CN101273138A

CN101273138A - 产生l-氨基酸的细菌和用于产生l-氨基酸的方法

Info

Publication number: CN101273138A
Application number: CNA2006800356876A
Authority: CN
Inventors: 植田拓嗣; 城永佑志
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2005-09-27
Filing date: 2006-09-25
Publication date: 2008-09-24

Abstract

提供用于产生L－氨基酸的方法，所述方法包括：在培养基中培养具有产生L－氨基酸的能力并且经修饰而将β－糖苷PTS活性增强的肠杆菌科的微生物，和从所述培养基或细胞中收集L－氨基酸。

Description

产生L-氨基酸的细菌和用于产生L-氨基酸的方法

技术领域

本发明涉及使用微生物产生L-氨基酸的方法，更具体地，涉及用于产生L-氨基酸例如L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-谷氨酸等的方法。L-赖氨酸和L-苏氨酸通常用作动物饲料添加剂、保健食品成分、氨基酸浸剂(infusion)等，且L-谷氨酸通常用作调味品。因此，这些是工业上有用的L-氨基酸。

背景技术

在工业上采用发酵方法，使用短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)或埃希氏菌属(Escherichia)等的微生物生产L-氨基酸(EP0857784、0999267，1170358、JP11-192088A、WO00/53726、WO96/17930、WO03/04674)。野生型微生物、所述菌株的人工突变体和以通过重组DNA技术而将L-氨基酸生物合成酶的活性增强的方式修饰的微生物通常用于L-氨基酸的产生。

用于增强各种菌株产生L-氨基酸的能力的已知方法包括，修饰L-氨基酸的摄取(uptake)或输出(export)。例如，为了修饰摄取，通过缺失或减少细胞中的L-氨基酸摄取来增强产生L-氨基酸的能力。例如，一种方法是通过缺失gluABCD操纵子或该操纵子的一部分来缺失或减少L-谷氨酸的摄取(EP1038970)等。

用于修饰L-氨基酸输出的方法之一是缺失或减少L-氨基酸生物合成中间物的输出，而另一种方法是加强L-氨基酸的输出。对于前者，如果目标氨基酸是L-谷氨酸，已知方法是通过突变或破坏α-酮戊二酸通透酶基因，减少L-谷氨酸生物合成中的中间物α-酮戊二酸的输出(WO01/005959)。

为了缺失或减少L-氨基酸生物合成中间物的输出，已经报道了过量表达L-氨基酸输出的方法，例如，使用将L-赖氨酸或L-精氨酸输出基因(LysE)(Journal of Molecular Microbiology Biotechnology(J Mol Microbiol Biotechnol)1999Nov；1(2)：327-36)的表达增强的棒杆菌属微生物的细菌菌株来产生L-赖氨酸(WO97/23597)或L-精氨酸。另外，报道了使用埃希氏菌属的细菌产生L-氨基酸的方法，在所述细菌中表达rhtA、B和C基因(US6,303,348)或yfiK、yahN基因等(EP 1013765)。

除了如上所述修饰L-氨基酸生物合成途径和修饰L-氨基酸的摄取和输出，改进产生L-氨基酸能力的方法的其它实例是修饰摄取糖的能力。例如，磷酸烯醇丙酮酸：糖磷酸转移酶系统(在下文中也称作PTS：磷酸转移酶)是公知的摄取糖的转运体。另外，将PTS归类为非底物依赖性共有系统(commonsystem)EI(由ptsI编码)、HPr(由ptsH编码)，或底物特异性组分EII。葡萄糖特异性EII由ptsG和crr编码，其中crr基因与ptsH和ptsI一起是操纵子的一部分。用于产生L-氨基酸的一种已知方法使用将ptsG基因增强的埃希氏菌属(WO03/04670)，而另一种方法使用将ptsH、ptsI和crr基因增强的埃希氏菌属(WO03/04674)。

除了上述的葡萄糖PTS，已知bglF基因编码β-糖苷特异性磷酸转移酶(PTS)(Journal of Bacteriology，1999，Vol.18，No.2，p462-468，Biochemistry，1998，Vol.37，p17040-17047，Biochemistry，1998，Vol.37，p8714-8723)，但是尚未报道使用编码除葡萄糖PTS之外的PTS的基因用于产生L-氨基酸。

发明概述

本发明的目的是提供能够有效产生L-氨基酸的细菌菌株，并且提供使用所述细菌菌株产生L-氨基酸的方法。

为了解决上述问题，已经发现使用经修饰而增加β-糖苷PTS活性的属于肠杆菌科(family Enterobacteriaceae)的微生物能够有效地产生L-氨基酸。

即，本发明如下：

本发明的目的是提供产生L-氨基酸的方法，所述方法包括：在培养基中培养肠杆菌科的微生物，所述微生物具有产生L-氨基酸的能力并且经修饰以使β-糖苷PTS活性增强；和从所述培养基或细胞中收集L-氨基酸。

本发明的目的是提供上述方法，其中通过增加基因的拷贝数，或修饰所述基因的表达调节序列，或它们的组合对所述微生物进行修饰以增强编码β-糖苷PTS的bglF基因的表达。

本发明的目的是提供上述方法，其中所述bglF基因选自下组：

(a)包含SEQ ID No.5的核苷酸序列的DNA，

(b)在严紧条件下与SEQ ID No.5的核苷酸序列的互补序列或与能够从所述核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，并且所述DNA编码具有β-糖苷PTS活性的蛋白质。

本发明的目的是提供上述方法，其中所述微生物是埃希氏菌属或泛菌属(Pantoea)的细菌。

本发明的目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸选自下组：L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酸和它们的组合。

附图简述

图1显示质粒pMW118-attL-Tc-attR的构建。

图2显示质粒pMW118-attL-Cm-attR的构建。

图3显示质粒pMW-intxis-ts的构建。

优选实施方式详述

在下文中，将对本发明进行详细说明。

<1>本发明的微生物

本发明的微生物是肠杆菌科的微生物，其具有产生L-氨基酸的能力，并且经修饰以增强β-糖苷PTS活性。短语“产生L-氨基酸的能力”的意思是当在培养基中培养本发明的微生物时，在培养基或所述微生物的细胞中产生和引起L-氨基酸积累的能力。本发明的微生物可具有产生多种L-氨基酸的能力。所述微生物可能天然具有产生L-氨基酸的能力，或可通过诱变或重组DNA技术进行修饰以赋予产生L-氨基酸的能力，例如下文所述的那些。

L-氨基酸的类型无具体限制。L-氨基酸的实例包括：碱性L-氨基酸例如L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸和L-瓜氨酸(L-citrulline)；脂肪族L-氨基酸例如L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-甘氨酸；羟基L-氨基酸例如L-苏氨酸和L-丝氨酸；环状L-氨基酸例如L-脯氨酸；芳族L-氨基酸例如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸；含硫L-氨基酸例如L-半胱氨酸、L-胱氨酸和L-甲硫氨酸；和酸性L-氨基酸例如L-谷氨酸、L-天冬氨酸；酸性L-氨基酸的酰胺例如L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺等。本发明的微生物可具有产生两种或多种氨基酸的能力。

<1-1>赋予产生L-氨基酸的能力

以下实例包括对赋予产生L-氨基酸能力的方法的描述，以及能够用于本发明的被赋予产生L-氨基酸能力的微生物的实例。本发明的微生物不限于这些，只要它们具有产生L-氨基酸的能力，则可以是任何微生物。

对用于本发明的微生物无具体限制，只要其属于肠杆菌科，例如埃希氏菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)、摩根氏菌属(Morganella)等，并且其具有产生L-氨基酸的能力。具体地，可以使用属于如NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库中分类的肠杆菌科的任何微生物(http://www.genome.ad.jp/dbget-bm/get_htext？Organisms+-e+L+A+-s+F+-f+F+A2_A#L2)。

作为能够被修饰的肠杆菌科的亲本菌株，特别期望使用属于埃希氏菌属、肠杆菌属或泛菌属的细菌。

对于用以获得本发明的细菌的埃希氏菌属细菌的亲本菌株不进行具体限制，但可以使用Neidhardt等所列的菌株(Neidhardt，F.C.et al.，Escherichia coliand Salmonella Typhimurium，American Society for Microbiology，Washington，D.C.，1029表1)。一个实例是大肠杆菌。大肠杆菌的具体实例是大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等，其是源自K12的野生型菌株的原型(prototype)。

这些可以从例如美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection (地址：P.O.Box 1549Manassas，VA 20108，USA))获得。它们可以通过使用给予每个菌株的登录号来获得(参见http:/www.atcc.org)。所述登录号相应于每个细菌菌株，并且列于美国典型培养物保藏中心的目录。

肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。泛菌属细菌的实例是Pantoea ananatis。在近几年中，基于16S rRNA核苷酸序列分析，有时将成团肠杆菌重分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis和斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。对于本发明，可以使用归类在肠杆菌科中的任何细菌，无论属于肠杆菌属或泛菌属。菌株Pantoea ananatis AJ13355(FERM BP-6614)、AJ13356(FERMBP-6615)、AJ13601(FERM BP-7207)或它们的任何衍生物可用于通过基因工程方法培育Pantoea ananatis。在分离时，将这些菌株鉴定并且保藏为成团肠杆菌。如上所述，通过使用16S rRNA核苷酸序列的分析，已将这些细菌重分类为Pantoea ananatis。对于本发明，可以使用属于肠杆菌属或泛菌属的任何细菌，只要所述细菌归类于肠杆菌科中。

下文将描述用于将产生L-氨基酸的能力赋予属于肠杆菌科的微生物的方法。

为了赋予产生L-氨基酸的能力，可以获得营养缺陷突变体、类似物抗性菌株或代谢调节突变体，或可以产生将L-氨基酸生物合成酶的表达增强的重组菌株。也可使用在棒状杆菌型细菌(coryneform bacteria)或埃希氏菌属细菌的培育中常规使用的方法(参见“Amino Acid Fermentation”，Gakkai ShuppanCenter(Ltd.)，1st Edition，published May 30，1986，pp.77-100)。在本文中，在产生L-氨基酸的细菌的培育中，可赋予一种或多种性质，例如营养缺陷突变、类似物抗性或代谢调节突变。也可使用将一种或多种L-氨基酸生物合成酶的表达的增强。另外，可以将赋予性质与增强生物合成酶的活性组合进行，所述性质例如营养缺陷突变、类似物抗性或代谢调节突变。

具有产生L-氨基酸的能力的营养缺陷突变体菌株、L-氨基酸类似物抗性菌株或代谢调节突变体菌株可如下获得：对亲本或野生型菌株施以常规突变处理，例如用X-射线或UVB照射处理，或用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍处理等；其后选择显示营养缺陷突变、类似物抗性或代谢调节突变并且还具有产生L-氨基酸的能力的那些菌株。

L-赖氨酸类似物抗性菌株或代谢调节突变体的实例包括但不限于，大肠杆菌AJ11442菌株(FERM BP-1543、NRRL B-12185、JP56-18596A和美国专利No.4,346,170)、大肠杆菌VL611菌株(EP1016710A)等。也可以使用大肠杆菌WC196菌株(WO96/17930)作为产生L-赖氨酸的细菌。通过将AEC(S-(2-氨乙基)-半胱氨酸)抗性赋予源自大肠杆菌K-12的W3110菌株来培育WC196菌株。将这种菌株命名为大肠杆菌AJ13069，并且在1994年12月6日以登录号FERM P-14690保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(the NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology of the Agency of IndustrialScience and Technology)(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)；Chuo 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan)，并且根据布达佩斯条约(BudapestTreaty)在1995年9月29日转为国际保藏，并给予登录号FERM BP-5252。

也可通过增加L-赖氨酸生物合成酶活性来构建产生L-赖氨酸的细菌。编码L-赖氨酸生物合成酶的基因的实例是二氢吡啶二羧酸合酶基因(dapA)(EP0733710B)、天冬氨酸激酶基因(lysC)(EP 0733710、US5,932,453)、二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)(WO96/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)(JP60-87788A)、天冬氨酸氨基转移酶基因(aspC)(JP6-102028A)、二氨基庚二酸差向异构酶基因(dapF)(WO00/56858)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)(WO00/61723)和二氨基庚二酸途径酶的其它基因；以及高乌头酸水合酶基因(JP2000-157276)和氨基己二酸途径酶的其它基因。这些基因的缩写在各自名称之后的括号内给出。

此外，已知野生型二氢吡啶二羧酸合酶(DDPS)和天冬氨酸激酶(AK)受到L-赖氨酸反馈抑制的阻抑；因此，当使用dapA和lysC时，优选分别使用编码对L-赖氨酸反馈抑制有抗性的二氢吡啶二羧酸合酶和天冬氨酸激酶的突变基因(EP 0733710、US5,932,453)。

编码对L-赖氨酸反馈抑制有抗性的突变二氢吡啶二羧酸合酶的DNA的实例包括编码具有以下氨基酸序列的DDPS的DNA，在所述氨基酸序列中用酪氨酸取代第118位的组氨酸残基(U.S.5,661,012和6,040,160)。另外，编码对L-赖氨酸反馈抑制有抗性的突变AK的DNA的实例包括编码具有以下氨基酸序列的AK的DNA，在所述氨基酸序列中用异亮氨酸取代352-苏氨酸残基(U.S.5,661,012和6,040,160)。这些突变DNA能够通过使用PCR的定点诱变等获得。

以下是通过将编码L-赖氨酸生物合成酶的基因引入宿主中来赋予产生L-赖氨酸的能力的实例。即，通过将编码L-赖氨酸生物合成基因的基因片段与在用于产生L-赖氨酸的宿主微生物中发挥功能的载体连接来制备重组DNA，所述载体优选是多拷贝型载体，并且使用这种重组DNA来转化所述宿主。通过所述转化，在宿主细胞中编码L-赖氨酸生物合成酶的基因的拷贝数增加，使表达增强并且从而增加酶活性。

不具体指定编码L-赖氨酸生物合成酶的基因，只要它们能够在宿主微生物中表达。实例包括源自大肠杆菌的基因，和源自棒状杆菌型细菌的基因。由于大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的全基因组序列已经确定，所以能够基于这些基因的核苷酸序列合成引物，并且使用PCR方法获得这些基因，在所述PCR方法中将微生物(例如大肠杆菌K12)的染色体DNA等用作模板。

为了克隆这些基因，可以使用在肠杆菌科中自主复制的质粒。实例包括pBR322、pTWV228(Takara Bio Inc.)、pMW119(Nippon Gene Co.，Ltd.)、pUC19、pSTV29(Takara Bio Inc.)、RSF1010(Gene vol.75(2)，pp.271-288，1989)等。此外，也可使用噬菌体DNA的载体。

为了将靶基因连接至上述载体，将载体用限制酶消化，所述限制酶与含有靶基因的DNA片段末端匹配。连接通常用连接酶例如T4DNA连接酶进行。靶基因可能分别存在于不同的载体上，或存在于相同的载体上。可以使用本领域技术人员已知的常规方法来消化和连接DNA，以及制备染色体DNA、进行PCR、制备质粒DNA、转化、确定用作引物的寡核苷酸等。这些方法在Sambrook，J.，and Russell，D.W.Molecular Cloning A Laboratory Manual/ThirdEdition.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)等中描述。可以使用达到充分转化效率的任何方法将如上所述制备的重组DNA引入微生物。实例包括电穿孔(Canadian Journal of Microbiology，43，197(1997))。使用电穿孔制备的质粒的实例是pCABD2，所述质粒含有dapA、dapB和LysC基因(WO01/53459)。

也可通过将靶基因的多拷贝引入微生物的染色体DNA来实现增强编码L-赖氨酸生物合成酶的基因的表达。可通过使用以多拷贝存在于所述染色体DNA上的序列作为同源重组中的靶来将靶基因的多拷贝引入微生物的染色体DNA中。对这种以使用同源重组的基因取代为基础位点特异性地引入突变已有描述。已经描述使用线性DNA或含有温度敏感复制起点的质粒的方法(美国专利6,303,383和5,616,480)。可以使用重复DNA和存在于可转座元件末端的反向重复序列作为以多拷贝存在于染色体DNA上的序列。可将L-赖氨酸生物合成基因与天然存在于染色体上的基因串联(in tandem)连接，或可将其引入染色体上的非必需区或引入如果缺失将使L-赖氨酸产率得到改进的基因区。

此外，如US5,595,889中披露，还可将靶基因定位于转座子上，其后转移所述转座子以将多拷贝引入染色体DNA。用任一方法，将转化体中靶基因的拷贝数增加，从而使L-赖氨酸生物合成的酶活性增加。

除了上述基因扩增外，可通过用较强的启动子取代靶基因的表达调节序列(如启动子等)来实现L-赖氨酸生物合成酶活性的增加(参见JP1-215280A)。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子和tet启动子是公知的强启动子。使用这些启动子取代使靶基因的表达增加，由此增强酶活性。强启动子的实例和用于评估启动子强度的方法的实例在Goldstein等的文章等中描述(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1，105-128)。

也可通过修饰在靶基因表达的调节中涉及的元件来实现L-赖氨酸生物合成酶活性的增加，所述元件例如操纵基因或阻抑物(Hamilton et al，；J Bacteriol.1989Sep；171(9)：4617-22)。如WO 00/18935中披露，能够在靶基因启动子的-35、-10区中引入几个碱基的取代以修饰和增强所述基因。另外，已知在核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔区中，特别在起始密码子的紧邻上游序列中取代几个核苷酸，对mRNA翻译效率具有强烈的影响。能够通过启动子探针载体和基因分析软件(例如GENETYX)等确定靶基因启动子的表达调节区等。例如，能够以与上述使用温度敏感质粒的基因取代相同的方式进行表达调节序列的取代。也可使用Red-驱动整合方法(Red-driven integrationmethod(WO2005/010175))。

