CN113512506B

CN113512506B - 对木质纤维素类生物质衍生的抑制物耐受性高的酵母、及其构建方法

Info

Publication number: CN113512506B
Application number: CN202110473879.1A
Authority: CN
Inventors: 洪泂; 张妮妮; 王冬梅
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2021-04-29
Filing date: 2021-04-29
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2041-04-29
Also published as: CN113512506A

Abstract

本发明提供一种马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces.marxianus)CGMCC No.21814，该菌株对木质纤维素类生物质预处理过程中产生的多种毒性抑制物质包括弱酸类、呋喃类和酚类化合物的耐受能力优异。表现为该菌株在抑制物混合物下的培养延滞期明显缩短，在含有抑制物和葡萄糖的厌氧培养中乙醇的产量和生产速度提高，利用预处理过的玉米芯进行发酵时乙醇生产速率提高。本发明还提供构建上述菌株的方法，和提高马克斯克鲁维酵母对木质纤维素类衍生的多种毒性抑制物的耐受性的方法。

Description

对木质纤维素类生物质衍生的抑制物耐受性高的酵母、及其构建方法

技术领域

本发明涉及微生物及生物技术领域。具体涉及一种具有提高的生物特性的耐热的马克斯克鲁维酵母，构建其的方法和提高生物工程菌在利用木质纤维素类生物质时对抑制物的耐受性的方法。

背景技术

木质纤维素由于来源广泛、低成本、污染少等优势，作为生物能源与绿色制造等方面备受研究者青睐。木质纤维素中纤维素、半纤维素和木质素之间通过分子键紧密结合形成不易降解的复杂结构。

木质纤维素主要由纤维素、半纤维素、木质素和一些无机化合物组成，它们之间紧密结合形成不易降解的高分子复合物。木质纤维素紧密复杂的结构使得纤维素酶的水解效率低。因此为了提高纤维素的酶促水解效率，人们开发了各种预处理方法来破坏这种致密结构并释放可利用的葡萄糖等单糖(Mussatto et al.,2010)，从而使纤维素酶更易与嵌入的纤维素结合，提高可发酵糖的得率。

化学方法是目前最有效的，最适合工业发展需求的预处理技术，可以有效去除木质素与半纤维素，同时降低成本，常见的处理方法有酸处理、碱处理、有机溶剂处理、离子液体处理等。但存在以下问题：酸法、碱法等常用的预处理工艺会产生大量的抑制物，包括弱酸类、呋喃类和酚类化合物，严重影响后续的微生物繁殖、细胞活性及产品得率和生产速率，因此会增加糖化及发酵这样的后续步骤的生产成本。解决该问题的主要手段有：优化预处理条件、水解液脱毒处理、进化工程及基因工程改造微生物等。

物理化学方法结合了物理与化学的方法，被认为是很有效的方法。主要有蒸汽爆破、氨纤维爆破(AFEX)、氨循环渗透法(ARP)等，同其他方法一样，在这一预处理过程中木质纤维素的天然结构遭到破坏，酶与纤维素的接触面积变大，水解的糖得率也进一步提高。然而，它也没能解决预处理过程中存在的高耗能、产生有毒副产物、污染环境等问题(Alviraet al.,2010；Mosier et al.,2005)。

预处理过程中部分糖分解并由此产生一些毒性化合物，这些化合物将影响后续的糖化和发酵等过程(Oliva et al.,2003)。由木质纤维素预处理产生的有毒物质可以分为以下几类：弱酸类、呋喃类和酚类化合物(Lin et al.,2015；Mcmillan,1994)。

呋喃和5-羟甲基糠醛作为呋喃衍生物的主要代表，分别源于戊糖和己糖的降解(Palmqvist&Hahn-Hagerdal,2000)。常见的弱酸类抑制物有甲酸、乙酸和乙酰丙酸，其中乙酸来源于半纤维素的乙酰基，甲酸和乙酰丙酸则来源于糠醛和5-HMF的进一步降解(Morenoet al.,2015)。酚类化合物主要由木质素释放，虽然浓度小但毒性是最强的 (Jonsson&Martin,2016)。

预处理过程带来的各种类型的抑制物降低了细胞活性和微生物发酵能力。解决抑制物毒性问题迫在眉睫。当前，有两种可行的策略。一、去除抑制物；避免抑制物的产生；减少对微生物的毒性作用。这包括预处理优化即原料选择及处理条件(Kim,2018) 和水解液脱毒即化学脱毒、生物脱毒和物理脱毒等(Robak&Balcerek,2020)，但是此方法会带来额外的花费和糖的损失。二、提高发酵微生物的抑制物耐受性(Zhao et al., 2016)。这包括了微生物的筛选、进化工程及遗传/代谢工程(Parawira&Tekere,2011)。

