt alkalmas vektorba történő inszertálásával kaptunk. A transzformálást elvégezhetjük bármely, Escherichia coli transzformálásánál szokványosán alkalmazott eljárás segítségével. Ilyen például a sejtek kezelése kalcium-kloriddal a DNS sejtfalon történő átjutásának fokozása érdekében [Mandel, M. és Higa, A., J. Mól. Bioi. 53, 159 (1977)].
Bacillus nemzetséghez tartozó baktériumok transzformálására szolgáló eljárás például az, amely során a DNS bejuttatását a sejtek egy meghatározott növekedési periódusában végezzük, amelyben a sejtek képesek DNS felvételére (Bacillus subtilis-ró\ szóló közlemény, beküldték Duncan és munkatársai). Továbbá bakteriális sejtekbe úgy is bejuttathatunk DNS-t, hogy DNS-felvevőként protoplasztot vagy szferoplasztot készítünk, amelyek könnyen felvesznek plazmid-DNS-t. Ilyen eljárások ismeretesek Bacillus subtilis, Actinomyces, továbbá élesztők esetében [Chan, S. és munkatársai, Mól. Gén. Génét., 168, 111 (1979); Bibb és munkatársai, Natúré, 274, 398 (1978); Hinnen, A. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)].
Az elektroporációs eljárás, amely során a nagyfeszültségű elektromos pulzusok hatására pillanatszerűen pórusok alakulnak ki, amelyeken keresztül DNS jut be a sejtbe [Hanahan, D. és munkatársai, „Plasmid Transformation of Escherichia coli and other bacteria” Meth. Enzymol., 204, 63 (1991)], szintén hatékonyan alkalmazható mikroorganizmusok sejtjeinek széles körében. Túl ezen, egy, az elektroporációs módszeren alapuló, korineform baktériumok esetében alkalmazható transzformálási eljárást a 2-207791-es számú közzétett japán szabadalmi bejelentés tár fel.
Amikor azok közül a szóba jöhető vektorok közül, amelyekbe a pps-gén bejuttatható, kiválasztjuk azt a vektort, amelybe a pps-gént ténylegesen bejuttatjuk, egy PPS-hiányos törzzsel komplementációs tesztet végezhetünk. A PPS-hiányos törzs nem képes egyedüli szénforrásként piroszőlősavat tartalmazó minimális táptalajon nőni. így kiválaszthatjuk a transzformánsokat, amelyek képesek nőni ezen a táptalajon. Az Escherichia coli egy PPS-hiányos törzse az AT2572-1-es törzs [J. Bacteriol., 96, 2185 (1968)]. Az AT2572-1-es törzset az „E. coli Genetic Stock Centeréből (Yale University, Dept. Biology, Osborn Memóriái Labs., 06511-7444 New Haven, Connecticut, USA, P.O. Box 6666) szerezhetjük be, a törzs száma CGSC5242.
Amikor azok közül a szóba jöhető törzsek közül, amelyekben a PPS aktivitása megnövelhető, kiválasztjuk azt a törzset, amelyben a PPS aktivitását ténylegesen megnöveljük, alkalmazható egy ismert eljárás, amellyel a PPS enzimatikus aktivitásának növekedése ellenőrizhető [Cooper, R. A. és Kornberg, H. L., Meth. Enzymol., 13, 309, (1969)].
A találmány szerinti megoldás során előnyösen alkalmazhatunk olyan mikroorganizmusokat, amelyek eredetileg L-aminosav-termelő képességgel rendelkező mikroorganizmusból származnak, de PEP-termelő képességük megnövelt. Előnyösen alkalmazhatunk továbbá olyan mikroorganizmusokat is, amelyekbe PEP-termelő képességük megnövelése után aminosavtermelő képességet juttattunk be. Továbbá még olyan mikroorganizmus esetében is, amely eredetileg is képes volt L-aminosav termelésére, az L-aminosav-termelő képesség tovább javítható bizonyos esetekben azáltal, hogy egy enzimgén működését fokozzuk, amely gén a megfelelő aminosav saját bioszintetikus útvonalának egyik lépéséért felelős, vagy azáltal, hogy bejuttatunk egy operont vagy gént, amely érzéketlenített típusú (gátlással szemben csökkentett érzékenységű) enzimet kódol, amely enzim egyébként visszacsatolásos gátlás alatt lenne.
Ilyen génre vagy operonra példák az alábbiak:
L-fenil-alanin és L-tirozin esetében például az érzéketlen ített típusú korizmát („chorismate”)-mutáz-prefenát-dehidratáz (CM-PDT) génje (lásd az 5-236947-es és a 62-130693-as számú közzétett japán szabadalmi bejelentéseket) és az érzéketlen ített DS (3-dezoxi-D-arabino-hepturonát-7-foszfát-szintáz) génje (lásd az 5-236947-es és a 61-124375-ös számú közzétett japán szabadalmi bejelentéseket);
L-triptofán esetében például a triptofánoperon, amely értéketlenített típusú antranilátszintázt kódol (57-71397-es és 62-244381-es számú közzétett japán szabadalmi bejelentések és 4 371 614-es számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás);
L-treonin esetében például a treoninoperon, amely tartalmaz egy gént, amely egy olyan aszpartokinázt kódol, amelynek L-treonin okozta visszacsatolásos gátlással szembeni érzékenysége le van csökkentve (1-29559-es számú japán szabadalmi leírás), egy gént, amely homoszerindehidrogenázt kódol (60-012995-ös számú közzétett japán szabadalmi bejelentés), valamint egy gént, amely homoszerinkinázt és homoszerindehidrogenázt kódol (61-195695-ös számú közzétett japán szabadalmi bejelentés); valamint
L-ízoleucin esetében például a fent leírt treoninoperon és egy gén, ami treonindeaminázt kódol, amelynek L-treonin okozta visszacsatolásos gátlással szembeni
HU 224 895 Β1 érzékenysége le van csökkentve (2-458-as számú közzétett japán szabadalmi bejelentés).
Aromás aminosavak (L-fenil-alanin, L-triptofán és L-tirozin) esetében várható, hogy a termelékenységet tovább javíthatjuk azáltal, hogy a PPS-en kívül a sejtekben a transzketorázt (a leírásban „TK”-nak rövidítjük) termelő képességet fokozzuk. A mikroorganizmus TK-termelő képességének növelését megvalósíthatjuk úgy, hogy növeljük a TK-aktivitást a mikroorganizmusok sejtjeiben. A TK-aktivitás növelését megvalósíthatjuk például úgy, hogy növeljük a transzketoráz génjének (tkt) expressziós szintjét a mikroorganizmusok sejtjeiben, továbbá úgy is, hogy módosítjuk a fkf-gént, hogy megnövelt aktivitású TK-t kapjunk.
A fkf-gén expressziós szintjének növelésére a mikroorganizmusok sejtjeiben az egyik lehetőség az, hogy növeljük a fkf-gén kópiaszámát a mikroorganizmusok sejtjeiben. A fkf-gén kópiaszámának növelése érdekében szükség van a gént tartalmazó DNS-fragmensre. Az Escherichia nemzetséghez tartozó E. coli fkf-génjét már megklónozták, és nukleotidszekvenciáját meghatározták [Biochem. Biophys. Acta, 1216, 307 (1993)]. Ennek megfelelően a gént tartalmazó DNS-fragmens előállítását az ebben az iratban feltárt eljárás szerint végeztük. A kívánt DNS-fragmenst hibridizálási eljárás alkalmazásával úgy kaphatjuk meg, hogy a fenti irodalmi helyen közölt nukleotidszekvencia alapján előállított szintetikus DNS-próbát vagy PCR-t (polimeráz-láncreakció) alkalmazunk, amely utóbbi során ugyancsak a fent hivatkozott nukleotidszekvencia alapján készített láncindítókat alkalmazunk. A transzketorázgén kópiaszámát megnövelhetjük úgy, hogy a fkf-gént tartalmazó DNS-fragmenst egy vektorba ligáljuk, amely a célzott mikroorganizmusban autonóm módon replikálódni képes, és a kapott rekombináns DNS-t bejuttatjuk ugyanabba a mikroorganizmusba.