此外，在本发明的产生L-赖氨酸的细菌中，可将下述酶的活性减少或缺失：催化从L-赖氨酸生物合成途径分支的L-赖氨酸之外化合物产生的酶，或对L-赖氨酸的产生具有负效应的酶。这些酶包括高丝氨酸脱氢酶(thrA)、赖氨酸脱羧酶(cadA、lysC)和苹果酸酶(sfcA、b2463)。在WO 95/23864、WO96/17930、WO2005/010175等中提供酶活性减少或缺陷的菌株。

为了在细胞中减少或缺失所述酶活性，可使用常规和已知的方法，对编码上述酶的基因进行诱变。这可以通过如下方法实现：例如，使用遗传重组来缺失在染色体上编码酶的基因，或修饰启动子或Shine-Dalgarno(SD)序列等表达调节序列。这也可通过如下方法实现：在染色体上编码酶的区中引入氨基酸取代(错义突变)或终止密码子(无义突变)，引入添加或缺失1-2个碱基的移码突变，或缺失基因的部分或完整区(Journal of Biological Chemistry272：8611-8617(1997)；Journal ofAntimicrobial Chemotherapy 200 46，793-796；Biotechnol Prog 1999，15，58-64；J.Biological Chemistry vol 272 NO.13pp8611-8617)。同样，通过如下方法将酶活性减少或缺失：构建缺失编码区的编码突变酶的基因，其后通过同源重组等用这种基因取代染色体上的野生型基因，或将转座子或IS元件引入所述基因。

可以使用以下方法通过遗传重组来引入使上述酶活性减少或缺失的突变。将含有靶基因的分离的DNA突变，以使所得突变基因不产生正常发挥功能的酶。随后，使用含有所述基因的DNA，将这种突变基因转化至属于肠杆菌科的微生物中，并且产生突变型基因与染色体上基因的重组。对于使用这种同源重组的基因取代，存在使用线性DNA的方法，例如称为“Red-驱动整合”的方法(Proe.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，pp.6640-6645)，或将Red-驱动整合方法与λ噬菌体切除系统(λphage excisive system)组合的方法(J.Bacteriol.2002 Sep；184(18)：5200-3，Interactions between integrase andexcisionase in the phageλexcisive nucleoprotein complex.Cho EH，Gumport RI，Gardner JF)(参见WO2005/010175)等；还存在使用含有温度敏感复制起点的质粒的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，pp.6640-6645、美国专利No.6,303,383或5,616,480)。这种如上所述使用同源重组通过基因取代位点特异性地引入突变也可使用在宿主中不具有复制能力的质粒进行。

上述用于增加L-赖氨酸生物合成中涉及的酶活性的方法和用于减少酶活性的方法同样可以用来培育产生其它L-氨基酸的细菌。以下将说明用来培育其它L-氨基酸细菌的方法。

作为本发明中使用的产生L-谷氨酸的细菌，存在例如属于肠杆菌科的微生物，所述微生物经修饰而将编码L-谷氨酸生物合成中涉及的酶的基因的表达增加。L-谷氨酸生物合成中涉及的酶包括谷氨酸脱氢酶(gdh)、谷氨酰胺合成酶(gltAB)、谷氨酸合酶(glnA)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、乌头酸水合酶(acn)、柠檬酸合酶(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸羧化酶(pycA)、丙酮酸脱氢酶(pdhA)、丙酮酸激酶(pykA)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(pps)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgm)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)、丙糖磷酸异构酶(tpi)、果糖二磷酸醛缩酶(fba)、磷酸果糖激酶(pfk)、葡糖磷酸异构酶(gpi)等。在这些酶之中，柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、谷氨酸脱氢酶和它们的组合是优选的，并且使用全部三种是更优选的。

使用上述方法修饰而将柠檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达增强的属于肠杆菌科的微生物的实例在美国专利Nos.6,197,559和6,331,419、EP0999282、WO2006/051660中提供。

此外，还可以使用经修饰而将6-磷酸葡糖酸脱水酶或2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶中任一的活性增加或将二者的活性都增加的属于肠杆菌科的微生物(EP1352966B)。

可以使用的具有产生L-谷氨酸能力的肠杆菌科微生物包括下述细菌，在所述细菌中，将催化L-谷氨酸之外化合物的产生的酶活性减少或降低，而所述化合物的产生从L-谷氨酸的生物合成途径分支。催化从L-谷氨酸生物合成途径分支的除L-谷氨酸之外的化合物产生的酶的实例是2-酮戊二酸脱氢酶(sucA)、异柠檬酸裂合酶(aceA)、乙酰羟酸合酶(ilvG)、乙酰乳酸合酶(ilvN)、甲酸乙酰转移酶(pflB)、乳酸脱氢酶(ldh)、谷氨酸脱羧酶(gadA)和1-吡咯啉脱氢酶(1-pyrroline dehydrogenase)(putA)等。在这些之中，特别优选减少或缺失2-酮戊二酸脱氢酶的活性。

用于在属于肠杆菌科的微生物中缺失或减少2-酮戊二酸脱氢酶的活性的方法在美国专利5,573,945、美国专利No.6,197,559和美国专利No.6,331,419中描述。将2-酮戊二酸脱氢酶活性缺失或减少的属于肠杆菌科的微生物的实例包括以下：

Pantoea ananatis AJ 13601(FERM BP-7207)

植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)AJ13410菌株(FERM BP-6617)

大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)

等等。

AJ12949菌株是将α-酮戊二酸脱氢酶活性减少的细菌菌株，并且在1993年12月28日以登录号FERM P-14039保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(Chuo 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan)，并且根据布达佩斯条约在1994年11月11日转为国际保藏，并给予登录号FERMBP-4881。

本发明中优选使用的产生L-色氨酸的细菌是以下酶中一种或多种的活性增强的细菌：即邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)或色氨酸合酶(trpAB)。由于邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶均受到L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，能够通过保留(retain)脱敏的突变酶来增加这些酶的活性(US5,618,716、US 6,180,373)。例如，通过将邻氨基苯甲酸合酶基因(trpE)和/或磷酸甘油酸脱氢酶基因(serA)突变以防止反馈抑制，再将所述突变基因引入属于肠杆菌科的微生物，可获得具有脱敏的酶的细菌。这种细菌的具体实例是大肠杆菌SV164，所述细菌保留脱敏的邻氨基苯甲酸合酶，并且用具有突变serA的质粒pGH5转化所述细菌，所述突变的serA编码脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶(WO94/08301)。

用含有色氨酸操纵子的重组DNA转化的细菌也是优选的产生L-色氨酸的细菌。具体实例是用含有编码脱敏邻氨基苯甲酸合酶(trpAB)的基因的色氨酸操纵子转化的大肠杆菌(Japanese Patent Application Publication No.JP57-71397、Japanese Patent Application Publication No.JP 62-244382、美国专利No.4,371,614)。另外，在色氨酸操纵子中，能够通过增加编码色氨酸合酶的基因(trpBA)的表达来增强产生L-色氨酸的能力。色氨酸合酶含有分别由trpA和trpB编码的α和β亚基(WO2005/103275)。

产生L-色氨酸的细菌的实例是生长需要L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的大肠杆菌AGX17(pGX44)[NRRL B-12263]，和保留包含色氨酸操纵子的质粒pGX50的AGX6(pGX50)aroP[NRRL B-12264](参见美国专利No.4,371,614)。

缺乏色氨酸操纵子阻抑物(trpR)的菌株和具有突变trpT的菌株也是理想的产生L-色氨酸的细菌(美国专利No.4,371,614WO2005/056776)。

其它优选的产生L-色氨酸的细菌是结构性表达苹果酸合酶(aceB)、异柠檬酸裂合酶(aceA)和异柠檬酸脱氢酶/磷酸酶(icl)操纵子(ace操纵子)的细菌，或将所述操纵子的表达增强的细菌(WO2005/103275)。

L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸均为芳族氨基酸，并且共享生物合成系统。编码芳族氨基酸生物合成酶的基因的实例包括脱氧阿拉伯-庚酮糖酸磷酸合酶(deoxyarabino-heptulosonate phosphate synthase)(aroG)、3-脱氢奎宁酸合酶(aroB)、莽草酸脱水酶、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇丙酮酰莽草酸[-]3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate[-]3-phosphate synthase)(aroA)和分支酸合酶(aroC)(European Patent Application Publication No.763127)。因此，通过将编码这些酶的基因多重拷贝(multi-copy)至质粒或基因组上，能够改进产生芳族氨基酸的能力。已知这些基因由酪氨酸抑制子(tyrR)调控，所以也可通过缺失tyrR基因来增加芳族氨基酸的生物合成酶活性(EP763127)。

产生L-苏氨酸的细菌优选是属于肠杆菌科的微生物，其中已将所述L-苏氨酸生物合成酶增强。编码L-苏氨酸生物合成酶的基因的实例包括天冬氨酸激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、编码thr操纵子的天冬氨酸激酶I基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)和苏氨酸合酶基因(thrC)。这些基因的缩写在它们的名称之后的括号内给出。可引入这些基因中的两种以上。可将L-苏氨酸生物合成基因引入已将苏氨酸降解阻抑的埃希氏菌属的细菌。已将苏氨酸降解阻抑的埃希氏菌属的细菌实例包括将苏氨酸脱氢酶活性缺失的TDH6菌株(Japanese Patent Application Publication No.2001-346578)等等。

某些L-苏氨酸生物合成酶的活性受产生的L-苏氨酸抑制。因此，为了构建产生L-苏氨酸的细菌，优选对L-苏氨酸生物合成酶进行修饰以使所述酶不受到L-苏氨酸的反馈抑制。上述thrA、thrB和thrC基因组成苏氨酸操纵子，所述操纵子以弱化子(attenuator)结构的形式存在。苏氨酸操纵子的表达受到培养中存在的异亮氨酸和苏氨酸的抑制，并且使表达减弱。可通过去除弱化区中的前导序列或弱化子来实现苏氨酸操纵子的这种修饰(WO 02/26993；Biotechnology Letters Vol.24，No.21，November 2002；WO2005/049808)。

可将位于苏氨酸操纵子上的天然启动子用非天然启动子取代(WO98/04715)。或者，可构建苏氨酸操纵子而使苏氨酸生物合成中涉及的基因的表达受到λ噬菌体的阻抑物和启动子的调控(EP0593792)。同样，为了防止L-苏氨酸的反馈抑制，对埃希氏菌属细菌的修饰也可通过选择α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)抗性的细菌菌株来获得(JP45026708B)。

经修饰以防止L-苏氨酸的反馈抑制的苏氨酸操纵子优选在宿主中具有增加的拷贝数或连接至强启动子。除了使用质粒扩增所述基因的拷贝数，还可通过使用转座子、Mu噬菌体等在染色体上引入苏氨酸操纵子来增加基因的拷贝数。

对于天冬氨酸激酶III基因(lysC)，期望的是使用经修饰的基因以防止L-赖氨酸的这种反馈抑制。能够使用在美国专利No.5,932,453中描述的方法获得经修饰以防止反馈抑制的lysC基因。

除了L-苏氨酸生物合成酶，期望的是将糖酵解系统、TCA循环和呼吸链中涉及的基因、调控基因表达的基因和诱导糖摄取的基因增强。在L-苏氨酸产生中有效的这些基因的实例包括转氢酶基因(pntAB)(EP733712)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)(WO 95/06114)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(EP877090)、棒状杆菌型细菌或芽孢杆菌属(Bacillus)细菌中的丙酮酸羧化酶基因(WO99/18228、EP 1092776)。

还优选增强赋予对L-苏氨酸的抗性的基因和赋予对L-高丝氨酸的抗性的基因的表达，或赋予宿主L-苏氨酸抗性和L-高丝氨酸抗性。这些基因的实例是rhtA基因(Res Microbiol.2003Mar；154(2)：123-35)、rhtB基因(EP0994190)、rhtC基因(EP1013765)和yfiK、yeaS基因(EP1016710)。对于赋予宿主L-苏氨酸抗性，参考European Patent Application Publication No.0994190、WO90/04636。

产生L-苏氨酸的细菌另外的实例是大肠杆菌VKPM B-3996菌株(美国专利No.5,175,107)。这种VKPM B-3996菌株在1987年11月19日以登录号VKPM B-3996保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(the Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms)(VKPM)，GNII Genetika。此外，VKPMB-3996菌株保留质粒pVIC40(WO90/04636)，所述质粒pVIC40通过将苏氨酸生物合成基因(苏氨酸操纵子：thrABC)插入包含链霉素抗性标记的广宿主(wide-host)载体质粒pAY32中而获得(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.，Plasmid，1986，16，161-167)。在这种pVIC40中，已将L-苏氨酸对苏氨酸操纵子中thrA编码的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的反馈抑制脱敏。

进一步的实例是大肠杆菌B-5318菌株(参见European Patent No.0593792)。B-5318菌株在1990年5月3日以登录号VKPM B-5318保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，GNII Genetika(Russia，117545Moscow，1 Dorozhny Proezd，1)。这种VKPM B-5318菌株是异亮氨酸非营养缺陷型菌株，并且保留重组质粒DNA，将所述重组质粒DNA构建成使苏氨酸生物合成中涉及的基因，即将弱化子区和天然转录调节区缺失的苏氨酸操纵子位于λ噬菌体温度敏感CI阻抑物、PR启动子和λ噬菌体的Cro蛋白N末端的下游，并且苏氨酸生物合成中涉及的所述基因的表达由所述λ噬菌体阻抑物和启动子调控。

在本发明中使用的优选的L-组氨酸的实例包括：大肠杆菌FERM P-5038和5048菌株，其含有的载体中并入了L-组氨酸生物合成中涉及的基因信息(JP56-005099A)；引入了氨基酸输出基因Rht的细菌菌株(EP1016710)；对磺胺胍(sulfaguanidine)、D，L-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和链霉素具有抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，Russian Patent Publication No.2119536)等。

可使用表达L-组氨酸生物合成途径酶的编码基因的微生物来产生L-组氨酸。L-组氨酸生物合成酶的实例是ATP磷酸核糖转移酶(hisG)、磷酸核糖AMP环化水解酶(hisI)、磷酸核糖-ATP焦磷酸水解酶(hisIE)、磷酸核糖亚胺甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核苷酸异构酶(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazolecarboxamide ribotide isomerase)(hisA)、酰胺转移酶(hisH)、磷酸组氨醇氨基转移酶基因(hisC)、组氨醇磷酸酶基因(hisB)和组氨醇脱氢酶基因(hisD)等。

优选的本发明产生L-半胱氨酸的细菌是将胱硫醚β-裂合酶活性减少的细菌(JP2003-169668)，和保留丝氨酸乙酰转移酶的埃希氏菌属细菌，所述丝氨酸乙酰转移酶具有减少的L-半胱氨酸反馈抑制(JP11-155571)。

优选的本发明产生L-脯氨酸的细菌包括大肠杆菌702(VKPM B-8011)，其对3，4-脱羟基脯氨酸和氮杂环丁烷-2-羧酸(azetidine-2-carboxylate)有抗性，和702ilvA (VKPM B-8012菌株)，其缺乏ilvA并且源自702(JP2002-300874A)。

产生L-苯丙氨酸的细菌的实例包括具有tyrA、tyrR缺陷的AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPM B-8197)，和具有扩增的编码苯丙氨酸输出蛋白的基因例如yddG和yedA的菌株。

产生L-精氨酸的细菌的实例包括对α-甲基甲硫氨酸、p-氟苯丙氨酸、D-精氨酸、精氨酸氧肟酸、S-(2-氨乙基)-半胱氨酸、α-甲基丝氨酸(α-methyleserine)、β-2-噻吩丙氨酸或磺胺胍有抗性的大肠杆菌突变菌株(JP56-106598)等。大肠杆菌237菌株是产生L-精氨酸的细菌，所述细菌具有对L-精氨酸的反馈抑制有抗性的突变体并且保留高活性的N-乙酰谷氨酸合酶，并且其也是优选的产生L-精氨酸的菌株(EP1170361B)。所述编号为VKPMB-7925的菌株在2000年4月10日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，GNII Genetika，并且根据布达佩斯条约在2001年5月18日转化成国际保藏。也可以使用大肠杆菌382菌株，其是237菌株的衍生物并且是产生L-精氨酸的细菌，所述细菌具有改进的乙酸同化能力(US6,841,365)。编号为VKPM B-7926的大肠杆菌382菌株在2000年4月10日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)。

同样，作为具有产生L-精氨酸能力的微生物，可以使用具有改进的基因表达的微生物，所述基因编码L-精氨酸生物合成中涉及的酶。L-精氨酸生物合成酶的实例包括N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰-谷氨酰-磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸氨基转移酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(argF)、精氨琥珀酸合酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)和氨甲酰磷酸合酶(carAB)，和它们的组合。在每种酶名称之后，在圆括号内提供编码该酶的基因的名称。期望的是使用N-乙酰谷氨酸合酶基因(argA)的突变，其中通过取代对应于野生型中位置15-19的氨基酸序列将L-精氨酸反馈抑制去除(EP EP1170361)。

可以使用的产生L-亮氨酸的细菌包括：大肠杆菌属的细菌，在所述细菌中将由ilvE基因编码的支链氨基酸氨基转移酶失活，并且将由tyrB基因编码的芳族氨基酸氨基转移酶的活性增强(EP1375655A)；大肠杆菌H-9068菌株(ATCC21530)，所述菌株对4-氮亮氨酸或5，5，5-三氟亮氨酸有抗性；大肠杆菌H-9070菌株(FERM BP-4704)；大肠杆菌H-9072菌株(FERM BP-4706)(美国专利No.5,744,331)；大肠杆菌菌株，在所述菌株中将L-亮氨酸对异丙基苹果酸合酶的反馈抑制脱敏(European Patent No.1067191)；大肠杆菌AJ11478菌株，所述菌株对β-2噻吩丙氨酸和β-羟亮氨酸有抗性(美国专利No.5,763,231)，等等。

