CN114134095A - 一种利用嗜盐细菌生产l-赖氨酸和/或1,5-戊二胺的方法 - Google Patents

一种利用嗜盐细菌生产l-赖氨酸和/或1,5-戊二胺的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组菌及其制备方法，以及该重组菌在生产L‑赖氨酸和/或1,5‑戊二胺中的应用。本发明通过将无法生产L‑赖氨酸的盐单胞菌，通过改造生产L‑赖氨酸和1,5‑戊二胺，改造后的重组菌具有很强的生产能力。

Description

一种利用嗜盐细菌生产L-赖氨酸和/或1,5-戊二胺的方法
技术领域
本发明涉及菌种改造技术领域，具体涉及生产L-赖氨酸及1,5-戊二胺的重组菌的分子生物学改造及其应用，涉及分子生物学、基因工程、代谢工程、合成生物学和发酵工程领域。
背景技术
L-赖氨酸作为一种必需氨基酸，是生物体蛋白质的基本组成元素，其在细胞结构的形成、生理环境的维持等方面起着重要作用。L-赖氨酸是微生物发酵生产的一种重要的商业氨基酸，在世界范围内拥有广泛的市场，主要应用在饲料添加剂、食品添加剂和医药等方面。在饲料添加剂方面，添加L-赖氨酸可以提高蛋白质含量，促进猪、家禽、鱼类等动物的生长，并且L-赖氨酸在所有的饲料级氨基酸中占超过50%的份额，具有巨大的市场需求。在食品添加剂方面，L-赖氨酸常作为营养物质添加到各种加工食品中，并且L-赖氨酸通过聚合形成的ε-聚-L-赖氨酸具有广谱的抑菌效果，在食品防腐剂方面具有广泛应用。在医药方面，L-赖氨酸对治疗和预防单纯疱疹病毒（HSV）与复发性的溃疡、冻疮等疾病有显著治疗效果。因此，L-赖氨酸自身作为一种高需求的必需氨基酸具有重要的研究和生产价值。
L-赖氨酸除了作为饲料添加剂具有重要的商业价值外，L-赖氨酸的衍生物还是一些重要化合物的合成前体，可以用于合成附加值高的生物聚合物，进而减少石油和化石燃料的消耗。其中，1,5-戊二胺作为L-赖氨酸的衍生物之一，主要用于合成高性能的生物基尼龙(尼龙45，尼龙56等)材料，并在工程材料、纺织、农业和医药等领域有着广泛的应用。目前，1,5-戊二胺主要是通过化学法合成，而化学合成法除需要利用化石资源外还具有碳排放高的环境不友好问题。因此，1,5-戊二胺通过微生物发酵生产成为一种有前途的替代方法。
L-赖氨酸和1,5-戊二胺均为碱性化合物，非专利文献：Enhanced CadaverineProduction by Engineered Escherichia coli Using Soybean Residue Hydrolysate(SRH) as a Sole Nitrogen Source（Guo et al，Applied Biochemistry andBiotechnology，2021）和General organization of the genes specifically involvedin the diaminopimelate-lysine biosynthetic pathway of Corynebacteriumglutamicum（Yeh et al，MGG Molecular & General Genetics，1988）公开了目前主要在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中发酵生产。然而，谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌在中性环境中生长最佳，在生物生长过程中长期存在被污染的风险，在大规模工业发酵生产中更是需要输入大量的能量进行高温灭菌处理，并且其发酵过程需要补充大量的酸来维持发酵中性的pH值，因此在大规模、低成本工业发展中限制了其竞争优势。
发明内容
为解决现有技术的问题，本申请将原本不产生L-赖氨酸和1,5-戊二胺的菌，经过改造生产L-赖氨酸和/或1,5-戊二胺，开发了低成本的L-赖氨酸和1,5-戊二胺生产平台菌，对工业生产L-赖氨酸及其衍生物具有深远意义。
本发明的第一方面，提供了一种重组菌，所述的重组菌的基因组中包含导入基因，所述的导入基因包含dapA、dapB和lysA，所述的重组菌为盐单胞菌。
优选的，所述的导入基因还包含ppc、lysC和/或lysE。进一步优选的，所述的导入基因还包括ldcC和/或lysP。
所述的dapA、dapB和lysA来源于大肠杆菌基因组。
所述的ppc来源于盐单胞菌基因组。
所述的lysC和/或lysE来源于谷氨酸棒杆菌基因组。在本发明的一个具体实施方式中，所述的lysC和/或lysE经过密码子优化，lysC的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，lysE的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
经过密码子优化的lysC和/或lysE基因虽然来源于革兰氏阳性菌的谷氨酸棒杆菌基因组，却在革兰氏阴性菌的盐单胞菌中很好的表达。
所述的ldcC和/或lysP来源于大肠杆菌。
优选的，所述的导入基因在盐单胞菌中表达。进一步优选的，所述的导入基因在一个或多个质粒上表达或者在重组菌的染色体上表达。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的导入基因在染色体上的相同位置或不同位置表达。
