CN117070379B - 一种重组粗糙脉孢菌及其应用 - Google Patents

一种重组粗糙脉孢菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117070379B
CN117070379B CN202311340446.4A CN202311340446A CN117070379B CN 117070379 B CN117070379 B CN 117070379B CN 202311340446 A CN202311340446 A CN 202311340446A CN 117070379 B CN117070379 B CN 117070379B
Authority
CN
China
Prior art keywords
crassa
gene
neurospora crassa
ncpfk
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202311340446.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117070379A (zh
Inventor
赵晨
梁嘉诚
马彩虹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Research Institute Of Northwest University Of Agriculture And Forestry Science And Technology
Original Assignee
Shenzhen Research Institute Of Northwest University Of Agriculture And Forestry Science And Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Research Institute Of Northwest University Of Agriculture And Forestry Science And Technology filed Critical Shenzhen Research Institute Of Northwest University Of Agriculture And Forestry Science And Technology
Priority to CN202311340446.4A priority Critical patent/CN117070379B/zh
Publication of CN117070379A publication Critical patent/CN117070379A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117070379B publication Critical patent/CN117070379B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/99—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with other acceptors (1.6.99)
    • C12Y106/99003—NADH dehydrogenase (1.6.99.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01011—6-Phosphofructokinase (2.7.1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01017—Xylulokinase (2.7.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种重组粗糙脉孢菌及其应用，所述重组粗糙脉孢菌包括菌株N.crassa EG‑ncpfk、N.crassa EG‑scpfk和N.crassa EG‑ncpfk‑noxe。所述重组粗糙脉孢菌敲除了木酮糖激酶基因，破坏了木糖代谢的戊糖磷酸途径，激活了乙二醇合成途径。重组粗糙脉孢菌在含有木质素水解液的培养基中能够合成乙二醇。优化发酵条件后，菌株N.crassa EG‑ncpfk在添加水解液的木糖培养基中发酵120h乙二醇的产量达到1015.31mg/L，较优化前提升5.40倍。本发明为乙二醇制备提供一种原料来源广泛、生产成本低的方法。

Description

一种重组粗糙脉孢菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种重组粗糙脉孢菌及其应用。
背景技术
粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）是一种雌雄异株的丝状真菌，存在于热带、亚热带和温带地区，易被发现生长在火烧焦的植被表面。粗糙脉孢菌具有高水平合成和分泌降解木质纤维素的各种类型酶的能力，能在以木糖为唯一碳源的培养基中生长，且消耗木糖速率与消耗葡萄糖的速率接近，能够利用纤维素进行生长。据报道，粗糙脉孢菌在氧气充足的条件下，代谢己糖和戊糖、纤维素聚合物等生成大量菌丝，而在限氧条件下会积累中间代谢产物。
木糖是木质纤维素中第二丰富的糖，占比18%~30%，仅次于葡萄糖，广泛存在于植物中，也存在于动物肝素、软骨素和糖蛋白中。然而大多数真菌和细菌缺少转运木糖的蛋白，无法将木糖转运进细胞内；部分微生物的木糖代谢途径微弱，不能在以木糖为唯一碳源的培养基中生长。
乙二醇（EG）是一种双碳二羟基醇，其用途主要包括：作为防冻剂、作为聚合物聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的前体，也广泛用于化学工业，如油漆和树脂。现有技术制备乙二醇主要是由环氧乙烷通过热反应或催化反应水化或由环氧乙烷通过碳酸化和随后的碱性催化剂水解生成，市场上少量乙二醇是通过生物基乙醇脱水生产的。
然而，这些工艺都是通过相对成本较高的化学过程实现的。因此，提供一种原料来源广泛、生产成本低的乙二醇制备方法具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术制备乙二醇的方法中生产成本较高的问题，本发明提供一种重组粗糙脉孢菌及其应用。本发明将粗糙脉孢菌中的木酮糖激酶基因xyk-1敲除，阻止粗糙脉孢菌以木酮糖为底物的磷酸戊糖途径（PPP），碳源无法由PPP流向中心碳代谢途径，最终导致了木糖醇的积累，从而激活了天然存在的乙二醇合成途径，达到以木糖为底物合成乙二醇的目的。
本发明进一步改造粗糙脉孢菌，通过表达6-磷酸果糖激酶（PFK）以及NADH氧化酶NOXE进一步提高乙二醇的产量，构建的菌株N. crassaEG-ncpfk-noxe在木糖发酵72h后，乙二醇的产量达到最大113.59mg/L，而原始粗糙脉孢菌并不能生产乙二醇。经过添加水解液和补加葡萄糖，菌株N. crassaEG-ncpfk在摇瓶中发酵产乙二醇的量达到1015.31mg/L。
本发明改造后的粗糙脉孢菌不仅具有一定解毒能力，对于木质纤维素预处理过程中产生的糠醛等对细胞有毒害、抑制细胞正常生长的物质具有一定抗性，还能够利用木质纤维素水解液提高乙二醇的产量。