产生L-异亮氨酸的细菌包括：6-二甲基氨基嘌呤抗性的大肠杆菌突变菌株(JP 5-304969A)、L-异亮氨酸氧肟酸抗性的大肠杆菌突变菌株(JP5-130882A)、硫代异亮氨酸抗性的(thiaisoleucine-resistant)大肠杆菌突变菌株(JP5-130882A)、DL-乙基硫氨酸抗性的大肠杆菌突变菌株(JP5-130882A)和精氨酸氧肟酸抗性的突变菌株(JP5-130882A)，所述全部菌株均具有产生L-异亮氨酸的能力。埃希氏菌属的重组细菌的实例是以下细菌菌株，在所述菌株中将编码L-异亮氨酸生物合成酶苏氨酸脱氨基酶或乙酰羟酸合酶的基因的表达增加(JP2-458A，JP2-42988A，JP 8-47397A)，等等。

用于衍生本发明产生L-缬氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括但不限于，经修饰而过量表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利No.5,998,178)。期望的是将ilvGMEDA操纵子中弱化所需的区去除，从而使所述操纵子的表达不被L-缬氨酸弱化。此外，期望地将操纵子中的ilvA基因破坏，以使苏氨酸脱氨基酶活性减少。

用于衍生本发明产生L-缬氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括在氨基-酰基t-RNA合成酶中具有突变的突变体(美国专利No.5,658,766)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970，其在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。大肠杆菌VL1970已经在1988年6月24日以登录号VKPM B-4411保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia，113545Moscow，1Dorozhny Proezd，1)。

此外，生长需要硫辛酸(lipoic acid)和/或缺乏H+-ATP酶的突变体也可用作亲本菌株(WO96/06926)。

在本发明中使用的产生L-氨基酸的细菌中，除编码天然生物合成酶的基因之外，可将糖摄取、糖代谢(糖酵解系统)和能量代谢中涉及的基因增强。

糖代谢中涉及的基因的实例是编码摄取糖的糖酵解酶或蛋白的基因，例如编码葡糖-6-磷酸异构酶的基因(pgi；WO01/02542)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)、磷酸葡糖变位酶基因(pgm；WO03/04598)、果糖二磷酸醛缩酶基因(fba；WO03/04664)、丙酮酸激酶基因(pykF；WO03/008609)、转醛醇酶(transaldolase)基因(talB；WO03/008611)、延胡索酸酶基因(fum；WO01/02545)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps；EP877090)、非-PTS蔗糖摄取系统基因(csc；EP149911)和蔗糖同化基因(scrAB操纵子；WO90/04636)。

能量代谢中涉及的基因的实例包括转氢酶基因(pntAB；美国专利No.5,830,716)和细胞色素bo型氧化酶基因(cyoABCD；EP1070376)。

<1-2>用于增加β-糖苷PTS的活性的方法

能够通过修饰如上所述具有产生L-氨基酸的能力并且属于肠杆菌科的微生物，以增加β-糖苷PTS的酶活性从而获得本发明的微生物。然而，可以在增加β-糖苷PTS的酶活性的修饰之后赋予产生L-氨基酸的能力。能够通过修饰编码β-糖苷PTS的bglF基因的表达来实现β-糖苷PTS的酶活性的增加(稍后描述)。这可以是通过修饰表达调节区(包括启动子修饰)使内源bglF基因表达增加；或这可以是通过引入含有bglF基因的质粒，通过扩增染色体上的bglF基因来增加拷贝数等使外源bglF基因表达增加。另外，可以采用这些技术的组合。

本发明中的β-糖苷PTS指将糖摄取至细胞质中，同时将磷酸烯醇丙酮酸(此后称为PEP)中的磷酸基团转移至β-糖苷的通透酶活性。在本文中，β-糖苷是以β-D-葡萄糖作为糖组分的糖苷，例如，与水杨醇糖苷连接(glucoside-linked)的水杨苷，或糖苷连接至氢醌(hydroquinone)的熊果苷(arbutin)，并且通常意指糖衍生物，在所述糖衍生物中多种化合物例如醇、酚、花色素苷(anthocyanin)等连接至β-D-葡萄糖的还原基团。本发明的β-糖苷PTS还可发挥转移磷酸基团的功能，不仅是转移至β-糖苷，还同时转移至葡萄糖。(E.coli & Salmonella2nd Edition American society for Microbiology)。

能够通过使用Chen等的方法体外测试磷酸化活性来确认β-糖苷PTS的酶活性的增加(Biochemistry 199837：8714-8723)(EC 2.7.1.69)。当与亲本菌株例如野生菌株或未经修饰的菌株比较时，也能够通过与所述野生型或未经修饰的菌株比较bglF的mRNA量来确认bglF表达的增强。Northern杂交和RT-PCR也可用来确认表达(Molecular Cloning(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor(USA)，2001))。只要活性与野生型或未经修饰的菌株相比增加，对酶活性的增加程度不进行限制，但是期望的是，例如是野生或未经修饰的菌株的1.5或更多倍，优选2或更多倍，或更优选3或更多倍。如果靶蛋白量相对于未经修饰的或野生型菌株增加，则能够确认酶活性的增加。这能够通过例如使用抗体的Western印迹来检测(Molecular Cloning(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold spring Harbor(USA)，2001))。

本发明的bglF基因是埃希氏菌属细菌的bglF基因和它们的同源物。例如，大肠杆菌的bglF基因编码具有SEQ ID No.6的氨基酸序列的蛋白质。所述基因登记为Genbank NP_418178，而W3110的序列登记为GenbankPTV3B_ECOLI[P08722]，二者均与SEQ ID NO.5相同。大肠杆菌的bglF基因在SEQ ID NO.5中显示，而氨基酸序列示于SEQ ID NO.6中。

bglF基因的同源物包括源自其它微生物的，与大肠杆菌的bglF基因在结构上具有高相似性的，当引入宿主时改进产生L-氨基酸的能力并且显示β-糖苷PTS活性的那些。bglF同源物的实例是来自胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)的bglF基因(Genbank Accession No.YP_050260)、来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的bglF基因(NP_735260)和来自发光光杆菌亚种(Photorhabdus luminescens subsp.)的bglF基因(NP_927931)。另外，基于与以上实例中提供的基因的同源性，可以从以下细菌中克隆bglF基因：棒状杆菌型细菌组(coryneform group of bacteria)，例如谷氨酸棒杆菌、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)等；假单胞菌属的细菌(Pseudomonas)，例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等；分枝杆菌属(Mycobacterium)的细菌，例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)等；等等。例如，可以使用合成的寡核苷酸SEQ ID Nos.1和2来克隆bglF基因。

本发明中使用的编码β-糖苷PTS的基因不限于野生型基因，只要编码的β-糖苷PTS蛋白的功能(即，β-糖苷PTS活性)不受损。它们也可以是编码蛋白质的突变体或人工修饰的产物，所述蛋白质包含在SEQ ID No.6的氨基酸序列中的一个或多个位置含有几个氨基酸取代、缺失、插入、添加等的序列。在本文中，术语“几个”根据蛋白质立体结构中氨基酸残基的位置和类型而变化。具体地，几个的意思是1-20，优选地1-10，并且更优选地1-5。以上一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入或添加是保持β-糖苷PTS活性的保守突变。在保守突变中，如果取代位置是芳族氨基酸，则取代相互发生在Phe、Trp、Tyr之间；如果取代位置是疏水氨基酸，则在Leu、Ile、Val之间；如果是极性氨基酸，则在Gln、Asn之间；如果是碱性氨基酸，则在Lys、Arg、His之间；如果是酸性氨基酸，则在Asp、Glu之间；并且如果是具有羟基的氨基酸，则在Ser、Thr之间。常规的保守突变是保守取代。优选的保守取代包括用Ser或Thr取代Ala；用Gln、His或Lys取代Arg；用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn；用Asn、Glu或Gln取代Asp；用Ser或Ala取代Cys；用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln；用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu；用Pro取代Gly；用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His；用Leu、Met、Val或Phe取代Ile；用Ile、Met、Val或Phe取代Leu；用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys；用Ile、Leu、Val或Phe取代Met；用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe；用Thr或Ala取代Ser；用Ser或Ala取代Thr；用Phe或Tyr取代Trp；用His、Phe或Trp取代Tyr；和用Met、Ile或Leu取代Val。上述氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等包括依赖于保留bglF基因的微生物的种间差异或个体差异而天然存在的那些(突变体或变体)。能够通过如下方法获得这些基因：使用例如位点特异性突变方法来修饰SEQID No.5中显示的核苷酸序列，从而使编码的蛋白质中位点特异性的氨基酸残基包含取代、缺失、插入或添加。

此外，作为bglF基因，同源物可与SEQ No.6的氨基酸序列具有80％或以上，优选90％或以上，更优选95％或以上，甚至更优选97％或以上的同源性。由于基因的简并密码性质根据引入所述基因的宿主变化，用宿主更容易使用的密码子取代的基因是期望的。同样，只要bglF基因具有(carry)β-糖苷PTS的功能，可以将所述基因的N末端或C末端延伸或去除。例如，延伸或去除的长度可以是50或更少，优选20或更少，更优选10或更少，并且甚至更优选5或更少的氨基酸残基。更具体地，可以使用编码以下蛋白质的基因，所述蛋白质具有从N末端延伸或去除50-5个氨基酸的SEQ ID No.6，从C末端延伸或去除50-5个氨基酸的SEQ ID No.6。

同样，能够通过以下常规突变处理获得基因的变体。突变处理方法之一是使用羟胺等，体外突变具有如SEQ ID No.5的核苷酸序列中所示核苷酸序列的基因。另一种方法使用紫外线或突变处理中通常使用的突变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EMS)来处理具有所述基因的微生物，例如，埃希氏菌属的细菌。这些基因是否编码具有β-糖苷PTS活性的蛋白质能够通过如下方法确认：例如在适当的细胞中表达这些基因，并且研究摄取β-糖苷的能力是否增加，或采用Chen等的方法研究体外磷酸化活性(Biochemistry 199837：8714-8723)。

bglF基因还可以是在严紧条件下与SEQ ID No.5中核苷酸序列的互补核苷酸序列或与从这些序列制备的探针杂交的DNA。在本文中，术语“严紧条件”指形成所谓的特异性杂合体(hybrid)，并且不形成非特异性杂合体的条件。尽管难以以数字清楚地表述这些条件，但是可将这些条件例举为如下条件：在该条件下高度同源的DNA片段，例如，具有不少于80％、90％或95％同源性的DNA相互杂交，并且具有低于以上同源性的DNA不相互杂交。或者，严紧条件的示例是Southern杂交洗涤条件中的常规条件，所述条件为在相应于60℃、1x SSC、0.1％SDS，优选0.1x SSC、0.1％SDS，并且更优选68℃、0.1x SSC、0.1％SDS的温度和盐浓度，洗涤一次或优选2-3次。

含有SEQ ID No.5的核苷酸序列或部分所述序列的DNA也可用作探针。这种探针可以使用PCR制备，其中将含有SEQ ID No.5的核苷酸序列的DNA片段用作模板，并且将基于SEQ ID No.5的核苷酸序列制备的寡核苷酸用作引物。例如，当使用大约300bp长的DNA片段作为探针时，杂交洗涤条件是50℃、2x SSC和0.1％SDS。

能够通过使用例如增加细胞中上述bglF基因拷贝数的遗传重组技术来进行增强bglF基因表达的修饰。例如，将含有bglF基因的DNA片段与在宿主微生物中发挥功能的载体(优选多拷贝型载体)连接，以制备重组DNA，其后将所述重组DNA引入该微生物以将其转化。

当使用大肠杆菌的bglF基因时，能够使用PCR(PCR：聚合酶链式反应；参见White，T.J.et al.，Trends Genet.5，185(1989))来获得所述bglF基因，在所述PCR中大肠杆菌的染色体DNA是模板，并且基于SEQ ID No.5的核苷酸序列制备引物，例如，SEQ ID Nos.1和2中所示的引物。使用基于BglF蛋白质的序列信息制备引物的PCR方法，或使用基于上述序列信息制备探针的杂交方法，也可从那些微生物中已知的bglF基因或其它种微生物中的bglF基因，或从微生物的染色体DNA或染色体DNA文库获得属于肠杆菌科的其它微生物的bglF基因。另外，染色体DNA可从DNA供体微生物制备。例如，可以使用Saito和Miura的方法等(H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)，Seibutsu Kogaku Jikkensho edited by The Society ofBiotechnology，Japan，pp.97-98，Baifukan，1992)。

其后，通过将通过PCR方法扩增的bglF基因与能够在宿主微生物的细胞中发挥功能的载体DNA连接来制备重组DNA。能够在宿主微生物的细胞中发挥功能的载体是在所述宿主微生物的细胞中可自主复制的载体。在大肠杆菌的细胞中可自主复制的载体的实例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184(pHSG和pACYC可从Takara Bio Inc.获得)、RSF1010、pBR322、pMW219(pMW可从Nippon Gene Co.，Ltd.获得)、pSTV29(可从Takara Bio Inc.获得)等。

可将如上所述制备的重组DNA依照迄今已经报导的任何转化方法引入微生物。例如，一种方法是通过用氯化钙处理受体细菌来增加DNA的透过性，如关于大肠杆菌K-12所报导的(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))。另一种方法是在从生长期的细胞制备感受态细胞之后引入DNA，如关于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)所报导的(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.andYoung，F.E.，Gene，1，153(1977))。同样，另一种方法是当已知宿主微生物涉及枯草芽孢杆菌、放线菌类和酵母时，将其改变为能够容易地摄取重组DNA的原生质体或原生质球状态，随后将所述重组DNA引入该DNA受体细菌中(Chang，S.and Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 1929(1978))。

能够通过将如上所述的bglF基因的多拷贝引入微生物的染色体DNA中来增加bglF基因的拷贝数。使用以多拷贝存在于所述染色体DNA上的序列作为靶，通过同源重组将bglF基因的多拷贝引入微生物的染色体DNA。可以使用重复DNA和存在于可转座元件末端的反向重复序列作为所述以多拷贝存在于染色体DNA上的序列。同样，可以将这些基因与存在于染色体上的bglF基因串联连接，或可以将这些基因通过在染色体上的非必需基因上的复制(duplication)来并入。可以使用温度敏感载体或整合载体来引入这些基因。

如JP2-109985A所披露，可以将bglF基因并入转座子，再将所述转座子转移以将多拷贝并入染色体DNA。所述基因是否已经转移至染色体上能够通过使用部分bglF基因作为探针进行Southern杂交来确认。

除了上述的增加拷贝数，bglF基因的表达还可通过使用WO00/18935中描述的方法来增强，例如将染色体DNA或质粒上的bglF基因启动子等表达调节序列用更强的取代，使-35、-10区接近共有序列，扩增能够增强bglF基因表达的调节基因，和缺失或减弱将减少bglF基因表达的调节基因。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、araBA启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、T7启动子、

启动子等是公知的强启动子。还可将碱基取代等引入bglF基因的启动子区和SD区以实现更强的启动子强度。

用于评估启动子强度的方法的实例和强启动子的实例在Goldstein等的文章(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1，105-128)等中描述。另外，已知在核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔区中取代几个核苷酸，特别在起始密码子的紧邻上游的序列中取代几个核苷酸，对mRNA翻译效率具有强烈影响。可对这些进行修饰。可通过启动子搜索载体和基因分析软件如GENETYX等确定bglF基因的启动子等表达调节区。能够通过取代或修饰这些启动子来增强bglF基因的表达。能够例如通过使用温度敏感质粒或Red-驱动整合方法来进行表达调节序列的取代(WO2005/010175)。

为了增加由bglF基因编码的蛋白质的活性，也可以将增加β-糖苷PTS活性的突变引入bglF基因。增加由bglF基因编码蛋白质的活性的突变实例包括增加bglF基因转录的启动子序列中的突变，和增加BglF蛋白比活性的所述基因编码区内的突变。

<2>产生L-氨基酸的方法

本发明的用于产生L-氨基酸的方法包括在培养基中培养本发明的微生物，在所述培养基或微生物中产生和积累L-氨基酸，和从所述培养基或微生物中收集L-氨基酸。

在使用微生物的L-氨基酸的发酵和产生中通常使用的培养基可用于本发明。即，可以使用含有碳源、氮源、非有机离子和所需的其它有机组分的普通培养基。碳源包括糖，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物等；醇，例如甘油、山梨糖醇(solbitol)等；有机酸，例如延胡索酸、柠檬酸、琥珀酸等。在这些中，优选使用葡萄糖作为碳源。氮源包括无机铵盐，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等；有机氮，例如大豆水解产物等；氨气；氨水等。期望的是有机微量营养物源含有适当量的营养缺陷物质(auxotrophicsubstance)，例如维生素B1、L-高丝氨酸等，或酵母提取物等。除这些之外，根据需要，可以添加小量的磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。本发明中使用的培养基可以是天然的或合成的培养基，只要其含有碳源、氮源、无机离子和需要的其它有机微量营养物。

建议将培养在需氧条件下，在24℃-37℃的培养温度进行1-7天，培养期间的pH为5-9。可以使用无机或有机酸或碱物质和氨气等来调节pH。使用常规离子交换树脂方法、沉淀方法和其它已知方法的组合可从发酵液中收集L-氨基酸。如果L-氨基酸积累在微生物的细胞内，可通过超声等将细胞破碎，随后通过离心分离去除以获得上清，使用离子交换树脂方法等可从所述上清中收集L-氨基酸。

还可使用适合于以沉淀产生L-谷氨酸的液体培养基，并且进行培养，在培养的同时将L-谷氨酸产生在培养基中。用于产生L-谷氨酸的条件包括，例如，pH为5.0-4.0，优选pH为4.5-4.0，更优选pH为4.3-4.0，并且甚至更优选pH为4.0。

在培养完成之后，可以使用任何已知的回收方法从培养液中收集L-谷氨酸。例如，可以在将细胞从培养液中去除之后使用浓缩结晶法收集L-谷氨酸，或通过离子交换层析等收集L-谷氨酸。当在产生L-谷氨酸的条件下进行培养时，也可通过离心分离、过滤等收集沉淀在培养液中的L-谷氨酸。在这种情况下，可以将溶解在培养液中的L-谷氨酸结晶之后再分离。