所述的导入基因可以在现有技术中的任何常规启动子下表达。优选的，所述的导入基因在组成型或诱导型启动子下表达。所述的组成型启动子可以为组成型孔蛋白基因porin启动子。优选的，所述的组成型启动子可以为低强度启动子、中等强度启动子或高强度启动子。例如野生型porin、porin221、porin194、porin68、porin42、porin140、porin141、porin3、porin211等。所述的诱导型启动子可以为IPTG诱导型T7启动子。
优选的，所述的导入基因中的每一个可以独立地各自在一个或多个启动子的控制下表达，也可以相互组合用一个或多个启动子的控制下表达。
优选的，所述的导入基因中每个基因可以在一个质粒或几个基因组合在一个或多个质粒上。
优选的，所述的重组菌为嗜碱的盐单胞菌。进一步优选为Halomonas bluephagenesis、Halomonas campaniensis或Halomonas aydingkolgenesis。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组菌选自Halomonas bluephagenesis TD1.0、Halomonas campaniensis LS21、Halomonas campaniensis LC-9或Halomonas aydingkolgenesis M1。
本发明的第二方面，提供了一种重组菌，所述的重组菌的基因组中包含导入基因，所述的导入基因包含dapA、dapB和lysA。
优选的，所述的导入基因还包含ppc、lysC和/或lysE。
进一步优选的，所述的导入基因还包括ldcC和/或lysP。
所述的重组菌为Halomonas bluephagenesis。优选的，所述的重组菌为Halomonas bluephagenesis TD1.0。
本发明的第三方面，提供了一种重组菌，所述的重组菌的基因组中包含导入基因，所述的导入基因包含ldcC和/或lysP。
所述的重组菌为Halomonas campaniensis。优选的，所述的重组菌为Halomonas campaniensis LC-9。
上述的重组菌通过导入基因使得L-赖氨酸输出系统加强和草酰乙酸前体供应增加，更加有效合成L-赖氨酸。
本发明的第四方面，提供了一种上述的重组菌的制备方法，所述的制备方法包括将导入基因导入盐单胞菌。
优选的，采用质粒将导入基因导入盐单胞菌。使得盐单胞菌中过表达导入基因。
优选的，所述的质粒中包含导入基因。
优选的，所述的制备方法优选为基因编辑技术，例如CRISPR-Cas9或者Loxp-cre系统。
在本发明的一个具体实施方式中，采用与大肠杆菌接合转化的方式将导入基因导入盐单胞菌。
优选的，所述的导入为将导入基因插入盐单胞菌的基因组中。本发明的第五方面，提供了一种生产L-赖氨酸的方法，所述的方法包括发酵培养重组菌。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组菌包含导入基因，所述的导入基因为dapA、dapB和lysA。优选还包含ppc、lysC和/或lysE。进一步优选还包括ldcC和/或lysP。所述的重组菌为Halomonas bluephagenesis。
优选的，所述的发酵在开放的条件下进行。
优选的，所述发酵的设备及培养基无需灭菌。
优选的，所述发酵的产物还包含PHA。
本发明的第六方面，提供了一种生产1,5-戊二胺的方法，所述的方法包括发酵培养重组菌。
优选的，发酵的碳源可以为葡萄糖或可以分解为葡萄糖的二糖、多糖等。
优选的，发酵的培养基中包含葡萄糖和/或L-赖氨酸。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组菌包含导入基因，所述的导入基因包含dapA、dapB、lysA、ppc、lysC、lysE、ldcC和lysP。所述的重组菌为Halomonas bluephagenesis。其中，发酵的培养基中包含葡萄糖。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组菌包含导入基因，所述的导入基因为ldcC和lysP，所述的重组菌为Halomonas campaniensis。其中，发酵的培养基中包含L-赖氨酸。
优选的，所述的发酵在开放的条件下进行。
优选的，所述发酵的设备及培养基无需灭菌。
优选的，所述发酵的产物还包含PHA。
优选的，所述的发酵培养基中包含Triton。
优选的，所述生产1,5-戊二胺的方法中包括加入Triton的步骤。
本发明的第七方面，提供了一种生产1,5-戊二胺的方法，所述的方法包括发酵培养两种或以上种重组菌。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法包括发酵培养包含dapA、dapB、lysA、ppc、lysC和lysE的导入基因的Halomonas bluephagenesis，和包含ldcC和lysP的Halomonas campaniensis。
优选的，所述的发酵在开放的条件下进行。
优选的，所述发酵的设备及培养基无需灭菌。
优选的，所述发酵的产物还包含PHA。
优选的，所述的发酵培养基中包含Triton。
优选的，所述生产1,5-戊二胺的方法中包括加入Triton的步骤。
可构建或者选择能快速自凝絮的盐单胞菌，通过自凝絮分离盐单胞菌菌体和含1,5-戊二胺的上清液，然后继续补加L-赖氨酸到盐单胞菌菌体中进行全细胞催化。
优选的，所述的方法还包括纯化1,5-戊二胺的步骤，优选所述的纯化无需离心，利用重组菌的自沉淀特性。
本发明的第八方面，提供了上述重组菌在制备L-赖氨酸和/或1,5-戊二胺中的应用。