A DNS-láncindítók, amelyeket a fkf-gén Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumból PCR-eljárással történő klónozásához használtunk, minden nehézség nélkül előállíthatok például az Escherichia coli esetében ismert szekvencia alapján [Biochem. Biophys. Acta, 1216, 307 (1993)]. Közelebbről, az alábbi láncindítók:
5’-AGAGGATCCAGAGATTTCTGAAGC-3’ (a szekvencialistában a 3-as azonosító számon megadott szekvencia) és
5'-TCTGGATCCGCAAACGGACATTATCA-3' (a szekvencialistában a 4-es azonosító számon megadott szekvencia) megfelelnek a fenti célnak, és lehetővé teszik egy, a fkf-gént tartalmazó, kb. 2,2 kb hosszúságú régió amplifikálását. Ezek a láncindítók teszik lehetővé a fkf-génnek olyan formában történő amplifikálását, hogy a végein BamHI restrikciós helyet, illetve hasított végeket tartalmazzon. Ha a PCR-termék terminálisain restrikciós enzimmel hasított végeket építünk ki, az amplifikált DNS-fragmens a megfelelő restrikciós enzim alkalmazásával könnyűszerrel klónozható, és a DNS-fragmenst minden nehézség nélkül átvihetjük egy másik vektor-DNS-be is. A láncindítókat megszintetizálhatjuk például egy, Applied Biosystems által előállított DNA synthesizer model 380B segítségével, a foszforamidit-módszerrel [Tetrahedron Letters, 22, 1859, (1981)]. A PCR-t elvégezhetjük például egy Thermal Cycler PJ2000 (Takara Shuzo) alkalmazásával Taq-polimerázt használva a forgalmazó utasításai szerint.
A fkf-gént tartalmazó DNS-fragmenst megkaphatjuk más, Escherichia nemzetséghez tartozó baktériumoktól eltérő mikroorganizmusokból is. A DNS-fragmens kinyerésére irányuló egyik eljárás során szintetikus DNS-próbák alkalmazásán alapuló hibridizálást végzünk, ahol a DNS-próbákat a fent idézett irodalmi helyen [Biochem. Biophys. Acta, 1216, 307 (1993)] feltárt nukleotídszekvenciák alapján készítjük el, vagy más lehetőségként ugyanezen nukleotidszekvencián alapuló szintetikus DNS-láncindítók alkalmazásával PCR-t végzünk. A hibridizálási eljárás során alkalmazott DNS-próbát ugyanolyan módon készíthetjük el az ismert szekvencia alapján, mint a PCR-eljárás során alkalmazott DNS-láncindítókat. Feltételezhető, hogy a gén nukleotidszekvenciája az adott mikroorganizmustól függően különböző lehet. így tehát kívánatos olyan szintetikus DNS-t készíteni, amelyik bármely mikroorganizmusból származó TK-nak a konzervált régiójához hibridizál.
Amikor mikroorganizmusba juttatjuk be a fent leírt, megfelelő géneket, a gének mindegyike elhelyezkedhet a kromoszómán, vagy hordozhatja őket ugyanaz a plazmid, a pps-génnel azonos módon. Másik lehetőségként a megfelelő géneket különböző plazmidok is hordozhatják.
A kívánt aminosavat termelhetjük úgy, hogy a fent leírt módon kapott pps-gént tartalmazó rekombináns DNS-sel transzformált mikroorganizmust tenyésztjük, így L-aminosav termelődését és felhalmozódását váltjuk ki a tápközegben, majd az L-aminosavat a tenyészetből kinyerjük.
A tenyésztéshez alkalmazott tápközeg bármely szokványos tápközeg lehet, amely szénforrást, nitrogénforrást, szervetlen ionokat és adott esetben más szerves komponenseket tartalmaz.
Szénforrásként alkalmazhatunk cukrot, például glükózt, laktózt, galaktózt, fruktózt, szacharózt és keményítőhidrolizátumot; alkoholt, például glicerint vagy szorbitot; szerves savakat, például fumársavat, citromsavat és borostyánkősavat.
Nitrogénforrásként alkalmazhatunk szervetlen ammóniumsókat, mint például az ammónium-szulfát, az ammónium-klorid, az ammónium-foszfát; szerves nitrogénforrásokat, például szójabab-hidrolizátumot; ammóniagázt, valamint vizes ammóniát.
Szerves nyomtápanyagforrásként kívánatos alkalmaznunk, amennyiben szükséges, a szervezet számára nélkülözhetetlen anyagokat, mint például a B1-vitamin, a B6-vitamin, valamint élesztőkivonatot vagy hasonlót megfelelő mennyiségben.
Emellett szükség esetén alkalmazhatunk például kis mennyiségben kálium-foszfátot, magnézium-szulfátot, vasiont, mangániont.
A tenyésztést a mikroorganizmus által megkívánt körülmények között végezhetjük. Közelebbről, a te6
HU 224 895 Β1 nyésztést előnyösen aerob körülmények között végezzük 16 és 72 óra közötti tenyésztési idővel. A tenyésztés hőmérsékletét 30 °C és 45 °C közé állítjuk be egy adott értékre, a pH-t pedig 5 és 7 közé, és ezen az értéken tartjuk. A pH-beállítást elvégezhetjük szerves vagy szervetlen savakkal vagy bázisokkal, valamint ammóniagázzal.
Az L-aminosavat a fermentációs elegyből kinyerhetjük ismert eljárások kombinálásával, például beszerezhető ioncserélő gyanta segítségével, kicsapással vagy más módon.
Az alábbiakban megadjuk az ábrák rövid leírását.
Az Lábra a pHSGSK-plazmid megalkotásának folyamatát mutatja be.
A 2. ábra a pdGM1-plazmid megalkotásának folyamatát mutatja be.
A 3. ábra a pMWGMA2-plazmid megalkotásának folyamatát mutatja be.
A 4. ábra a pMWD5-plazmid megalkotásának folyamatát mutatja be.
A találmány szerinti megoldást az alábbi példák segítségével részletesebben is kifejtjük, anélkül azonban, hogy a példákkal a találmány oltalmi körét korlátozni kívánnánk.
1. példa
Escherichia coli pps-gén előállítása
A kromoszomális DNS-t az Escherichia coli Κ-12-es törzsből származó W3110-es törzsből izoláltuk Saito és Miura módszerével [Biochem. Biophys. Acta, 72, 619, (1963)]. Másfelől, az oligonukleotid-láncindítókat, amelyeket a pps-gén kromoszomális DNS-ből PCR-módszerrel végzett amplifikálásához használtunk, a pps-gén ismert nukleotidszekvenciája alapján szintetizáltuk meg [Mól. Gén. Génét. 231, 332 (1992)]:
(1) 5'-CCCGTCGACGGATCCAGTTTCATCTCTTG-3’ (a szekvencialistában az 1-es azonosító számon megadott szekvencia) (2) 5’-CCCGTCGACGATCATGCGCTTATGTCGTG-3’ (a szekvencialistában a 2-es azonosító számon megadott szekvencia)
A fenti láncindítók a pps-gén 5’- és 3'-végein elhelyezkedő szekvenciákkal rendre homológ, illetve komplementer szekvenciát tartalmaznak, továbbá Sall-enzim által felismerhető szekvenciákat, a PCR-termék klónozásának elősegítése érdekében.