考虑到对生物燃料生产而言，木质纤维素是原料之一。如果在生物燃料生产中采用第一种策略，则抑制物的去除程序会大大增加生产成本，阻碍纤维素乙醇商业化，因此，认为提高发酵微生物的抑制物耐受性为更优的解决办法。

已知马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces.marxianus)作为一种安全的微生物(GRAS) 可以用于多种食品和药物的生产。除了利用葡萄糖、蔗糖、棉子糖、果糖等作为底物进行发酵外，还可以利用木糖、阿拉伯糖等五碳糖(Goshima et al.,2013)，马克思克鲁维酵母的这种底物广谱性使得纤维素乙醇商业化成为可能。

另外，马克思克鲁维酵母最大的特点就是耐热，据报道最高耐受温度可达52℃，并具有很高的生长速率(0.86–0.99h-1，40℃)。“耐热”这个特点会使菌株在利用木质纤维素生物质和工业发酵中具有很多优势。工业生产中发酵会产生大量的热量，需要制冷来维持发酵温度，在高温条件下的发酵可以降低工业发酵过程中的冷却费用；并且对高温季节或热带地区来说，应用耐热酵母发酵更具有优势；在利用半纤维素、纤维素的发酵过程中，需要加入商业化的半纤维素酶、纤维素酶来催化生成单糖进行进一步发酵，而工业上这些酶的最适催化温度为48-52℃左右，如果利用马克思克鲁维酵母进行发酵，就不需要提前水解再进行发酵，而是可以直接进行同步糖化和发酵及同步糖化共发酵。这样可以促进糖化效率，减少发酵时间，提高发酵的速率。最后，高温发酵可以杜绝大部分微生物的生长，从而降低杂菌污染的可能性。

发明内容

本发明通过使马克斯克鲁维酵母的硝基还原酶基因过表达，发现了提高发酵微生物对木质纤维素预处理过程中衍生的抑制物的耐受性的方法，并成功获得了一个对木质纤维素生物质来源抑制物耐受提高的马克斯克鲁维酵母突变菌株，所述菌株当在所述抑制物存在时乙醇的产量和生产速度都得到了提升。

所述耐热马克斯克鲁维酵母突变菌株YZN013已于2021年2月5日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其对应的保藏号为CGMCC No.21814(YZN013)。

所述菌株YZN013在包括乙酸盐、糠醛、酚类的复合抑制物存在时，硝基还原酶基因过表达菌株生长速率和生物量的积累都有提高，在这些抑制物存在时，厌氧发酵的乙醇产量和速度分别提高了8.05％,和21.55％。利用稀酸处理未脱毒的玉米芯生产乙醇中时生产速率提高了19.75％。

这种表达一个基因就能同时提高多种抑制物耐受的改造的报导较少，尤其是在耐热酵母菌株中更少见。目前还没有硝基还原酶基因在木质纤维素来源的多种抑制物的耐受方面的研究。通过利用这样的提高耐受性的方法来获得过表达硝基还原酶的耐热酵母菌株，在构建高效利用木质纤维素生物质工程菌方面有很大应用潜力。

本发明包括以下内容。

1.酵母菌，其为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces.marxianus)YHJ010的突变株，其中的硝基还原酶基因过表达，所述硝基还原酶基因为KmHBN1，所述KmHBN1如 GenBankaccession No:MT383676所示。

2.根据项1所述的酵母菌，其为保藏号为CGMCC No.21814的马克斯克鲁维酵母。

3.组合物，其包含项1或2所述的酵母菌。

4.项1或2所述的酵母菌及项3所述的组合物在处理木质纤维素类生物质中的用途，优选用于通过利用木质纤维素类生物质生产乙醇的用途。

5.提高利用木质纤维素生物质的工程菌对木质纤维素类衍生的抑制物质的耐受性的方法，包括，通过基因工程方法使所述菌中过表达硝基还原酶基因KmHBN1，所述KmHBN1如GenBank accession No:MT383676所示，

6.根据项5所述的方法，其中，所述抑制物质包括选自弱酸类化合物、呋喃类化合物和酚类化合物中的一种或多种。

7.根据项6所述的方法，其中，所述弱酸类化合物包括乙酸或乙酸盐，呋喃类化合物包括糠醛和5-羟甲基糠醛，酚类化合物包括邻苯二酚、丁香醛、香兰素和4-羟基苯甲醛。

8.根据项7所述的方法，其中，所述基因工程方法包括向菌体中导入用于过表达所述KmHBN1基因的开放阅读框片段的质粒，所述开放阅读框片段的序列如SEQ ID No：13所示。