本发明的第九方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体包含导入基因。
优选的，所述的表达载体能够在宿主细胞中复制、转录及翻译。因此，其还包含常规的其他表达元件，例如终止子、酶切位点等等。
优选的，所述的表达载体可以为原核表达载体或真核表达载体，优选为原核表达载体。
优选的，所述的表达载体为质粒。
本发明的第十方面，提供了一种包含上述表达载体的细胞。
本发明的效果:
1）本发明构建的生产L-赖氨酸的重组菌Halomonas bluephagenesis TDL8-68-259，在没有经过优化条件下，L-赖氨酸的生产由原来的0提升到23g/L。
2）本发明构建的生产1,5-戊二胺的重组菌Halomonas campaniensis LC-9-ldcC- lysP，以直接添加L-赖氨酸为底物，经过0.05%的triton处理增加细胞膜通透性，使得L-赖氨酸到1,5-戊二胺的转化率提高到100%，并在7L的发酵罐中通过连续发酵产生了高达118g/L的1,5-戊二胺。
3）本发明提高了1,5-戊二胺的从头合成效率，通过将L-赖氨酸生产重组菌Halomonas bluephagenesis TDL8-68-259与1,5-戊二胺生产菌Halomonas campaniensisLC-9-ldcC-lysP进行组合，1,5-戊二胺从头合成的效率提高了96%，并以葡萄糖为底物可产生5.24g/L的1,5-戊二胺。
4）Halomonas campaniensis LC-9本身具有自沉淀的特性，经过改造后依然保留着这一特性，降低了后续产物离心的成本，直接分离高浓度的1,5-戊二胺上清液，减少其毒性，单独使用Halomonas bluephagenesisTDL12-68-259或Halomonas campaniensis LC-9-ldcC-lysP生产1,5-戊二胺可以继续生产或加入L-赖氨酸，继续生产1,5-戊二胺，实现了1,5-戊二胺半连续生产。
本申请简写与全称对照：
ppc：phosphoenolpyruvate carboxylase，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因。
lysC：aspartate kinase，天冬氨酸激酶。lysC T311I为第311位由T突变为I的天冬氨酸激酶的编码序列。
dapA：dihydrodipicolinate synthase，二氢二吡啶酸合酶。dapA H56K：为第56位由H突变为K后的二氢二吡啶酸合酶的编码序列。
dapB：dihydrodipicolinate reductase，二氢二吡啶酸还原酶。
lysA：diaminopimelate decarboxylase，二氨基丙烯酸脱羧酶。
lysE：lysine exporter，L-赖氨酸分泌蛋白。
本发明所述的“PHA”为均聚PHA和/或共聚PHA。优选的，所述的PHA选自3-羟基丁酸（3HB）均聚物PHB，3-羟基丁酸（3HB）和4-羟基丁酸(4HB)二元共聚物P3HB4HB，3-羟基丁酸（3HB）、4-羟基丁酸(4HB)和3-羟基戊酸三元共聚物P(3HB-co-4HB-co-3HV)，3-羟基丁酸（3HB）和3-羟基己酸二元共聚物PHBHHx，3-羟基丙酸（3HP）的均聚物或共聚物，优选的，所述的3-羟基丙酸（3HP）的均聚物为P3HP，优选的，所述的3-羟基丙酸（3HP）的共聚物为P(3HB-co-3HP)或PHBHP。在本发明的一个具体实施方式中，所述的PHA选自3-羟基丁酸均聚物PHB，3-羟基丁酸和4-羟基丁酸二元共聚物P3HB4HB，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基戊酸三元共聚物PHBV4HB，3-羟基丁酸和3-羟基己酸二元共聚物PHBHHx，3-羟基丙酸的均聚物或共聚物，所述的3-羟基丙酸的均聚物为P3HP，所述的3-羟基丙酸的共聚物为P(3HB-co-3HP)或PHBHP。
本发明所述的“导入基因”可以通过一定的方式导入细胞中，其可以是细胞中原本含有的基因种类也可以是细胞中原本不含有的基因种类。当然，其根据实际需要可以调整其具体序列，例如如果是来源于其他种属或者分别来源于革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，则可以进行密码子的喜好性进行优化，例如可以根据更适合产生产物的需要，将基因进行突变，例如为解除产物抑制，将dapA变为dapA H56K或者，将lysC变为lysC T311I。
本发明所述的“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。
本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本问列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
附图说明
图1：通过位点特异性重组基因编辑技术将dapA H56K、dapB、lysA基因整合到盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD1.0基因组的示意图，其中，attP为噬菌体附着位点，lacI为乳糖操纵子，PTac为启动子的调控蛋白基因，Int5为整合酶，attB为细菌附着位点，RK2为复制子，OriT为复制起始位点，CmR为氯霉素耐药，attR和attL均为包含一半attP和一半attB的杂合序列。