为实现本发明的技术目的，一方面，本发明提供一种重组粗糙脉孢菌，将敲除载体转化入粗糙脉孢菌得到菌株N. crassa∆xk，将菌株N. crassa∆xk与组氨酸缺陷型粗糙脉孢菌FGSC 9717杂交后，得到粗糙脉孢菌组氨酸缺陷和木酮糖激酶敲除的双突变型菌株N. crassaEG，随后通过表达6-磷酸果糖激酶（PFK）得到重组粗糙脉孢菌N. crassaEG-ncpfk或重组粗糙脉孢菌N. crassaEG-scpfk。
进一步，本发明提供的菌株N. crassa ∆xk中，敲除载体敲除粗糙脉孢菌中的木酮糖激酶基因，木酮糖激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。敲除载体的制备包括：扩增木酮糖激酶基因的上游同源臂基因和下游同源臂基因后，将上游同源臂基因、潮霉素表达盒、下游同源臂基因与线性化质粒pUC18连接得到。
进一步，本发明通过发酵试验验证，菌株N. crassa∆xk在木糖培养基中发酵72h后，乙二醇积累量为58.33mg/L，而未敲除木酮糖磷酸激酶基因的粗糙脉孢菌并未合成出乙二醇。通过敲除粗糙脉孢菌中的木酮糖磷酸激酶基因xyk-1，破坏木糖代谢的戊糖磷酸途径，激活了乙二醇合成途径。
进一步，本发明提供的粗糙脉孢菌中，6-磷酸果糖激酶（PFK）为本源或异源中的一种。通过表达本源6-磷酸果糖激酶基因构建重组粗糙脉孢菌N. crassaEG-ncpfk，通过表达异源6-磷酸果糖激酶基因构建重组粗糙脉孢菌N. crassaEG-scpfk。本源6-磷酸果糖激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；异源6-磷酸果糖激酶基因包括PFKα基因和PFKβ基因，PFKα基因的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，PFKβ基因的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
进一步，本发明通过本发明通过发酵试验验证，菌株N. crassaEG-ncpfk和菌株N. crassaEG-scpfk在发酵72h后乙二醇达到88.5mg/L和产量79.7mg/L。菌株N. crassaEG-ncpfk在发酵96h后乙二醇的产量最高，为102.08mg/L，相比于对照菌株N. crassa∆xk最高产量58.33mg/L提高了75%，说明表达本源或异源6-磷酸果糖激酶基因能够提高乙二醇的产量。
另一方面，本发明提供一种粗糙脉孢菌，将NCPFK-NOXE共表达载体转入粗糙脉孢菌N. crassaEG的感受态细胞中，构建重组粗糙脉孢菌N. crassaEG-ncpfk-noxe。
进一步，本发明提供的粗糙脉孢菌中，NCPFK-NOXE共表达载体的制备包括：将6-磷酸果糖激酶基因、NADH氧化酶的基因与线性化质粒pMF272连接后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，提取质粒得到。6-磷酸果糖激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；NADH氧化酶为NOXE，NOXE基因的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示。
进一步，本发明通过发酵试验验证，菌株N. crassaEG-ncpfk-noxe能够达到增加胞内NAD+的浓度的目的，最终菌株N. crassaEG-ncpfk-noxe在木糖发酵72h后，乙二醇的产量达到最大113.59mg/L，相比于菌株N. crassa∆xk和菌株N. crassaEG-ncpfk提高了94.7%和28.3%。说明表达NOXE能够促进木糖醇向下游途径代谢，共表达NCPFK和NOXE能够有效地提高乙二醇的产量。
另一方面，本发明请求保护上述重组粗糙脉孢菌在生产乙二醇中的应用。上述重组粗糙脉孢菌以木糖为底物生产乙二醇，而原始粗糙脉孢菌并不能生产乙二醇。
进一步，本发明将菌株N. crassa∆xk和菌株N. crassaEG-ncpfk接种至含有玉米秸秆水解液的15g/L木糖培养基中25℃，200rpm摇床暗培养发酵，结果显示乙二醇的产量均得到了提升，最高为158.55mg/L。本发明构建的菌株不仅具有一定解毒能力，对于木质纤维素预处理过程中产生的糠醛等对细胞有毒害、抑制细胞正常生长的物质具有一定抗性，还能够利用木质纤维素水解液提高乙二醇的产量。表明乙酸和糠醛等抑制物并没有影响乙二醇的积累，相反能够极大地促进乙二醇的积累。
进一步，本发明对菌株的发酵条件进行优化，在木糖培养基中分别于0、48、96h时添加10g/L葡萄糖，并在前48h进行限氧发酵，菌株N. crassaEG-ncpfk加入量增加一倍，在发酵120h时最高产量提升至1015.31mg/L，较优化前的158.55mg/L提升5.40倍。
另一方面，本发明请求保护一种生产乙二醇的方法，通过采用重组粗糙脉孢菌N. crassaEG-ncpfk，或重组粗糙脉孢菌N. crassaEG-scpfk，或重组粗糙脉孢菌N. crassaEG-ncpfk-noxe，以木糖为底物经发酵获得。
还有，本发明请求保护重组粗糙脉孢菌N. crassaEG-ncpfk，或重组粗糙脉孢菌N. crassaEG-scpfk，或重组粗糙脉孢菌N. crassaEG-ncpfk-noxe的制备方法，包括敲除粗糙脉孢菌中的木酮糖激酶基因，木酮糖激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。重组粗糙脉孢菌N. crassaEG-ncpfk，或重组粗糙脉孢菌N. crassaEG-scpfk，或重组粗糙脉孢菌N. crassaEG-ncpfk-noxe以木糖为底物合成乙二醇。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案至少具备下述的有益效果或优点：
本发明首先在粗糙脉孢菌中敲除木酮糖磷酸激酶基因xyk-1，破坏木糖代谢的戊糖磷酸途径后，碳源无法由PPP流向中心碳代谢途径，而粗糙脉孢菌的其他木糖代谢途径较弱，不能快速代谢中间产物，最终导致了木糖醇的积累，从而激活了天然存在的乙二醇合成途径。菌株N. crassa∆xk在木糖培养基中发酵72h后，乙二醇积累量为58.33mg/L，而未敲除木酮糖磷酸激酶的粗糙脉孢菌并未合成出乙二醇。
本发明进一步改造粗糙脉孢菌，通过表达本源或异源6-磷酸果糖激酶（PFK）基因，构建菌株N. crassaEG-ncpfk和菌株N. crassaEG-scpfk，经发酵试验验证得知，菌株N. crassaEG-ncpfk和菌株N. crassaEG-scpfk在发酵72h后乙二醇产量分别达到88.5mg/L和79.7mg/L。菌株N. crassaEG-ncpfk在发酵96h后乙二醇的产量最高，为102.08mg/L，相比于对照菌株N. crassa∆xk最高产量58.33mg/L提高了75%，说明表达本源或异源6-磷酸果糖激酶基因能够提高乙二醇的产量。