9.根据项5～8中任一项所述的方法，其中，所述菌为具有耐热性的菌，优选为马克斯克鲁维酵母属的菌。

保藏说明

本发明所述的耐热工程酵母菌株马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)YZN013于2021年2月5日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编： 100101)，其对应的保藏号为CGMCC No.21814(菌株YZN013)。

附图说明

图1在不同抑制物存在时硝基还原酶基因KmHBN1的相对表达水平的图。

图2过表达硝基还原酶基因KmHBN1的酵母菌株在含有或不含有抑制物的液体合成培养基中的生长曲线。A：无抑制物，B：有抑制物。

图3过表达硝基还原酶基因KmHBN1的酵母菌株在抑制物混合物中的发酵能力及乙醇得率的图。A：生长曲线，B：糖消耗曲线，C：乙醇生产曲线。

图4过表达硝基还原酶基因KmHBN1的酵母菌株利用稀酸处理的玉米芯生产乙醇的能力。

具体实施方式

本发明的一种实施方式为一种对木质纤维素生物质来源抑制物耐受提高的耐热工程酵母菌株，其为菌株YZN013。所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21814。

本发明的一种实施方式包括通过下述方法得到所述菌株：以尿嘧啶、亮氨酸和色氨酸的三重营养缺陷性的马克斯克鲁维酵母菌株YHJ010(Hong et al.，2007)作为宿主，在其中过表达硝基还原酶基因获得。

在本发明的一种实施方式中，用于过表达硝基还原酶基因的质粒为pZN003(由发明人构建)。该质粒的构建方法如下：

(1)依据马克斯克鲁维酵母基因组中硝基还原酶基因KmHBN1(GenBank accessionNo.:MT383676)的序列，设计了引物10054Up-F(序列示于SEQ ID No：1)和 10054Down-R(序列示于SEQ ID No：2)，

(2)以马克斯克鲁维酵母基因组为模板利用上述引物进行PCR扩增，得到包括硝基还原酶基因开放阅读框(open reading frame,ORF)及上下游序列的DNA片段。将此片段插入到pGEM-T Easy载体(Promega公司)中，得到质粒pZN001。

(3)以pZN001为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)和引物10054Gene-EcorI-F(序列示于SEQ ID No：3)和10054Gene-NotI-R(序列示于SEQ ID No：4)进行PCR扩增，得到硝基还原酶基因的开放阅读框。此阅读框在EcoR I和Not I酶切后插入到经相同酶切的表达载体YEGAP(Hong et al.,2007)中，获得硝基还原酶的表达载体pZN003。

本发明的另一种实施方式包括：进一步以质粒YEUGAP(构建方法可参见CN201410727487.3，Zhang et al.,2015)为模板，利用引物ScURA3-SmaI-F(SEQ ID No： 5)和ScURA3-SmaI-R(SEQ ID No：6)通过PCR扩增后获得ScURA3表达框，使YHJ010 的尿嘧啶营养缺陷型消除，获得尿嘧啶的合成能力。将所述ScURA3表达框转化到马克斯克鲁维酵母菌株YHJ010中，获得菌株YZN011(具有尿嘧啶营养缺陷型消除)。然后将上述得到的质粒pZN003转化到YZN011中，获得硝基还原酶基因过表达菌株 YZN013(尿嘧啶营养缺陷型消除，且为LEU2，亮氨酸营养缺陷型)。

同时，将YEGAP(对应质粒pZN003的空载体)质粒转化到YZN011中，获得了和YZN013同样营养缺陷型，但不表达硝基还原酶的菌株YZN012(尿嘧啶营养缺陷型消除，且LEU2，亮氨酸营养缺陷型)，在后续试验中作为对照菌株。

实施例

试剂和菌株

在本发明的实施例中的所有试剂均为市场购买的试剂级以上的试剂。其中，葡萄糖、乙酸、糠醛、5-羟甲基糠醛、邻苯二酚、香兰素、丁香醛、4-羟基苯甲醛酵母基本氮源，尿嘧啶、色氨酸、亮氨酸，胶回收试剂盒以及所有的限制性内切酶均来源于上海生工生物工程公司。

PrimeSTAR HS DNA聚合酶，T4 DNA连接酶购自大连宝生物公司，pGEM-T Easy 载体购自Promega公司。

作为DNA操作时使用的宿主菌使用了大肠杆菌Escherichia coli DH5α菌株。E.coli 在包含100μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基(1％胰蛋白胨,0.5％酵母提取物,1％NaCl)进行培养。

葡萄糖合成培养基(葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L)，当用于酵母转化和转化子筛选时，依需要向其中补充色氨酸20mg/L或亮氨酸30mg/L。