图2：重组质粒pSEVA341-P porin -ppc-P porin259 –lysC T311I -lysE的示意图，其中，OriT为复制起点，SpeR为壮观霉素抗性基因，KanR为卡那霉素抗性基因。
图3：在Halomonas bluephagenesis TD1.0基因组上使用不同强度的组成型启动子表达dapA H56K、dapB、lysA基因后细胞干重及生产L-赖氨酸（L-Lysine）的摇瓶结果。
图4：在Halomonas bluephagenesis TDL2-68菌株上表达lysE、lysC T311I和/或ppc基因生产L-赖氨酸的摇瓶结果。
图5：Halomonas bluephagenesis TDL8-68-259在7L的发酵罐中开放式发酵，细胞干重、以及生产L-赖氨酸（L-Lysine）和PHB的情况，其中，PHB含量（wt%）为PHB质量占细胞干重的百分比。
图6：重组质粒pSEVA321-P porin50 -ldcC-P porin70 -lysP的示意图，其中，OriT为复制起点，CmR为氯霉素耐药。
图7：重组菌Halomonas campaniensis LC-9-ldcC-lysP在不同浓度的Triton-X100处理下1,5-戊二胺生产的摇瓶结果，其中，Control为未经Triton-X100处理的对照组，转化率为已转化为1,5-戊二胺的摩尔质量占L-赖氨酸加入总摩尔量的百分比。
图8：重组菌Halomonas campaniensis LC-9-ldcC-lysP在7L的发酵罐中开放式发酵细胞干重、以及生产1,5-戊二胺和PHB的情况。
图9A：重组菌Halomonas bluephagenesis TDL12-68-259从头合成1,5-戊二胺的摇瓶结果。
图9B：组合菌Halomonas bluephagenesis TDL8-68-259和Halomonas campaniensis LC-9-ldcC-lysP从头合成1,5-戊二胺的摇瓶结果，其中，24h+LC-9-ldcC- lysP为TDL8-68-259发酵24h后加LC-9-ldcC-lysP继续组合发酵，No+LC-9-ldcC-lysP为重组菌LC-9-ldcC-lysP单独从头合成1,5-戊二胺的对照组。
图10A：重组菌Halomonas bluephagenesis TDL12-68-259在7L的发酵罐中开放式发酵生产1,5-戊二胺、L-赖氨酸和PHB的情况。
图10B：Halomonas bluephagenesis TDL8-68-259和Halomonas campaniensis LC-9-ldcC-lysP组合在7L的发酵罐中开放式发酵生产1,5-戊二胺、L-赖氨酸和PHB的情况。
具体实施方式
以下内容，以实施例的方式详细描述本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
大肠杆菌生长在LB培养基上，培养基成分配置含有：10g/L的氯化钠，10g/L的蛋白胨（英国OXID公司，产品目录号LP0042），5g/L的酵母提取物（英国OXID公司，产品目录号LP0021）。
盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD1.0在LB60的培养基上培养，其成分除氯化钠的浓度变成60g/L外其它成分同LB一样。
盐单胞菌Halomonas campaniensis LC-9在LB40的培养基上培养，其成分除氯化钠的浓度变成40g/L外其它成分同LB一样。
MMGU60培养基含：60g/L的氯化钠，1g/L的酵母提取物（英国OXID公司，产品目录号LP0021），30g/L的葡萄糖，5g/L的尿素及其它微量元素组成。
大肠杆菌和盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD1.0/LC-9的生长温度均为37℃，200rpm。
Halomonas bluephagenesis TD1.0参见Novel T7-like expression systemsused for Halomonas（Zhao et al，Metabolic Engineering，2017）。
Halomonas campaniensis LC-9具有自沉淀的特性，参见文献Engineering self‐flocculating Halomonas campaniensis for wastewaterless open and continuousfermentation (Linget al，Biotechnology and Bioengineering，2019)或Novel T7-likeexpression systems used for Halomonas（Zhao et al，Metabolic Engineering，2017）或A seawater-based open and continuous process for polyhydroxyalkanoatesproduction by recombinant Halomonas campaniensis LS21 grown in mixedsubstrates（Yueet al，Biotechnology for Biofuels，2014）。
实施例1：构建生产L-赖氨酸的Halomonas bluephagenesis TDL8-68-259
在Halomonas bluephagenesis TD1.0菌株基因组插入dapA H56K基因、dapB基因、lysA基因构建成重组菌Halomonas bluephagenesis TDL2-xx，实现了dapA H56K -dapB-lysA表达模块的稳定表达，并将质粒pSEVA341-P porin -ppc- P porin259 –lysC T311I -lysE结合到Halomonas bluephagenesis THL2-xx菌中构建成重组菌Halomonas bluephagenesis TDL8-xx-259，实现了ppc基因、lysE基因、lysC T311I基因的高强度表达，实现了L-赖氨酸的积累。
具体实验操作如下：
构建生产L-赖氨酸的重组菌Halomonas bluephagenesis TDL8-68-259，获得L-赖氨酸通路中关键合成基因可靠表达的重组菌。实验操作如下：
1）基因组插入dapA H56K基因、dapB基因、lysA基因
构建包含目的基因dapA H56K 、dapB、lysA及对应启动子、RBS元件的基因整合质粒pSEVA321-integrase-P porin XX -dapA H56K -dapB-lysA，其中的porin启动子使用porin221、porin194、porin68、porin42、porin140、porin141、porin3。
构建表达SCre重组酶的切除多余骨架的pSEVA341质粒，其中SCre酶用来切除基因组上插入的Int5整合酶等多余骨架。
表达目的基因dapA H56K 、dapB、lysA的整合质粒pSEVA321和表达SCre酶的pSEVA341切除质粒，均通过大肠杆菌S17-1接合转化到盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD1.0中，实验流程如图1所示。
最后，通过PCR和测序验证dapA H56K 、dapB、lysA成功整合到Halomonas bluephagenesis TD1.0基因组上，构建成重组菌简称为：TDL2-221（在TD1.0的基因组上插入P porin221 -dapA H56K -dapB-lysA表达模块）、TDL2-194（在TD1.0的基因组上插入P porin194 - dapA H56K -dapB-lysA表达模块）、TDL2-68（在TD1.0的基因组上插入P porin68 -dapA H56K -dapB- lysA表达模块）、TDL2-42（在TD1.0的基因组上插入P porin42 -dapA H56K -dapB-lysA表达模块）、TDL2-140（在TD1.0的基因组上插入P porin140 -dapA H56K -dapB-lysA表达模块）、TDL2-141（在TD1.0的基因组上插入P porin141 -dapA H56K -dapB-lysA表达模块）、TDL2-3（在TD1.0的基因组上插入P porin3 -dapA H56K -dapB-lysA表达模块）。
2）摇瓶发酵验证表达dapA H56K -dapB-lysA的L-赖氨酸积累情况
将重组菌TDL2-221、TDL2-194、TDL2-68、TDL2-42、TDL2-140、TDL2-141、TDL2-3接种到20mL的LB60培养基中，培养12-16h后按1%的体积比转接到新的20mL的LB60培养基中，继续培养8-12h。
菌液培养8-12h后即为种子菌液，将2.5mL的种子菌液接种到含有47.5mLMMGU60培养基的250mL锥形瓶中，进行摇瓶实验。摇床温度为37℃，转速为200rpm，发酵时间为48h。
发酵结束后离心取上清通过高效液相色谱分析L-赖氨酸，菌体经过冻干机干燥后称重，摇瓶结果显示野生型Halomonas bluephagenesis TD1.0及TDL2-221、TDL2-194、TDL2-141和TDL2-3均不产生L-赖氨酸，TDL2-68、TDL2-42、TDL2-140可以产生L-赖氨酸，且TDL2-68菌株经过48h发酵后获得了2.64g/L的L-赖氨酸和10g/L的细胞干重，表明表达dapA H56K -dapB-lysA有助于L-赖氨酸的积累并且porin68是表达dapA H56K -dapB-lysA模块的最适强度启动子（图3）。
3）在Halomonas bluephagenesis TDL2-68菌株表达ppc、lysE、lysC T311I基因，构建成重组菌TDL8-68-259、TDL7-68、TDL6-68
在高拷贝的pSEVA341质粒上使用组成型启动子野生型porin表达内源的ppc基因，使用组成型启动子porin259表达谷氨酸棒杆菌来源的经过密码子优化的lysC T311I和lysE基因，构建成重组质粒pSEVA341-P porin259 –lysE，pSEVA341-P porin259 –lysC T311I -lysE，及pSEVA341-P porin -ppc-P porin259 –lysC T311I -lysE（图2）。
通过大肠杆菌S17-1接合转化将pSEVA341-P porin259 –lysE、pSEVA341-P porin259 –lysC T311I -lysE、pSEVA341-P porin -ppc-P porin259 –lysC T311I -lysE质粒转化到盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TDL2-68中，构建成重组菌简称为TDL6-68、TDL7-68、TDL8-68-259。
4）摇瓶发酵验证重组菌TDL2-68、TDL6-68、TDL7-68、TDL8-68-259的L-赖氨酸积累情况