A PCR-reakciót a kromoszomális DNS és a fenti láncindítók alkalmazásával hajtottuk végre Erlich módszerével [„PCR Technology”, Stockton press (1989)]. A reakciókörülmények egy reakcióciklusra a következők voltak: hődenaturálás 1 percig 93 °C-on, hibridizálás 1,5 percig 55 °C-on, polimerázreakció 3 percig 72 °C-on. Ezt a ciklust 30 alkalommal ismételtük meg.
A PCR-rel egy 3,3 kb hosszúságú DNS-fragmenst kaptunk, amelyet Sáli restrikciós enzimmel emésztettünk, majd a pTWV228 ampicillinrezisztens (Apr) plazmidvektor (Takara Shuzo) Sall-helyére ligáltuk DNS-ligáz alkalmazásával. Egy PPS-deficiens törzset, az Escherichia coli AT2572-1-et [J. Bacteriol., 96, 2185 (1968), amelyet az „E. coli Genetic Stock Centeréből szereztünk be, cím mint fent] transzformáltunk a ligálóeleggyel. A transzformánsokat ampicillintartalmú táptalajra szélesztettük, hogy a felnövekedett ampicillinrezisztens törzseket elválaszthassuk, majd közülük kiválasztottunk egy törzset, amely minimális tápközegen egyedüli szénforrásként piroszőlősavat alkalmazva is nőni tudott. A törzsből plazmid-DNS-t állítottunk elő. A kapott plazmidot pTWV-pps-nek jelöltük.
Restrikciós hasítási térkép alapján megvizsgáltuk a fent leírt módon előállított pTWV-pps inszertált DNSfragmensét, és megmértük a kapott transzformáns PPS-aktivitását. A vizsgálat és a mérés eredményei alapján megbizonyosodtunk róla, hogy a DNS-fragmens tartalmazta a pps-gént.
2. példa
L-fenil-alanin termelése <1> L-fenil-alanin-termelő baktérium létrehozása
Az L-fenil-alanin bioszintetikus rendszerének saját részéhez tartozó, érzéketlen ített típusú korizmát („chorismate”)-mutáz-prefenát-dehidratáz (CM-PDT) génjét tartalmazó DNS-fragmenst inszertáltunk a klór-amfenikol-rezisztens (Cmr) pACYC184-plazmidvektor BamHI és Hindlll hasítási helyeire, amivel a szintén klór-amfenikol-rezisztens pACMAB-plazmidot (Cmr) kaptuk (lásd az 5-236947-es számú közzétett japán szabadalmi bejelentést), amelyet Sall-gyel emésztettünk. A pTWV-pps-ből Sall-gyel kivágott pps-génfragmenst ebbe a linearizált vektorba ligáltuk DNS-ligáz alkalmazásával. A kapott,
8,9 kb hosszúságú plazmidot pACMAB-pps-nek jelöltük.
Másfelől, érzéketlen ített típusú DS (3-dezoxi-D-arabino-hepturonát-7-foszfát-szintáz) génjét (aroG4) tartalmazó DNS-fragmenst inszertáltunk pBR322-plazmidvektor EcoRI, Hindlll hasítási helyeire, és az így kapott plazmidot pBR-aroG4-nek neveztük el (Apr, lásd 5-236947-es számú közzétett japán szabadalmi bejelentés). Ezzel a plazmiddal Escherichia co//W3110-sejteket (tyrA) transzformáltunk. A pACMAB-pps-t bejuttattuk a kapott transzformáns törzsbe, és Apr és Cmr alapján szelektáltunk. A kapott transzformáns törzset W31 Wf/yrAJ/pACMAB-pps, pBR-aroG4-nek jelöltük.
A fyrA-deficiens (AJ12604 jelű) Escherichia coli W3110-es törzset transzformálva a pBR-aroG4-gyel és pACMAB-vel 1991. január 28-án helyeztük letétbe FERM P-11975 nyilvántartási számon a „National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry” Intézetnél (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan), majd 1991. szeptember 26-án a Budapesti Egyezménynek megfelelően is letétbe helyeztünk a FERM ΒΡ-3579-es nyilvántartási számon. A pBR-aroG4 és pACMAB kinyerhető ebből a törzsből a szokványos módon.
<2> Az L-fenil-alanin-termelékenység értékelése
A fentiekben leírt módon kapott Escherichia coli W3110(íyrA,)/pACMAB-pps, pBR-aroG4 törzset 37 °C-on tenyésztettük 40 órán át L-fenil-alanin-termelő tápközeget (tartalma: 20 g glükóz, 29,4 g dinátrium-hidrogén-foszfát, 6 g kálium-dihidrogén-foszfát,
HU 224 895 Β1 g nátrium-klorid, 2 g ammónium-klorid, 10 g nátrium-citrát, 0,4 g nátrium-glutamát, 3 g magnéziumszulfát-heptahidrát, 0,23 g kalcium-klorid, 2 mg tiamin-hidroklorid és 100 mg L-tirozin 1 I vízben, pH 7,0) alkalmazva. A W3110(fyrA)/pACMAB, pBR-aroG4 törzset ugyanúgy tenyésztettük kontrollként. A tápközegben kvantitatívan meghatároztuk az L-fenil-alanin mennyiségét nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) segítségével. Az eredményeket az 1. táblázat foglalja össze.
1. táblázat
| Baktériumtörzs | L-fenil-alanin mennyisége (g/l) |
| W3110(fyrA)/pACMAB, pBR-aroG4 | 3,8 |
| W311O/fyrAj/pACMAB-pps, pBR-aroG4 | 4,1 |
3. példa
L-triptofán termelése <1> L-triptofán-termelő baktérium létrehozása
Egy érzéketlenített típusú DS-gént tartalmazó (araG4) DNS-fragmenst és egy kanamicinrezisztens gént inszertáltunk a pACYC177E-plazmidba, amit a pACYC177-plazmidból nyertünk úgy, hogy annak Xhol-helyét EcoRI-hellyé alakítottuk át. így tehát a kanamicin- és ampicillinrezisztens pACKG4-plazmidot (Apr, Kmr) nyertük, ami 6,4 kb hosszúságú (lásd az 5-236947-es közzétett japán szabadalmi bejelentést). Ezt a plazmidot részlegesen emésztettük Hindlll-mal, majd tompa végűvé tettük DNS-polimeráz Klenow-fragmens alkalmazásával. Másfelől az 1. példa szerint előállított, 3,3 kbp hosszúságú, pps-gént tartalmazó Sallfragmenst ugyanígy tompa végűvé tettük, majd a fent leírt pACKG4-fragmenssel ligáltuk. Az Escherichia coli PPS-deficiens törzset transzformáltuk a ligálóeleggyel, és Apr, Kmr és pps+ tulajdonságokra szelektáltunk. A kapott transzformánsból plazmidot izoláltunk, amit pACKG4-pps-nek jelöltünk (hossza: 9,4 kb).