本发明进一步改造粗糙脉孢菌，通过共表达粗糙脉孢菌本源PFK和NADH氧化酶NOXE，构建菌株N. crassaEG-ncpfk-noxe，经发酵试验验证得知，菌株N. crassaEG-ncpfk-noxe达到增加胞内NAD+的浓度的目的，菌株N. crassaEG-ncpfk-noxe在木糖发酵72h后，乙二醇的产量达到最大113.59mg/L，乙二醇产量相比于菌株N. crassa∆xk和菌株N. crassaEG-ncpfk提高了94.7%和28.3%。说明表达NOXE能够促进木糖醇向下游途径代谢，共表达NCPFK和NOXE能够有效地提高乙二醇的产量。
本发明将菌株N. crassa∆xk和菌株N. crassaEG-ncpfk接种至含有玉米秸秆水解液的木糖培养基中发酵，结果显示两种重组粗糙脉孢菌乙二醇的产量均得到了提升，最高为158.55mg/L。本发明构建的菌株不仅具有一定解毒能力，对于木质纤维素预处理过程中产生的糠醛等对细胞有毒害、抑制细胞正常生长的物质具有一定抗性，还能够利用木质纤维素水解液提高乙二醇的产量。表明乙酸和糠醛等抑制物并没有影响乙二醇的积累，相反能够极大地促进乙二醇的积累。
本发明对粗糙脉孢菌的发酵条件进行优化，在含木质纤维素水解液的木糖培养基中分别于0、48、96h时添加10g/L葡萄糖，并在前48h进行限氧发酵，同时N.crassaEG-ncpfk菌株接种量提高一倍。优化后粗糙脉孢菌的乙二醇产量大大提升，在发酵120h时最高产量提升至1015.31mg/L，较优化前的158.55mg/L提升5.40倍；较产量为66.98mg/L的未添加木质纤维素水解液的菌株N. crassaEG-ncpfk组，提高了14.16倍。该优化后的发酵条件中，添加葡萄糖为菌株代谢提供了能量和还原力，提升了菌体活力；限氧发酵避免了菌株利用葡萄糖进行过度生长；增加接种量提升了整体的转化效率。由此表明，本发明中的菌株经过发酵优化能够使乙二醇产量大幅度提升。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。
图1为木酮糖激酶基因xyk-1的上游同源臂基因片段和下游同源臂基因片段的核酸电泳图。M为指示分子量大小的标准条带；泳道1~3为木酮糖激酶xyk-1的上游同源臂基因片段的电泳条带；泳道4为木酮糖激酶xyk-1的下游同源臂基因片段的电泳条带。
图2为敲除xyk-1基因后的粗糙脉孢菌菌株以及野生型粗糙脉孢菌菌株的发酵实验结果图。FGSC 2489为野生型粗糙脉孢菌菌株；N. crassa∆xk为xyk-1基因敲除后的粗糙脉孢菌菌株。
图3为粗糙脉孢菌异核杂交过程中菌株N. crassa∆xk的分生孢子图以及将分生孢子涂于粗糙脉孢菌组氨酸缺陷型菌株孢子囊上培养后的子囊孢子图。a为菌株N. crassa∆xk的分生孢子图；b为将分生孢子涂于粗糙脉孢菌组氨酸缺陷型菌株孢子囊上培养后的子囊孢子图。
图4为组氨酸缺陷和木酮糖激酶敲除的双突变菌株的电泳图。a为菌株潮霉素基因片段的电泳图；b为菌株xyk-1基因片段的电泳图；泳道1~6为选取的杂交后的6株菌株的基因组电泳验证条带；a中泳道M为指示分子量大小的标准条带，泳道1、2、4为扩增出潮霉素基因片段的条带；b中泳道M为指示分子量大小的标准条带，泳道5为扩增出xyk-1基因片段的条带。
图5为粗糙脉孢菌本源emp-3基因的核酸电泳图。M为指示分子量大小的标准条带，泳道1~5为挑选的5株菌株的电泳条带。
图6为Pccg-1-PFKβ和Pccg-1-PFKβ-PFKα的核酸电泳图。a为Pccg-1-PFKβ的核酸电泳图，M为指示分子量大小的标准条带，泳道3、4为片段Pccg-1-PFKβ的电泳图；b为Pccg-1-PFKβ-PFKα的核酸电泳图，M为指示分子量大小的标准条带，泳道3、4、6、7、10、12为片段Pccg-1-PFKβ-PFKα的电泳图。
图7为pfk基因表达菌株在木糖培养基中的发酵情况图。a为pfk基因表达菌株在木糖培养基中的木糖消耗图；b为pfk基因表达菌株在木糖培养基中的乙二醇产生图。
图8为粗糙脉孢菌利用木糖合成乙二醇的途径。
图9为NCPFK和NOXE共表达载体的图谱。
图10为菌株N. crassaEG-ncpfk-noxe的核酸电泳图。M为指示分子量大小的标准条带；1~12泳道分别展示了12个转化子的验证情况，1、4、6、8、9泳道菌株为含有NOXE的阳性菌株。
图11为菌株N. crassaEG-ncpfk-noxe和菌株N. crassa∆xk、菌株N. crassaEG-ncpfk在木糖培养基中乙二醇的产量。
图12为菌株N. crassa∆xk和菌株N. crassaEG-ncpfk在含木糖的玉米秸秆水解液中乙二醇的产量。*为添加玉米秸秆水解液。
图13为菌株N.crassaEG-ncpfk发酵条件优化后的乙二醇产量。
具体实施方式
下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
微量元素（Trace elements）：枸橼酸（Citric acid·H2O）50g/L，ZnSO4·7H2O50g/L，Fe(NH4)2(SO4)·6H2O 10g/L，CuSO4·5H2O 2.5g/L，MnSO4·H2O 0.5g/L，H3BO30.5g/L，NaMoO4·2H2O 0.5g/L，用0.22μm的过滤器过滤除菌后，保存在4℃冰箱。
生物素：50mg生物素（Biotin，购于BBI Life Science）溶解在1L的50%的乙醇中，用0.22μm的过滤器过滤除菌后，保存在4℃冰箱。
50×Vogel’s：二水合柠檬酸三钠（Na3Citrate·2H2O）126.8g/L，CaCl2·2H2O 5g/L（单独在水中溶解后再加入），KH2PO4250g/L，MgSO4·7H2O 10g/L，NH4NO3100g/L，微量元素10mL/L，生物素10mL/L，最后加入5mL/L的氯仿防止盐溶液被微生物污染。
LB固体培养基：酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂15g/L。
LB液体培养基：酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L。
VM固体培养基（100mL）：50×Vogel’s 2mL，琼脂1.0g，蔗糖1.5g。
VM液体培养基（100mL）：50×Vogel’s 2mL，蔗糖1.5g。
10×FGS：山梨糖（Sorbose）200g/L，葡萄糖（Glucose）5g/L，果糖（Fructose）5g/L。
再生琼脂（Regeneration agar）（50mL）：50×Vogel’s 1mL，10×FGS 5mL，蔗糖0.5g，根据实验需要添加终浓度为100μg/mL的组氨酸或终浓度为200μg/mL的潮霉素B（抗生素在高压灭菌后再添加）。
种子培养基（50mL）：50×Vogel’s 1mL，蔗糖1g。
发酵培养基（50mL）：50×Vogel’s 1mL，木糖（Xylose）1g。
1×SCM培养基：KNO31g/L，K2HPO40.7g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl20.1g/L，NaCl 0.1g/L，生物素1mL/L，微量元素1mL/L，蔗糖15g/L，琼脂10g/L，121℃高压灭菌20min，冷却后放4℃冰箱保存。
1M山梨醇（100mL）：山梨醇（Sorbitol）18.22g。
实施例1
本实施例提供了粗糙脉孢菌xyk-1基因的敲除，具体包括以下步骤：