YPD培养基(10g/L酵母提取物，20g/L细菌蛋白胨，20g/L葡萄糖)用于酵母前培养。如果需要使用固体培养基时，添加1.5％的琼脂。

实施例1在不同抑制物存在时硝基还原酶KmHBN1基因表达水平的变化。

首先，发明人通过Real-time PCR测定了原始菌株YHJ010中，在不同抑制物存在时硝基还原酶KmHBN1基因表达水平的变化。设了五个组，分别是无抑制物组，抑制物混合物组(乙酸、糠醛+5-羟甲基糠醛、酚类混合物(邻苯二酚、丁香醛、香兰素、 4-羟基苯甲醛))，乙酸抑制物组，酚类混合物抑制物组(邻苯二酚、丁香醛、香兰素、 4-羟基苯甲醛)，呋喃类混合物抑制物组(糠醛+5-羟甲基糠醛)。

具体操作如下。

1.从-80℃冰箱中取出菌株YHJ010，按常法接种至YPD固体培养基中，37℃过夜培养。

2.第二天，挑取单克隆于YPD液体培养基中，用摇床培养至达对数期(37℃，250rpm)。

3.制备下述五种组成的YPD液体培养基，按初始OD₆₀₀＝0.3的量分别转接YHJ010菌液：

a.无抑制物

b.抑制物混合物(3.0g/L乙酸、0.7g/L糠醛+0.7g/L 5-羟甲基糠醛、0.28g/L酚类混合物(邻苯二酚、丁香醛、香兰素、4-羟基苯甲醛各0.075g/L))

c.2g/L乙酸

d.0.8g/L酚类混合物(邻苯二酚、丁香醛、香兰素、4-羟基苯甲醛各0.2g/L)

e.1g/L糠醛+1g/L 5-羟甲基糠醛

4.恒温摇床培养(42℃，250rpm)至菌液的OD₆₀₀为6，离心收集菌体提取RNA。

5.采用上海生工的柱式酵母总RNA抽提纯化试剂盒，取干净的1.5mL RNA-free EP管分别收集上述五个组的细胞。离心(室温、12000rpm、30s)，弃上清。

6.称取菌体，对各组分别取20mg的酵母细胞加入600μL蜗牛酶缓冲液(来自上述总RNA抽提纯化试剂盒)和50μL的蜗牛酶溶液(来自上述总RNA抽提纯化试剂盒)。将它们混匀后放到37℃水浴锅水浴5min，以此去除酵母细胞壁。

7. 10000rpm，4℃，离心5min后，去除上清，向菌体里加入400μL Buffer Rlysis-Y溶液(来自上述总RNA抽提纯化试剂盒，以下试剂相同)，混匀后放到65℃水浴锅水浴5min。

8.冰上放置5min后，再加入200μL Buffer YK溶液。

9. 12000rpm，4℃，离心5min，取上清至新的RNA-free离心管，再加入600μL 酚氯仿溶液(酚pH为4.5)混匀。

10. 12000rpm，4℃，离心5min，取上清至新的RNA-free离心管，并加入0.5倍的冰乙醇，混匀后，加入到结合柱上。

11.结合3min后，离心(12000rpm、1min)，弃上清。

12.加入500μL清洗液清洗一遍，12000rpm离心1min，去除收集管的废液。

13.重复步骤10。

14. 12000rpm空离心2min。

15.室温晾干10min，去除乙醇。

16.取50μL预热的DEPC处理的灭菌水加入到结合柱的白色垫片上，室温结合2min。

17. 12000rpm离心2min。

18.按说明书方法测定浓度后，标注名称、日期等信息。得到各组酵母菌的RNA， -20℃保存备用。

19.反转录采用了东洋纺的ReverTra

qPCR RT Master Mix with gDNARemover试剂盒。440μL 4X DN Master Mix与8.8μL gDNA Remover混匀。

20.冰上取1μg RNA于RNase-free的PCR管中，用DEPC-treated ddH₂O补足至 6μL。

21.在PCR仪中65℃，5min后立即冰上冷却2min。

22.冰上加入2μL 4X DN Master Mix(已添加gDNA Remover)，混匀，PCR仪中 37℃、5min。

23.冰上加入2μL 5x RT Master MixII，混匀。PCR仪中37℃，15min、50℃，5min、98℃，5min。

24.标注名称、日期等信息，得到各组酵母菌的cDNA，-20℃保存备用。

25.-20℃冰箱中取出上述cDNA，并稀释4倍，混匀备用。

26.RealTimePCR使用Vazyme的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒。在反应管中配制如下混合液，