A pGX44-plazmidot eltávolítottuk az Escherichia coli AGX17(pGX44) törzsből, amely L-fenil-alanin- és L-tirozin-auxotrófiát mutat. (Az eredeti AGX17-es törzs L-fenil-alanin-, L-tirozin- és L-triptofán-auxotróf.) így megkaptuk az AGX17-es törzset. Másfelől, a pGX50-et kinyertük az Escherichia coli K12 AGX6(pGX50) (aroP) törzséből, amely a triptofánoperont tartalmazó pGX50(Apr)-plazmidot hordozza [4 371 617-es számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban feltárva, letétbe helyezve 1981. január 31-én az NRRL Β-12264-es nyilvántartási számon, az „Agrucultural Research Service Culture Collection (NRRL)” gyűjteménynél (1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA)]. Ezt a plazmidot juttattuk be az AGX17-es törzsbe, amit Apr és Trp+ tulajdonságokra szelektáltunk. A kapott transzformánsba ezután bejuttattuk a pACKG4-pps-plazmidot, majd Apr és Kmr szelekciós markerek alapján szelektáltunk. A kapott transzformánst AGX17/pGX50, pACKG4-pps-nek jelöltük.
Másrészt a pGX50- és a pACKG4-plazmidokat is bejuttattuk az AGX17-es törzsbe, Apr, Trp+ és Kmr tulajdonságokra szelektáltunk, és a kapott transzformánst AGX17/pGX50, pACKG4-nek jelöltük.
<2> Az L-triptofán-termelékenység értékelése
Az AGX17/pGX50, pACKG4-pps törzset 31 °C-on tenyésztettük 48 órán át L-triptofán-termelő tápközeget alkalmazva (tartalma: 40 g glükóz, 16 g ammónium-szulfát, 1 g kálium-dihidrogén-foszfát, 1 g magnézium-szulfát-heptahidrát, 0,01 g vas-szulfát-heptahidrát, 0,01 g mangán-klorid-tetrahidrát, 2 g élesztőkivonat, 40 g kalcium-karbonát, és 100 mg L-fenil-alanin és 100 mg L-tirozin 1 I vízben, pH 7,0). Az AGX17/pGX50, pACKG4 törzset ugyanúgy tenyésztettük kontrollként. A tápközegben kvantitatívan meghatároztuk az L-triptofán mennyiségét nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) segítségével. Az eredményeket a 2. táblázat foglalja össze.
2. táblázat
| Baktériumtörzs | Termelt L-triptofán mennyisége (g/l) |
| AGX17/pGX50, pACKG4 | 2,1 |
| AGX17/pGX50, pACKG4-pps | 2,5 |
4. példa
L-treonin előállítása <1> L-treonin-termelő baktérium előállítása
Az 1. példa szerint előállított pTWV-pps-t egy L-treonin-termelő baktériumba, az Escherichia coli VKPM Β-3996-os törzsbe juttattuk be [feltárva az 5 175 107-es számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, letétbe helyezve 1987. november 19-én RIA 1867-es nyilvántartási számon az „All-Union Scientific Center of Antibiotics (VNIIA)” gyűjteménynél (Nagatinxkaya Street 3-a, 11305 Moscow, Russian Federation)]. Smr és Apr tulajdonságok alapján szelektálva egy transzformánst állítottunk elő, amit Β-3996/pTWV-pps-nek jelöltünk. A VKPM Β-3996-os törzs hordoz egy sztreptomicinrezisztenciát kódoló plazmidot, a pVIC40-et (Smr), amely treoninoperont tartalmaz. Ennek része egy L-treonin okozta visszacsatolásos gátlással szemben lényegesen lecsökkentett érzékenységű aszpartokinázt kódoló gén.
<2> Az L-treonin-termelékenység értékelése
A B-3996 és a Β-3996/pTWV-pps törzseket 37 °C-on tenyésztettük 24 órán át L-treonin-termelő tápközeget alkalmazva (tartalma: 40 g glükóz, 16 g ammónium-szulfát, 1 g kálium-dihidrogén-foszfát, 1 g magnézium-szulfát-heptahidrát, 0,01 g vas-szulfát-heptahidrát, 0,01 g mangán-klorid-tetrahidrát, 2 g élesztőkivonat, 40 g kalcium-karbonát 1 I vízben, pH 7,0). A tápközegben kvantitatívan meghatároztuk az L-treonin mennyiségét nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) segítségével. Az eredményeket a 3. táblázat foglalja össze.
HU 224 895 Β1
3. táblázat
| Baktériumtörzs | Termelt L-treonin mennyisége (g/l) |
| B-3996 | 14,5 |
| Β-3996/pTWV-pps | 15,5 |
5. példa
L-izoleucin termelése <1> L-izoleucin-termelő baktérium előállítása (1) Treoninoperont és pps-gént tartalmazó plazmid megalkotása
A treoninoperonnak része egy L-treonin okozta visszacsatolásos gátlással szemben lényegesen lecsökkenteti érzékenységű aszpartokinázt kódoló gén. Az ezt a gént tartalmazó treoninoperont a pVIC40plazmid tartalmazza (feltárva az 5 175 107-es számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban). Ezt BamHI-gyel emésztettük, majd a kapott fragmenst Klenow-fragmenssel tompa végűvé tettük. Másfelől az 1. példa szerint előállított, 3,3 kbp hosszúságú, pps-gént tartalmazó Sall-fragmenst ugyanígy tompa végűvé tettük, majd a fent leírt pVIC40-fragmenssel ligáltuk. Az Escherichia coli PPS-deficiens törzset transzformáltuk a ligálóeleggyel, és Smr és pps+ tulajdonságokra szelektáltunk. A kapott transzformánsból plazmidot izoláltunk, amit pVIC40-pps-nek jelöltünk (hossza: 17,9 kb).
(2) Az ilvGMEDA-operont tartalmazó plazmid előállítása
Az Escherichia coli MI162-es törzsből kromoszomális DNS-t állítottunk elő. A kromoszomális DNS-t Hindlll restrikciós enzimmel emésztettük. Megállapítottuk, hogy az ilvGM-gént tartalmazó Hindlll-Hindlll DNS-fragmens 4,8 kb hosszúságú. Ennek megfelelően a kb. 4,8 kb hosszúságú Hindlll-Hindlll DNSfragmenst ligáltuk egy, a pBR322-plazmidvektor (Takara Shuzo) Hindlll-emésztésével kapott DNS-fragmenssel.
A kapott ligálóeleggyel a hidroxi-ecetsav („acetohydroxiacid”)-szintázban hiányos Escherichia coli MI262 törzset transzformáltuk. A transzformált törzset szelektáltuk az alapján, hogy megszűnt-e a hidroxi-ecetsav-szintáz hiánya. Izoláltuk a sejtekből a plazmidot. A plazmid szerkezeti analízise eredményeképpen megállapítottuk, hogy a 4,8 kb hosszúságú, ilvGM-gént és az ilvE-gén 5’-terminális részét tartalmazó fragmens a pBR322 Hindlll helyére inszertálódott. A plazmidot pBRGM7-nek jelöltük.
A szekvencialistában a 6-os és a 7-es azonosító számon megadott szekvenciájú szintetikus oligonukleotidokat szintetizáltuk az ilvGM-gén közölt nukleotidszekvenciája alapján [Gene, 97, 21 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 922 (1981); és J. Bacteriol., 149, 294 (1982)]. Egy, promotert, attenuátort és az ilvGM-gén nukleotidszekvenciájának kódolórégióját tartalmazó szekvenciát adtunk meg a szekvencialistában az 5-ös azonosító számon a kódolórégió aminosavszekvenciájával együtt. Mindkét oligonukleotidot láncindítóként alkalmazva DNS-t amplifikáltunk PCR-eljárással, templátként az MI162-es törzs kromoszomális DNS-e szolgált. Az amplifikált DNS-fragmens szekvenciája a szekvencialistában az 5-ös azonosító számon megadott szekvencia 25-952. nukleotidjáig terjed. Ezt a fragmenst neveztük el A-fragmensnek.