将重组菌TDL2-68、TDL6-68、TDL7-68、TDL8-68-259接种到20mL的LB60培养基中，培养12-16h后按1%的体积比转接到新的20mL的LB60培养基中，继续培养8-12h。
菌液培养8-12h后，将2.5mL的种子菌液接种到含有47.5mL MMGU60培养基的250mL锥形瓶中，进行摇瓶实验。摇床温度为37℃，转速为200rpm，发酵时间为48h。
发酵结束后分析L-赖氨酸，摇瓶结果发现重组菌TDL6-68、TDL7-68、TDL8-68-259均较TDL2-68产生更多的L-赖氨酸，且TDL8-68-259菌株经过48h发酵后获得了6.03g/L的L-赖氨酸，表明表达dapA H56K 、dapB、lysA、ppc、lysE、lysC T311I基因有助于L-赖氨酸的积累（图4）。
5）验证Halomonas bluephagenesis TDL8-68-259在7L的发酵罐中开放式发酵生产L-赖氨酸和PHB的情况
将重组菌Halomonas bluephagenesis TDL8-68-259接种到20mL的LB60培养基中，培养12-16h后按1%的体积比转接到新的LB60培养基中，继续培养8-12h，制备好300mL种子溶液作为7L生物反应器（NBS Bioflo3000）的接种物。
配置2.7L底料培养基，底料含有葡萄糖（60g）、盐（150g）、酵母提取物（32g）、硫酸镁（0.63g）、尿素（9g）、磷酸二氢钾（12g）、磷酸钠（8.1g）。
配置补料I培养基含有葡萄糖（200g）、酵母提取物（8.2g）、硫酸镁（0.1g）、尿素（32g）、磷酸二氢钾（1.1g）和磷酸钠（0.9g）。
配置补料II培养基含有葡萄糖（200g）、酵母提取物（4g）、尿素（28g）和Na2HPO4（0.84g）。培养基的pH值由NaOH自动调节。
在发酵过程中通过搅拌和通气来调节氧溶量，通过每小时用血糖仪测残糖来监控发酵培养基中葡萄糖的含量，从而调控进料量。
结果如图5所示，在7L的发酵罐中，经过32小时的发酵，L-赖氨酸积累量提升到22.59g/L。由于TDL8-68-259是天然产PHB的菌株，因此，也分析了TDL8-68-259菌株的PHB含量，每4小时取35mL培养液收集一次样，用GC检测PHB的含量，结果发现PHB含有23%的积累。PHB是在胞内积累的产物而L-赖氨酸是胞外积累的产物，两者在后期产物提取方面互不干扰，因此，TDL8-68-259还具有共产L-赖氨酸和PHB的优势。而且，TDL8-68-259菌株在完全没有灭菌操作的情况下发酵没有发生任何污染，证明了以盐单胞菌为底盘菌生产L-赖氨酸更具有低成本优势。
实施例2 构建生产1,5-戊二胺的重组菌Halomonas campaniensis LC-9-ldcC- lysP
在Halomonas campaniensis LC-9出发菌株中高强度表达优选的大肠杆菌来源的ldcC基因和lysP基因，实现了1,5-戊二胺的积累。
具体实验操作如下：
构建生产1,5-戊二胺的重组菌Halomonas campaniensis LC-9-ldcC-lysP，获得1,5-戊二胺通路中关键合成基因可靠表达的重组菌。实验操作如下：
1）构建重组菌Halomonas campaniensis LC-9-ldcC-lysP
通过PCR分别扩增大肠杆菌基因组的ldcC和lysP基因序列以及启动子porin50和porin70序列。
通过Gibson将DNA片段连接到低拷贝质粒pSEVA321骨架上，并通过PCR和测序验证重组质粒pSEVA321-P porin50 -ldcC-P porin70 -lysP构建成功（图6）。
最后，通过大肠杆菌S17-1接合转化将pSEVA321-P porin50 -ldcC-P porin70 -lysP质粒转化到Halomonas campaniensis LC-9中，构建成重组菌Halomonas campaniensis LC-9-ldcC-lysP（简称LC-9-ldcC-lysP）。
2）摇瓶发酵验证重组菌LC-9-ldcC-lysP在0.05%的Triton-X100（聚乙二醇辛基苯基醚）处理下1,5-戊二胺生产
将重组菌LC-9-ldcC-lysP接种到20mL的LB40培养基中，培养12-16h后按1%的体积比转接到新的20mL的LB40培养基中，继续培养8-12h。
菌液培养8-12h后即为种子菌液，将2.5mL的种子菌液接种到含有47.5mL LB40培养基的250mL锥形瓶中，进行摇瓶实验。摇床温度为37℃，转速为200rpm。
培养24h后，添加50g/L的L-赖氨酸和不同浓度的Triton-X100处理，继续发酵36h。
发酵结束后离心取上清通过高效液相色谱分析1,5-戊二胺，菌体经过冻干机干燥后称重，摇瓶结果发现Halomonas campaniensis LC-9-ldcC-lysP菌株在0.05%的Triton-X100处理下，积累了36g/L的1,5-戊二胺，并将转化率提升到100%（图7）。
3）验证重组菌Halomonas campaniensis LC-9-ldcC-lysP在7L的发酵罐中开放式发酵生产1,5-戊二胺的情况
将重组菌Halomonas campaniensis LC-9-ldcC-lysP接种到20mL的LB40培养基中，培养12-16h后按1%的体积比转接到新的LB40培养基中，继续培养8-12h，制备好300mL种子溶液作为7L生物反应器（NBS Bioflo3000）的接种物。
配置2.7L的LB40底料培养基，补料培养基为L-赖氨酸溶液。