此外，可以通过以下分离方法制备以本发明产生的发酵液为基础的动物饲料添加剂。可以使用L-氨基酸分离方法例如离心、过滤、倾析、絮凝或这些的组合来去除或减少生物质。

可以使用已知方法例如旋转蒸发器、薄层蒸发器、反渗透或纳米过滤(FR8613346B、US4,997,754、EP410005B，JP1073646B)来浓缩由本发明获得的培养液。

随后使用冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾制粒(spray granulation)，或产生作为动物饲料添加剂使用的优选为自由流动、细碎的粉末的任何其它过程的方法处理浓缩的培养液。通过使用合适的压实或制粒方法，可将这种自由流动的细碎粉末转变成粗粒的、流动非常自由的、稳定并且基本上无尘的产品。总而言之，以这种方法将多于90％的水去除，以使动物饲料添加剂中的水浓度按重量计少于10％，优选少于5％。

所述饲料添加剂中的蛋白质含量按重量计可少于10％，优选少于5％，并且L-苏氨酸的浓度可多于50％，优选多于85％，更优选多于95％(US5,431,933、JP1214636B、US4,956,471、US4,777,051、US4946654、US5,840358、US6,238,714、US2005/0025878)。

上述分离步骤不必一定进行，而是可以按照在技术上有利的方式组合。

实施例：

在下文中将参考以下非限定性实施例对本发明进行更具体的说明。

参考实施例1：构建产生L-赖氨酸的细菌

<1-1>构建破坏了编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因的菌株

首先，构建不产生赖氨酸脱羧酶的菌株。使用WO WO2005/010175中描述的Red-驱动整合方法和λ噬菌体切除系统(J.Bacteriol.2002 Sep；184(18)：5200-3.Interactions between integrase and excisionase in the phageλexcisivenucleoprotein complex.Cho EH，Gumport RI，Gardner JF)来构建将赖氨酸脱羧酶基因破坏的菌株。赖氨酸脱羧酶由cadA基因(Genbank Accession No.NP_418555.SEQ ID No.42)和ldcC基因(Genbank Accession No.NP_414728.SEQ ID No.44)编码(WO96/17930)。将WC196菌株用作亲本菌株。将WC196菌株命名为大肠杆菌AJ13069，并且在1994年12月6日以登录号FERMP-14690保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心；Chuo 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan))，并且根据布达佩斯条约在1995年9月29日转为国际保藏，并给予登录号FERM BP-5252。

使用最初由Datsenko和Wanner开发的称为“Red-驱动整合”的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，pp.6640-6645)和λ噬菌体切除系统(J.Bacteriol.2002 Sep；184(18)：5200-3)，将编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因缺失。根据“Red-driven整合”方法，通过使用以源自靶基因的5’末端和抗生素抗性基因的3’末端的合成寡核苷酸引物获得的PCR产物，可以在单一的步骤中构建基因破坏的菌株。另外，通过λ噬菌体切除，可将整合在染色体中的抗生素抗性基因从菌株中去除。

(1)破坏cadA基因

将下文描述的pMW118-attL-Cm-attR质粒用作PCR模板。通过将λ噬菌体的attL和attR附着位点和抗生素抗性基因cat基因以attL-cat-attR的顺序插入pMW118(Takara Bio Inc.)来获得pMW118-attL-Cm-attR(参见WO2005/010175)。attL序列示于SEQ ID No.11，而且attR序列示于SEQ ID No.12。

使用SEQ ID Nos.46和47中所示合成寡核苷酸作为引物进行PCR，其中相应于attL和attR两个末端的序列位于所述引物的3’端，并且相应于靶基因cadA基因的一部分的序列位于所述引物的5’端。

用琼脂糖凝胶纯化扩增的PCR产物，其后通过电穿孔引入含有质粒pKD46的大肠杆菌WC196菌株，所述质粒具有温度敏感复制能力。质粒pKD46(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，pp.6640-6645)包含λ噬菌体DNA片段(2154碱基)，并且其包含编码λRed同源重组系统中Red重组酶的基因(γ、β和exo)，所述基因受阿拉伯糖诱导的ParaB启动子调控(GenBank/EMBL Accession No.J02459，31088th-33241st)。

如下制备用于电穿孔的感受态细胞。将在含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中在30℃培养过夜的大肠杆菌WC196菌株在含有氨苄青霉素(20mg/L)和L-阿拉伯糖(1mM)的5mL SOB培养基中稀释100倍(MolecularCloning：Lab Manual 2^nd edition，Sambrook，J.，et al.，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))。将稀释产物在30℃培养直到OD 600增长至大约0.6，之后将其浓缩100倍并用10％甘油洗涤三次准备电穿孔。使用70μl感受态细胞和大约100ng PCR产物进行电穿孔。添加1mL SOC培养基(Molecular Cloning：Lab Manual 2^nd edition，Sambrook，J.，et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989))并且在37℃培养2.5小时，其后在含有Cm(氯霉素)(25mg/L)L-琼脂的平板培养基上在37℃培养，并且选择Cm抗性的重组体。接下来，为了去除pKD46质粒，将细胞在含有Cm的L-琼脂培养基上在42℃传代培养两次，检测所得菌落的氨苄青霉素抗性，并且获得了无pKD46的氨苄青霉素敏感性菌株。

使用PCR确认通过氯霉素抗性基因鉴定的突变体中cadA基因的缺失。将cadA缺陷型菌株命名为WC196ΔcadA::att-cat。

其后，为了去除cadA基因中引入的att-cat基因，使用在下文描述的辅助质粒pMW-intxis-ts。pMW-intxis-ts含有编码λ噬菌体整合酶(Int)的基因(SEQID No.13)和编码切除酶(Xis)的基因(SEQ ID No.15)，并且具有温度敏感复制能力。通过引入pMW-intxis-ts，识别染色体上的attL(SEQ ID No.11)和attR(SEQ ID No.12)，引起重组，并且将attL和attR之间的基因切除，只保留attL或attR序列在染色体上。

使用常规方法制备如上所述获得的WC196ΔcadA::att-cat菌株的感受态细胞，并且用辅助质粒pMW-intxis-ts转化，在含有50mg/L氨苄青霉素的L-琼脂平板培养基上在30℃培养，由此选择氨苄青霉素抗性菌株。其后，为了去除pMW-intxis-ts质粒，将转化体在L-琼脂培养基上在42℃传代培养，检测所得菌落的氨苄青霉素抗性和氯霉素抗性，并且获得了将att-cat和pMW-intxis-ts去除的氯霉素和氨苄青霉素敏感性菌株。将这种菌株命名为WC196ΔcadA。

(2)在WC196ΔcadA菌株中缺失ldcC基因

按照上文描述的技术，使用具有SEQ ID Nos.48和49的序列的引物作为ldcC破坏引物将WC196ΔcadA菌株中的ldcC基因缺失。由此产生将cadA和ldcC两者都破坏的WC196ΔcadAΔldcC。

(3)制备PCR模板和辅助质粒

如下制备PCR模板pMW 118-attL-Cm-attR和辅助质粒pMW-intxis-ts。

(3-1)pMW118-attL-Cm-attR

基于pMW118-attL-Cm-attR构建pMW118-attL-Tc-attR。制备以下四种DNA片段：

1)含有attL的BglII-EcoRI DNA片段(120bp)(SEQ ID No.11)，其通过PCR扩增相应于大肠杆菌W3350菌株(含有λ原噬菌体的ATCC31278)染色体的序列而获得，使用寡核苷酸P1和P2(SEQ ID Nos.17 & 18)作为引物(这些引物额外地含有BglII和EcoRI内切核酸酶的识别位点)，

2)含有attR的PstI-HindIII DNA片段(182bp)(SEQ ID No.12)，其通过PCR扩增相应于大肠杆菌W3350菌株(含有λ原噬菌体)染色体的序列而获得，使用寡核苷酸P3和P4(SEQ ID Nos.19 & 20)作为引物(这些引物额外地含有PstI和HindIII内切核酸酶的识别位点)，

3)pMW118-ter_rrnB的BglII-HindIII大片段(3916bp)：所述pMW118-ter_rrnB通过连接以下三个片段获得：

i)含有来自pMW118的AatII-EcoRIpol片段的大片段(2359bp)，如下获得：用EcoRI限制性内切核酸酶消化pMW118，将其用DNA聚合酶I的Klenow片段处理，其后用AatII限制性内切核酸酶消化所述片段，

ii)含有氨苄青霉素抗性的(Ap^R)bla基因的pUC19的AatII-BglII小片段(1194bp)，如下获得：PCR扩增相应于pUC19质粒的序列，使用寡核苷酸P5和P6(SEQ ID Nos.21 & 22)作为引物(这些引物额外地含有AatII和BglII内切核酸酶的识别位点)，

iii)含有转录终止子ter_rrnB的小BglII-PstIpol片段(363bp)，如下获得：PCR扩增相应于大肠杆菌MG1655菌株的染色体的区域，使用寡核苷酸P7和P8(SEQ ID Nos.23 & 24)作为引物(这些引物额外地含有BglII和PstI内切核酸酶的识别位点)，

4)含有四环素抗性基因和转录终止子ter_thrL的pML-Tc-ter_thrL的小EcoRI-PstI片段(1388bp)(SEQ ID No、29)。如下获得pML-Tc-ter_thrL。

将pML-MSC(Mol Biol (Mosk).2005 Sep-Oct；39(5)：823-31；Biotechnologiya(Russian)No.5：3-20.))用XbaI和BamHI限制性内切核酸酶消化，并且将它的大片段(3342bp)与含有终止子ter_thrL的XbaI-BamHI片段(68bp)连接。所述XbaI-BamHI片段(68bp)相应于大肠杆菌MG1655的染色体，并且通过PCR扩增获得，使用寡核苷酸P9和P10(SEQ ID Nos.25 & 26)作为引物(这些引物额外地含有XbaI和BamHI内切核酸酶的识别位点)。将连接反应产物命名为质粒pML-ter_thrL。

将pML-ter_thrL用KpnI和XbaI限制性内切核酸酶消化，用DNA聚合酶I的Klenow片段处理，其后与含有四环素抗性基因的pBR322的小EcoRI-Van91I片段(1317bp)连接(将用EcoRI和Van911限制性内切核酸酶消化的pBR322用DNA聚合酶I的Klenow片段处理)。将这种连接的产物命名为质粒pML-Tc-ter_thrL。

其后，通过连接大BamHI-XbaI片段(4413bp)、PA2启动子(T7噬菌体的原始启动子)、氯霉素抗性的(CmR)cat基因、含有转录终止子ter_thrL的人工BglII-XbaI DNA片段(1162bp)和attR构建了pMW118-attL-Cm-attR。如下获得所述人工DNA片段(SEQ ID No.30)。

将pML-MSC(Mol Biol (Mosk).2005 Sep-Oct；39(5)：823-31；Biotechnologiya(Russian)No.5：3-20.))用KpnI和XbaI限制性内切核酸酶消化，并且与含有PA2启动子(T7噬菌体的早期启动子)的小KpnI-XbaI片段(120bp)连接。KpnI-XbaI片段通过扩增相应于T7噬菌体DNA的区域来获得，使用寡核苷酸P11和P12(SEQ ID Nos.27 & 28)作为引物(这些引物额外地含有KpnI和XbaI内切核酸酶的识别位点)。将所述连接的产物命名为质粒pML-PA2-MCS。

将XbaI位点从pML-PA2-MCS去除。将产物命名为质粒pML-PA2-MCS(XbaI-)。

将含有PA2启动子(T7噬菌体的原始启动子)和氯霉素抗性的(CmR)cat基因的pML-PA2-MCS(XbaI-)的小BglII-HindIII片段(928bp)与含有转录终止子ter_thrL和attR的pMW118-attL-Tc-attR的小HindIII-HindIII片段(234bp)连接。

使用寡核苷酸P9和P4(SEQ ID Nos.25 & 20)作为引物(这些引物含有HindIII和XbaI内切核酸酶的识别位点)，通过PCR扩增所述连接混合物获得目标人工DNA片段(1156bp)。

(3-2)pMW-intxis-ts

首先，基于λ噬菌体DNA(Fermentas)作为模板扩增了两个DNA片段。第一片段由λ噬菌体DNA基因组中的nt 37168-38046区(SEQ ID No.39)组成，并且含有cI阻抑物、Prm和Pr启动子，以及cro基因的前导序列。此片段通过扩增获得，使用寡核苷酸P1’和P2’(SEQ ID Nos.31 & 32)作为引物。第二片段由λ噬菌体DNA基因组中的nt 27801-29100区(SEQ ID No.40)组成，其含有来自λ噬菌体DNA的xis-int基因。此片段通过PCR获得，使用寡核苷酸P3’和P4’(SEQ ID Nos.33 & 34)作为引物。全部所述引物含有适当的内切核酸酶识别位点。

第一PCR扩增片段含有cI阻抑物，将所述片段用ClaI限制性内切核酸酶消化，其后用EcoRI限制性内切核酸酶消化。

将第二PCR片段用EcoRI和PstI内切核酸酶消化。将质粒pMWPlaclacI-ts用BglII内切核酸酶消化，用DNA聚合酶I的Klenow片段处理，其后用PstI限制性内切核酸酶消化。从琼脂糖凝胶中洗脱pMWPlaclacI-ts的载体片段，并且与切割的PCR扩增片段连接。

质粒pMWPlaclacI-ts是pMWPlaclacI的衍生物，含有以下部分：1)人工BglII-HindIII DNA片段，其含有PlacUV5启动子和在噬菌体T7基因10的RBS控制下的lacI基因；2)含有氨苄青霉素抗性的(Ap^R)基因的AatII-BglII片段，其通过PCR扩增相应于pUC19质粒的区域来获得，使用寡核苷酸P5’和P6’(SEQ ID Nos.35 & 36)作为引物(这些引物含有AatII和BglII内切核酸酶的识别位点)；3)AatII-HindIII片段，其含有重组质粒pMW118-ter_rrnB的AatII-PvuI片段。如下构建所述质粒pMW118-ter_rrnB。使用含有适当的内切核酸酶识别位点的寡核苷酸P7’和P8’(SEQ ID Nos.37 & 38)作为引物，通过PCR扩增相应于大肠杆菌MG1655菌株中染色体的区来获得含有终止子ter_rrnB的PstI-HindIII片段。在连接之前，将pMW118和ter_rrnB片段(SEQID No.41的互补链)分别用PvuI或PstI消化，用DNA聚合酶I的Klenow片段处理以将末端平端化，其后用AatII或HindIII内切核酸酶消化。在pMWPlaclacI-ts突变体的构建中，将质粒pMWPlaclacI的AatII-EcoRV片段用质粒pMAN997的AatII-EcoRV片段取代，所述AatII-EcoRV片段含有pSC 101复制子的par、ori和repAts基因(Applied and Environmental Microbiology，June2005，p.3228-32)。

实施例1：构建用于bglF过量表达的质粒

已经测定大肠杆菌(大肠杆菌K-12菌株)染色体的全基因组序列(Science，277，1453-1474(1997))。基于bglF基因的核苷酸序列，使用具有HindIII位点的SEQ ID No.1的合成寡核苷酸作为5’引物，和具有XbaI位点的SEQ IDNo.2的合成寡核苷酸作为3’引物，使用大肠杆菌MG1655菌株的染色体DNA作为模板进行PCR。将所述PCR产物用限制性内切核酸酶HindIII和XbaI处理，获得了含有bglF基因的基因片段。

将纯化的PCR产物与已经用HindIII和XbaI消化的载体pMW219(NipponGene Co.，Ltd.)连接，以构建用于bglF过量表达的质粒pM-bglF。这种质粒受lac启动子的调控，并且将bglF基因置于所述lac启动子的下游。将pM-bglF用HindIII和EcoRI消化，收集和纯化bglF基因片段，并且连接至已经用HindIII和EcoRI消化的载体pSTV29(Takara Shuzo)。以这种方法，构建了用于bglF过量表达的质粒pS-bglF。

按照与上文所述bglF基因的相同方式，构建了用于表达ptsG基因的质粒作为对照。ptsG的序列示于SEQ ID No.7，并且将氨基酸的序列提供于SEQID No.8；ptsG序列可参考Genbank Accession No.NP_415619获得。使用含有HindIII位点的SEQ ID No.3的合成寡核苷酸作为5’引物，和含有XbaI位点的SEQ ID No.4的合成寡核苷酸作为3’引物，使用大肠杆菌MG1655菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，再用限制性内切核酸酶HindIII和XbaI处理所述PCR片段，并且获得了含有ptsG的基因片段。将纯化的PCR产物与已经用HindIII和XbaI消化的载体pMW219连接，以构建用于ptsG过量表达的质粒pM-ptsG。这种质粒受lac启动子的调控，并且将ptsG基因置于所述lac启动子的下游。按照与bglF相同的方式，将ptsG基因片段从pM-ptsG中切除，并且连接至载体pSTV29。以这种方法，构建了用于ptsG过量表达的质粒pS-ptsG。

实施例2：构建过量表达bglF基因的菌株和评估所述菌株的L-赖氨酸产生

作为产生L-赖氨酸的大肠杆菌菌株，将WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2)菌株用作亲本菌株。将含有dapA、dapB和lysC基因的产生Lys的质粒pCABD2(WO01/53459)引入WC196ΔldcCΔcadA菌株。用实施例1中构建的bglF过量表达质粒pM-bglF和ptsG过量表达质粒pM-ptsG，和对照质粒pMW219转化WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2)菌株，并且获得了卡那霉素抗性菌株。在确认已将这些质粒引入后，将引入了bglF过量表达质粒pM-bglF的菌株命名为WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2，pM-bglF)；将引入了ptsG过量表达质粒pM-ptsG的菌株命名为WC 196ΔldcCΔcadA(pCABD2，pM-ptsG)；并且将引入了对照质粒pMW219的菌株命名为WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2，pMW219)。

将如上所述构建的菌株在含有25mg/L卡那霉素的L培养基中在37℃培养至最终成为OD6000.6。其后，将等体积的40％甘油溶液添加至所述培养物并搅动，再吸取适量并且贮藏在-80℃。将其称为甘油原种(glycerolstock)。

在将这些菌株的甘油原种融化之后，将各100μL均匀地铺在含有25mg/L卡那霉素的L平板上，并且将其在37℃培养24小时。将平板上大约1/8的细胞接种至500mL Sakaguchi摇瓶中具有25mg/L卡那霉素的20mL发酵培养基(下文所示)中，并且使用往复摇动培养装置在37℃培养24小时。培养之后，使用Biotech-analyzer AS210(Sakura Seiki)测量培养基中积累的赖氨酸的量。

在第24小时的OD和已经积累的L-赖氨酸示于表1。从表1中显而易见，与不合bglF基因的WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2，pMW219)菌株相比，在WC196Δ1dcCΔcadA(pCABD2，pM-bglF)菌株中积累了大量的L-赖氨酸。在积累的L-赖氨酸量上的改进还在与不含ptsG基因的WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2，pM-ptsG)菌株的比较中得到确认。这样的数据显示在赖氨酸的产生中bglF基因的过量表达比ptsG的过量表达更有效。

表1

细菌菌株	OD600	Lys-HCl(g/L)
细菌菌株	OD600	Lys-HCl(g/L)	WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2，pMW219)	12.6	10.0
WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2，pM-bglF)	17.1	16.1	WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2，pMW219)	12.6	10.0
WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2，pM-bglF)	17.1	16.1	WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2，pM-ptsG)	15.8	14.7

用于L-赖氨酸产生的培养基：

葡萄糖 40g/L

硫酸铵 24g/L

磷酸二氢钾 1.0g/L

硫酸镁7-水合物 1.0g/L

硫酸亚铁4·7-水合物 0.01g/L

硫酸锰4·7-水合物 0.01g/L

酵母提取物 2.0g/L

碳酸钙 30g/L

用KOH调节至pH 7.0，并且在115℃灭菌10分钟。

将葡萄糖和MgSO₄·7H₂O单独灭菌。

实施例3：bglF过量表达对产生L-谷氨酸的大肠杆菌菌株的影响

将产生L-谷氨酸的大肠杆菌菌株AJ12949菌株用作亲本菌株。AJ12949菌株是已将α-酮戊二酸脱氢酶活性减少的细菌菌株，并且在1993年12月28日以登录号FERM P-14039保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心；Chuo 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan)，并且根据布达佩斯条约在1994年11月11日转为国际保藏，并给予登录号FERM BP-4881。

用实施例1中使用的bglF过量表达质粒pS-bglF，和对照质粒pSTV29转化AJ12949菌株，并且获得了氯霉素抗性菌株。在确认已将所述质粒引入之后，将引入了bglF过量表达质粒pS-bglF的菌株命名为AJ12949(pS-bglF)；并且将引入了对照质粒pSTV29的菌株命名为AJ12949(pSTV29)。

将AJ12949(pS-bglF)菌株和AJ12949(pSTV29)菌株在含有20mg/L氯霉素的L培养基中在37℃培养至最终成为OD6000.6。此后，将等体积的40％溶液添加至所述培养物并搅动，再吸取适量以获得甘油原种并且贮藏在-80℃。

在将这些菌株的甘油原种融化之后，将各100μL均匀地铺在含有20mg/L氯霉素的L平板上，并将其在37℃培养24小时。将平板上大约1/8的细胞接种至500mL Sakaguchi摇瓶中具有20mg/L氯霉素的20mL发酵培养基(下文所示)中，并且使用往复摇动培养装置在37℃培养40小时。培养之后，使用Biotech-analyzer AS210(Sakura Seiki)测量培养基中积累的L-谷氨酸的量。

在第40小时的OD和已经积累的L-谷氨酸示于表2。如表2所示，与不含bglF基因的AJ12949(pSTV29)菌株相比，在AJ12949(pS-bglF)菌株中积累了大量的L-谷氨酸。

表2

细菌菌株	OD600	L-Glu(g/L)
细菌菌株	OD600	L-Glu(g/L)	AJ12949(pSTV29)	14.7	18.6
AJ12949(pS-bglF)	16.6	20.4	AJ12949(pSTV29)	14.7	18.6

用于L-谷氨酸产生的培养基：

葡萄糖 40g/L

硫酸铵 20g/L

磷酸二氢钾 1.0g/L

硫酸镁7-水合物 1.0g/L

硫酸亚铁4·7-水合物 0.01g/L

硫酸锰4·7-水合物 0.01g/L

酵母提取物 2.0g/L

碳酸钙 30g/L

用KOH调节至pH 7.0，并且在115℃灭菌10分钟。

将葡萄糖和MgSO₄·7H₂O单独灭菌。

另外，培养物温度在60℃或以下时，添加已用DISMIC-25cs 0.2mm滤器(ADVANTEC)灭菌的盐酸硫胺素溶液，以获得0.01g/L的终浓度。

实施例4：

bglF过量表达对产生L-苏氨酸的埃希氏菌属细菌菌株的影响

作为用于产生L-苏氨酸的bglF过量表达的亲本菌株，使用B-5318菌株。将B-5318菌株在1990年5月3日以登录号VKPM B-5318保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，GNII Genetika(Russia，117545 Moscow，1Dorozhny Proezd，1)。从B-5318构建bglF过量表达菌株，所述构建使用如实施例1中描述的质粒进行。

用实施例1中使用的bglF扩增质粒pS-bglF和对照质粒pSTV29转化B-5318菌株，并且获得了氯霉素抗性菌株。在确认了将指定的质粒引入后，将引入了bglF过量表达质粒pS-bglF的菌株命名为B-5318(pS-bglF)；并且将引入了对照质粒pSTV29的菌株命名为B-5318(pSTV29)。

将B-5318(pS-bglF)菌株和B-5318(pSTV29)菌株在含有20mg/L氯霉素的L培养基中在37℃培养至最终成为OD6000.6。此后，将等体积的40％溶液添加至所述培养物并搅动，再吸取适量以获得甘油原种并且贮藏在-80℃。

在将这些菌株的甘油原种融化之后，将各100μL均匀地铺在含有20mg/L氯霉素的L平板上，并且将其在37℃培养24小时。将平板上大约1/8的细胞接种至500mL Sakaguchi摇瓶中具有20mg/L氯霉素的20mL发酵培养基中，并且使用往复摇动培养装置在37℃培养16小时。培养之后，使用高效液相层析测量培养基中积累的L-苏氨酸的量。

在第16小时的OD和已经积累的L-苏氨酸示于表3。如该表中所示，与不含bglF基因的B-5318(pSTV29)菌株相比，在B-5318(pS-bglF)菌株中积累了大量的L-苏氨酸。

表3

用于L-苏氨酸的产生的培养基：

葡萄糖 60g/L

硫酸铵 16g/L

硫酸二氢钾 0.7g/L

硫酸镁7-水合物 1.0g/L

硫酸亚铁7-水合物 0.01g/L

硫酸锰7-水合物 0.01g/L

酵母提取物 0.5g/L

盐酸硫胺素 0.2mg/L

L-异亮氨酸 0.05g/L

碳酸钙 30g/L

用KOH调节至pH 7.0，在115℃灭菌10分钟。

然而，将葡萄糖和MgSO₄·7H₂O单独灭菌。将氢氧化钾在180℃干热灭菌3小时。在培养物温度降低至60℃或更低之后，添加已用DISMIC-25cs 0.2mm滤器(ADVANTEC)灭菌的盐酸硫胺素溶液以获得0.2mg/L的终浓度。

实施例5

bglF过量表达对产生L-谷氨酸的泛菌属细菌菌株的影响

作为bglF扩增产生L-谷氨酸的菌株的亲本菌株，可以使用Pantoeaananatis AJ13601菌株。所述Pantoea ananatis AJ13601菌株在1999年8月18日以登录号FERM P-17516保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(Naional Institute of Bioscience and Human Technology，Agency ofIndustrial Science and Technology，Ministry of Economy，Trade and Industry)(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566)，并且根据布达佩斯条约在2000年7月6日转为国际保藏，并获得登录号FERM BP-7207。使用实施例1中描述的质粒能够从产生L-谷氨酸的细菌构建bglF扩增的菌株。

将bglF过量表达的菌株在L-谷氨酸产生培养基中培养，并且使用往复摇动培养设备进行培养。在培养之后，使用Biotech-analyzer AS210(Sakura Seiki)测量培养基中积累的L-谷氨酸的量以确认L-谷氨酸的积累是否增加。通过这种方法，能够获得具有改进的产生L-谷氨酸能力的bglF过量表达的菌株。

序列表

<110>味之素株式会社(AJINOMOTO Co Inc)

<120>产生L-氨基酸的细菌和用于产生L-氨基酸的方法

<130>C-555

<150>JP2005-279025

<151>2005-09-27

<150>US60/723938

<151>2005-10-06

<150>JP2005-360671

<151>2005-12-14

<160>49

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>人工DNA

<220>

<223>bglF引物1

<400>1

acacaagctt aggaggacaa gttatgacgg a 31

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>人工DNA

<220>

<223>bglF引物2

<400>2

gtgttctaga aaatctgagg tcgagatccc ttt 33

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工DNA

<220>

<223>ptsG引物1

<400>3

cacaaaagct tcatactcag gagcactctc a 31

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工DNA

<220>

<223>ptsG引物2

<400>4

gtgtgtctag aaactggcaa aatcgcgtgt a 31

<210>5

<211>1878

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1878)

<223>

<400>5

atg acg gag tta gcc aga aaa ata gtc gca gga gtc ggg ggc gca gat 48

Met Thr Glu Leu Ala Arg Lys Ile Val Ala Gly Val Gly Gly Ala Asp

1 5 10 15

aac att gtg agt ctg atg cat tgc gca acg cga tta cgt ttt aaa tta 96

Asn Ile Val Ser Leu Met His Cys Ala Thr Arg Leu Arg Phe Lys Leu

20 25 30

aag gat gaa agc aaa gcg caa gca gag gta ctg aaa aag acc ccc ggt 144

Lys Asp Glu Ser Lys Ala Gln Ala Glu Val Leu Lys Lys Thr Pro Gly

35 40 45

att att atg gtg gtg gaa agc ggt ggc cag ttt cag gtg gtc ata ggt 192

Ile Ile Met Val Val Glu Ser Gly Gly Gln Phe Gln Val Val Ile Gly

50 55 60

aac cat gtg gcc gat gtc ttc ctg gcg gtt aac agt gtg gca ggc ctt 240

Asn His Val Ala Asp Val Phe Leu Ala Val Asn Ser Val Ala Gly Leu

65 70 75 80

gac gaa aaa gcg caa cag gca ccg gaa aat gat gat aaa ggt aat ctg 288

Asp Glu Lys Ala Gln Gln Ala Pro Glu Asn Asp Asp Lys Gly Asn Leu

85 90 95

cta aac cgc ttt gtt tat gtt att tca ggt att ttt acg cct ctg atc 336

Leu Asn Arg Phe Val Tyr Val Ile Ser Gly Ile Phe Thr Pro Leu Ile

100 105 110

ggt ttg atg gcg gca acc ggg atc ttg aaa ggt atg ctg gct ctg gcg 384

Gly Leu Met Ala Ala Thr Gly Ile Leu Lys Gly Met Leu Ala Leu Ala

115 120 125

ctc act ttt cag tgg acg acc gaa caa agt ggt act tat tta att tta 432

Leu Thr Phe Gln Trp Thr Thr Glu Gln Ser Gly Thr Tyr Leu Ile Leu

130 135 140

ttc agc gcc agt gat gcc ttg ttt tgg ttc ttc ccg ata atc ctg gga 480

Phe Ser Ala Ser Asp Ala Leu Phe Trp Phe Phe Pro Ile Ile Leu Gly

145 150 155 160

tac acc gcg ggg aaa cgc ttc ggc ggt aat cca ttt act gcc atg gtg 528

Tyr Thr Ala Gly Lys Arg Phe Gly Gly Asn Pro Phe Thr Ala Met Val

165 170 175

att ggt gga gcg tta gtg cat cca tta att ctg act gct ttc gag aac 576

Ile Gly Gly Ala Leu Val His Pro Leu Ile Leu Thr Ala Phe Glu Asn

180 185 190

ggg caa aaa gcg gat gcg ctg ggg ctg gat ttc ctg ggt att ccg gtc 624

Gly Gln Lys Ala Asp Ala Leu Gly Leu Asp Phe Leu Gly Ile Pro Val

195 200 205

aca ttg ttg aat tac tcg tca tcg gtt att ccc att att ttt tct gcc 672

Thr Leu Leu Asn Tyr Ser Ser Ser Val Ile Pro Ile Ile Phe Ser Ala

210 215 220

tgg ttg tgc agc att ctg gaa cgc cga ctt aat gcg tgg tta ccg tcg 720

Trp Leu Cys Ser Ile Leu Glu Arg Arg Leu Asn Ala Trp Leu Pro Ser

225 230 235 240

gca atc aaa aat ttc ttc aca cca ttg cta tgt ctg atg gtt atc aca 768

Ala Ile Lys Asn Phe Phe Thr Pro Leu Leu Cys Leu Met Val Ile Thr

245 250 255

ccc gtc acc ttt ctg ctg gtg ggg ccg cta tca acc tgg ata agc gaa 816

Pro Val Thr Phe Leu Leu Val Gly Pro Leu Ser Thr Trp Ile Ser Glu

260 265 270

ctg att gcc gcc ggt tat ctc tgg ctt tat cag gcg gtt cct gca ttt 864

Leu Ile Ala Ala Gly Tyr Le u Trp Leu Tyr Gln Ala Val Pro Ala Phe

275 280 285

gcg ggc gcg gta atg ggc ggc ttc tgg caa atc ttc gtc atg ttc gga 912

Ala Gly Ala Val Met Gly Gly Phe Trp Gln Ile Phe Val Met Phe Gly

290 295 300

ctg cac tgg ggc ctg gtg ccg ctg tgt atc aat aac ttc acc gtg ctg 960

Leu His Trp Gly Leu Val Pro Leu Cys Ile Asn Asn Phe Thr Val Leu

305 310 315 320

ggc tac gac acc atg atc ccg ctg tta atg ccc gcc att atg gcg cag 1008

Gly Tyr Asp Thr Met Ile Pro Leu Leu Met Pro Ala Ile Met Ala Gln

325 330 335

gtc ggg gcg gcg ctc ggc gtc ttc ctc tgc gaa cgc gat gcg cag aaa 1056

Val Gly Ala Ala Leu Gly Val Phe Leu Cys Glu Arg Asp Ala Gln Lys

340 345 350

aaa gtg gtg gcg gga tca gcg gcg ttg acg agt ctg ttt ggt atc acc 1104

Lys Val Val Ala Gly Ser Ala Ala Leu Thr Ser Leu Phe Gly Ile Thr

355 360 365

gaa cca gcg gta tat ggc gtc aac ctg ccg cgt aag tac ccc ttt gtt 1152

Glu Pro Ala Val Tyr Gly Val Asn Leu Pro Arg Lys Tyr Pro Phe Val

370 375 380

atc gcc tgt atc agt ggg gct ttg ggg gcc acc att att ggc tac gcg 1200

Ile Ala Cys Ile Ser Gly Ala Leu Gly Ala Thr Ile Ile Gly Tyr Ala

385 390 395 400

caa acg aaa gtc tac tcc ttt ggt ttg cca agt att ttc acc ttc atg 1248

Gln Thr Lys Val Tyr Ser Phe Gly Leu Pro Ser Ile Phe Thr Phe Met

405 410 415

caa acc atc ccg tca acg gga att gat ttc acc gtc tgg gcc agc gtt 1296

Gln Thr Ile Pro Ser Thr Gly Ile Asp Phe Thr Val Trp Ala Ser Val

420 425 430

att ggc ggt gtc att gcc atc ggt tgc gca ttt gtc ggt acg gtg atg 1344

Ile Gly Gly Val Ile Ala Ile Gly Cys Ala Phe Val Gly Thr Val Met

435 440 445

ctt cat ttc atc acc gct aaa cgt cag cca gcg cag ggt gcc ccg caa 1392

Leu His Phe Ile Thr Ala Lys Arg Gln Pro Ala Gln Gly Ala Pro Gln

450 455 460

gag aaa aca cca gag gtt att aca cca cct gag cag ggc ggt atc tgt 1440

Glu Lys Thr Pro Glu Val Ile Thr Pro Pro Glu Gln Gly Gly Ile Cys

465 470 475 480

tca ccg atg acg gga gag att gtg ccg ctc att cac gtc gct gat acc 1488

Ser Pro Met Thr Gly Glu Ile Val Pro Leu Ile His Val Ala Asp Thr

485 490 495

acg ttt gcc agt ggc ctg ttg ggt aaa ggt att gcc att ctg ccc tcg 1536

Thr Phe Ala Ser Gly Leu Leu Gly Lys Gly Ile Ala Ile Leu Pro Ser

500 505 510

gtt ggt gaa gtg cgt tct ccg gtt gcg ggt cga att gct tcg ttg ttc 1584

Val Gly Glu Val Arg Ser Pro Val Ala Gly Arg Ile Ala Ser Leu Phe

515 520 525

gcc aca tta cac gcc att ggc att gag tca gat gat ggt gtg gag atc 1632

Ala Thr Leu His Ala Ile Gly Ile Glu Ser Asp Asp Gly Val Glu Ile

530 535 540

ctg att cat gtc ggt atc gac acc gta aaa ctg gac ggc aaa ttc ttt 1680

Leu Ile His Val Gly Ile Asp Thr Val Lys Leu Asp Gly Lys Phe Phe

545 550 555 560

tcc gct cac gtc aac gtg ggt gac aag gtc aat aca ggc gat cgg ctg 1728

Ser Ala His Val Asn Val Gly Asp Lys Val Asn Thr Gly Asp Arg Leu

565 570 575

att tct ttt gat atc cct gct att cgc gag gcc gga ttt gat ctg acg 1776

Ile Ser Phe Asp Ile Pro Ala Ile Arg Glu Ala Gly Phe Asp Leu Thr

580 585 590

acg ccg gta tta atc agt aat agc gat gat ttt acg gac gta tta ccc 1824

Thr Pro Val Leu Ile Ser Asn Ser Asp Asp Phe Thr Asp Val Leu Pro

595 600 605

cac ggc acg gcg cag ata agc gca ggt gaa ccg ctg tta tcc atc att 1872

His Gly Thr Ala Gln Ile Ser Ala Gly Glu Pro Leu Leu Ser Ile Ile

610 615 620

cgc taa 1878

Arg

625

<210>6

<211>625

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>6

Met Thr Glu Leu Ala Arg Lys Ile Val Ala Gly Val Gly Gly Ala Asp

1 5 10 15

Asn Ile Val Ser Leu Met His Cys Ala Thr Arg Leu Arg Phe Lys Leu

20 25 30

Lys Asp Glu Ser Lys Ala Gln Ala Glu Val Leu Lys Lys Thr Pro GlV

35 40 45

Ile Ile Met Val Val Glu Ser Gly Gly Gln Phe Gln Val Val Ile Gly

50 55 60

Asn His Val Ala Asp Val Phe Leu Ala Val Asn Ser Val Ala Gly Leu

65 70 75 80

Asp Glu Lys Ala Gln Gln Ala Pro Glu Asn Asp Asp Lys Gly Asn Leu

85 90 95

Leu Asn Arg Phe Val Tyr Val Ile Ser Gly Ile Phe Thr Pro Leu Ile

100 105 110

Gly Leu Met Ala Ala Thr Gly Ile Leu Lys Gly Met Leu Ala Leu Ala

115 120 125

Leu Thr Phe Gln Trp Thr Thr Glu Gln Ser Gly Thr Tyr Leu Ile Leu

130 135 140

Phe Ser Ala Ser Asp Ala Leu Phe Trp Phe Phe Pro Ile Ile Leu Gly

145 150 155 160

Tyr Thr Ala Gly Lys Arg Phe Gly Gly Asn Pro Phe Thr Ala Met Val

165 170 175

Ile Gly Gly Ala Leu Val His Pro Leu Ile Leu Thr Ala Phe Glu Asn

180 185 190

Gly Gln Lys Ala Asp Ala Leu Gly Leu Asp Phe Leu Gly Ile Pro Val

195 200 205

Thr Leu Leu Asn Tyr Ser Ser Ser Val Ile Pro Ile Ile Phe Ser Ala

210 215 220

Trp Leu Cys Ser Ile Leu Glu Arg Arg Leu Asn Ala Trp Leu Pro Ser

225 230 235 240

Ala Ile Lys Asn Phe Phe Thr Pro Leu Leu Cys Leu Met Val Ile Thr

245 250 255

Pro Val Thr Phe Leu Leu Val Gly Pro Leu Ser Thr Trp Ile Ser Glu

260 265 270

Leu Ile Ala Ala Gly Tyr Leu Trp Leu Tyr Gln Ala Val Pro Ala Phe

275 280 285

Ala Gly Ala Val Met Gly Gly Phe Trp Gln Ile Phe Val Met Phe Gly

290 295 300

Leu His Trp Gly Leu Val Pro Leu Cys Ile Asn Asn Phe Thr Val Leu

305 310 315 320

Gly Tyr Asp Thr Met Ile Pro Leu Leu Met Pro Ala Ile Met Ala Gln

325 330 335

Val Gly Ala Ala Leu Gly Val Phe Leu Cys Glu Arg Asp Ala Gln Lys

340 345 350

Lys Val Val Ala Gly Ser Ala Ala Leu Thr Ser Leu Phe Gly Ile Thr

355 360 365

Glu Pro Ala Val Tyr Gly Val Asn Leu Pro Arg Lys Tyr Pro Phe Val

370 375 380

Ile Ala Cys Ile Ser Gly Ala Leu Gly Ala Thr Ile Ile Gly Tyr Ala

385 390 395 400

Gln Thr Lys Val Tyr Ser Phe Gly Leu Pro Ser Ile Phe Thr Phe Met

405 410 415

Gln Thr Ile Pro Ser Thr Gly Ile Asp Phe Thr Val Trp Ala Ser Val

420 425 430

Ile Gly Gly Val Ile Ala Ile Gly Cys Ala Phe Val Gly Thr Val Met

435 440 445

Leu His Phe Ile Thr Ala Lys Arg Gln Pro Ala Gln Gly Ala Pro Gln

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Glu Val Ile Thr Pro Pro Glu Gln Gly Gly Ile Cys

465 470 475 480

Ser Pro Met Thr Gly Glu Ile Val Pro Leu Ile His Val Ala Asp Thr

485 490 495

Thr Phe Ala Ser Gly Leu Leu Gly Lys Gly Ile Ala Ile Leu Pro Ser

500 505 510

Val Gly Glu Val Arg Ser Pro Val Ala Gly Arg Ile Ala Ser Leu Phe

515 520 525

Ala Thr Leu His Ala Ile Gly Ile Glu Ser Asp Asp Gly Val Glu Ile

530 535 540

Leu Ile His Val Gly Ile Asp Thr Val Lys Leu Asp Gly Lys Phe Phe

545 550 555 560

Ser Ala His Val Asn Val Gly Asp Lys Val Asn Thr Gly Asp Arg Leu

565 570 575

Ile Ser Phe Asp Ile Pro Ala Ile Arg Glu Ala Gly Phe Asp Leu Thr

580 585 590

Thr Pro Val Leu Ile Ser Asn Ser Asp Asp Phe Thr Asp Val Leu Pro

595 600 605

His Gly Thr Ala Gln Ile Ser Ala Gly Glu Pro Leu Leu Ser Ile Ile

610 615 620

Arg

625

<210>7

<211>1434

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1434)

<223>ptsG

<400>7

atg ttt aag aat gca ttt gct aac ctg caa aag gtc ggt aaa tcg ctg 48

Met Phe Lys Asn Ala Phe Ala Asn Leu Gln Lys Val Gly Lys Ser Leu

1 5 10 15

atg ctg ccg gta tcc gta ctg cct atc gca ggt att ctg ctg ggc gtc 96

Met Leu Pro Val Set Val Leu Pro Ile Ala Gly Ile Leu Leu Gly Val

20 25 30

ggt tcc gcg aat ttc agc tgg ctg ccc gcc gtt gta tcg cat gtt atg 144

Gly Set Ala Asn Phe Ser Trp Leu Pro Ala Val Val Ser His Val Met

35 40 45

gca gaa gca ggc ggt tcc gtc ttt gca aac atg cca ctg att ttt gcg 192

Ala Glu Ala Gly Gly Ser Val Phe Ala Asn Met Pro Leu Ile Phe Ala

50 55 60

atc ggt gtc gcc ctc ggc ttt acc aat aac gat ggc gta tcc gcg ctg 240

Ile Gly Val Ala Leu Gly Phe Thr Asn Asn Asp Gly Val Ser Ala Leu

65 70 75 80

gcc gca gtt gtt gcc tat ggc atc atg gtt aaa acc atg gcc gtg gtt 288

Ala Ala Val Val Ala Tyr Gly Ile Met Val Lys Thr Met Ala Val Val

85 90 95

gcg cca ctg gta ctg cat tta cct get gaa gaa atc gcc tct aaa cac 336

Ala Pro Leu Val Leu His Leu Pro Ala Glu Glu Ile Ala Ser Lys His

100 105 110

ctg gcg gat act ggc gta ctc gga ggg att atc tcc ggt gcg atc gca 384

Leu Ala Asp Thr Gly Val Leu Gly Gly Ile Ile Ser Gly Ala Ile Ala

115 120 125

gcg tac atg ttt aac cgt ttc tac cgt att aag ctg cct gag tat ctt 432

Ala Tyr Met Phe Asn Arg Phe Tyr Arg Ile Lys Leu Pro Glu Tyr Leu

130 135 140

ggc ttc ttt gcc ggt aaa cgc ttt gtg ccg atc att tct ggc ctg gct 480

Gly Phe Phe Ala Gly Lys Arg Phe Val Pro Ile Ile Ser Gly Leu Ala

145 150 155 160

gcc atc ttt act ggc gtt gtg ctg tcc ttc att tgg ccg ccg att ggt 528

Ala Ile Phe Thr Gly Val Val Leu Ser Phe Ile Trp Pro Pro Ile Gly

165 170 175

tct gca atc cag acc ttc tct cag tgg gct gct tac cag aac ccg gta 576

Ser Ala Ile Gln Thr Phe Ser Gln Trp Ala Ala Tyr Gln Asn Pro Val

180 185 190

gtt gcg ttt ggc att tac ggt ttc atc gaa cgt tgc ctg gta ccg ttt 624

Val Ala Phe Gly Ile Tyr Gly Phe Ile Glu Arg Cys Leu Val Pro Phe

195 200 205

ggt ctg cac cac atc tgg aac gta cct ttc cag atg cag att ggt gaa 672

Gly Leu His His Ile Trp Asn Val Pro Phe Gln Met Gln Ile Gly Glu

210 215 220

tac acc aac gca gca ggt cag gtt ttc cac ggc gac att ccg cgt tat 720

Tyr Thr Asn Ala Ala Gly Gln Val Phe His Gly Asp Ile Pro Arg Tyr

225 230 235 240

atg gcg ggt gac ccg act gcg ggt aaa ctg tct ggt ggc ttc ctg ttc 768

Met Ala Gly Asp Pro Thr Ala Gly Lys Leu Ser Gly Gly Phe Leu Phe

245 250 255

aaa atg tac ggt ctg cca gct gcc gca att gct atc tgg cac tct gct 816

Lys Met Tyr Gly Leu Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ile Trp His Ser Ala

260 265 270

aaa cca gaa aac cgc gcg aaa gtg ggc ggt att atg atc tcc gcg gcg 864

Lys Pro Glu Asn Arg Ala Lys Val Gly Gly Ile Met Ile Ser Ala Ala

275 280 285

ctg acc tcg ttc ctg acc ggt atc acc gag ccg atc gag ttc tcc ttc 912

Leu Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Thr Glu Pro Ile Glu Phe Ser Phe

290 295 300

atg ttc gtt gcg ccg atc ctg tac atc atc cac gcg att ctg gca ggc 960

Met Phe Val Ala Pro Ile Leu Tyr Ile Ile His Ala Ile Leu Ala Gly

305 310 315 320

ctg gca ttc cca atc tgt att ctt ctg ggg atg cgt gac ggt acg tcg 1008

Leu Ala Phe Pro Ile Cys Ile Leu Leu Gly Met Arg Asp Gly Thr Ser

325 330 335

ttc tcg cac ggt ctg atc gac ttc atc gtt ctg tct ggt aac agc agc 1056

Phe Ser His Gly Leu Ile Asp Phe Ile Val Leu Ser Gly Asn Ser Ser

340 345 350

aaa ctg tgg ctg ttc ccg atc gtc ggt atc ggt tat gcg att gtt tac 1104

Lys Leu Trp Leu Phe Pro Ile Val Gly Ile Gly Tyr Ala Ile Val Tyr

355 360 365

tac acc atc ttc cgc gtg ctg att aaa gca ctg gat ctg aaa acg ccg 1152

Tyr Thr Ile Phe Arg Val Leu Ile Lys Ala Leu Asp Leu Lys Thr Pro

370 375 380

ggt cgt gaa gac gcg act gaa gat gca aaa gcg aca ggt acc agc gaa 1200

Gly Arg Glu Asp Ala Thr Glu Asp Ala Lys Ala Thr Gly Thr Ser Glu

385 390 395 400

atg gca ccg gct ctg gtt gct gca ttt ggt ggt aaa gaa aac att act 1248

Met Ala Pro Ala Leu Val Ala Ala Phe Gly Gly Lys Glu Asn Ile Thr

405 410 415

aac ctc gac gca tgt att acc cgt ctg cgc gtc agc gtt gct gat gtg 1296

Asn Leu Asp Ala Cys Ile Thr Arg Leu Arg Val Ser Val Ala Asp Val

420 425 430

tct aaa gtg gat cag gcc ggc ctg aag aaa ctg ggc gca gcg ggc gta 1344

Ser Lys Val Asp Gln Ala Gly Leu Lys Lys Leu Gly Ala Ala Gly Val

435 440 445

gtg gtt gct ggt tct ggt gtt cag gcg att ttc ggt act aaa tcc gat 1392

Val Val Ala Gly Ser Gly Val Gln Ala Ile Phe Gly Thr Lys Ser Asp

450 455 460

aac ctg aaa acc gag atg gat gag tac atc cgt aac cac taa 1434

Asn Leu Lys Thr Glu Met Asp Glu Tyr Ile Arg Asn His

465 470 475

<210>8

<211>477

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>8

Met Phe Lys Asn Ala Phe Ala Asn Leu Gln Lys Val Gly Lys Ser Leu

1 5 10 15

Met Leu Pro Val Ser Val Leu Pro Ile Ala Gly Ile Leu Leu Gly Val

20 25 30

Gly Ser Ala Asn Phe Ser Trp Leu Pro Ala Val Val Ser His Val Met

35 40 45

Ala Glu Ala Gly Gly Ser Val Phe Ala Asn Met Pro Leu Ile Phe Ala

50 55 60

Ile Gly Val Ala Leu Gly Phe Thr Asn Asn Asp Gly Val Ser Ala Leu

65 70 75 80

Ala Ala Val Val ALa Tyr Gly Ile Met Val Lys Thr Met Ala Val Val

85 90 95

Ala Pro Leu Val Leu His Leu Pro Ala Glu Glu Ile Ala Ser Lys His

100 105 110

Leu Ala Asp Thr Gly Val Leu Gly Gly Ile Ile Ser Gly Ala Ile Ala

115 120 125

Ala Tyr Met Phe Asn Arg Phe Tyr Arg Ile Lys Leu Pro Glu Tyr Leu

130 135 140

Gly Phe Phe Ala Gly Lys Arg Phe Val Pro Ile Ile Ser Gly Leu Ala

145 150 155 160

Ala Ile Phe Thr Gly Val Val Leu Ser Phe Ile Trp Pro Pro Ile Gly

165 170 175

Ser Ala Ile Gln Thr Phe Ser Gln Trp Ala Ala Tyr Gln Asn Pro Val

180 185 190

Val Ala Phe Gly Ile Tyr Gly Phe Ile Glu Arg Cys Leu Val Pro Phe

195 200 205

Gly Leu His His Ile Trp Asn Val Pro Phe Gln Met Gln Ile Gly Glu

210 215 220

Tyr Thr Asn Ala Ala Gly Gln Val Phe His Gly Asp Ile Pro Arg Tyr

225 230 235 240

Met Ala Gly Asp Pro Thr Ala Gly Lys Leu Ser Gly Gly Phe Leu Phe

245 250 255

Lys Met Tyr Gly Leu Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ile Trp His Ser Ala

260 265 270

Lys Pro Glu Asn Arg Ala Lys Val Gly Gly Ile Met Ile Ser Ala Ala

275 280 285

Leu Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Thr Glu Pro Ile Glu Phe Ser Phe

290 295 300

Met Phe Val Ala Pro Ile Leu Tyr Ile Ile His Ala Ile Leu Ala Gly

305 310 315 320

Leu Ala Phe Pro Ile Cys Ile Leu Leu Gly Met Arg Asp Gly Thr Ser

325 330 335

Phe Ser His Gly Leu Ile Asp Phe Ile Val Leu Ser Gly Asn Ser Ser

340 345 350

Lys Leu Trp Leu Phe Pro Ile Val Gly Ile Gly Tyr Ala Ile Val Tyr

355 360 365

Tyr Thr Ile Phe Arg Val Leu Ile Lys Ala Leu Asp Leu Lys Thr Pro

370 375 380

Gly Arg Glu Asp Ala Thr Glu Asp Ala Lys Ala Thr Gly Thr Ser Glu

385 390 395 400

Met Ala Pro Ala Leu Val Ala Ala Phe Gly Gly Lys Glu Asn Ile Thr

405 410 415

Asn Leu Asp Ala Cys Ile Thr Arg Leu Arg Val Ser Val Ala Asp Val

420 425 430

Ser Lys Val Asp Gln Ala Gly Leu Lys Lys Leu Gly Ala Ala Gly Val

435 440 445

Val Val Ala Gly Ser Gly Val Gln Ala Ile Phe Gly Thr Lys Ser Asp

450 455 460

Asn Leu Lys Thr Glu Met Asp Glu Tyr Ile Arg Asn His

465 470 475

<210>9

<211>101

<212>DNA

<213>λ噬菌体

<400>9

cctgcttttttat actaagt tggcattata aaaaagcatt gcttatcaat ttgttgcaac 60

gaacaggtca ctatcagtca aaataaaatc attatttgat t 101

<210>10

<211>172

<212>DNA

<213>λ噬菌体

<400>10

gcgctaatgc tctgttacag gtcactaata ccatctaagt agttgattca tagtgactgc 60

atatgttgtg ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata 120

ttgatattta tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaact tg 172

<210>11

<211>120

<212>DNA

<213>λ噬菌体

<400>11

agatcttgaa gcctgctttt ttatactaag ttggcattat aaaaaagcat tgcttatcaa 60

tttgttgcaa cgaacaggtc actatcagtc aaaataaaat cattatttga tttcgaattc 120

<210>12

<211>184

<212>DNA

<213>λ噬菌体

<400>12

ctgcagtctg ttacaggtca ctaataccat ctaagtagtt gattcatagt gactgcatat 60

gttgtgtttt acagtattat gtagtctgtt ttttatgcaa aatctaattt aatatattga 120

tatttatatc attttacgtt tctcgttcag cttttttata ctaacttgag cgtctagaaa 180

gctt 184

<210>13

<211>1071

<212>DNA

<213>λ噬菌体

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1071)

<400>13

atg gga aga agg cga agt cat gag cgc cgg gat tta ccc cct aac ctt 48

Met Gly Arg Arg Arg Ser His Glu Arg Arg Asp Leu Pro Pro Asn Leu

1 5 10 15

tat ata aga aac aat gga tat tac tgc tac agg gac cca agg acg ggt 96

Tyr Ile Arg Asn Asn Gly Tyr Tyr Cys Tyr Arg Asp Pro Arg Thr Gly

20 25 30

aaa gag ttt gga tta ggc aga gac agg cga atc gca atc act gaa gct 144

Lys Glu Phe Gly Leu Gly Arg Asp Arg Arg Ile Ala Ile Thr Glu Ala

35 40 45

ata cag gcc aac att gag tta ttt tca gga cac aaa cac aag cct ctg 192

Ile Gln Ala Asn Ile Glu Leu Phe Ser Gly His Lys His Lys Pro Leu

50 55 60

aca gcg aga atc aac agt gat aat tcc gtt acg tta cat tca tgg ctt 240

Thr Ala Arg Ile Asn Ser Asp Asn Ser Val Thr Leu His Ser Trp Leu

65 70 75 80

gat cgc tac gaa aaa atc ctg gcc agc aga gga atc aag cag aag aca 288

Asp Arg Tyr Glu Lys Ile Leu Ala Ser Arg Gly Ile Lys Gln Lys Thr

85 90 95

ctc ata aat tac atg agc aaa att aaa gca ata agg agg ggt ctg cct 336

Leu Ile Asn Tyr Met Ser Lys Ile Lys Ala Ile Arg Arg Gly Leu Pro

100 105 110

gat gct cca ctt gaa gac atc acc aca aaa gaa att gcg gca atg ctc 384

Asp Ala Pro Leu Glu Asp Ile Thr Thr Lys Glu Ile Ala Ala Met Leu

115 120 125

aat gga tac ata gac gag ggc aag gcg gcg tca gcc aag tta atc aga 432

Asn Gly Tyr Ile Asp Glu Gly Lys Ala Ala Ser Ala Lys Leu Ile Arg

130 135 140

tca aca ctg agc gat gca ttc cga gag gca ata gct gaa ggc cat ata 480

Ser Thr Leu Ser Asp Ala Phe Arg Glu Ala Ile Ala Glu Gly His Ile

145 150 155 160

aca aca aac cat gtc gct gcc act cgc gca gca aaa tca gag gta agg 528

Thr Thr Asn His Val Ala Ala Thr Arg Ala Ala Lys Ser Glu Val Arg

165 170 175

aga tca aga ctt acg gct gac gaa tac ctg aaa att tat caa gca gca 576

Arg Set Arg Leu Thr Ala Asp Glu Tyr Leu Lys Ile Tyr Gln Ala Ala

180 185 190

gaa tca tca cca tgt tgg ctc aga ctt gca atg gaa ctg gct gtt gtt 624

Glu Ser Ser Pro Cys Trp Leu Arg Leu Ala Met Glu Leu Ala Val Val

195 200 205

acc ggg caa cga gtt ggt gat tta tgc gaa atg aag tgg tct gat atc 672

Thr Gly Gln Arg Val Gly Asp Leu Cys Glu Met Lys Trp Ser Asp Ile

210 215 220

gta gat gga tat ctt tat gtc gag caa agc aaa aca ggc gta aaa att 720

Val Asp Gly Tyr Leu Tyr Val Glu Gln Ser Lys Thr Gly Val Lys Ile

225 230 235 240

gcc atc cca aca gca ttg cat att gat gct ctc gga ata tca atg aag 768

Ala Ile Pro Thr Ala Leu His Ile Asp Ala Leu Gly Ile Ser Met Lys

245 250 255

gaa aca ctt gat aaa tgc aaa gag att ctt ggc gga gaa acc ata att 816

Glu Thr Leu Asp Lys Cys Lys Glu Ile Leu Gly Gly Glu Thr Ile Ile

260 265 270

gca tct act cgt cgc gaa ccg ctt tca tcc ggc aca gta tca agg tat 864

Ala Ser Thr Arg Arg Glu Pro Leu Ser Ser Gly Thr Val Ser Arg Tyr

275 280 285

ttt atg cgc gca cga aaa gca tca ggt ctt tcc ttc gaa ggg gat ccg 912

Phe Met Arg Ala Arg Lys Ala Ser Gly Leu Ser Phe Glu Gly Asp Pro

290 295 300

cct acc ttt cac gag ttg cgc agt ttg tct gca aga ctc tat gag aag 960

Pro Thr Phe His Glu Leu Arg Ser Leu Ser Ala Arg Leu Tyr Glu Lys

305 310 315 320

cag ata agc gat aag ttt gct caa cat ctt ctc ggg cat aag tcg gac 1008

Gln Ile Ser Asp Lys Phe Ala Gln His Leu Leu Gly His Lys Ser Asp

325 330 335

acc atg gca tca cag tat cgt gat gac aga ggc agg gag tgg gac aaa 1056

Thr Met Ala Ser Gln Tyr Arg Asp Asp Arg Gly Arg Glu Trp Asp Lys

340 345 350

att gaa atc aaa taa 1071

Ile Glu Ile Lys

355

<210>14

<211>356

<212>PRT

<213>λ噬菌体

<400>14

Met Gly Arg Arg Arg Ser His Glu Arg Arg Asp Leu Pro Pro Asn Leu

1 5 10 15

Tyr Ile Arg Asn Asn Gly Tyr Tyr Cys Tyr Arg Asp Pro Arg Thr Gly

20 25 30

Lys Glu Phe Gly Leu Gly Arg Asp Arg Arg Ile Ala Ile Thr Glu Ala

35 40 45

Ile Gln Ala Asn Ile Glu Leu Phe Ser Gly His Lys His Lys Pro Leu

50 55 60

Thr Ala Arg Ile Asn Ser Asp Asn Ser Val Thr Leu His Ser Trp Leu

65 70 75 80

Asp Arg Tyr Glu Lys Ile Leu Ala Ser Arg Gly Ile Lys Gln Lys Thr

85 90 95

Leu Ile Asn Tyr Met Ser Lys Ile Lys Ala Ile Arg Arg Gly Leu Pro

100 105 110

Asp Ala Pro Leu Glu Asp Ile Thr Thr Lys Glu Ile Ala Ala Met Leu

115 120 125

Asn Gly Tyr Ile Asp Glu Gly Lys Ala Ala Ser Ala Lys Leu Ile Arg

130 135 140

Ser Thr Leu Ser Asp Ala Phe Arg Glu Ala Ile Ala Glu Gly His Ile

145 150 155 160

Thr Thr Asn His Val Ala Ala Thr Arg Ala Ala Lys Ser Glu Val Arg

165 170 175

Arg Ser Arg Leu Thr Ala Asp Glu Tyr Leu Lys Ile Tyr Gln Ala Ala

180 185 190

Glu Ser Ser Pro Cys Trp Leu Arg Leu Ala Met Glu Leu Ala Val Val

195 200 205

Thr Gly Gln Arg Val Gly Asp Leu Cys Glu Met Lys Trp Ser Asp Ile

210 215 220

Val Asp Gly Tyr Leu Tyr Val Glu Gln Ser Lys Thr Gly Val Lys Ile

225 230 235 240

Ala Ile Pro Thr Ala Leu His Ile Asp Ala Leu Gly Ile Ser Met Lys

245 250 255

Glu Thr Leu Asp Lys Cys Lys Glu Ile Leu Gly Gly Glu Thr Ile Ile

260 265 270

Ala Ser Thr Arg Arg Glu Pro Leu Ser Ser Gly Thr Val Ser Arg Tyr

275 280 285

Phe Met Arg Ala Arg Lys Ala Ser Gly Leu Ser Phe Glu Gly Asp Pro

290 295 300

Pro Thr Phe His Glu Leu Arg Ser Leu Ser Ala Arg Leu Tyr Glu Lys

305 310 315 320

Gln Ile Ser Asp Lys Phe Ala Gln His Leu Leu Gly His Lys Ser Asp

325 330 335

Thr Met Ala Ser Gln Tyr Arg Asp Asp Arg Gly Arg Glu Trp Asp Lys

340 345 350

Ile Glu Ile Lys

355

<210>15

<211>219

<212>DNA

<213>λ噬菌体

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(219)

<400>15

atg tac ttg aca ctt cag gag tgg aac gca cgc cag cga cgt cca aga 48

Met Tyr Leu Thr Leu Gln Glu Trp Asn Ala Arg Gln Arg Arg Pro Arg

1 5 10 15

agc ctt gaa aca gtt cgt cga tgg gtt cgg gaa tgc agg ata ttc cca 96

Ser Leu Glu Thr Val Arg Arg Trp Val Arg Glu Cys Arg Ile Phe Pro

20 25 30

cct ccg gtt aag gat gga aga gag tat ctg ttc cac gaa tca gcg gta 144

Pro Pro Val Lys Asp Gly Arg Glu Tyr Leu Phe His Glu Ser Ala Val

35 40 45

aag gtt gac tta aat cga cca gta aca ggt ggc ctt ttg aag agg atc 192

Lys Val Asp Leu Asn Arg Pro Val Thr Gly Gly Leu Leu Lys Arg Ile

50 55 60

aga aat ggg aag aag gcg aag tca tga 219

Arg Asn Gly Lys Lys Ala Lys Ser

65 70

<210>16

<211>72

<212>PRT

<213>λ噬菌体

<400>16

Met Tyr Leu Thr Leu Gln Glu Trp Asn Ala Arg Gln Arg Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser Leu Glu Thr Val Arg Arg Trp Val Arg Glu Cys Arg Ile Phe Pro

20 25 30

Pro Pro Val Lys Asp Gly Arg Glu Tyr Leu Phe His Glu Ser Ala Val

35 40 45

Lys Val Asp Leu Asn Arg Pro Val Thr Gly Gly Leu Leu Lys Arg Ile

50 55 60

Arg Asn Gly Lys Lys Ala Lys Ser

65 70

<210>17

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P1

<400>17

ctagtaagat cttgaagcct gcttttttat actaagttgg 40

<210>18

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P2

<400>18

atgatcgaat tcgaaatcaa ataatgattt tattttgact g 41

<210>19

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P3

<400>19

atgccactgc agtctgttac aggtcactaa taccatctaa g 41

<210>20

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P4

<400>20

accgttaagc tttctagacg ctcaagttag tataaaaaag ctgaac 46

<210>21

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P5

<400>21

ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgc 38

<210>22

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P6

<400>22

taacagagat ctcgcgcaga aaaaaaggat ctcaaga 37

<210>23

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P7

<400>23

aacagagatc taagcttaga tcctttgcct ggcggcagta gcgcgg 46

<210>24

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P8

<400>24

ataaactgca gcaaaaagag tttgtagaaa cgcaa 35

<210>25

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P9

<400>25

agtaattcta gaaagcttaa cacagaaaaa agcccg 36

<210>26

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P10

<400>26

ctagtaggat ccctgcagtg gtcgaaaaaa aaagcccgca ctg 43

<210>27

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P11

<400>27

atcgaggtac cagatctccg gataagtaga cagcctg 37

<210>28

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P12

<400>28

gaaggtctag agcgcccggt tgacgctgct ag 32

<210>29

<211>1388

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>包含四环素抗性基因(pBR322的小EcoRI-Van91I片段)和转录终止子ter_thrL的克隆的DNA片段EcoRI-PstI

<400>29

gaattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctttaa tgcggtagtt tatcacagtt 60

aaattgctaa cgcagtcagg caccgtgtat gaaatctaac aatgcgctca tcgtcatcct 120

cggcaccgtc accctggatg ctgtaggcat aggcttggtt atgccggtac tgccgggcct 180

cttgcgggat atcgtccatt ccgacagcat cgccagtcac tatggcgtgc tgctagcgct 240

atatgcgttg atgcaatttc tatgcgcacc cgttctcgga gcactgtccg accgctttgg 300

ccgccgccca gtcctgctcg cttcgctact tggagccact atcgactacg cgatcatggc 360

gaccacaccc gtcctgtgga tcctctacgc cggacgcatc gtggccggca tcaccggcgc 420

cacaggtgcg gttgctggcg cctatatcgc cgacatcacc gatggggaag atcgggctcg 480

ccacttcggg ctcatgagcg cttgtttcgg cgtgggtatg gtggcaggcc ccgtggccgg 540

gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg tgctcaacgg 600

cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag agcgtcgacc 660

gatgcccttg agagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat 720

cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc 780

gctctgggtc attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc gcgacgatga tcggcctgtc 840

gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac 900

caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg gcggccgacg cgctgggcta 960

cgtcttgctg gcgttcgcga cgcgaggctg gatggccttc cccattatga ttcttctcgc 1020

ttccggcggc atcgggatgc ccgcgttgca ggccatgctg tccaggcagg tagatgacga 1080

ccatcaggga cagcttcaag gatcgctcgc ggctcttacc agcctaactt cgatcactgg 1140

accgctgatc gtcacggcga tttatgccgc ctcggcgagc acatggaacg ggttggcatg 1200

gattgtaggc gccgccctat accttgtctg cctccccgcg ttgcgtcgcg gtgcatggag 1260

ccgggccacc tcgacctgaa tggaagccgg cggcacctcg ctaacggatt caccactcca 1320

actagaaagc ttaacacaga aaaaagcccg cacctgacag tgcgggcttt ttttttcgac 1380

cactgcag 1388

<210>30

<211>1162

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有人工DNA片段的克隆的DNA片段，所述人工DNA片段包含启动子PA2(噬菌体T7的早期启动子)、氯霉素抗性的cat基因(CmR)、转录终止子ter_thrL和attR

<400>30

agatctccgg ataagtagac agcctgataa gtcgcacgaa aaacaggtat tgacaacatg 60

aagtaacatg cagtaagata caaatcgcta ggtaacacta gcagcgtcaa ccgggcgctc 120

tagctagagc caagctagct tggccggatc cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa 180

tggagaaaaa aatcactgga tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac 240

attttgaggc atttcagtca gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata 300

ttacggcctt tttaaagacc gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc 360

acattcttgc ccgcctgatg aatgctcatc cggaattccg tatggcaatg aaagacggtg 420

agctggtgat atgggatagt gttcaccctt gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa 480

cgttttcatc gctctggagt gaataccacg acgatttccg gcagtttcta cacatatatt 540

cgcaagatgt ggcgtgttac ggtgaaaacc tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga 600

atatgttttt cgtctcagcc aatccctggg tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg 660

ccaatatgga caacttcttc gcccccgttt tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg 720

acaaggtgct gatgccgctg gcgattcagg ttcatcatgc cgtctgtgat ggcttccatg 780

tcggcagaat gcttaatgaa ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaat 840

ttttttaagg cagttattgg tgcccttaaa cgcctggtgc tacgcctgaa taagtgataa 900

taagcggatg aatggcagaa attcgtcgaa gcttaacaca gaaaaaagcc cgcacctgac 960

agtgcgggct ttttttttcg accactgcag tctgttacag gtcactaata ccatctaagt 1020

agttgattca tagtgactgc atatgttgtg ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat 1080

gcaaaatcta atttaatata ttgatattta tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt 1140

tatactaact tgagcgtcta ga 1162

<210>31

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P1’

<400>31

ctaatatcga tgaagattct tgctcaa 27

<210>32

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P2’

<400>32

gcgttgaatt ccatacaacc tccttagtac atgc 34

<210>33

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P3’

<400>33

gtactagaat tcgtgtaatt gcggagactt tgcg 34

<210>34

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P4’

<400>34

aatagcctgc agttatttga tttcaatttt gtcccactcc c 41

<210>35

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P5’

<400>35

ttct tagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgc 38

<210>36

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P6’

<400>36

taacagagat ctagcgcaga aaaaaaggat ctcaaga 37

<210>37

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P7’

<400>37

ataaactgca gcaaaaagag tttgtagaaa cgcaa 35

<210>38

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P8’

<400>38

aacagaagct ttttgcctgg cggcagtagc gcgg 34

<210>39

<211>879

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有cI阻抑基因和启动子区的克隆的DNA片段

<400>39

tcgatgaaga ttcttgctca attgttatca gctatgcgcc gaccagaaca ccttgccgat 60

cagccaaacg tctcttcagg ccactgacta gcgataactt tccccacaac ggaacaactc 120

tcattgcatg ggatcattgg gtactgtggg tttagtggtt gtaaaaacac ctgaccgcta 180

tccctgatca gtttcttgaa ggtaaactca tcacccccaa gtctggctat gcagaaatca 240

cctggctcaa cagcctgctc agggtcaacg agaattaaca ttccgtcagg aaagcttggc 300

ttggagcctg ttggtgcggt catggaatta ccttcaacct caagccagaa tgcagaatca 360

ctggcttttt tggttgtgct tacccatctc tccgcatcac ctttggtaaa ggttctaagc 420

tcaggtgaga acatccctgc ctgaacatga gaaaaaacag ggtactcata ctcacttcta 480

agtgacggct gcatactaac cgcttcatac atctcgtaga tttctctggc gattgaaggg 540

ctaaattctt caacgctaac tttgagaatt tttgcaagca atgcggcgtt ataagcattt 600

aatgcattga tgccattaaa taaagcacca acgcctgact gccccatccc catcttgtct 660

gcgacagatt cctgggataa gccaagttca tttttctttt tttcataaat tgctttaagg 720

cgacgtgcgt cctcaagctg ctcttgtgtt aatggtttct tttttgtgct catacgttaa 780

atctatcacc gcaagggata aatatctaac accgtgcgtg ttgactattt tacctctggc 840

ggtgataatg gttgcatgta ctaaggaggt tgtatggaa 879

<210>40

<211>1290

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有int-xis基因的克隆的DNA片段

<400>40

attatttgat ttcaattttg tcccactccc tgcctctgtc atcacgatac tgtgatgcca 60

tggtgtccga cttatgcccg agaagatgtt gagcaaactt atcgcttatc tgcttctcat 120

agagtcttgc agacaaactg cgcaactcgt gaaaggtagg cggatcccct tcgaaggaaa 180

gacctgatgc ttttcgtgcg cgcataaaat accttgatac tgtgccggat gaaagcggtt 240

cgcgacgagt agatgcaatt atggtttctc cgccaagaat ctctttgcat ttatcaagtg 300

tttccttcat tgatattccg agagcatcaa tatgcaatgc tgttgggatg gcaattttta 360

cgcctgtttt gctttgctcg acataaagat atccatctac gatatcagac cacttcattt 420

cgcataaatc accaactcgt tgcccggtaa caacagccag ttccattgca agtctgagcc 480

aacatggtga tgattctgct gcttgataaa ttttcaggta ttcgtcagcc gtaagtcttg 540

atctccttac ctctgatttt gctgcgcgag tggcagcgac atggtttgtt gttatatggc 600

cttcagctat tgcctctcgg aatgcatcgc tcagtgttga tctgattaac ttggctgacg 660

ccgccttgcc ctcgtctatg tatccattga gcattgccgc aatttctttt gtggtgatgt 720

cttcaagtgg agcatcaggc agacccctcc ttattgcttt aattttgctc atgtaattta 780

tgagtgtctt ctgcttgatt cctctgctgg ccaggatttt ttcgtagcga tcaagccatg 840

aatgtaacgt aacggaatta tcactgttga ttctcgctgt cagaggcttg tgtttgtgtc 900

ctgaaaataa ctcaatgttg gcctgtatag cttcagtgat tgcgattcgc ctgtctctgc 960

ctaatccaaa ctctttaccc gtccttgggt ccctgtagca gtaatatcca ttgtttctta 1020

tataaaggtt agggggtaaa tcccggcgct catgacttcg ccttcttccc atttctgatc 1080

ctcttcaaaa ggccacctgt tactggtcga tttaagtcaa cctttaccgc tgattcgtgg 1140

aacagatact ctcttccatc cttaaccgga ggtgggaata tcctgcattc ccgaacccat 1200

cgacgaactg tttcaaggct tcttggacgt cgctggcgtg cgttccactc ctgaagtgtc 1260

aagtacatcg caaagtctcc gcaattacac 1290

<210>41

<211>351

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ter_rrnB片段(补体)

<400>41

caaaaagagt ttgtagaaac gcaaaaaggc catccgtcag gatggccttc tgcttaattt 60

gatgcctggc agtttatggc gggcgtcctg cccgccaccc tccgggccgt tgcttcgcaa 120

cgttcaaatc cgctcccggc ggatttgtcc tactcaggag agcgttcacc gacaaacaac 180

agataaaacg aaaggcccag tctttcgact gagcctttcg ttttatttga tgcctggcag 240

ttccctactc tcgcatgggg agaccccaca ctaccatcgg cgctacggcg tttcacttct 300

gagttcggca tggggtcagg tgggaccacc gcgctactgc cgccaggcaa a

<210>42

<211>2148

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2148)

<223>

<400>42

atg aac gtt att gca ata ttg aat cac atg ggg gtt tat ttt aaa gaa 48

Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1 5 10 15

gaa ccc atc cgt gaa ctt cat cgc gcg ctt gaa cgt ctg aac ttc cag 96

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

20 25 30

att gtt tac ccg aac gac cgt gac gac tta tta aaa ctg atc gaa aac 144

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45

aat gcg cgt ctg tgc ggc gtt att ttt gac tgg gat aaa tat aat ctc 192

Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60

gag ctg tgc gaa gaa att agc aaa atg aac gag aac ctg ccg ttg tac 240

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

gcg ttc gct aat acg tat tcc act ctc gat gta agc ctg aat gac ctg 288

Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95

cgt tta cag att agc ttc ttt gaa tat gcg ctg ggt gct gct gaa gat 336

Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110

att gct aat aag atc aag cag acc act gac gaa tat atc aac act att 384

Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

115 120 125

ctg cct ccg ctg act aaa gca ctg ttt aaa tat gtt cgt gaa ggt aaa 432

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140

tat act ttc tgt act cct ggt cac atg ggc ggt act gca ttc cag aaa 480

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

agc ccg gta ggt agc ctg ttc tat gat ttc ttt ggt ccg aat acc atg 528

Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

165 170 175

aaa tct gat att tcc att tca gta tct gaa ctg ggt tct ctg ctg gat 576

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

cac agt ggt cca cac aaa gaa gca gaa cag tat atc gct cgc gtc ttt 624

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205

aac gca gac cgc agc tac atg gtg acc aac ggt act tcc act gcg aac 672

Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

aaa att gtt ggt atg tac tct gct cca gca ggc agc acc att ctg att 720

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile

225 230 235 240

gac cgt aac tgc cac aaa tcg ctg acc cac ctg atg atg atg agc gat 768

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255

gtt acg cca atc tat ttc cgc ccg acc cgt aac gct tac ggt att ctt 816

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

ggt ggt atc cca cag agt gaa ttc cag cac gct acc att gct aag cgc 864

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

275 280 285

gtg aaa gaa aca cca aac gca acc tgg ccg gta cat gct gta att acc 912

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

aac tct acc tat gat ggt ctg ctg tac aac acc gac ttc atc aag aaa 960

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Le u Leu Tyr Asn ThrAsp Phe Ile Lys Lys

305 310 315 320

aca ctg gat gtg aaa tcc atc cac ttt gac tcc gcg tgg gtg cct tac 1008

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val ProTyr

325 330 335

acc aac ttc tca ccg att tac gaa ggt aaa tgc ggt atg agc ggt ggc 1056

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

340 345 350

cgt gta gaa ggg aaa gtg att tac gaa acc cag tcc act cac aaa ctg 1104

Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

ctg gcg gcg ttc tct cag gct tcc atg atc cac gtt aaa ggt gac gta 1152

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

370 375 380

aac gaa gaa acc ttt aac gaa gcc tac atg atg cac acc acc act tct 1200

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

ccg cac tac ggt atc gtg gcg tcc act gaa acc gct gcg gcg atg atg 1248

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

aaa ggc aat gca ggt aag cgt ctg atc aac ggt tct att gaa cgt gcg 1296

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430

atc aaa ttc cgt aaa gag atc aaa cgt ctg aga acg gaa tct gat ggc 1344

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

435 440 445

tgg ttc ttt gat gta tgg cag ccg gat cat atc gat acg act gaa tgc 1392

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

450 455 460

tgg ccg ctg cgt tct gac agc acc tgg cac ggc ttc aaa aac atc gat 1440

Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465 470 475 480

aac gag cac atg tat ctt gac ccg atc aaa gtc acc ctg ctg act ccg 1488

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

ggg atg gaa aaa gac ggc acc atg agc gac ttt ggt att ccg gcc agc 1536

Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

atc gtg gcg aaa tac ctc gac gaa cat ggc atc gtt gtt gag aaa acc 1584

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

ggt ccg tat aac ctg ctg ttc ctg ttc agc atc ggt atc gat aag acc 1632

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

aaa gca ctg agc ctg ctg cgt gct ctg act gac ttt aaa cgt gcg ttc 1680

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

545 550 555 560

gac ctg aac ctg cgt gtg aaa aac atg ctg ccg tct ctg tat cgt gaa 1728

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

gat cct gaa ttc tat gaa aac atg cgt att cag gaa ctg gct cag aat 1776

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590

atc cac aaa ctg att gtt cac cac aat ctg ccg gat ctg atg tat cgc 1824

Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605

gca ttt gaa gtg ctg ccg acg atg gta atg act ccg tat gct gca ttc 1872

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

610 615 620

cag aaa gag ctg cac ggt atg acc gaa gaa gtt tac ctc gac gaa atg 1920

Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met

625 630 635 640

gta ggt cgt att aac gcc aat atg atc ctt ccg tac ccg ccg gga gtt 1968

Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

cct ctg gta atg ccg ggt gaa atg atc acc gaa gaa agc cgt ccg gtt 2016

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

ctg gag ttc ctg cag atg ctg tgt gaa atc ggc gct cac tat ccg ggc 2064

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

ttt gaa acc gat att cac ggt gca tac cgt cag gct gat ggc cgc tat 2112

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700

acc gtt aag gta ttg aaa gaa gaa agc aaa aaa taa 2148

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys

705 710 715

<210>43

<211>715

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>43

Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1 5 10 15

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

20 25 30

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45

Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110

Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

115 120 125

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

165 170 175

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205

Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

275 280 285

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

340 345 350

Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

370 375 380

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

450 455 460

Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465 470 475 480

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590

Ile His Lys Leu Ile Val Hi s His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

610 615 620

Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met

625 630 635 640

Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys

705 710 715

<210>44

<211>2142

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2142)

<223>

<400>44

atg aac atc att gcc att atg gga ccg cat ggc gtc ttt tat aaa gat 48

Met Asn Ile Ile Ala Ile Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

gag ccc atc aaa gaa ctg gag tcg gcg ctg gtg gcg caa ggc ttt cag 96

Glu Pro Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gln Gly Phe Gln

20 25 30

att atc tgg cca caa aac agc gtt gat ttg ctg aaa ttt atc gag cat 144

Ile Ile Trp Pro Gln Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe Ile Glu His

35 40 45

aac cct cga att tgc ggc gtg att ttt gac tgg gat gag tac agt ctc 192

Asn Pro Arg Ile Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu

50 55 60

gat tta tgt agc gat atc aat cag ctt aat gaa tat ctc ccg ctt tat 240

Asp Leu Cys Ser Asp Ile Asn Gln Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

gcc ttc atc aac acc cac tcg acg atg gat gtc agc gtg cag gat atg 288

Ala Phe Ile Asn Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gln Asp Met

85 90 95

cgg atg gcg ctc tgg ttt ttt gaa tat gcg ctg ggg cag gcg gaa gat 336

Arg Met Ala Leu Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gln Ala Glu Asp

100 105 110

atc gcc att cgt atg cgt cag tac acc gac gaa tat ctt gat aac att 384

Ile Ala Ile Arg Met Arg Gln Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ile

115 120 125

aca ccg ccg ttc acg aaa gcc ttg ttt acc tac gtc aaa gag cgg aag 432

Thr Pro Pro PheThr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys

130 135 140

tac acc ttt tgt acg ccg ggg cat atg ggc ggc acc gca tat caa aaa 480

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gln Lys

145 150 155 160

agc ccg gtt ggc tgt ctg ttt tat gat ttt ttc ggc ggg aat act ctt 528

Ser Pro Val Gly Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu

165 170 175

aag gct gat gtc tct att tcg gtc acc gag ctt ggt tcg ttg ctc gac 576

Lys Ala Asp Val Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

cac acc ggg cca cac ctg gaa gcg gaa gag tac atc gcg cgg act ttt 624

His Thr Gly Pro His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe

195 200 205

ggc gcg gaa cag agt tat atc gtt acc aac gga aca tcg acg tcg aac 672

Gly Ala Glu Gln Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn

210 215 220

aaa att gtg ggt atg tac gcc gcg cca tcc ggc agt acg ctg ttg atc 720

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile

225 230 235 240

gac cgc aat tgt cat aaa tcg ctg gcg cat ctg ttg atg atg aac gat 768

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp

245 250 255

gta gtg cca gtc tgg ctg aaa ccg acg cgt aat gcg ttg ggg att ctt 816

Val Val Pro Val Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly Ile Leu

260 265 270

ggt ggg atc ccg cgc cgt gaa ttt act cgc gac agc atc gaa gag aaa 864

Gly Gly Ile Pro Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys

275 280 285

gtc gct gct acc acg caa gca caa tgg ccg gtt cat gcg gtg atc acc 912

Val Ala Ala Thr Thr Gln Ala Gln Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

aac tcc acc tat gat ggc ttg ctc tac aac acc gac tgg atc aaa cag 960

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp Ile Lys Gln

305 310 315 320

acg ctg gat gtc ccg tcg att cac ttc gat tct gcc tgg gtg ccg tac 1008

Thr Leu Asp Val Pro Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

acc cat ttt cat ccg atc tac cag ggt aaa agt ggt atg agc ggc gag 1056

Thr His Phe His Pro Ile Tyr Gln Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu

340 345 350

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Arg Val Ala Gly Lys Val Ile Phe Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Met

355 360 365

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Leu Ala Ala Leu Ser Gln Ala Ser Leu Ile His Ile Lys Gly Glu Tyr

370 375 380

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Asp Glu Glu Ala Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

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Pro Ser Tyr Pro Ile Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu

405 410 415

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Arg Gly Asn Pro Gly Lys Arg Leu Ile Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala

420 425 430

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Leu His Phe Arg Lys Glu Val Gln Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly

435 440 445

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Trp Phe Phe Asp Ile Trp Gln Pro Pro Gln Val Asp Glu Ala Glu Cys

450 455 460

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Trp Pro Val Ala Pro Gly Glu Gln Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp

465 470 475 480

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Ala Asp His Met Phe Leu Asp Pro Val Lys Val Thr Ile Leu Thr Pro

485 490 495

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Gly Met Asp Glu Gln Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly Ile Pro Ala Ala

500 505 510

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Leu Val Ala Lys Phe Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

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Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

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Lys Ala Met Gly Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr

545 550 555 560

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Asp Leu Asn Leu Arg Ile Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu

565 570 575

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Asp Pro Asp Phe Tyr Arg Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu Ala Gln Gly

580 585 590

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Ile His Lys Leu Ile Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg

595 6006 05

gca ttc gat act ttg ccg gag atg atc atg acg cca cat cag gca tgg 1872

Ala Phe Asp Thr Leu Pro Glu Met Ile Met Thr Pro His Gln Ala Trp

610 615 620

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Gln Ara Gln Ile Lys Gly Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Glu Gln Leu

625 630 635 640

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Val Gly Arg Val Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

ccg ctg ttg atg cct gga gaa atg ctg acc aaa gag agc cgc aca gta 2016

Pro Leu Leu Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val

660 665 670

crc gat ttt cta ctg atg ctt tgt tcc gtc ggg caa cat tac ccc ggt 2064

Leu Asp Phe Leu Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gln His Tyr Pro Gly

675 680 685

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Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Lys Gln Asp Glu Asp Gly Val Tyr

690 695 700

cgc gta cga gtc cta aaa atg gcg gga taa 2142

Arg Val Arg Val Leu Lys Met Ala Gly

705 710

<210>45

<211>713

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>45

Met Asn Ile Ile Ala Ile Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Glu Pro Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gln Gly Phe Gln

20 25 30

Ile Ile Trp Pro Gln Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe Ile Glu His

35 40 45

Asn Pro Arg Ile Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu

50 55 60

Asp Leu Cys Ser Asp Ile Asn Gln Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ile Asn Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gln Asp Met

85 90 95

Arg Met Ala Leu Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gln Ala Glu Asp

100 105 110

Ile Ala Ile Arg Met Arg Gln Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ile

115 120 125

Thr Pro Pro Phe Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys

130 135 140

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145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu

165 170 175

Lys Ala Asp Val Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

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195 200 205

Gly Ala Glu Gln Ser Tyr Il e Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp

245 250 255

Val Val Pro Val Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys

275 280 285

Val Ala Ala Thr Thr Gln Ala Gln Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp Ile Lys Gln

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Pro Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr His Phe His Pro Ile Tyr Gln Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu

340 345 350

Arg Val Ala Gly Lys Val Ile Phe Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Met

355 360 365

Leu Ala Ala Leu Ser Gln Ala Ser Leu Ile His Ile Lys Gly Glu Tyr

370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

Arg Gly Asn Pro Gly Lys Arg Leu Ile Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala

420 425 430

Leu His Phe Arg Lys Gl u Val Gln Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Ile Trp Gln Pro Pro Gln Val Asp Glu Ala Glu Cys

450 455 460

Trp Pro Val Ala Pro Gly Glu Gln Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp

465 470 475 480

Ala Asp His Met Phe Leu Asp Pro Val Lys Val Thr Ile Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Asp Glu Gln Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly Ile Pro Ala Ala

500 505 510

Leu Val Ala Lys Phe Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Met Gly Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Ile Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu

565 570 575

Asp Pro Asp Phe Tyr Arg Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu Ala Gln Gly

580 585 590

Ile His Lys Leu Ile Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg

595 600 605

Ala Phe Asp Thr Leu Pro Glu Met Ile Met Thr Pro His Gln Ala Trp

610 615 620

Gln Arg Gln Ile Lys Gly Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Glu Gln Leu

625 630 635 640

Val Gly Arg Val Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Leu Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val

660 665 670

Leu Asp Phe Leu Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gln His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile Hi s Gly Ala Lys Gln Asp Glu Asp Gly Val Tyr

690 695 700

Arg Val Arg Val Leu Lys Met Ala Gly

705 710

<210>46

<211>54

<212>DNA

<213>人工DNA

<220>

<223>cadA-attL

<400>46

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<210>47

<211>54

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<213>人工DNA

<220>

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<400>47

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<210>48

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<213>人工DNA

<220>

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<400>48

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<210>49

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<212>DNA

<213>人工DNA

<220>

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<400>49

cgccattttt aggactcgta cgcggtaaac gccgtccgtc aagttagtat aaa 53

Claims

1. 用于产生L-氨基酸的方法，其包括：在培养基中培养肠杆菌科的微生物，所述微生物具有产生L-氨基酸的能力，并且经修饰而将β-糖苷PTS活性增强；和从所述培养基或微生物中收集L-氨基酸。

2. 根据权利要求1的方法，其中通过增加编码β-糖苷PTS的bglF基因的拷贝数、修饰该基因的表达调节序列或它们的组合来修饰所述微生物以增强该基因的表达。

3. 根据权利要求1或2的方法，其中所述bglF基因选自下组：

(a)包含SEQ ID NO.5的核苷酸序列的DNA，

(b)在严紧条件下，与SEQ ID NO.5的核苷酸序列的互补序列或能够从所述核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，并且所述DNA编码具有β-糖苷PTS活性的蛋白质。

4. 根据权利要求1或2的方法，其中所述bglF基因编码选自下组的蛋白质：

(A)由SEQ ID NO.6的氨基酸序列组成的蛋白质，

(B)包含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的蛋白质，其包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，并且所述蛋白质具有β-糖苷PTS活性。

5. 根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述微生物是埃希氏菌属或泛菌属的细菌。

6. 根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述L-氨基酸选自下组：L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酸和它们的组合。