A szekvencialistában a 8-as és a 9-es azonosító számon megadott szekvenciájú szintetikus oligonukleotidokat szintetizáltuk az alábbi irodalmi helyeken megadott nukleotidszekvenciák alapján [Gene, 97, 21 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 922 (1981); és J. Bacteriol., 149, 294 (1982)], a fent leírt módon. Mindkét oligonukleotidot láncindítóként alkalmazva DNS-t amplifikáltunk PCR-eljárással, templátként az MI162-es törzs kromoszomális DNS-e szolgált. Az amplifikált DNS-fragmens szekvenciája a szekvencialistában az 5-ös azonosító számon megadott szekvencia 1161-2421. nukleotidjáig terjed. Ezt a fragmenst neveztük el B-fragmensnek.
Az A-fragmens Smal-gyel végzett emésztésével kapott nagyobbik fragmenst a pUC18-vektor (Takara Shuzo) Smal-gyel végzett emésztésével kapott DNSfragmenssel ligáltuk, ezzel a pUCA-plazmidhoz jutottunk. A B-fragmens Kpnl-gyel végzett emésztésével kapott nagyobbik fragmenst a pHSG399 (Takara Shuzo) Hincl-gyel és Kpnl-gyel végzett emésztésével kapott nagyobbik fragmenssel ligáltuk, ezzel a pHSGBplazmidhoz jutottunk.
A pUCA-plazmidot Kpnl-gyel emésztettük, majd a végeket a DNS-polimeráz I nagy fragmensével (Klenow-fragmens) tompa végűvé tettük, majd végül Pstl-es emésztéssel izoláltuk az A-fragmenst tartalmazó DNS-fragmenst. A pHSGB-plazmidot Hindlll-mal emésztettük, majd a végeket a DNS-polimeráz I nagy fragmensével (Klenow-fragmens) tompa végűvé tettük, majd végül Pstl-es emésztéssel izoláltuk a B-fragmenst tartalmazó DNS-fragmenst. A két DNS-fragmenst egymással is ligáltuk, így állítottuk elő a pHSGSK-plazmidot.
Az Smal-Kpnl-fragmenst, amelyet a pHSGSK-plazmid hordoz, és amelyet az A- és a B-fragmensek ligálásával nyertünk, C-fragmensnek neveztük el. A C-fragmens megfelel annak a fragmensnek, amelyhez az ilvGM-gént tartalmazó 4,8 kb hosszúságú HindlllHindlll-fragmens Smal-gyel és Kpnl-gyel végzett emésztésével jutottunk, amely promotert, SD-szekvenciát, valamint az ilvG-gén 5’-régióját tartalmazza, de amelyből hiányzik egy kb. 0,2 kb hosszúságú szakasz, amely a vezető- („leader”) szekvenciától az attenuátor (csillapító-) régióig tart. A pHSGSK megalkotásának folyamatát az 1. ábra foglalja össze.
A C-fragmenst úgy izoláltuk, hogy a pHSGSK-plazmidot Smal-gyel és Kpnl-gyel emésztettük. Ezt és a pBRGM7-plazmid nagyobbik DNS-fragmensét, amelyet szintén Smal-gyel és Kpnl-gyel emésztetve kaptunk, ligáltuk egymással. A kapott plazmidot pdGM1nek jelöltük. Az ilvGM-gént tartalmazó 4,6 kb hosszúságú HindlII-HindlII-fragmens, amelyet a pdGM1 hordoz, nem tartalmazza az attenuációhoz szükséges ré9
HU 224 895 Β1 giót. Az ilvGM-gén, amely nem tartalmazza az attenuációhoz szükséges régiót, ebben a példában és a rajzokon AattGM-ként van feltüntetve. A pdGM1 megalkotásának fent leírt folyamatát a 2. ábrán foglaltuk össze.
A pDRIA4-plazmid, amelyet a 2-458-as számú közzétett japán szabadalmi bejelentés ismertet, autonóm módon replikálódni képes Escherichia nemzetséghez tartozó baktériumok sejtjeiben. A pDRIA4-plazmidot úgy állították elő, hogy a pDR1120 átviteli vektort, amely autonóm módon replikálódni képes Brevibacterium nemzetséghez tartozó baktériumok sejtjeiben, kombinálták egy - E. coli Κ-12-eredetű treonindeaminázt kódoló - z'/vA-gént és az z/vD-gén 3'-terminális részét tartalmazó BamHI-BamHI-fragmenssel. Ezt a BamHI-BamHI-fragmenst a 2-458-as számú közzétett japán szabadalmi bejelentés ismerteti, és 2,3 kb hosszúságúnak írja le. Mi azonban a BamHI-BamHIfragmenst 2,75 kb hosszúságúnak találtuk. A pDRIA4-plazmid a Brevibacterium flavum AJ 12358 (FERM P-9764) vagy a Brevibacterium flavum AJ 12359 (FERM P-9765) kromoszomális DNS-én kívül található. A pDRIA4-plazmid a fenti törzsekből a szokványos módon előállítható.
Az L-izoleucin okozta gátlással szemben lényegesen csökkentett érzékenységű treonindeaminázt kódoló z'/vA-gént tartalmazó HindlII-BamHI-fragmenst a pDRIA4-plazmid 2,75 kb hosszúságú BamHI-BamHIfragmenséből állítottuk elő. A HindlII-BamHI-fragmenst a pMW119-vektor (Nippon Gene) Hindlll-mal és BamHI-gyel végzett emésztésével kapott DNS-fragmenssel ligáltuk. Az így kapott plazmidot pMWA1-nek jelöltük.
A pMWA1 Hindlll-mal végzett emésztésével kapott DNS-fragmenst a pdGM1-plazmid Hindlll-mal végzett emésztésével kapott, ilvGM-gént tartalmazó DNSfragmensével ligáltuk. A plazmid restrikciós helyeinek pozíciói alapján restrikciós enzimes emésztés segítségével kiválasztottunk egy olyan plazmidot, amelyben az ilvGM-gén transzkripció szempontjából ugyanabban az irányban helyezkedett el, mint az z/vA-gén. A kapott plazmidot pMWGMA2-nek jelöltük. A pMWGMA2 tartalmazta az z'/vG/W-gént attenuátor nélkül, az z/vE-gén 5’-temninális régiójának egy részét és az z/vD-gén 3'-terminális régiójának egy részét. A pMWGMA2 megalkotásának folyamatát a 3. ábra foglalja össze.
Az Escherichia coli Ml 162 kromoszomális DNS-ét izoláltuk, majd megemésztettük Sáli és Pstl restrikciós enzimekkel, hogy a DNS-fragmensek elegyét kapjuk. Másrészt pUC19-vektort is (Takara Shuzo) megemésztettünk Sáli és Pstl restrikciós enzimekkel, amivel egy DNS-fragmenst kaptunk. A DNS-fragmensek elegyét ligáltuk a pUC19 emésztésével kapott fragmenssel, amivel újra egy DNS-elegyhez jutottunk. Ezt a DNS-elegyet juttattuk be a transzamináz B-ben hiányos AB2070-es törzsbe [J. Bacteriol., 109, 703 (1972)], amit az „E. coli Genetic Stock Center”-ből szereztünk be (CGSC2070), hogy kiválaszthassunk egy transzformánst, amelyben az elágazó láncú aminosavakkal kapcsolatos auxotrófia megszűnt. Amikor a kapott törzsből plazmidot izoláltunk, a kapott plazmid nem volt más, mint a DNS-fragmens, amit a pUC19-plazmid Sall-gyel és Pstl-gyel végzett emésztésével kaptunk, ligáivá az /'/vE-gént tartalmazó Sall-Pstl-fragmenssel. Ezt a plazmidot neveztük el pUCE1-nek. A pUCE1 tartalmazza az ilvM-gén 3’-terminális régiójának egy részét, az z/vE-gént és az ilvD-gén 5’-terminális régiójának egy részét.