1、粗糙脉孢菌感受态的制备
1）在250mL的锥形瓶中配制25mL的VM固体培养基，将粗糙脉孢菌FGSC 4200（购于美国Fungal Genetics Stock Center）接种于培养上，30℃暗培养箱中培养2~3天，25℃光照培养箱中培养6~7天。
2）约9天后培养基上生成大量的分生孢子，在锥形瓶中加入20~30mL无菌水，震荡使孢子悬浮在无菌水中，用四层纱布过滤将分生孢子过滤到50mL的离心管中，3000rpm，4℃离心5min。
3）倒掉上清液，在离心管中加入20mL冰浴过的的无菌水，重新悬浮孢子，2500rpm，4℃离心5min，弃上清液。
4）在离心管中倒入30mL冰浴过的1M的山梨醇溶液，再次悬浮孢子，3500rpm，4℃离心15min。
5）重复步骤4）3次后，将上清液吸取干净，得到粗糙脉孢菌的感受态细胞。
6）加入1mL的1M山梨醇溶液，轻轻吹打悬浮孢子，最后分装到1.5mL的离心管中，每管中装90μL的感受态细胞，保存在-80℃冰箱备用。
2、敲除载体的构建
根据NCBI中粗糙脉孢菌基因序列信息，使用引物xyk-1F和xyk-1R扩增所要敲除的基因木酮糖激酶基因xyk-1（xyk-1基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示），使用引物5xrF和5xrR扩增得到xyk-1上游约1.5kb基因片段（上游同源臂），使用引物3xrF和3xrR扩增得到xyk-1下游约1.5kb基因片段（下游同源臂），扩增所用的酶为来自YEASEN的2x HieffCanace Plus PCR Master Mix，是一种高保真酶。使用该高保真酶扩增时反应条件为：98℃下预变性3min；98℃下变性10sec、60℃下退火20sec、72℃下延伸30sec/kb共35个循环；72℃下终延伸5min。使用该高保真酶扩增时反应体系如表1所示。
将扩增得到的目的基因片段进行核酸电泳鉴定（图1）。扩增得到潮霉素表达盒序列，质粒pUC18（实验室保存）通过PCR进行线性化，按顺序将上游同源臂、潮霉素表达盒序列、下游同源臂和线性化质粒相连接，构成粗糙脉孢菌的敲除载体。扩增潮霉素表达盒序列使用的引物包括Hph-F（5’-ctgaaacacagaGTCGACAGAAGATGATATTGAAGGAG-3’）和Hph-R（5’-tacaccCTATTCCTTTGCCCTCGGACG-3’）；线性化质粒pUC18使用的引物包括pUC18-F（5’-GTACCTCGAGACTAGTGAGCTCGAA-3’）和pUC18-R（5’-CTGTCGGCAGAGGCATCTTC-3’）。
表1：PCR扩增体系
由图1可知，通过扩增得到了上游同源臂基因片段和下游同源臂基因片段，条带1~3为上游同源臂基因片段，大小为1231bp，条带4为下游同源臂基因片段，大小为1502bp。
3、粗糙脉孢菌的电激转化
1）将粗糙脉孢菌的感受态细胞从-80℃冰箱中取出后冰浴融化，加入3~4μg的敲除载体，用移液枪轻轻吹打混匀，上述细胞和载体全部转入电转杯中，冰浴30min。
2）打开电转仪预热10min，设定电压为2.5KV。
3）用干净的纸巾擦干净电转杯的表面，电激，电激结束后立即加入900μL的1M山梨醇溶液，轻轻加入同时吹打3次，最后冰浴5min。
4）将产物全部转移到装有500μL无菌水的1.5mL的离心管中，30℃摇床复苏3h。
5）复苏3h后，5000rpm离心5min，弃去上清液后将细胞加入25mL的再生琼脂中，混匀培养基和细胞后倒平板。
6）将平板放置在30℃的暗培养箱中，培养3~4d。
将敲除载体转化入粗糙脉孢菌中后，敲除载体中xyk-1基因的上游和下游序列与染色体中的相同序列发生同源重组，xyk-1被替换为潮霉素表达盒，得到电激转化后的粗糙脉孢菌。
实施例2
本实施例提供了敲除xyk-1基因后的粗糙脉孢菌纯合子的筛选及其发酵培养，具体包括以下步骤：
1、粗糙脉孢菌纯合子的筛选
将电激转化后的粗糙脉孢菌在VM固体培养基中培养，获得分生孢子后用无菌水悬浮分生孢子，将分生孢子悬浮液通过5μm的滤膜过滤，过滤回收的孢子液经12000rpm离心1~2min，弃去上清液，重新用无菌水悬浮孢子后涂布于FGS培养基（含有终浓度200μg/L的潮霉素B）上，筛选出粗糙脉孢菌纯合子菌株N. crassa∆xk。
2、粗糙脉孢菌纯合子的发酵方法
将筛选得到的粗糙脉孢菌纯合子菌株N. crassa∆xk和粗糙脉孢菌野生型菌株FGSC 2489（购于美国Fungal Genetics Stock Center）在VM固体培养基中30℃暗培养3d，25℃光照培养6d，生成大量的分生孢子，无菌水冲洗分生孢子后用四层纱布过滤得到孢子悬浮液；将孢子液稀释10倍后用紫外分光光度计测量OD600的值，并计算接种量，使最终接入到50mL种子培养基中的孢子浓度为1×106/mL；在25℃，200rpm的摇床中暗培养40h，得到一定量的菌丝，将菌丝在无菌的的布氏漏斗中抽滤，并用无菌水冲洗残留的种子培养基，而后将菌丝转移到发酵培养基中继续在25℃，200rpm的摇床中暗培养；分别在发酵培养的0h、24h、48h、72h、96h、120h取样，进行高效液相色谱检测乙二醇含量，每个菌株生物学重复三次，数据以均值±SD表示（图2）。高效液相色谱检测的条件为：柱子为Aminex HPX-87H（300×7.8）；流速为0.7mL/min；流动相为0.014mol/L硫酸溶液；示差折光检测器池温为50℃。
由图2可知，木糖发酵96h内，菌株N. crassa∆xk检测到乙二醇，且在72小时时达到最大值58.3mg/L。对照菌株FGSC 2489中未检测出乙二醇。以上实验说明粗糙脉孢菌在敲除xyk-1基因后，木糖能够经由其天然的代谢途径转化为乙二醇。
实施例3
本实施例提供了粗糙脉孢菌组氨酸缺陷和木酮糖激酶敲除的双突变型菌株的构建，具体包括以下步骤：
1、粗糙脉孢菌的异核杂交
1）在玻璃试管中配制5mL的1×SCM培养基（含有终浓度为100μg/mL的组氨酸），制成斜面培养基后接种粗糙脉孢菌组氨酸缺陷型菌株FGSC 9717（matA）（购于美国FungalGenetics Stock Center），在25℃光照培养箱中培养6d；
2）提前在VM固体培养基中培养菌株N. crassa∆xk，30℃暗培养3d，25℃光照培养6d；纱布过滤收集菌株N. crassa∆xk的分生孢子（图3中的a），将其悬浮于10mL的离心管中。
3）用无菌湿润的棉花团擦洗斜面培养基所对的试管表面，使试管内壁保持干净，用无菌棉花团蘸取菌株N. crassa∆xk的孢子悬浮液轻轻涂于菌株FGSC 9717的孢子囊上，最终使整个斜面培养基上涂满孢子悬浮液；
4）在25℃光照培养中培养4~6d后看到黑色的子囊壳；培养约3.5周后，在擦干净的试管内壁表面能够看到大量黑色的子囊孢子（图3中的b）；用无菌湿润的棉花团在试管内壁面收集子囊孢子，将其悬浮在2mL的无菌水中，在4℃冰箱保存备用；
5）用无菌水稀释悬浮子囊孢子，在60℃的水浴锅中热激30~45min；热激后将子囊孢子涂布在VM固体培养基（含有终浓度200μg/mL的潮霉素B和100μg/mL的组氨酸）上，约16h后用体式显微镜观察培养基，看到在萌发的黑色梭状子囊孢子周围长有透明的菌丝，挑取单个萌发后的子囊孢子于VM斜面培养基（含有200μg/mL的潮霉素B和100μg/mL的组氨酸）上，在30℃培养箱中培养。将孢子再接种于未添加组氨酸的VM斜面培养基上，如果不能生长则为组氨酸缺陷型菌株。选取6株在未添加组氨酸的VM斜面培养基上不生长的菌株，收集选取的6株菌株菌丝提取基因组进行xyk-1敲除的核酸电泳验证（图4）。