检测KmHBN1的引物为KmHBN1-RT-F(序列示于SEQ ID No：1)、KmHBN1-RT-R (序列示于SEQ ID No：2)，内参引物为KmACT1-RT-F(序列示于SEQ ID No：3)、 KmACT1-RT-R(序列示于SEQ ID No：4)。反应混合物如下。

3.在实时荧光定量PCR仪Roche

中按下列条件进行实时荧光定量检测，将结果统计后示于图1，以2^-ΔΔCt表示基因表达的改变。

结果显示，从图1可以看到，与无抑制物组相比，在抑制物混合物、酚类混合物抑制物组、呋喃类抑制物组及乙酸抑制物组中，KmHBN1基因的相对表达水平分别上调了20倍、14倍、3倍、4倍。提示硝基还原酶基因与马克斯克鲁维酵母菌体对木质纤维素类生物质衍生的抑制物的反应相关。

实施例2硝基还原酶基因KmHBN1过表达菌株的构建:

1.硝基还原酶表达载体的构建。

1)硝基还原酶基因的克隆。根据Genbank中硝基还原酶基因(GenBank accessionNo.：MT383676)的序列设计扩增包括硝基还原酶基因的上下游600bp以及开发阅读框的片段序列的引物10054Up-F(SEQ ID No：5)和10054Down-R(SEQ ID No： 6)。以YHJ010菌株的基因组DNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)进行PCR，得到长度约1.7kb的片段。将所述片段通过常法进行加A 处理后与pGEM-T Easy(美国Promega公司)连接形成质粒PZN001。具体构建过程如下：

(1)马克思克鲁维酵母基因组的提取

a)-80℃冰箱中取出保存的酵母菌株并接种于YPD固体培养基中，37℃培养箱过夜培养。

b)挑取菌落接种于5ml YPD液体培养基中，37℃、250rpm培养16-24h。

c)离心(6000rpm、30秒)收集菌体于1.5mL EP管中。

d)用800μL无菌水重悬菌体，离心(6000rpm、30秒)，弃上清。

e)用200μL破壁缓冲液(TritonX-100(2％(w/v)),Tris-HCl(10mM,pH 8.0), SDS(1％(w/v)),EDTA(1mM),NaCl(100mM))重悬菌体。

f)另取灭菌的1.5mL EP管，加入0.2g玻璃珠(Sigma，30-40目)。转移实验操作 e中的菌体裂解液至含玻璃珠的EP管中。

g)加入200μL酚氯仿溶液(酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1(PH>7.8)体积比)，涡旋仪上高速涡旋5min。

h)加入200μl 1×TE(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA)，涡旋混匀。

i)离心(4℃、12000rpm、5min)，吸取上清至1.5ml离心管中，得到粗提取的酵母基因组。

j)用1mL预冷的无水乙醇重悬混匀粗提取的基因组，离心(4℃、12000rpm、10min)，弃上清。

k)在55℃干燥箱中静置10min以去除乙醇。

l)用400μL1×TE重悬混匀，加入2μL RNase(2mg/mL)，37℃水浴锅温育5min 去除提取物中可能混有的RNA。

m)温浴结束后取出离心管，加入0.1倍体积的3M乙酸钠(PH5.2)，混匀后加入 2.5倍体积的冰无水乙醇，混匀。

n)-20℃冰箱中静置1h。

o)离心(4℃、12000rpm、30min)，弃上清。

p)用500μL预冷的75％乙醇离心洗涤(4℃、12000rpm、5min)，弃上清。

q)离心去除管壁多余的乙醇，55℃干燥箱中静置10min。

r)根据后续实验需求加入适量的无菌水进行溶解。

s)利用分光光度计测定DNA浓度，标注名称、浓度、日期等信息，得到提取的基因组，在-20℃保存备用。

(2)硝基还原酶基因的扩增

PCR扩增体系如下：

PCR程序：

(3)采用Promega的凝胶回收试剂盒，按说明书进行凝胶回收PCR扩增获得的片段，在DNA的末端进行加“A”处理，并与pGEM-T Easy载体连接。

反应体系：

72℃温育1h。

温育结束后,用Promega的DNA纯化试剂盒将加A产物纯化回收，根据载体(pGEM-TEasy)：片段(加A产物)(摩尔比)＝1：3--1：10的比例进行TA连接。

TA连接体系：

22℃连接5h或4℃过夜连接。

(4)连接产物转化大肠杆菌(Escherichia coli XL10-Gold)，挑取克隆，送测序，序列正确的为包含硝基还原酶基因的质粒，获得的质粒为PZN001。

2)硝基还原酶基因过表达质粒的构建

利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上述质粒pZN001为模板， 10054Gene-EcorI-F(SEQ ID No：7)、10054Gene-NOTI-R(SEQ ID No：8)为引物对进行了PCR扩增，得到片段硝基还原酶基因KmHBN1的开放阅读框，长度591bp，序列示于SEQ ID No：13中。用EcoR I和Not I双酶切处理硝基还原酶基因KmHBN1片段及载体YEGAP。回收纯化酶切后的片段与载体，按照载体与片段摩尔比1：5的比例连接，获得的质粒即为pZN003。

PCR体系：

PCR程序：

将片段硝基还原酶开放阅读框，和质粒YEGAP用EcoR I和Not I双酶切处理。

片段酶切体系：

37℃温育10h后，酶切片段进行产物纯化，酶切质粒则凝胶电泳纯化回收。

按摩尔比1：5的比例连接酶切片段硝基还原酶开放阅读框及载体YEGAP。

连接体系：

22℃连接5h，进行了连接，获得连接产物。

用连接产物常法转化大肠杆菌(Escherichia coli XL10-Gold)，37℃倒置培养至出现菌落。挑取单克隆，用10054Gene-EcorI-F(SEQ ID No：7)、10054Gene-NOTI-R(SEQ IDNo：8)进行PCR检测。提取PCR检测为阳性的克隆中包含的质粒，将质粒用EcoR I和Not I双酶切后的条带送测序检测。测序结果与Genbank中的序列比对，将比对完全正确的质粒标记为pZN003。

3)硝基还原酶过表达菌株的构建。

以YEUGAP(构建方法可参见CN201410727487.3，Zhang et al.,2015)为模板，ScURA3-SMAI-F(序列示于SEQ ID No：9)和ScURA3-SMAI-R(序列示于SEQ ID No： 10)为引物，用PrimeSTAR DNA聚合酶(宝生物，大连)扩增，得到ScURA3片段。这里的PCR反应体系与扩增硝基还原酶基因的体系，除引物和模板之外都相同。PCR反应条件也一致。

将扩增得到的ScURA3片段转化到宿主菌YHJ010(Hong et al.,2007)里，使用含有亮氨酸与色氨酸，但是不含有尿嘧啶的合成培养基筛选克隆，获得的菌株为YZN011。

将空载体YEGAP(Hong et al.,2007)转化到YZN011菌株中，在合成培养基上筛选，获得YZN012菌株。所述YZN012菌株为LEU2亮氨酸营养缺陷型，但硝基还原酶基因没有过表达，在本发明中作为对照菌株使用。上述菌株YZN012通过利用空载体 YEGAP和YZN011菌株，能够重复性良好的获得。

以上述质粒pZN003为模板，Expression-F(SEQ ID No：11)和Expression-R(SEQID No：12)为引物，用PrimeSTAR DNA聚合酶扩增，得到带ScTRP1标签的硝基还原酶基因过表达片段。这里的PCR反应体系与扩增硝基还原酶基因的体系，除引物之外都相同。PCR反应条件也一致。扩增得到的片段转化到YSY011里，使用含有亮氨酸，不含色氨酸及尿嘧啶的合成培养基筛选，得到尿嘧啶和色氨酸合成能力恢复(即，同时带有ScTRP1标签和ScURA3标签)的KmHBN1过表达菌株YSY013。

实施例3菌株YZN013对多种抑制物的耐受性测试

在本实施例中，发明人对硝基还原酶基因过表达突变菌株YZN013对多种抑制物的耐受性进行了测试。试验分为两组，对照组(菌株YZN012，不表达硝基还原酶，但营养缺陷型与YZN013相同)和过表达组(YZN013)。

1)将上述菌株YZN012与YZN013划线至YPD固体培养基上，37℃培养箱中培养；

2)挑取单克隆至5mL YPD液体培养基中，过夜培养(37℃、250rpm)至对数期；

3)配置含有抑制物混合物的合成培养基(酵母氮源基础(yeast nitrogen base，YNB，上海生工)0.67％，2％葡萄糖，抑制物混合物)液体培养基，分装30mL至锥形瓶中；

这里，所述抑制物混合物为1.9g/L乙酸+0.95g/L呋喃衍生物(糠醛和5-羟甲基糠醛各0.475g/L)+0.19g/L酚类化合物(邻苯二酚、丁香醛、香兰素和4-羟基苯甲醛各0.0475g/L))。

4)按过夜培养的两组菌株按起始OD₆₀₀＝0.3的量分别转接菌至上述培养基中；

5)在摇床中培养(42℃、250rpm)，期间观察菌体生长状态，在第0，4，6，8， 12，14，16，18，20，23，26，29，32小时分别取出500μL菌液，测量OD₆₀₀，统计后，将不同时间点的生长结果示于图2。

结果显示，无抑制物时，菌株YZN013与对照菌株组YZN012具有相同的延滞期。而有抑制物时，与对照组YZN012(12h)相比，菌株YZN013具有更短的延滞期(8h)，表明菌株YZN013对于多种毒性抑制物造成的生长速度延滞的抵抗更强。证明过表达硝基还原酶基因提高了该酵母菌株对衍生自木质纤维素类生物质的多种毒性抑制物的耐受能力。

实施例4在多种抑制物存在下菌株YZN013的发酵特性测试

在本实施例中，发明人对菌株YZN013在多种抑制物存在下的无氧发酵特性进行了测试。试验分为两组，对照组(菌株YZN012)和过表达组(YZN013)。

1)将菌株YZN012与YZN013划线至YPD固体培养基中，在37℃培养箱中培养；

2)挑取单克隆至5mL YPD液体培养基中，摇床过夜培养(37℃、250rpm)至对数期；

3)配置含有抑制物混合物[1.9g/L乙酸+0.95g/L糠醛(等量的糠醛和五羟甲基糠醛)+0.19g/L酚(邻苯二酚、丁香醛、香兰素和4-羟基苯甲醛各0.0475g/L)]的YPD液体培养基，分装20mL至无氧发酵小瓶中；

4)按起始OD₆₀₀＝0.3的量转接菌至上述培养基中；

5)在摇床中培养(42℃、250rpm)，期间观察菌体生长状态，菌体开始繁殖生长时，在第0、12、18、21、24、27、40、46小时取出500μL菌液，一部分菌液用于测量 OD₆₀₀，一部分菌液在离心(12000rpm、5min)后取上清，-20℃保存备用；

6)发酵进行48小时后，终止发酵。将培养基上清进行离心(12000rpm、10min)，取上清进行HPLC分析。HPLC(条件：进样量20μL、流速0.3mL/min、流动相：0.025 M硫酸)检测葡萄糖消耗量及乙醇产量情况，酵母细胞密度通过OD₆₀₀测定。将结果示于图3。

结果显示，当培养基中存在抑制物混合物时，与对照组相比，YZN013无论是菌株生长状态，葡萄糖消耗速率还是乙醇产率及产量方面都有提高。具体地，YZN013在 24小时内生产了31.40g/L的乙醇，生产速率为1.31g/(L·h)，而YZN012在27小时仅生产了29.06g/L乙醇，生产速率为1.076g/(L·h)。YZN013生产乙醇的产量和速率比对照菌株YZN012分别提高了8.05％和21.74％。

实施例5菌株YZN013利用预处理的玉米芯进行同步糖化和共发酵的特性

在本实施例中，发明人对菌株YZN013利用预处理的玉米芯+未脱毒处理上清进行同步糖化和共发酵时表现的特性进行了测试。试验分为两组，对照组(菌株YZN012) 和过表达组(YZN013)。

1)玉米芯的预处理：

(1)用天平称取300克的玉米芯然后装入2升的锥形瓶中，按照固液比1：4 的比例加入预混的酸溶液(0.5％(w/w)H₂SO₄+1.5％(w/w)H₃PO₄)充分混合；

(2)玉米芯与酸溶液充分混合后将锥形瓶的口封住，然后放入灭菌锅中进行高温处理，处理条件为127℃，60min；

(3)高温高压处理结束后取出放置于室温，自然冷却。待冷却后通过医用纱布将残渣与上清分离，得到的上清即酸性的玉米芯水解液；

(4)由于此时的玉米芯水解液酸性太强并不适合用于酵母的生长和发酵，通过添加Ca(OH)₂粉末调节pH到6，此时会产生大量沉淀，使用普通分析滤纸过滤去除沉淀。得到的上清即未脱毒处理(即抑制物未去除)的玉米芯水解液，简称未脱毒处理上清；将未脱毒处理上清在55℃温箱中保温浓缩，直至体积减少到一半， 4℃保存备用，得到浓缩后的未脱毒上清。

(5)同时将处理后的玉米芯残渣用水洗至pH中性，医用纱布过滤去除水分，4℃保存备用。称取10g湿重玉米芯残渣，55℃烘干，称重，计算10g湿重玉米芯残渣含有多少干重的玉米芯残渣(10g湿重相当于3.3g干重)。

需要说明的是，经酸处理并调节pH而得到的未脱毒或者脱毒的玉米芯水解液都可以不经灭菌直接用于菌株发酵生长。

2)发酵方案

(1)从-80℃冰箱中取出菌株YZN013、YZN012，画线至YPD固体培养基中，37℃倒置培养。

(2)挑取单克隆至5mL YPD液体培养基中，37℃、250rpm摇床过夜培养。

(3)在此期间称量32.7g湿重(相当于干重10.8g)的上述玉米芯残渣于250mL锥形瓶中，同上条件进行了高温高压灭菌。

(4)向锥形瓶中加入17mL浓缩后的未脱毒上清，按15FPU/g玉米芯干重添加纤维素酶(尤特尔，湖南)，添加1％酵母提取物和2％蛋白胨，补充水分至64mL。

(4)按起始OD₆₀₀＝1的菌量分别接种YZN013，YZN012至上述锥形瓶中。

(5)42℃、250rpm摇床培养。

(6)分别在0、16、23、31、36、41、51、59.5、66、72、82、94小时取1mL培养物出来，4℃、14000rpm、5min，吸取上清，-80℃保存。

(7)发酵结束后，从-80℃取出各时间段的待分析样本，稀释30倍通过HPLC(条件：安捷伦1260，菲罗门ROA-Organic Acid H+(8％)层析柱，流动相0.0025M H₂SO₄，柱温75℃，流速0.3mL/min)检测乙醇产量，将发酵结果示于图4。

结果显示：菌株YZN013在60小时内生产了23.06g/L的乙醇，生产速率为0.38 g/(L·h)，而YZN012在60小时内仅生产了17.88g/L乙醇，在72小时，才达到23.22g/L，生产速率为0.32g/(L·h)。YZN013利用酸处理的玉米芯生产乙醇的速率比对照菌株 YZN012提高了19.75％。证明过表达硝基还原酶KmHBN1提高了马克斯克鲁维酵母在实际的木质纤维素乙醇生产中的抑制物耐受性。

表1本发明中用到的引物，下划线表示酶切位点，方向为5'到3'

综上所述，本发明通过在马克斯克鲁维酵母中过表达硝基还原酶基因KmHBN1，实现了所述酵母对木质纤维素预处理过程中产生的多种抑制物混合物耐受的提高。构建的酵母在多种抑制物混合物存在的合成培养基中生长的延滞期为8小时，而对照菌株为12小时；培养16小时后，过表达菌株YZN013的菌密度(OD600)达1.95，而对照菌株YZN012菌密度仅1.41，且对照菌株需要20小时才达最高菌密度(OD600)1.93；在厌氧条件下培养且抑制物存在时，过表达菌株比对照菌株的乙醇产量和生产速率分别提高了8.05％和21.55％。

工业实用性

本发明提供一种马克斯克鲁维酵母，该菌株对木质纤维素类生物质预处理过程中产生的多种毒性抑制物质包括弱酸类、呋喃类和酚类化合物的耐受能力优异。这样的菌株可作为平台菌株，用于生物乙醇的生产，还可通过基因工程等手段进一步优化，获得高效利用木质纤维素类生物质生产各种化学品的菌株。

发明人通过过表达硝基还原酶实现了提高酵母对多种抑制物混合物的耐受，尤其是在利用稀酸处理的玉米芯生产乙醇的发酵中，被证实有效，这为抵抗抑制物毒性、构建高耐受菌株提供了理论基础和方法，构建的菌株可以作为进一步构建更好的抑制物耐受的菌株的出发菌株。

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Claims

1.酵母菌，其为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces.marxianus)YHJ010的突变株，其中的硝基还原酶基因过表达，所述硝基还原酶基因为KmHBN1，所述KmHBN1如GenBankaccession No:MT383676所示。

2.根据权利要求1所述的酵母菌，其为保藏号为CGMCC No.21814的马克斯克鲁维酵母。

3.组合物，其包含权利要求1或2所述的酵母菌。

4.权利要求1或2所述的酵母菌及权利要求3所述的组合物在处理木质纤维素类生物质中的用途。

5.权利要求1或2所述的酵母菌及权利要求3所述的组合物在用于通过利用木质纤维素类生物质生产乙醇中的用途。

6.提高利用木质纤维素生物质的工程菌对木质纤维素类衍生的抑制物质的耐受性的方法，包括，通过基因工程方法使所述菌中过表达硝基还原酶基因KmHBN1，所述KmHBN1如GenBank accession No:MT383676所示，所述菌为马克斯克鲁维酵母属的菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述抑制物质包括选自弱酸类化合物、呋喃类化合物和酚类化合物中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述弱酸类化合物包括乙酸或乙酸盐，呋喃类化合物包括糠醛和5-羟甲基糠醛，酚类化合物包括邻苯二酚、丁香醛、香兰素和4-羟基苯甲醛。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述基因工程方法包括向菌体中导入用于过表达所述KmHBN1基因的开放阅读框片段的质粒，所述开放阅读框片段的序列如SEQ ID No：13所示。