A pMWGMA2-t részlegesen emésztettük Hindlllmal, amivel DNS-fragmensek elegyéhez jutottunk. Másfelől, a pUCE1-et is emésztettük Hindlll-mal, így egy 1,7 kb hosszúságú, az z'/vE-gén egy részét és az ilvD-gén 5’-terminális régiójának egy részét tartalmazó HindlII-DNS-fragmenshez jutottunk. A kettőt ligáltuk egymással, így újra egy DNS-elegyhez jutottunk, amellyel egy dihidroxisav-dehidratázban (az ilvD-gén terméke) hiányos törzset, nevezetesen az AB1280-as törzset transzformáltuk. Egy olyan transzformáns törzset szelektáltunk ki, amelyből az elágazó láncú aminosavakkal kapcsolatos auxotrófia eltűnt. Amikor a kapott transzformáns törzsből plazmidot izoláltunk, azt tapasztaltuk, hogy egy DNS-fragmens, amelyet a pMWGMA2-nek csupán a AattGM és az ilvA közötti Hindlll-helyen emésztett fragmensét és a pUCE1-ből származó, 1,7 kb hosszúságú, az ilvE- és az ilvD-gének egy-egy részét tartalmazó fragmenst ligáltuk, amivel az ilvGMEDA-operon helyreállt. Az így kapott plazmidot neveztük el pMWD5-nek. A pMWD5 megalkotásának folyamatát a 4. ábra foglalja össze.
A fentiekben leírt módon kapott pMWD5(Apr)-plazmid a pMW119 mint vektor alkalmazásán alapul, amely az ilvGMEDA-operont hordozza, amelyből az attenuációhoz szükséges régiót eltávolítottuk.
(3) L-izoleucin-termelő baktérium létrehozása
A pVIC40-pps-t Escherichia coli VNIIGenetika TDH-6-ba juttattuk be (a TDH-6 megfelel egy gazdabaktériumnak, amely a fent leírt Escherichia coli VKPM B-3996 törzsből nyerhető a pVIC40-plazmid eltávolítása útján), és a transzformánsokat Smr szelekciós markerek alapján választottuk ki. Ezután a pMWD5-öt bejuttattuk ebbe a törzsbe, az így kapott transzformánst TDH-6/pVIC40-pps, pMWD5-nek jelöltük, ennek Smr és Apr tulajdonsága van. Másrészt, pVIC40-et és pMWD5-öt juttattunk be TDH-6-ba, és szelekciós markerként Smr-t és Apr-t alkalmazva a TDH-6/pVIC40, pMWD5-höz jutottunk.
<2> Az L-izoleucin-termelékenység értékelése
A TDH-6/pVIC40-pps, pMWD5 törzset 37 °C-on tenyésztettük 24 órán át L-izoleucin-termelő tápközeget alkalmazva (tartalma: 40 g glükóz, 16 g ammónium-szulfát, 1 g kálium-dihidrogén-foszfát, 1 g magnézium-szulfát-heptahidrát, 0,01 g vas-szulfát-heptahidrát, 0,01 g mangán-klorid-tetrahidrát, 2 g élesztőkivonat, 40 g kalcium-karbonát 1 I vízben, pH 7,0). A TDH-6/pVIC40, pMWD5-törzset ugyanígy, termosztálva tenyésztettük. A tápközegben kvantitatívan meghatároztuk az L-izoleucin mennyiségét nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) segítségével. Az eredményeket a 4. táblázat foglalja össze.
HU 224 895 Β1
4. táblázat
| Baktériumtörzs | Termelt L-izoleucin mennyisége (g/i) |
| TDH-6/pVIC40, pMWD5 | 10,0 |
| TDH-6/pVIC40-pps, pMWD5 | 11,5 |
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható különböző aminosavak, például aromás aminosavak, L-fenil-alanin, L-triptofán, L-tirozin, továbbá L-treonin és L-izoleucin előállítására magas hozammal. Ezen aminosavak termelődését tovább fokozhatjuk a találmány szerinti megoldást olyan mikroorganizmusok esetében alkalmazva, amelyek önmagukban is jó termelékenységgel állítják elő a fenti aminosavakat.
Claims (6)
1. Eljárás L-aminosavak előállítására egy L-aminosav-termelő mikroorganizmus tápközegben történő tenyésztése, az L-aminosav előállítása és tápközegben való felhalmozódásának kiváltása, valamint az L-aminosav elkülönítése útján, azzal jellemezve, hogy L-aminosavként L-treonint vagy L-izoleucint állítunk elő, és mikroorganizmusként vad típusú törzshöz képest mikrobiális sejtjeiben megnövelt foszfoenol-piruvát-szintáz-aktivitású mikroorganizmust használunk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Escherichia nemzetséghez tartozó mikroorganizmust használunk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként korineform baktériumot használunk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy megnövelt foszfoenol-piruvát-szintáz-aktivitású mikroorganizmusként olyan mik15 roorganizmust használunk, amelynek mikrobiális sejtjeiben a foszfoenol-piruvát-szintáz-gén expressziója fokozott mértékű.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan mikroorganizmust használunk, amelyben
20 a foszfoenol-piruvát-szintáz-gén expressziójának mértéke a gén kópiaszámának növelése útján fokozott.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként foszfoenol-piruvát-szintáz25 génnel transzformált, rekombináns törzset alkalmazunk.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22156195 | 1995-08-30 | ||
| JP20086096A JP4032441B2 (ja) | 1995-08-30 | 1996-07-30 | Ｌ−アミノ酸の製造方法 |
| PCT/JP1996/002399 WO1997008333A1 (fr) | 1995-08-30 | 1996-08-27 | Procede de production d'acides amines levogyres |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP9901198A2 HUP9901198A2 (hu) | 1999-07-28 |
| HUP9901198A3 HUP9901198A3 (en) | 2001-10-29 |
| HU224895B1 true HU224895B1 (en) | 2006-04-28 |
Family
ID=26512437
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9901198A HU224895B1 (en) | 1995-08-30 | 1996-08-27 | Process for producing l-amino acids |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6319696B1 (hu) |
| EP (1) | EP0877090B1 (hu) |
| JP (1) | JP4032441B2 (hu) |
| CN (1) | CN1077139C (hu) |
| DE (1) | DE69635493T2 (hu) |
| DK (1) | DK0877090T3 (hu) |
| HU (1) | HU224895B1 (hu) |
| PL (1) | PL183472B1 (hu) |
| SK (1) | SK282611B6 (hu) |
| WO (1) | WO1997008333A1 (hu) |
Families Citing this family (94)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5985617A (en) * | 1997-02-18 | 1999-11-16 | Liao; James C. | Microorganisms and methods for overproduction of DAHP by cloned PPS gene |
| WO2000056859A1 (fr) * | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production des l-aminoacides |
| JP2003204783A (ja) * | 1999-07-19 | 2003-07-22 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| JP4362959B2 (ja) * | 2000-08-24 | 2009-11-11 | 味の素株式会社 | 塩基性アミノ酸の製造方法 |
| DE10045497A1 (de) * | 2000-09-13 | 2002-03-28 | Degussa | Neue für das ppsA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| DE10063314A1 (de) * | 2000-12-20 | 2002-07-04 | Degussa | Neue für das ilvE-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| JP2002209596A (ja) * | 2001-01-19 | 2002-07-30 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2229513C2 (ru) | 2001-11-23 | 2004-05-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) |
| DE60236684D1 (de) | 2001-11-23 | 2010-07-22 | Ajinomoto Kk | Verfahren zur l-aminosäureproduktion mit escherichia |
| RU2244007C2 (ru) * | 2002-02-27 | 2005-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения l-треонина, штамм escherichia coli - продуцент треонина (варианты) |
| WO2005030973A1 (ja) | 2003-09-30 | 2005-04-07 | Ajinomoto Co., Inc. | 発酵液からのコハク酸の精製方法 |
| KR101142885B1 (ko) * | 2003-12-15 | 2012-05-10 | 씨제이제일제당 (주) | 트립토판 생합성 관련 변이유전자를 함유한 대장균 변이주및 이를 이용한 트립토판 제조방법 |