在7L的发酵罐中连续培养24h使重组菌Halomonas campaniensis LC-9-ldcC- lysP积累足够多的细胞量后，流加L-赖氨酸溶液，并每小时通过生物传感器检测L-赖氨酸的含量，控制流加速度使发酵罐中的L-赖氨酸含量尽量保持在50g/L，同时使用乙酸调节pH至7.6。
结果发现经过36h的发酵时，1,5-戊二胺的产量最高，积累量为118g/L（图8）。这一结果表明，Halomonas campaniensis LC-9-ldcC-lysP具有高效生产1,5-戊二胺的潜力，可作为工业生产1,5-戊二胺的平台菌。
实施例3 提供一种提高从头合成1,5-戊二胺效率的方法，应用于所构建的重组菌发酵生产1,5-戊二胺。
具体实验内容如下：
1）构建从头合成1,5-戊二胺的重组菌Halomonas bluephagenesis TDL12-68-259，并摇瓶培养验证1,5-戊二胺的积累情况。
重组菌Halomonas bluephagenesis TDL8-68-259接种到20mL的LB60培养基中，培养8-12h；同时将含有重组质粒pSEVA321-P porin50 -ldcC-P porin70 -lysP的大肠杆菌S17-1接种到20mL的LB培养基中培养8-12h。
通过接合转化将pSEVA321-P porin50 -ldcC-P porin70 -lysP质粒转化到重组菌Halomonas bluephagenesis TDL8-68-259中，构建成重组菌Halomonas bluephagenesis TDL12-68-259。
将重组菌Halomonas bluephagenesis TDL12-68-259接种到20mL的LB60培养基中，培养12-16h后按1%的体积比转接到新的20mL的LB60培养基中，继续培养8-12h。
菌液培养8-12h后，将2.5mL的种子菌液接种到含有47.5mL MMGU60培养基的250mL锥形瓶中，进行摇瓶实验。摇床温度为37℃，转速为200rpm，发酵时间为48h。
发酵结束后分析1,5-戊二胺，摇瓶结果发现Halomonas bluephagenesis TDL12-68-259菌株经过48h发酵后获得了1.6g/L的1,5-戊二胺（图9A）。
2）提供一种提高从头合成1,5-戊二胺效率的方法。
首先在MMGU60培养基中培养生产L-赖氨酸的菌株Halomonas bluephagenesis TDL8-68-259，待培养24h后加入生产1,5-戊二胺的菌株Halomonas campaniensis LC-9- ldcC-lysP。
摇瓶结果发现，在Halomonas bluephagenesis TDL8-68-259培养24小时后添加Halomonas campaniensis LC-9-ldcC-lysP，累积了2.6g/L的1,5-戊二胺，与Halomonas bluephagenesis TDL12-68-259单个菌相比从头合成1,5-戊二胺的效率显著提升（图9B）。
3）在7L的发酵罐中验证从头合成1,5-戊二胺的积累情况。
将重组菌Halomonas bluephagenesis TDL12-68-259接种到20mL的LB60培养基中，培养12-16h后按1%的体积比转接到新的LB60培养基中，继续培养8-12h，制备好300mL种子溶液作为7L生物反应器（NBS Bioflo3000）的接种物。
配置2.7L底料培养基，底料含有葡萄糖（60g）、盐（150g）、酵母提取物（32g）、硫酸镁（0.63g）、尿素（9g）、磷酸二氢钾（12g）、磷酸钠（8.1g）。
配置补料I培养基含有葡萄糖（200g）、酵母提取物（8.2g）、硫酸镁（0.1g）、尿素（32g）、磷酸二氢钾（1.1g）和磷酸钠（0.9g）。
配置补料II培养基含有葡萄糖（200g）、酵母提取物（4g）、尿素（28g）和Na2HPO4（0.84g）。培养基的pH值由NaOH自动调节。
在发酵过程中我们通过搅拌和通气来调节氧溶量，通过每1h用血糖仪测残糖来监控发酵培养基中葡萄糖的含量，从而调控进料量。
结果如图10A所示，在7L的发酵罐中，经过20h的发酵后，1,5-戊二胺积累量为2.67g/L。
将生产L-赖氨酸的重组菌Halomonas bluephagenesis TDL8-68-259在7L的发酵罐中发酵培养24h后，添加生产1,5-戊二胺的重组菌Halomonas campaniensis LC-9-ldcC- lysP继续发酵至52h时1,5-戊二胺的积累量为5.24g/L，比重组菌Halomonas bluephagenesis TDL12-68-259中1,5-戊二胺的积累量增加了96%。这一结果表明，L-赖氨酸生产菌株Halomonas bluephagenesis TDL8-68-259和1,5-戊二胺生产菌株Halomonas campaniensis LC-9-ldcC-lysP的结合更有利于从头合成1,5-戊二胺（图10B）。
通过以上描述，应该注意到并理解，在不脱离后附的权利要求所要求的本发明的精神和范围的情况下，能够对上述详细描述的本发明做出各种修改和改进。因此，要求保护的技术方案的范围不受所给出的任何特定示范教导的限制。
申请人声明，以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 清华大学，北京微构工场生物技术有限公司
<120> 一种利用嗜盐细菌生产L-赖氨酸和/或1,5-戊二胺的方法
<130> P0102022010037YW
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1266
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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atggtgatca tggaaatctt catcaccggc ctgctgctgg gcgccagcct gcttctgagc 60
attggtccgc aaaatgttct ggtgattaaa cagggcatca aacgcgaagg cctgatcgcc 120
gttctgctgg tttgtctgat tagcgacgtt ttcctgttca tcgccggcac cctgggcgtt 180
gatcttcttt ctaatgccgc cccgattgtg ctggatatta tgcgctgggg cggcatcgcc 240
tatctgctgt ggtttgccgt tatggccgcc aaagacgcca tgaccaataa agtggaagcc 300
ccgcagatca tcgaagaaac cgaaccgacc gtgccggacg acacccctct gggcggtagc 360
gccgttgcca ctgacactcg taatcgcgtt cgtgtggaag ttagcgtgga caaacagcgc 420
gtgtgggtga aaccgatgct gatggccatt gtgctgacct ggctgaaccc gaacgcctac 480
ctggatgcct tcgtgtttat tggcggcgtg ggtgcccaat atggcgacac cggtcgttgg 540
atttttgccg ccggtgcctt tgccgccagc ctgatttggt ttccgctggt tggtttcggc 600
gccgccgccc tgagccgtcc gctgagcagc ccgaaagttt ggcgttggat taacgtggtg 660
gtggccgttg tgatgaccgc ccttgctatt aaactgatgc tgatgggcta a 711

Claims (16)

1.一种重组菌，其特征在于，所述的重组菌的基因组中包含导入基因，所述的导入基因包含dapA、dapB和lysA，所述的重组菌为盐单胞菌。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的导入基因还包含ppc、lysC和/或lysE。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于，所述的导入基因还包括ldcC和/或lysP。
4.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于，所述的导入基因在组成型或诱导型启动子下表达。
5.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于，所述的导入基因在一个或多个质粒上表达或者在重组菌的染色体上表达。
6.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌为Halomonas bluephagenesis、Halomonas campaniensis或Halomonas aydingkolgenesis。
7.一种重组菌，其特征在于，所述的重组菌的基因组中包含导入基因，所述的导入基因包含dapA、dapB和lysA，所述的重组菌为Halomonas bluephagenesis。
8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于，所述的导入基因还包含ppc、lysC和/或lysE。
9.根据权利要求7或8所述的重组菌，其特征在于，所述的导入基因还包括ldcC和/或lysP。
10.一种重组菌，其特征在于，所述的重组菌的基因组中包含导入基因，所述的导入基因包含ldcC和/或lysP，所述的重组菌为Halomonas campaniensis。
11.一种权利要求1-10任一所述的重组菌的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括将导入基因导入盐单胞菌。
12.一种生产L-赖氨酸的方法，其特征在于，所述的方法包括发酵培养权利要求1-9任一所述的重组菌。
13.一种生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于，所述的方法包括发酵培养权利要求9-10任一所述的重组菌。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：
A）发酵培养权利要求9所述的重组菌，其中，发酵培养基包含葡萄糖；或，
B）发酵培养权利要求10所述的重组菌，其中，发酵培养基包含L-赖氨酸。
15.一种生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于，所述的方法包括发酵培养权利要求1-8任一所述的重组菌和权利要求10所述的重组菌。
16.根据权利要求12-15任一所述的方法，其特征在于，所述发酵的产物还包含PHA。
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