由图4中的b可知，基因xyk-1扩增的片段大小为1406bp，泳道1~4、6均未扩增出条带，表明选取到的6株菌株中菌株1~4、6为木酮糖激酶敲除的菌株。图4中的a可知，泳道1、2、4扩增出符合目的基因片段大小的条带，表明选取到的6株菌株中1、2、4号菌株为组氨酸缺陷和木酮糖激酶敲除的双突变型菌株，将其命名为菌株N. crassaEG。
实施例4
本实施例提供了粗糙脉孢菌pfk基因对乙二醇合成的影响，具体包括以下步骤：
1、粗糙脉孢菌基因组的提取
1）在10mL的离心管中加入2~3mL的VM液体培养基，接入一定量的的粗糙脉孢菌野生型菌株FGSC 2489的菌丝1~2环，在30℃，200rpm的条件下培养36~40h；
2）利用真空泵收集培养好的菌丝，将收集的菌丝装进2mL的离心管，每个离心管中加入一个小钢珠，并用液氮速冻。
3）快速将离心管放入高通量组织研磨仪中，在35HZ的频率下研磨40s。
4）离心管中加入500μL DNA提取缓冲液，震荡混匀，使细胞组织与缓冲液混匀。
5）加入500μL的氯仿:异戊醇（24:1），快速震荡离心管约1min；
6）12000rpm常温离心10min，取上清液300μL转入新的1.5mL离心管；
7）在取得的上清液中加入600μL的无水乙醇，颠倒混匀后放入-20℃冰箱，等待10min使DNA析出；
8）12000rpm常温下离心1min，DNA将沉淀到离心管底部；
9）倒掉上清液，加入600μL体积分数为70%的酒精，吹洗DNA；
10）12000rpm常温下离心1min，倒掉上清液后开盖干燥；
11）加入一定量的无菌水溶解DNA，保存于-20℃备用。
2、粗糙脉孢菌本源的6-磷酸果糖激酶基因（emp-3）的获取
从NCBI网站获取粗糙脉孢菌本源的6-磷酸果糖激酶基因（emp-3）序列信息，粗糙脉孢菌本源的6-磷酸果糖激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示，设计引物emp-3F和emp-3R，PCR扩增该目的片段，PCR扩增方法同实施例1。
3、目的基因片段的回收
PCR扩增所得的目的基因片段emp-3经核酸电泳验证，使用Cycle-Pure Kit（购于Omega公司）将PCR产物进行溶液回收。回收步骤按说明书操作。
4、pfk基因的表达
通过一步克隆的方法将目的基因片段emp-3与实验室保存的表达质粒pMF272相连接，质粒pMF272中包含强启动子Pccg-1、终止子TtrpC，启动子和终止子之间有Xba I等酶切位点。使用限制性核酸内切酶QuickCut Xba I（购于Takara）线性化质粒pMF272，将PCR扩增所得到的目的基因片段emp-3与线性化的质粒pMF272利用DiNing的无缝克隆试剂盒连接在一起，构建pMF272-emp-3表达载体。
将pMF272-emp-3表达载体用热激法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞（购于上海唯地生物技术有限公司）中，转化后的大肠杆菌涂布在含有氨苄青霉素（100mg/mL）的LB固体培养基上，在37℃培养箱中培养12h后，挑取单菌落进行菌落PCR验证。
菌落PCR中菌落悬液的制备方法为：用枪头挑取菌落分散于10μL无菌水中制成悬液。菌落PCR所用酶为2×Rapid Taq Master Mix（购于诺唯赞生物公司），此Taq酶的扩增反应条件为：95℃下预变性5min；95℃下变性15sec、60℃下退火15sec、72℃下延伸15sec/kb共35个循环；72℃下终延伸5min。此Taq酶的扩增体系如表2所示。设计引物扩增启动子Pccg-1到目的基因emp-3的核苷酸序列，扩增后片段大小为3591bp，经菌落PCR验证（图5），4号条带大小符合所扩增的目的条带。
表2：Taq酶PCR扩增体系
将菌落PCR验证阳性的4号大肠杆菌菌株接入装有5mL的含有氨苄（Biotopped）抗性的试管，在37℃摇床中培养12~16h后，使用Plasmid Mini Kit I（购于Omega公司）提取质粒pMF272-emp-3，操作方法步骤按说明书进行。将提取的质粒电激转入菌株N. crassaEG的感受态细胞中（感受态细胞的制备同实施例1），电激转入的方法同实施例1中的粗糙脉孢菌的电激转化，筛选得到阳性菌株，构成过表达emp-3的菌株N. crassaEG-ncpfk。
5、酵母的6-磷酸果糖激酶的表达
为了验证其他来源6-磷酸果糖激酶对粗糙脉孢菌乙二醇合成的影响，对酿酒酵母的6-磷酸果糖激酶（PFK）进行密码子优化（由上海生工生物公司进行），酿酒酵母的PFK是一种异八聚酶，由非连锁的基因PFKα和PFKβ分别编码的4个α亚基和4个β亚基组成，PFKα编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，PFKβ编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示，基因PFKα和PFKβ经密码子优化（上海生工生物公司）后分别与表达质粒pMF272连接，将启动子序列Pccg-1与序列PFKβ整体PCR扩增，扩增引物包括scpfkβF和scpfkβR得到片段Pccg-1-PFKβ，片段大小为3808bp，进行核酸电泳验证（图6中的a），使用Cycle-Pure Kit（购于Omega公司）将PCR产物进行溶液回收。
将单独表达PFKα的pMF272载体经EcoR I（购于Takara）酶切线性化，PFKα的扩增引物包括scpfkαF和scpfkαR，将线性化的载体与条带Pccg-1-PFKβ连接，构成异源表达酵母PFK的载体pMF272-scpfk，将载体pMF272-scpfk经电激转化法（同实施例1中的粗糙脉孢菌的电激转化）导入粗糙脉孢菌N. crassaEG的感受态细胞中（感受态细胞的制备同实施例1）得到菌株N. crassaEG-scpfk。
进行菌落PCR验证（图6中的b），扩增片段PFKα到Pccg-1-PFKβ的启动子，大小为4610bp，使用Cycle-Pure Kit（购于Omega公司）将PCR产物进行溶液回收。
由图6中的a可知，泳道3和4的电泳条带大小符合目的片段大小（3808bp），表明构建质粒的片段Pccg-1-PFKβ大小正确。由图6中的b可知，泳道3、4、6、7、10、12符合扩增片段大小（4610bp），表明泳道3、4、6、7、10、12对应的菌株是含有基因PFKα和PFKβ的阳性菌株。
6、pfk基因表达菌株的发酵实验
以菌株N. crassa∆xk作为对照组，过表达粗糙脉孢菌本源pfk基因的菌株N. crassaEG-ncpfk和表达经密码子优化的酿酒酵母pfk基因的菌株N. crassaEG-scpfk在15g/L的木糖培养基（制备方法同发酵培养基）中进行发酵实验（同实施例2中粗糙脉孢菌纯合子的发酵方法），用液相色谱检测发酵液中木糖和乙二醇的浓度（检测方法同实施例2），每个菌株生物学重复三次，数据以均值±SD表示（图7）。
由图7中的a可知，三种菌株的木糖消耗速率没有明显的区别，在96h内完成了木糖的吸收利用，说明过表达pfk对木糖的转运和吸收并没有太大的影响。由图7中的b可知，两种过表达pfk的菌株乙二醇的产量明显高于菌株N. crassa∆xk，菌株N. crassaEG-ncpfk和菌株N. crassaEG-scpfk在发酵72h后乙二醇浓度分别为88.5mg/L和79.7mg/L。菌株N. crassaEG-ncpfk在发酵96h后乙二醇的产量最高，为102.08mg/L，相比于对照菌株最高产量58.33mg/L提高了75%，说明表达6-磷酸果糖激酶能够提高乙二醇的产量。
推测粗糙脉孢菌利用木糖合成乙二醇的途径如图8所示。
实施例5
本实施例提供了NCPFK与NOXE的共表达对粗糙脉孢菌合成乙二醇的影响，具体包括以下步骤：
1、NCPFK与NOXE的共表达载体及菌株的构建
由于木糖醇的积累会影响乙二醇的生产，而辅酶NAD+的供应是否充足可能是木糖醇积累的一个重要原因，因此将来源于乳酸链球菌（Lactococcus lactis）的NADH氧化酶NOXE进行密码子优化（由上海生工生物公司进行）得到序列noxe，noxe基因的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示，将将强启动子Pccg-1与密码子优化后的noxe基因、6-磷酸果糖激酶基因、和线性化质粒pMF272连接后，构成NCPFK和NOXE共表达载体（图9）。将NCPFK和NOXE共表达载体电激转化入（电激转化方法同实施例1）粗糙脉孢菌N. crassaEG的感受态细胞（制备方法同实施例1）中，得到菌株N. crassaEG-ncpfk-noxe，挑取阳性菌株提取基因组进行核酸电泳验证（图10），扩增所使用的引物包括：扩增基因ncpfk的引物emp-3F、emp-3R和扩增基因noxe使用的引物noxeF、noxeR，扩增的目的基因条带大小为2538bp。
由图9可知，共表达载体中基因ncpfk与noxe前都有强启动子Pccg-1，ncpfk和noxe之间也存在终止子TtrpC。
由图10可知，条带1、4、6、8、9符合扩增序列大小，表明菌株1、4、6、8、9能够表达ncpfk和noxe，使用Cycle-Pure Kit将PCR产物溶液回收后，送往擎科生物公司测序验证。
2、NCPFK与NOXE的共表达菌株的木糖发酵实验
对构建成功的菌株N. crassaEG-ncpfk-noxe和菌株N. crassa∆xk、菌株N. crassaEG-ncpfk进行发酵验证（同实施例2中粗糙脉孢菌纯合子的发酵方法），在含有15g/L的木糖培养基中培养120h，使用高效液相色谱仪对乙二醇的生成量进行测定，每个菌株生物学重复三次，数据以均值±SD表示（图11）。
由图11可知，在木糖发酵72h时，菌株N. crassaEG-ncpfk-noxe的乙二醇的生成量达到最大值为113.59mg/L，相比于菌株N. crassa∆xk和菌株N. crassaEG-ncpfk乙二醇的生成量为58.34mg/L和88.53mg/L，提高了94.7%和28.3%。说明了表达NOXE能够促进木糖醇向下游途径代谢，共表达NCPFK和NOXE可以有效地提高乙二醇的产量。
实施例6
本实施例提供了添加木质纤维素水解液对菌株木糖发酵的影响，具体包括以下步骤：
由于微生物不能直接利用自然界的木质纤维素，因木质纤维素的结构紧密，需要碱处理或酸处理等方法进行预处理，而预处理的过程中会产生糠醛等对细胞有毒害、抑制细胞正常生长的物质。本试验测试了菌株在木质纤维素水解液中利用木糖合成乙二醇的能力。
将玉米秸秆（来源于江苏省连云港市东海县白塔埠镇）磨成粉末，过60目筛，按照固液比1:10加1%浓硫酸，135℃处理90min，取上清，高效液相色谱仪测得水解液中主要抑制物乙酸含量为3.6g/L，糠醛含量为2.1g/L。将上清用氢氧化钠调节pH至中性备用，使用。将菌株N. crassa∆xk（7g/L）和菌株N. crassaEG-ncpfk（7g/L）在含木质纤维素水解液的木糖培养基（木糖浓度为15g/L，乙酸浓度为1g/L，糠醛浓度为0.58g/L）中发酵48h，高效液相色谱仪测定培养基中乙二醇产量，每个菌株生物学重复三次，数据以均值±SD表示（图12）。
由图12可知，在含抑制物的水解液（乙酸1g/L，糠醛0.58g/L）中，菌株N. crassaEG-ncpfk和N. crassa∆xk在发酵培养48h后，乙二醇产量得到提高，最高产量为158.55mg/L，相比于产量为66.98mg/L的未添加木质纤维素水解液的菌株N. crassaEG-ncpfk组，提高了1.37倍。表明乙酸和糠醛等抑制物并没有影响乙二醇的积累，相反能够极大地促进乙二醇的积累。这是因为这些抑制物在细胞代谢时产生了有利于乙二醇合成的辅因子，例如，醇脱氢酶转化糠醛生成糠醇时，增加了NAD+的量，缓解了细胞内氧化还原的不平衡，促进乙二醇合成时的中间产物木糖醇向下游产物的代谢。因此，本实验构建的合成乙二醇菌株可以适应水解液的毒性环境，能够应用于含木糖的木质纤维素水解液中。
实施例7
本实施例提供了对菌株N. crassaEG-ncpfk发酵条件的优化，具体包括以下步骤：
含木质纤维素水解液的木糖培养基（同实施例6）中分别于0、48、96h时添加10g/L葡萄糖。并在前48h进行限氧发酵，即将三角瓶口用保鲜膜封死，同时N.crassaEG-ncpfk菌株接种量为实施例6的一倍。高效液相色谱仪测定培养基中乙二醇产量，每个菌株生物学重复三次，数据以均值±SD表示（图13）。
由图13可知，本发明提供的发酵条件优化能够促进乙二醇的合成，在发酵120h时最高产量提升至1015.31mg/L，较优化前158.55mg/L提升5.40倍；较产量为66.98mg/L的未添加木质纤维素水解液的菌株N. crassaEG-ncpfk组，提高了14.16倍。该优化过程中，添加葡萄糖为菌株代谢提供了能量和还原力，提升了菌体活力；限氧发酵避免了菌株利用木糖进行过度生长；增加接种量提升了整体的转化效率。由此表明，本发明中的菌株经过发酵优化可以使其乙二醇产量大幅度提升。
由上述实施例可知，本发明首先在粗糙脉孢菌中敲除木酮糖磷酸激酶基因xyk-1，破坏木糖代谢的戊糖磷酸途径后，碳源无法由PPP流向中心碳代谢途径，而粗糙脉孢菌的其他木糖代谢途径较弱，不能快速代谢中间产物，最终导致了木糖醇的积累，从而激活了天然存在的乙二醇合成途径。菌株N. crassa∆xk在木糖培养基中发酵72h后，乙二醇积累量为58.33mg/L，而未敲除木酮糖磷酸激酶的粗糙脉孢菌并未合成出乙二醇。
本发明进一步改造粗糙脉孢菌，通过表达本源或异源6-磷酸果糖激酶（PFK），构建菌株N. crassaEG-ncpfk和菌株N. crassaEG-scpfk，经发酵试验验证得知，菌株N. crassaEG-ncpfk和菌株N. crassaEG-scpfk在发酵72h后乙二醇达到88.5mg/L和产量79.7mg/L。菌株N. crassaEG-ncpfk在发酵96h后乙二醇的产量最高，为102.08mg/L，相比于对照菌株最高产量58.33mg/L提高了75%，说明表达本源或异源6-磷酸果糖激酶能够提高乙二醇的产量。
本发明进一步改造粗糙脉孢菌，通过共表达PFK和NADH氧化酶NOXE，构建菌株N. crassaEG-ncpfk-noxe，经发酵试验验证得知，菌株N. crassaEG-ncpfk-noxe达到增加胞内NAD+的浓度的目的，最终菌株N. crassaEG-ncpfk-noxe在木糖发酵72h后，乙二醇的产量达到最大113.59mg/L，相比于菌株N. crassa∆xk和菌株N. crassaEG-ncpfk提高了94.7%和28.3%。说明了表达NOXE能够促进木糖醇向下游途径代谢，共表达NCPFK和NOXE能够有效地提高乙二醇的产量。
本发明将菌株N. crassa∆xk和菌株N. crassaEG-ncpfk接种至含有玉米秸秆水解液的木糖培养基中发酵，结果显示乙二醇的产量均得到了提升，最高为158.55mg/L。本发明构建的菌株不仅具有一定解毒能力，对于木质纤维素预处理过程中产生的糠醛等对细胞有毒害、抑制细胞正常生长的物质具有一定抗性，还能够利用木质纤维素水解液提高乙二醇的产量。表明乙酸和糠醛等抑制物并没有影响乙二醇的积累，相反能够极大地促进乙二醇的积累。
本发明对粗糙脉孢菌的发酵条件进行优化，在含木质纤维素水解液的木糖培养基中分别于0、48、96h时添加10g/L葡萄糖，并在前48h进行限氧发酵，同时N.crassaEG-ncpfk菌株接种量提高一倍。优化后粗糙脉孢菌的乙二醇产量大大提升，在发酵120h时最高产量提升至1015.31mg/L，较优化前158.55mg/L提升5.40倍；较产量为66.98mg/L的未添加木质纤维素水解液的菌株N. crassaEG-ncpfk组，提高了14.16倍。该优化过程中，添加葡萄糖为菌株代谢提供了能量和还原力，提升了菌体活力；限氧发酵避免了菌株利用葡萄糖进行过度生长；增加接种量提升了整体的转化效率。由此表明，本发明中的菌株经过发酵优化可以使其乙二醇产量大幅度提升。
以上所述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。在依据本发明构思的条件下本领域普通技术人员进行的相关推演和替换，在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (6)

1.一种用于生产乙二醇的重组粗糙脉孢菌，其特征在于，将敲除载体转化入粗糙脉孢菌FGSC 4200的感受态细胞中筛选得到纯合子菌株N. crassa ∆xk，将所述菌株N. crassa ∆xk与组氨酸缺陷型粗糙脉孢菌FGSC 2489杂交后得到菌株N. crassa EG，将粗糙脉孢菌同源的6-磷酸果糖激酶基因转化入所述菌株N. crassa EG的感受态细胞中，得到所述重组粗糙脉孢菌N. crassa EG-ncpfk；
所述敲除载体敲除粗糙脉孢菌中的木酮糖激酶基因；
所述木酮糖激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；
所述敲除载体的制备包括：扩增所述木酮糖激酶基因的上游同源臂基因和下游同源臂基因后，将所述上游同源臂基因、所述下游同源臂基因和标签基因与线性化质粒连接得到；
所述标签基因为潮霉素表达盒；
所述质粒为pUC18；
所述菌株N. crassa EG为组氨酸缺陷和木酮糖激酶敲除的双突变型菌株；
所述粗糙脉孢菌同源的6-磷酸果糖激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
2.一种用于生产乙二醇的重组粗糙脉孢菌，其特征在于，将粗糙脉孢菌异源的6-磷酸果糖激酶基因转化入权利要求1所述菌株N. crassa EG的感受态细胞中，得到所述重组粗糙脉孢菌N. crassa EG-scpfk；
所述粗糙脉孢菌异源的6-磷酸果糖激酶基因包括PFKα基因和PFKβ基因；
所述PFKα基因的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；
所述PFKβ基因的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
3.一种用于生产乙二醇的重组粗糙脉孢菌，其特征在于，将NCPFK-NOXE共表达载体转入权利要求1所述菌株N. crassa EG的感受态细胞中，构建菌株N. crassa EG-ncpfk-noxe；
所述NCPFK-NOXE共表达载体的制备包括：将6-磷酸果糖激酶基因、NADH氧化酶的基因与线性化质粒pMF272连接后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，提取质粒得到；
所述6-磷酸果糖激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；
所述NADH氧化酶为NOXE；
所述NOXE编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示。
4.权利要求1~3任一项所述的用于生产乙二醇的重组粗糙脉孢菌在制备乙二醇中的应用。
5.一种生产乙二醇的方法，其特征在于，采用权利要求1所述重组粗糙脉孢菌N. crassa EG-ncpfk，或权利要求2所述重组粗糙脉孢菌N. crassa EG-scpfk，或权利要求3所述重组粗糙脉孢菌N. crassa EG-ncpfk-noxe，以木糖为底物经发酵获得。
6.权利要求1所述重组粗糙脉孢菌N. crassa EG-ncpfk，或权利要求2所述重组粗糙脉孢菌N. crassa EG-scpfk，或权利要求3所述重组粗糙脉孢菌N. crassa EG-ncpfk-noxe的制备方法，其特征在于，包括敲除粗糙脉孢菌中的木酮糖激酶基因，所述重组粗糙脉孢菌N. crassa EG-ncpfk、N. crassa EG-scpfk、N. crassa EG-ncpfk-noxe以木糖为底物合成乙二醇；
所述木酮糖激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
CN202311340446.4A 2023-10-17 2023-10-17 一种重组粗糙脉孢菌及其应用 Active CN117070379B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311340446.4A CN117070379B (zh) 2023-10-17 2023-10-17 一种重组粗糙脉孢菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311340446.4A CN117070379B (zh) 2023-10-17 2023-10-17 一种重组粗糙脉孢菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117070379A CN117070379A (zh) 2023-11-17
CN117070379B true CN117070379B (zh) 2024-01-09

Family

ID=88704674

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311340446.4A Active CN117070379B (zh) 2023-10-17 2023-10-17 一种重组粗糙脉孢菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117070379B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115806886B (zh) * 2022-09-08 2024-06-07 西北农林科技大学 粗糙脉孢菌木酮糖激酶基因敲除突变株及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006002021A2 (en) * 2004-06-15 2006-01-05 Biotechnology Research And Development Corporation A highly active xylose reductase from neurospora crassa
CN104164375A (zh) * 2014-08-04 2014-11-26 中国科学技术大学 乙醇高温高产工程菌株的构建及应用
CN109837232A (zh) * 2019-03-27 2019-06-04 黑龙江大学 一种粗糙脉胞菌外切葡聚糖酶突变菌株的构建方法和应用
CN110373337A (zh) * 2019-07-24 2019-10-25 威海惟农生物科技有限公司 一种粗糙脉胞菌工程菌及其制备方法和应用
CN113684208A (zh) * 2020-05-19 2021-11-23 天津科技大学 一种来自丝状真菌粗糙脉胞菌的新型诱导型启动子及其应用
CN115806886A (zh) * 2022-09-08 2023-03-17 西北农林科技大学 粗糙脉孢菌木酮糖激酶基因敲除突变株及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006002021A2 (en) * 2004-06-15 2006-01-05 Biotechnology Research And Development Corporation A highly active xylose reductase from neurospora crassa
CN104164375A (zh) * 2014-08-04 2014-11-26 中国科学技术大学 乙醇高温高产工程菌株的构建及应用
CN109837232A (zh) * 2019-03-27 2019-06-04 黑龙江大学 一种粗糙脉胞菌外切葡聚糖酶突变菌株的构建方法和应用
CN110373337A (zh) * 2019-07-24 2019-10-25 威海惟农生物科技有限公司 一种粗糙脉胞菌工程菌及其制备方法和应用
CN113684208A (zh) * 2020-05-19 2021-11-23 天津科技大学 一种来自丝状真菌粗糙脉胞菌的新型诱导型启动子及其应用
CN115806886A (zh) * 2022-09-08 2023-03-17 西北农林科技大学 粗糙脉孢菌木酮糖激酶基因敲除突变株及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Effects of oxygen limitation on xylose fermentation, intracellular metabolites, and key enzymes of Neurospora crassa AS3.1602;Zhihua Zhang et al.;《Applied Biochemistry and Biotechnology》;第145卷;39-51 *
Engineering of primary carbon metabolism in filamentous fungi;Tania Chroumpi et al.;《Biotechnology Advances》;第43卷;1-23 *
粗糙脉孢菌蛋白表达系统构建研究;高染染 等;《生物技术通报》;第32卷(第7期);160-169 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN117070379A (zh) 2023-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2022025108A (ja) Ｆｄｃａの真菌による生産
Lara et al. Identification and characterisation of xylanolytic yeasts isolated from decaying wood and sugarcane bagasse in Brazil
CN117070379B (zh) 一种重组粗糙脉孢菌及其应用
CN107236757A (zh) 一种提高丝状真菌木质纤维素酶系表达及生物基化学品生产的方法
WO2015195934A2 (en) Method for fermenting sugars using genetically engineered yeast
CN106854237A (zh) 功能蛋白pox08415及其编码基因与应用
CN109628367B (zh) 一种提高氧化葡萄糖酸杆菌山梨糖产量和生产强度的方法
CN103952326B (zh) 一种共表达菊粉外切酶和内切酶的重组毕赤酵母菌株及其构建方法与应用
CN108603179A (zh) 发酵产物生产增加的真核细胞
US20230053729A1 (en) A recombinant filamentous fungus for producing ethanol and its construction and application
CN110004070B (zh) 一株产木聚糖酶黑曲霉基因工程菌及其构建方法与应用
FR2962444A1 (fr) Procede de production d'enzymes cellulolytiques et/ou hemicellulolytiques ameliore
WO2016088272A1 (ja) 高効率エタノール発酵菌
CN113512506B (zh) 对木质纤维素类生物质衍生的抑制物耐受性高的酵母、及其构建方法
CN1544640A (zh) 一种耐高温木聚糖酶的表达方法及其专用表达载体
CN112646797B (zh) 一种异源表达大球盖菇β-葡萄糖苷酶基因的方法
CN115197957A (zh) 一种提高贵州木霉njau 4742在逆境下分解农作物秸秆的基因片段及其应用
KR101630832B1 (ko) 동시 당화 발효 효능이 우수한 고온내성 신규 균주 및 이를 이용한 바이오에탄올 생산방법
CN113481116A (zh) 对木质纤维素衍生的抑制物高耐受的耐热酵母、其构建方法及应用
CN113025506A (zh) 一种生产乙醇的重组丝状真菌及其构建和应用
CN110713940B (zh) 一种高产重油出芽短梗霉菌株及其构建方法与用途
JP6249391B2 (ja) キシロースを高温で発酵する方法
CN113980939B (zh) 一种耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶及其表达基因和应用
KR101737814B1 (ko) 신규효모 캔디다 균주 및 이의 이용기술
CN114507608B (zh) 一种在线粒体内生产乙醇的重组丝状真菌及其构建和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant