CN111394380A

CN111394380A - 一种利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法

Info

Publication number: CN111394380A
Application number: CN202010166455.6A
Authority: CN
Inventors: 袁文杰; 杜聪; 李益民
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2020-03-11
Filing date: 2020-03-11
Publication date: 2020-07-10
Also published as: CN115975832B; CN115975832A

Abstract

本发明公开了一种利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法，其通过过表达甲酸脱氢酶提高菌株对纤维素水解液中乙酸和甲酸的耐受能力。在本发明提供的方法中，可在纤维素乙醇生产菌株中，过表达甲酸脱氢酶，提高菌株对纤维素水解液中甲酸和乙酸的抗性，方法简单可行，降低物料脱毒成本，有助于纤维素乙醇的产业化生产。

Description

一种利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法

技术领域

本发明属于生物工程的技术领域，具体涉及一种利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法，具体地，其是一种通过过表达甲酸脱氢酶同时提高微生物对甲酸和乙酸耐受能力的方法。

背景技术

纤维素原料来源广泛、价格低廉，有效转化纤维素原料还有利于农村经济，被广泛研究为生产生物燃料和生物基化学品。木质纤维素原料需要进行预处理过程来获得微生物可直接利用的糖类，但是预处理之后会产生多种抑制物对细胞生长代谢有毒害作用，影响后续的发酵，抑制物主要包括：弱酸(甲酸和乙酸等)、呋喃类(糠醛和5-羟甲基糠醛等)、酚类化合物(香草醛和4-水杨酸等)，预处理的方法不同，水解液中的抑制物含量也有所不同。

乙酸是纤维素水解液中含量最高的抑制物之一，浓度为1.0g/L～15.0g/L[Wei N,Enhanced biofuel production through coupled acetic acid and xyloseconsumption by engineered yeast[J].Nature Communication,2013,4:2580-2587.]，其通过释放H⁺导致细胞内环境酸化，为了保持胞内环境稳定，细胞通过消耗ATP将乙酸排到胞外，造成能量损失致使细胞活性下降。乙酸的存在还会引起微生物细胞的氧化应激反应，产生大量ROS，引起细胞损伤。

甲酸在纤维素水解液中的浓度较低为1.4g/L左右，但是对酵母的毒性较乙酸强，甲酸pKa＝3.75小于乙酸的pKa＝4.75，且甲酸的分子更小更易于扩散，所以具有更强的毒性。由于胞内的pH较高，未解离的甲酸可以从培养基中扩散到整个质膜表面，从而降低胞质pH，影响细胞活性[Oshoma CE，Screening of Non-Saccharomyces cerevisiae Strainsfor Tolerance to Formic Acid in BioethanolFermentation[J].PLoS One,2015，10(8),e0135626.]。所以提高微生物发酵菌株对纤维素水解液中主要抑制物(甲酸和乙酸)的耐受能力，对以纤维素水解液为底物生产的生物乙醇、生物油脂及其他生物基化学品，具有重要意义。

甲酸脱氢酶是通过催化甲酸的氧化产生二氧化碳，并产生还原性NADH和ATP，其是已知的，广泛的应用在腐胺的生成(专利申请号201780017515.4)、辅酶的还原(专利申请号201711230338.6)等反应中，但是对提高乙酸的胁迫能力方面，目前并无报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够同时提高微生物菌株对甲酸和乙酸耐受能力的方法。

本发明的技术方案为：

为了实现上述目的，在一方面，本发明提供一种利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法，其包括在微生物发酵菌株中过表达甲酸脱氢酶的步骤。

在一个具体的实施方案中，甲酸脱氢酶来源于不同的微生物发酵菌株；例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、毕赤酵母(Pichia pastoris)。

由于显示活性的甲酸脱氢酶及其氨基酸序列可根据微生物发酵菌株而变化，因此，甲酸脱氢酶的来源不限于酿酒酵母，甲酸脱氢酶的基因序列不限制于SEQ ID NO.3所示的序列；同样，过表达甲酸脱氢酶的微生物发酵菌株可以根据需要选择其他微生物，不限于此处公开的酿酒酵母，例如过表达甲酸脱氢酶的宿主可以选自大肠杆菌、毕赤酵母、运动假单胞菌、马克斯克鲁维酵母、假丝酵母、Spathaspora passalidarum。

另外，在本发明中，甲酸脱氢酶可不受限制地包括具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列的任何蛋白质，或具有与SEQ ID NO.3的氨基酸序列具有至少70％、具体地至少80％、更具体地至少90％、甚至更具体地至少95％、和最具体地至少99％的同源性的氨基酸序列的任何蛋白质——其为实质上具有Fdh的活性的蛋白质。

显然，与SEQ ID NO.3相同并且具有与SEQ ID NO.3的蛋白质质上相同或等同的生物学活性的任何氨基酸序列可属于本发明的范围，即使氨基酸序列具有部分缺失、修饰、取代、或添加。

在一些具体的实施方案中，通过构建表达甲酸脱氢酶基因序列的重组的表达载体，并转化至微生物发酵菌株中，以在微生物发酵菌株中过表达甲酸脱氢酶。

具体地，表达载体可不受特别地限制，只要载体能够在微生物发酵菌株得细胞中复制，并且可使用本领域已知的任何载体。表达载体的实例可包括天然的或重组质粒、黏粒、病毒、和噬菌体。

在另一些实施方案中，通过更换强启动子、提高拷贝数、密码子优化、添加利于表达的增强子，以在微生物发酵菌株中过表达甲酸脱氢酶。在其他实施方案中，也可通过染色体插入表达(例如，同源重组)，以在微生物发酵菌株中过表达甲酸脱氢酶。

另一方面，本发明提供了甲酸脱氢酶在制备用于提高微生物发酵菌株对纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的试剂的用途。

本发明的效果和益处是：

本发明提供的利用甲酸脱氢酶提高微生物乙醇发酵菌株对纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法。在微生物中过表达甲酸脱氢酶，提高甲酸脱氢酶活性，能够提高甲酸和乙酸的抗性，以便在使用纤维素水解液作为底物进行发酵时，免去发酵前脱毒的步骤，简化了工艺，节约了成本。

附图说明

图1A和图1B是在酿酒酵母中过表达甲酸脱氢酶后，重组菌株与对照经10倍浓度稀释后，在4g/L乙酸(图1A)和1g/L甲酸(图1B)的固体培养基中的生长情况比较。从结果可以看出，过表达甲酸脱氢酶，可显著提高乙酸的抗性，提高幅度为2个数量级。也可提高甲酸的抗性，提高幅度为1个数量级。

图2A和图2B是在酿酒酵母中过表达甲酸脱氢酶后，重组菌株与对照在4g/L乙酸的液体培养基中的葡萄糖消耗和生物量情况。从结果可以看出，过表达甲酸脱氢酶后，在较高浓度乙酸存在的情况下，重组菌的生长速度和消耗葡萄糖的速率都高于对照菌株。

图3A和图3B是在酿酒酵母中过表达甲酸脱氢酶后，重组菌株与对照在1g/L甲酸的液体培养基中的葡萄糖消耗和生物量情况。从结果可以看出，过表达甲酸脱氢酶后，在较高浓度甲酸存在的情况下，重组菌经过延迟期后，出现了生长和葡萄糖的消耗，但对照菌株在这种情况下被甲酸完全抑制并死亡。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：菌株S.cerevisiae-FDH的构建

1)以酿酒酵母模式菌株S288C的基因组为模板进行PCR扩增，获得Fdh基因片段，上下游引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2所示：

上游引物：attgcggccgctatgtcgaagggaaaggttttg(SEQ ID NO.1)

下游引物：acgcgcgtcgacttatttcttctgtccataag(SEQ ID NO.2)

PCR扩增所用试剂盒为

HS DNAPolymerase(Code No.:R010A)，购于宝生物工程(大连)有限公司，PCR反应按照试剂盒说明书进行。

PCR扩增条件为：98℃预变性5min；98℃15s，55℃15s，72℃60s，30循环；72℃延伸7min；

2)获得的Fdh基因片段使用限制性核酸内切酶Not I和Sal I进行双酶切，再用连接酶进行连接到pRS424上(购于淼灵质粒平台)，得到重组质粒pRS424-FDH；

3)将构建好的重组质粒pRS424-FDH转化入酿酒酵母S288C中，获得过表达甲酸脱氢酶的重组菌株S.cerevisiae-FDH；

筛选培养基为：SD-Trp培养基：YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，不含Trp的氨基酸补充溶液。

其中，甲酸脱氢酶(Fdh)的氨基酸序列为(SEQ ID NO.3)：

mskgkvllvlyeggkhaeeqekllgcienelgirnfieeqgyelvttidkdpeptstvdrelkdaeivittpffpayisrnriaeapnlklcvtagvgsdhvdleaanerkitvtevtgsnvvsvaehvmatilvlirnyngghqqaingewdiagvakneydledkiistvgagrigyrvlerlvafnpkkllyydyqelpaeainrlneasklfngrgdivqrvekledmvaqsdvvtincplhkdsrglfnkklishmkdgaylvntargaicvaedvaeavksgklagyggdvwdkqpapkdhpwrtmdnkdhvgnamtvhisgtsldaqkryaqgvknilnsyfskkfdyrpqdiivqngsyatraygqkk

实施例2：采用两步法发酵纤维素原料生产木糖醇和乙醇，在含甲酸和乙酸的平板上生长情况的考察

1)活化培养基的制备：活化培养基：YNB 6.7g/L，葡萄糖10g/L，不含Trp的氨基酸补充溶液。

2)菌株的活化：取冰箱保藏的实施例1中制备的菌株S.cerevisiae-FDH和原始菌株S.cerevisiae S288C接种至活化培养基中，置于摇床中30℃，150rpm培养24h。

3)种子培养基的制备：种子培养基：YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，不含Trp的氨基酸补充溶液。

4)步骤2)中取活化后的菌体转接至步骤3)中制备的种子培养基中，置于摇床中30℃，150rpm培养24h。

5)鉴别培养基得制备：鉴别培养基：YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，不含Trp的氨基酸补充溶液，甲酸1g/L或乙酸4g/L。

6)菌种经活化、种子扩大培养后，离心收集细胞，将收集细胞用适量的无菌水重悬，使各个菌种初始OD₆₂₀保持一致(≈10.0)将收集的细胞10倍梯度稀释，取8μL的菌液点于鉴别平板上，待菌液晾干后，30℃倒置培养2-3d。

实验结果如图1A和图1B所示，在1g/L甲酸的固体培养基中，过表达了甲酸脱氢酶基因的S.cerevisiae-FDH较原始菌株生长情况更好，显示出更好的甲酸耐受能力；在4g/L乙酸的固体培养基中，重组菌株S.cerevisiae-FDH也表现出了更好的生长情况。以上实验结果说明，过表达甲酸脱氢酶基因后，重组菌株S.cerevisiae-FDH不仅提高了对甲酸的耐受能力，对乙酸的耐受能力也有明显提高。

实施例3：在含有乙酸的液体培养基中的发酵情况

1)活化培养基：YNB 6.7g/L，葡萄糖10g/L，不含Trp的氨基酸补充溶液。

2)取冰箱保藏实施例1中制备的菌株S.cerevisiae-FDH和原始菌株接种至活化培养基中，置于摇床中30℃，150rpm培养24h。

4)取活化后的菌体转接至步骤3)中制备的种子培养基中，置于摇床中30℃，150rpm培养24h-48h。

5)发酵培养基的制备：发酵培养基：YNB 6.7g/L，葡萄糖40g/L，不含Trp的氨基酸补充溶液，乙酸4g/L。

6)菌种经活化、种子扩大培养后，离心收集细胞，收集细胞接种至添加乙酸的发酵培养基中，接种量OD₆₂₀≈0.5，30℃，150rpm发酵72-96h，每12-24h取样。

发酵结果如图2A和图2B所示，在4g/L乙酸存在条件下，过表达了甲酸脱氢酶基因的S.cerevisiae-FDH较原始菌株的葡萄糖消耗更快，在发酵进行72h后，S.cerevisiae-FDH较原始菌株多消耗了3.6g/L葡萄糖，且菌株的生长更快，在24h生物量OD₆₂₀较出发菌株提高了11％，实验结果说明过表达甲酸脱氢酶后菌株S.cerevisiae-FDH对乙酸的耐受能力增强有所增强。

实施例4：在含有甲酸的液体培养基中的发酵情况

本实施例采用与实施例3相同的方法进行种子培养与扩大培养，区别仅在于：所添加的抑制物为1g/L甲酸。

实验结果如图3A和图3B所示，原始菌株在甲酸存在的条件下，由于较强的抑制作用，发酵过程中并无葡萄糖消耗，且生物量在逐渐降低，而重组菌株S.cerevisiae-FDH在经过延滞期后，葡萄糖快速消耗，生物量也随着葡萄糖的消耗快速生长至OD₆₂₀至0.83。以上实验结果说明，过表达甲酸脱氢酶后菌株的甲酸耐性明显增强。

以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。

序列表

<110> 大连理工大学

<120> 一种利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法

<130> 2020

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物

<400> 1

attgcggccg ctatgtcgaa gggaaaggtt ttg 33

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物

<400> 2

acgcgcgtcg acttatttct tctgtccata ag 32

<210> 3

<211> 376

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 甲酸脱氢酶（Fdh）的氨基酸序列

<400> 3

Met Ser Lys Gly Lys Val Leu Leu Val Leu Tyr Glu Gly Gly Lys His

1 5 10 15

Ala Glu Glu Gln Glu Lys Leu Leu Gly Cys Ile Glu Asn Glu Leu Gly

20 25 30

Ile Arg Asn Phe Ile Glu Glu Gln Gly Tyr Glu Leu Val Thr Thr Ile

35 40 45

Asp Lys Asp Pro Glu Pro Thr Ser Thr Val Asp Arg Glu Leu Lys Asp

50 55 60

Ala Glu Ile Val Ile Thr Thr Pro Phe Phe Pro Ala Tyr Ile Ser Arg

65 70 75 80

Asn Arg Ile Ala Glu Ala Pro Asn Leu Lys Leu Cys Val Thr Ala Gly

85 90 95

Val Gly Ser Asp His Val Asp Leu Glu Ala Ala Asn Glu Arg Lys Ile

100 105 110

Thr Val Thr Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His

115 120 125

Val Met Ala Thr Ile Leu Val Leu Ile Arg Asn Tyr Asn Gly Gly His

130 135 140

Gln Gln Ala Ile Asn Gly Glu Trp Asp Ile Ala Gly Val Ala Lys Asn

145 150 155 160

Glu Tyr Asp Leu Glu Asp Lys Ile Ile Ser Thr Val Gly Ala Gly Arg

165 170 175

Ile Gly Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Val Ala Phe Asn Pro Lys Lys

180 185 190

Leu Leu Tyr Tyr Asp Tyr Gln Glu Leu Pro Ala Glu Ala Ile Asn Arg

195 200 205

Leu Asn Glu Ala Ser Lys Leu Phe Asn Gly Arg Gly Asp Ile Val Gln

210 215 220

Arg Val Glu Lys Leu Glu Asp Met Val Ala Gln Ser Asp Val Val Thr

225 230 235 240

Ile Asn Cys Pro Leu His Lys Asp Ser Arg Gly Leu Phe Asn Lys Lys

245 250 255

Leu Ile Ser His Met Lys Asp Gly Ala Tyr Leu Val Asn Thr Ala Arg

260 265 270

Gly Ala Ile Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Glu Ala Val Lys Ser Gly

275 280 285

Lys Leu Ala Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Asp Lys Gln Pro Ala Pro

290 295 300

Lys Asp His Pro Trp Arg Thr Met Asp Asn Lys Asp His Val Gly Asn

305 310 315 320

Ala Met Thr Val His Ile Ser Gly Thr Ser Leu Asp Ala Gln Lys Arg

325 330 335

Tyr Ala Gln Gly Val Lys Asn Ile Leu Asn Ser Tyr Phe Ser Lys Lys

340 345 350

Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Val Gln Asn Gly Ser Tyr Ala

355 360 365

Thr Arg Ala Tyr Gly Gln Lys Lys

370 375

Claims

1.一种利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法，其特征在于，所述的利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法包括在微生物发酵菌株中过表达甲酸脱氢酶的步骤。

2.根据权利要求1所述的利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法，其特征在于，所述的甲酸脱氢酶来源于选自以下的微生物发酵菌株：酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母或毕赤酵母。

3.根据权利要求2所述的利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法，其特征在于，所述的甲酸脱氢酶来源于酿酒酵母模式菌株S288C，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法，其特征在于，所述的微生物发酵菌株选自大肠杆菌、毕赤酵母、运动假单胞菌、马克斯克鲁维酵母、假丝酵母或Spathaspora passalidarum。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法，其特征在于，通过构建表达甲酸脱氢酶基因序列的重组的表达载体，并转化至微生物发酵菌株中，以在微生物发酵菌株中过表达甲酸脱氢酶。

6.根据权利要求5所述的利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法，其特征在于，所述的表达载体选自天然的或重组质粒、黏粒、病毒或噬菌体。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的利用甲酸脱氢酶提高纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的方法，其特征在于，通过更换强启动子、提高拷贝数、密码子优化、添加利于表达的增强子，以在微生物发酵菌株中过表达甲酸脱氢酶。

8.甲酸脱氢酶在制备用于提高微生物发酵菌株对纤维素水解液中甲酸和乙酸抗性的试剂的用途。