| DE102004003410A1 (de) * | 2004-01-23 | 2005-08-25 | Degussa Ag | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| RU2288264C2 (ru) * | 2004-02-12 | 2006-11-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Бактерия, принадлежащая к роду escherichia - продуцент l-треонина и способ получения l-треонина |
| US7482140B2 (en) | 2004-06-15 | 2009-01-27 | Ajinomoto Co., Inc. | L-tyrosine-producing bacterium and a method for producing L-tyrosine |
| JP4796495B2 (ja) * | 2004-06-25 | 2011-10-19 | 協和発酵バイオ株式会社 | ジペプチドの製造法 |
| WO2007086546A1 (en) * | 2006-01-26 | 2007-08-02 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of enterobacteriaceae family with attenuated expression of the aldh gene |
| JP2009118740A (ja) | 2006-03-03 | 2009-06-04 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2186881B1 (en) | 2006-03-23 | 2014-04-23 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA |
| JP2009153382A (ja) | 2006-03-30 | 2009-07-16 | Ajinomoto Co Inc | メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法 |
| EP2007873B1 (en) * | 2006-04-18 | 2015-11-18 | Ajinomoto Co., Inc. | A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE sfmACDFH-fimZ CLUSTER OR THE fimZ GENE |
| JP2009165355A (ja) | 2006-04-28 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| WO2007139219A1 (en) * | 2006-06-01 | 2007-12-06 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of the rcsa gene |
| RU2337961C2 (ru) * | 2006-07-04 | 2008-11-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН rspAB |
| CN1986777B (zh) * | 2006-07-11 | 2010-09-08 | 湖北大学 | 活体催化工程菌及利用α-酮酸生产L型非天然疏水性氨基酸的方法 |
| WO2008010565A2 (en) * | 2006-07-19 | 2008-01-24 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family |
| RU2006129690A (ru) | 2006-08-16 | 2008-02-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ydiN, ГЕНА ydiB ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ |
| JP2010017082A (ja) | 2006-10-10 | 2010-01-28 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010017081A (ja) * | 2006-10-10 | 2010-01-28 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| WO2008072761A2 (en) * | 2006-12-11 | 2008-06-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing an l-amino acid |
| RU2006143864A (ru) * | 2006-12-12 | 2008-06-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ |
| JP2010041920A (ja) | 2006-12-19 | 2010-02-25 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2006145712A (ru) * | 2006-12-22 | 2008-06-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной способностью к утилизации глицерина |
| EP2116595B1 (en) | 2007-01-22 | 2017-04-05 | Ajinomoto Co., Inc. | An l-amino acid-producing microorganism and a method for producing an l-amino acid |
| JP2010088301A (ja) | 2007-02-01 | 2010-04-22 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010110216A (ja) | 2007-02-20 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法 |
| JP2010110217A (ja) | 2007-02-22 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| DE102007051024A1 (de) | 2007-03-05 | 2008-09-11 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| JP2010130899A (ja) | 2007-03-14 | 2010-06-17 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法 |
| EP1975241A1 (de) | 2007-03-29 | 2008-10-01 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| BRPI0816429A2 (pt) | 2007-09-04 | 2019-09-24 | Ajinomoto Kk | microorganismo, e, método para a produção de um l-aminoácido. |
| DE102007044134A1 (de) | 2007-09-15 | 2009-03-19 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| RU2396336C2 (ru) | 2007-09-27 | 2010-08-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia |
| DE102007052270A1 (de) | 2007-11-02 | 2009-05-07 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| EP2060636A1 (de) | 2007-11-14 | 2009-05-20 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| EP2248906A4 (en) | 2008-01-23 | 2012-07-11 | Ajinomoto Kk | PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACID |
| JP5217780B2 (ja) * | 2008-02-08 | 2013-06-19 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2008105793A (ru) | 2008-02-19 | 2009-08-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена |
| EP2098597A1 (de) | 2008-03-04 | 2009-09-09 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| DE102008002309A1 (de) | 2008-06-09 | 2009-12-10 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| DE102008040352A1 (de) | 2008-07-11 | 2010-01-14 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| DE102008044768A1 (de) | 2008-08-28 | 2010-03-04 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von organisch-chemischen Verbindungen unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| KR101627095B1 (ko) | 2008-09-08 | 2016-06-03 | 아지노모토 가부시키가이샤 | Ｌ-아미노산을 생산하는 미생물 및 ｌ-아미노산의 제조법 |
| JP2012029565A (ja) | 2008-11-27 | 2012-02-16 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010142200A (ja) | 2008-12-22 | 2010-07-01 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−リジンの製造法 |
| BRPI1007069A2 (pt) | 2009-01-23 | 2015-08-25 | Ajinomoto Kk | Método para produzir um l-aminoácido. |
| EP2267145A1 (de) | 2009-06-24 | 2010-12-29 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| WO2011013707A1 (ja) | 2009-07-29 | 2011-02-03 | 味の素株式会社 | Ｌ-アミノ酸の製造法 |
| JP2012223092A (ja) | 2009-08-28 | 2012-11-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2013013329A (ja) | 2009-11-06 | 2013-01-24 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2460793C2 (ru) | 2010-01-15 | 2012-09-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae |
| JP2013074795A (ja) | 2010-02-08 | 2013-04-25 | Ajinomoto Co Inc | 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法 |
| RU2471868C2 (ru) | 2010-02-18 | 2013-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот |
| RU2501858C2 (ru) | 2010-07-21 | 2013-12-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae |
| RU2482188C2 (ru) | 2010-07-21 | 2013-05-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE |
| JP2014036576A (ja) | 2010-12-10 | 2014-02-27 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2011134436A (ru) | 2011-08-18 | 2013-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности |
| EP2628792A1 (de) | 2012-02-17 | 2013-08-21 | Evonik Industries AG | Zelle mit verringerter ppGppase-Aktivität |
| EP2762571A1 (de) | 2013-01-30 | 2014-08-06 | Evonik Industries AG | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren |
| RU2013118637A (ru) | 2013-04-23 | 2014-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK |
| JP5831669B2 (ja) | 2013-05-13 | 2015-12-09 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2016165225A (ja) | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
| RU2013140115A (ru) | 2013-08-30 | 2015-03-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB |
| JP2016192903A (ja) | 2013-09-17 | 2016-11-17 | 味の素株式会社 | 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法 |
| RU2013144250A (ru) | 2013-10-02 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР |
| EP3053999B1 (en) | 2013-10-02 | 2019-11-20 | Ajinomoto Co., Inc. | Ammonia control apparatus and ammonia control method |
| BR112015005215B1 (pt) | 2013-10-21 | 2022-12-13 | Ajinomoto Co., Inc | Métodos para a produção de um l-aminoácido e para a produção de l-lisina |
| WO2015060391A1 (ja) | 2013-10-23 | 2015-04-30 | 味の素株式会社 | 目的物質の製造法 |
| RU2014105547A (ru) | 2014-02-14 | 2015-08-20 | Адзиномото Ко., Инк. | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL |
| RU2015120052A (ru) | 2015-05-28 | 2016-12-20 | Аджиномото Ко., Инк. | Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA |
| CN105316371B (zh) * | 2015-10-23 | 2018-08-14 | 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 | 一种用于提高色氨酸发酵产量的方法 |
| BR112018017227A2 (pt) | 2016-02-25 | 2019-02-05 | Ajinomoto Kk | método para produzir um l-aminoácido |
| BR112019000360A2 (pt) * | 2016-07-08 | 2019-04-24 | Evonik Degussa Gmbh | método e microrganismo geneticamente modificado para a produção de metionina ou sua forma análoga de hidróxi |
| JP7066977B2 (ja) | 2017-04-03 | 2022-05-16 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| EP3385275B1 (de) | 2017-04-07 | 2019-10-23 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur herstellung von aromatischen l-aminosäuren unter verwendung von verbesserten stämmen der familie enterobacteriaceae |
| JP7034496B2 (ja) * | 2017-08-07 | 2022-03-14 | 地方独立行政法人大阪産業技術研究所 | 芳香族化合物を産生する微生物 |
| EP3608409A1 (en) | 2018-08-09 | 2020-02-12 | Evonik Operations GmbH | Process for preparing l amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family |
| US11053526B2 (en) | 2018-08-09 | 2021-07-06 | Evonik Operations Gmbh | Process for preparing L amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family |
| WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
| BR112021014194A2 (pt) | 2019-02-22 | 2021-12-28 | Ajinomoto Kk | Método para a produção de um l-aminoácido |
| WO2020204179A1 (en) | 2019-04-05 | 2020-10-08 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing l-amino acids |
| WO2021060438A1 (en) | 2019-09-25 | 2021-04-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acids by bacterial fermentation |
| US20240229046A1 (en) * | 2021-05-18 | 2024-07-11 | Zymergen Inc. | Engineered biosynthetic pathways for production of deoxyhydrochorismic acid by fermentation |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5236831A (en) * | 1981-12-29 | 1993-08-17 | Kiowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Amino acid synthesis in corynebacteria using E. coli genes |
| DE3576523D1 (de) * | 1984-11-20 | 1990-04-19 | Ajinomoto Kk | Rekombinante dna enthaltende coryneformbakterien und verfahren zur herstellung von aromatischen aminosaeuren unter verwendung dieser bakterien. |
| DE3891417T1 (de) * | 1988-10-25 | 1991-01-10 | Vnii Genetiki Selektsii Promy | Stamm der bakterien escherichia coli bkiim b-3996, produziert von l-threonin |
| JPH02472A (ja) * | 1988-12-26 | 1990-01-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ―グルタミン酸の製造方法 |
| NZ238342A (en) * | 1990-06-04 | 1993-10-26 | Univ Notre Dame Du Lac | Preparation of beta-hydroxy-alphaamino acids useful as intermediates in the preparation of beta-lactam antibiotics |
| JP3880636B2 (ja) * | 1994-01-10 | 2007-02-14 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 |
| US5998178A (en) * | 1994-05-30 | 1999-12-07 | Ajinomoto Co., Ltd. | L-isoleucine-producing bacterium and method for preparing L-isoleucine through fermentation |
| ATE319834T1 (de) | 1994-09-16 | 2006-03-15 | Texas A & M Univ Sys | Mikroorganismen und verfahren zur überproduktion von dahp mittels klonierten ppsgens |
-
1996
- 1996-07-30 JP JP20086096A patent/JP4032441B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-08-27 PL PL96325155A patent/PL183472B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-08-27 HU HU9901198A patent/HU224895B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-08-27 US US09/011,762 patent/US6319696B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-27 DE DE69635493T patent/DE69635493T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-27 DK DK96927917T patent/DK0877090T3/da active
- 1996-08-27 WO PCT/JP1996/002399 patent/WO1997008333A1/ja active IP Right Grant
- 1996-08-27 SK SK235-98A patent/SK282611B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1996-08-27 EP EP96927917A patent/EP0877090B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-27 CN CN96197716A patent/CN1077139C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4032441B2 (ja) | 2008-01-16 |
| DE69635493D1 (de) | 2005-12-29 |
| JPH09121872A (ja) | 1997-05-13 |
| DK0877090T3 (da) | 2005-12-27 |
| PL325155A1 (en) | 1998-07-06 |
| SK23598A3 (en) | 1998-09-09 |
| CN1077139C (zh) | 2002-01-02 |
| HUP9901198A3 (en) | 2001-10-29 |
| EP0877090A1 (en) | 1998-11-11 |
| DE69635493T2 (de) | 2006-08-03 |
| EP0877090A4 (en) | 2001-04-18 |
| PL183472B1 (pl) | 2002-06-28 |
| US6319696B1 (en) | 2001-11-20 |
| HUP9901198A2 (hu) | 1999-07-28 |
| SK282611B6 (sk) | 2002-10-08 |
| EP0877090B1 (en) | 2005-11-23 |
| WO1997008333A1 (fr) | 1997-03-06 |
| CN1200150A (zh) | 1998-11-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU224895B1 (en) | Process for producing l-amino acids | |
| EP1092776B1 (en) | Method for producing L-amino acids by fermentation of an Escherichia strain which is transformed with a pyruvate carboxylase-encoding gene from Bacilus subtilis | |
| RU2230114C2 (ru) | Мутантная глутаминсинтетаза, фрагмент днк, штамм escherichia coli - продуцент l-глутамина и способ получения l-аминокислот | |
| KR100823044B1 (ko) | 트레오닌 및 이소류신의 제조방법 | |
| CA2175042C (en) | Method for production of substances using microorganisms with an increased productivity for nadph | |
| EP1740694B1 (en) | L-tryptophan-producing bacterium and a method for producing l-tryptophan | |
| EP0136359A1 (en) | Process for preparing l-histidine | |
| SK287800B6 (sk) | Spôsob výroby L-lyzínu | |
| KR100815041B1 (ko) | 아미노산 생산의 대사 공학 | |
| US5447857A (en) | Process for producing L-tryptophan | |
| US5563052A (en) | Process for producing L-tryptophan | |
| CA2328598A1 (en) | Microbial preparation of substances from aromatic metabolism/iii | |
| US20050106688A1 (en) | Method for producing L-amino acid | |
| EP1689876B1 (en) | L-threonine producing bacterium belonging to the genus escherichia and method for producing l-threonine | |
| US7220572B2 (en) | Method for producing L-leucine | |
| US5624828A (en) | Process for producing L-tryptophan in serine auxotrophic microorganisms belonging to the genus corynebacterium or brevabacterium | |
| US7256018B2 (en) | Microorganism producing L-threonine having inactivated tyrR gene, method of producing the same and method of producing L-threonine using the microorganism | |
| JP2000050894A (ja) | 発酵生産物の製造法及びストレス耐性微生物 | |
| BamHI | S kkkk I |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |