CN108603179A - 发酵产物生产增加的真核细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经遗传修饰的真核细胞，其包含一种或更多种异源基因，所述异源基因编码：a)D‑葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶和/或b)6‑磷酸葡糖酸脱氢酶；和/或c)葡萄糖脱氢酶、葡糖酸内酯酶和葡糖酸激酶，其中a)、b)和c)中的葡萄糖脱氢酶是NAD+依赖性的。

Description

发酵产物生产增加的真核细胞
领域
本发明涉及发酵产物生产增加的真核细胞。具体而言，本发明涉及乙酸盐/酯(acetate)转化提高的转化乙酸、戊糖和葡萄糖的真核细胞。本发明还涉及其中所述细胞生产发酵产物如乙醇的方法。
背景
第二代生物乙醇由例如被水解成游离单体糖(如己糖和戊糖)以发酵成乙醇的植物生物质的木质纤维素级分生产。除生物质预处理和水解期间的糖释放外，还形成一些有毒副产物。例如，糠醛和HMF就是这些产物中的两种。它们形成的量取决于几个预处理参数，如温度、压力和预处理时间。木质纤维素水解物也含有大量的乙酸，乙酸是微生物如真核细胞发酵能力的有效抑制物。
已经报道几种不同的方法，它们可以帮助减少乙酸对水解物中糖发酵的抑制作用，以及(例如通过酵母的遗传工程)通过缺失甘油生产中涉及的基因来(部分地)解决氧化还原平衡问题。乙酸以及其他抑制剂可通过化学或生物去毒程序从水解物中除去。但预处理后的额外去毒步骤是昂贵的且/或导致可发酵底物的损失。
在厌氧条件下，Saccharomyces cerevisiae不能自然消耗乙酸。此外，不同菌株之间的乙酸耐受性似乎差异很大。过去的研究主要集中于鉴定与耐受性提高相关的潜在基因候选物和通过使用代谢/进化工程方法来生成稳健性提高的菌株。然而，通过表达异源酶来生成去毒菌株的概念尚未经过充分研究。
Medina等,2010描述了来自E.coli的mhpF的表达，其编码NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶，通过将乙酸盐/酯到乙醛的还原与NAD+的再生耦合，使得gpd1Δgpd2Δ菌株能够厌氧生长。该方法完全消除了甘油的形成，并导致基于糖的乙醇产率提高了13％，这主要是由于最小化了生产甘油和将乙酸还原成乙醇所造成的碳损失。这种策略的另一个重要益处是：它使得酵母能够对乙酸进行原位去毒。然而，以这种方式可以减少的乙酸的量受限于与生物质形成相关的合成代谢期间产生的NADH的量。因此，仍然需要改善乙酸盐/酯、戊糖和/或己糖向发酵产物的转化。
概述
因此，本发明的一个目标是提供这样的真核细胞，其能够由乙酸或乙酸盐/酯生产乙醇，同时保留其发酵己糖(葡萄糖、果糖、半乳糖等)以及戊糖(如木糖)的能力，以及提供其中这些菌株被用于生产乙醇和/或其他发酵产物的方法。
另一个目标是提供细胞，例如真核细胞，其能够由甘油和/或甘油和乙酸生产乙醇，同时保留其发酵己糖(葡萄糖、果糖、半乳糖等)以及戊糖(如木糖)的能力。另一个目标是增加发酵产物的生产(产率、生产率或两者)。在一个其实施方式中，真核细胞生产较少甘油。
此外，本发明的一个目标是提供能够厌氧地共同发酵乙酸盐/酯、戊糖和葡萄糖的真核细胞株。
本发明的一个目标是提供通过发酵戊糖和/或乙酸盐/酯生产乙醇的成本有效的方法。
本发明的另一个目标是提供一种真核细胞，其能够以比使用本领域目前已知的菌株能够实现的速率更高的速率发酵戊糖。
另一个目标是减少发酵时间。
另一个目标是提高发酵的产率。
通过阅读说明书和权利要求，本发明的其它目标、特征和优点很明显。
根据本发明实现了这些目标中的一个或更多个，本发明提供了经遗传修饰的包含一种或更多种异源基因的真核细胞，所述异源基因编码：
a)D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；
b)6-磷酸葡糖酸脱氢酶和/或
c)葡萄糖脱氢酶、葡糖酸内酯酶和葡糖酸激酶，
其中a)、b)和c)中的葡萄糖脱氢酶是NAD+依赖性的。
根据本发明，真核细胞中的细胞溶质NADH水平可以提高。在一个实施方式中，这可导致甘油产率提高，其在酿酒工业中是有利的。在第二个实施方式中，它可导致增加的乙酸盐/酯水平降低和/或提高的发酵产物(例如乙醇)产率，这在生物燃料工业中是有利的。在第三个实施方式中，特别是当a)和b)都是NAD+依赖性时，所产生的NADH可用于真核细胞中任何发酵产物的生产中，其中细胞溶质中的NADH作为还原辅因子起作用。在第三个实施方式中，所产生的NADH可用于真核细胞中任何发酵产物的生产中，其中细胞溶质中的NADH作为还原辅因子起作用。这些优点在下文详细描述。
在本发明的一个实施方式中，真核细胞包含编码NAD+依赖性D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶a)的基因(在该实施方式中，6-磷酸葡糖酸脱氢酶仍可以是NADP+依赖性的)。在本发明的另一个实施方式中，真核细胞包含编码NAD+依赖性6-磷酸葡糖酸脱氢酶(b)的基因(在该实施方式中，D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶仍可以是NADP+依赖性的)。在一个实施方式中，真核细胞包含编码(a)和(b)二者(即NAD+依赖性D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(a)和NAD+依赖性6-磷酸葡糖酸脱氢酶(b)二者)的基因。实施方式a)和b)产生细胞溶质NADH。在一个实施方式中，细胞包含c)葡萄糖脱氢酶、葡糖酸内酯酶和葡糖酸激酶。这三种酶形成了与包含(a)或(b)的通路相比从葡萄糖到6-磷酸葡糖酸的另一通路，但由于(c)中的葡萄糖脱氢酶是NAD+依赖性的，所以也产生NADH。实施方式(c)可以与实施方式(a)和/或(b)组合。
因此，在一个实施方式中，真核细胞具有一个或更多个编码D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的天然基因和/或编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的天然基因的破坏，其中所述天然是指在真核细胞中天然。
在一个实施方式中，真核细胞中天然的D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶被NAD+依赖性D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶替代且/或真核细胞中天然的6-磷酸葡糖酸脱氢酶被NAD+依赖性6-磷酸葡糖酸脱氢酶替代。以这种方式，这些酶的辅因子被有利地修饰。辅因子依赖性/特异性的变化在本文中可被称为“辅因子工程”。
根据本发明的真核细胞，其具有编码：
a)D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；
b)6-磷酸葡糖酸脱氢酶；和/或
c)葡萄糖脱氢酶、葡糖酸内酯酶和葡糖酸激酶的异源基因，其中a)和b)以及c)中的葡萄糖脱氢酶是NAD+依赖性的，生产比天然菌株(具有NADP+依赖性D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和NADP+依赖性6-磷酸葡糖酸脱氢酶两者)更多的甘油。以这种方式产生的菌株对于酿酒工业中的应用是有利的，因为更多的甘油可以改善酒的味道，并且同时可以减少乙醇的量，这在酿酒工业中也是期望的。这些益处是根据本发明获得的，对酿酒酵母的发酵和酿酒工艺的影响极小。或者，根据本发明的菌株有利地用于生物燃料工业，例如生物乙醇燃料工业。
在一个实施方式中，所产生的NADH可用于任何发酵产物的生产，其中细胞溶质中的NADH作为还原辅因子起作用。这允许生产由于细胞溶质中缺乏NADH从而以其它方式不能由真核细胞生产的发酵产物。或者，如果这种发酵产物的生产受细胞溶质中的NADH水平限制，则能够提高产率。在这种实施方式中，有利的是(a)D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和(b)6-磷酸葡糖酸脱氢酶都是NAD+依赖性的，或者甚至(a)、(b)和(c1)葡萄糖脱氢酶是NAD+依赖性的。这些实施方式允许细胞溶质中的NADH-水平更高。因此，(a)、(b)和(c1)产生了灵活性：对于每种发酵产物和底物，本领域技术人员可以将底物中灵活的一部分转化成CO2和细胞溶质中的NADH，其适于以高产率生产发酵产物的需要。在一个实施方式中，发酵产物是比生产它的底物(例如葡萄糖)还原度更高(more reduced)的产物。比葡萄糖还原度更高的合适的发酵产物的实例有甘油。本领域技术人员可以确定可以以这种方式发酵的发酵产物。这种发酵可以是需氧的或厌氧的。
在一个实施方式中，真核细胞是经遗传修饰的，包含一个或更多个异源基因，所述异源基因编码：
a)D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和/或
b)6-磷酸葡糖酸脱氢酶；
其中a)和b)是NAD+依赖性的。
在本发明的一个实施方式中，其中真核细胞包含：
d)一种或更多种编码异源NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10)的核苷酸序列；
e)一种或更多种编码同源或异源乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)的核苷酸序列；和任选的
g)导致所述真核细胞中天然的甘油3-磷酸磷酸水解酶(E.C.3.1.3.21)和/或甘油3-磷酸脱氢酶(E.C.1.1.1.8或E.C.1.1.5.3)活性降低的修饰，根据本发明的这种菌株的优点是乙酸盐/酯消耗增加且发酵产物如乙醇生产增加。
因此，本发明还涉及使用上述真核细胞发酵底物以生产发酵产物的方法，其中与利用(本文所定义的)野生型真核细胞的相应发酵相比，发酵时间减少且/或产率提高，同时发酵产物产量提高。
附图简介
图1显示了来自在OD＝4-5(本文中在660nm处测量光密度，缩写为“OD”)时收获的指数生长摇瓶培养物的无细胞提取物的体外酶比活(specific enzymatic activity)。培养物在补充有20g L-1葡萄糖、pH 6的合成培养基中，30℃，200rpm下生长。示出的是：对于四种菌株：IMX585(白色条，左侧)、IMX705(浅灰色条)、IMX706(中灰色条)和IMX707(深灰色条，右侧)，给出了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、NADP+依赖性6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性、NAD+依赖性6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性。数据来自独立的重复实验，误差线表示重复的平均偏差。
图2：IMX585(图2a，顶部)、IMX705(图2b，顶部)、IMX899(图2a，中部)、IMX756(图2b，中部)的发酵曲线。葡萄糖＝实心圆，生物质＝实心方块，甘油＝空心方块，乙醇＝空心圆。在补充有20g L-1葡萄糖的合成培养基中进行发酵。在pH 5，鼓吹500ml min-1N2，30℃的条件下进行各批次。通过下述方法计算生物质：基于OD与生物质的换算公式，将整个发酵过程中的OD值换算为生物质，所述换算公式是通过针对指数期中间的OD绘制实际生物质样品而获得的。
使用IMX585、IMX705、IMX899、IMX756进行的厌氧分批发酵中基于葡萄糖的甘油产率(图2a，底部)。相同发酵中基于葡萄糖的乙醇产率(图2b，底部)。乙醇产率的计算基于针对蒸发校正的数据。数据表示为独立重复实验的平均值。
图3：IMX585(图3a，顶部)、IMX888(图3b，顶部)和IMX860(图3a，中部)的发酵曲线。葡萄糖＝实心圆，生物质＝实心方块，甘油＝空心方块，乙醇＝空心圆，乙酸盐/酯＝三角形。在补充有20g L-1葡萄糖和3g L-1乙酸的合成培养基中进行发酵。在pH 5，鼓吹500mlmin-1N2，30℃的条件下进行各批次。通过下述方法计算生物质：基于OD与生物质的换算公式，将整个发酵过程中的OD值换算为生物质，所述换算公式是通过针对指数期中间的OD绘制实际生物质样品而获得的。
使用IMX585、IMX888和IMX860进行的厌氧分批发酵中消耗的乙酸盐/酯与消耗的葡萄糖的比值(图3a，底部)。来自相同发酵的消耗的乙酸盐/酯与形成的生物质的比值(图3b，底部)。数据表示为独立重复实验的平均值。
图4显示了由Acs1p/Acs2p、EutEp和Ald6p催化的ATP驱动的转氢酶样循环。
序列表简介
SEQ ID NO:1合成的经密码子优化的gndA表达盒；
SEQ ID NO:2GndA蛋白(Methylobacillus flagellates)；
SEQ ID NO:3合成的经密码子优化的gox1705表达盒
SEQ ID NO:4Gox1705蛋白(Gluconobacter oxydans 621H)
SEQ ID NO:5合成的经经密码子优化的6pgdh表达盒
SEQ ID NO:6 6pgdh蛋白WP_011089498.1(多物种[Bradyrhizobium])
SEQ ID NO:7经密码子优化的azf基因
SEQ ID NO:8zf蛋白(ADEE03728.1，Haloferax volcanii)
SEQ ID NO:9eutE表达盒
SEQ ID NO:10GPD2缺失的引物确认(引物编码：2015)
SEQ ID NO:11GPD2缺失的引物确认(引物编码：2112)
SEQ ID NO:12GND1缺失的引物确认(引物编码：2123)
SEQ ID NO:13GND1缺失的引物确认(引物编码：2124)
SEQ ID NO:14ALD6缺失的引物确认(引物编码：2164)
SEQ ID NO:15ALD6缺失的引物确认(引物编码：2171)
SEQ ID NO:16GPD1缺失的引物确认(引物编码：4397)
SEQ ID NO:17GPD1缺失的引物确认(引物编码：4401)
SEQ ID NO:18用于扩增pMEL11骨架的引物(引物编码：5792)
SEQ ID NO:19用于扩增pROS11骨架的引物(引物编码：5793)
SEQ ID NO:20用于扩增pMEL11插入序列的引物(引物编码：5979)
SEQ ID NO:21用于扩增pMEL11骨架的引物(引物编码：5980)
SEQ ID NO:22用于扩增pROS11插入序列(靶向GPD1)的引物(引物编码：6965)
SEQ ID NO:23用于扩增pROS11插入序列(靶向GPD2)的引物(引物编码：6966)
SEQ ID NO:24用于修复寡核苷酸(GPD1敲除)的引物(引物编码：6967)
SEQ ID NO:25用于修复寡核苷酸(GPD1敲除)的引物(引物编码：6968)
SEQ ID NO:26用于扩增pMEL11插入物(靶向GND2)的引物(引物编码：7231)
SEQ ID NO:27用于确认GND2缺失的引物(引物编码：7258)
SEQ ID NO:28用于确认GND2缺失的引物(引物编码：7259)
SEQ ID NO:29用于修复寡核苷酸(GND2敲除)的引物(引物编码：7299)
SEQ ID NO:30用于修复寡核苷酸(GND2敲除)的引物(引物编号：7300)
SEQ ID NO:31用于扩增pMEL11插入物(靶向GND1)的引物(引物编码：7365)
SEQ ID NO:32用于扩增整合盒(gndA，6pgdh，gox1705)的引物(引物编号：7380)
SEQ ID NO:33用于扩增整合盒(gndA，6pgdh，gox1705)的引物(引物编码：7381)
SEQ ID NO:34用于确认gndA整合的引物(引物编码：7441)
SEQ ID NO:35用于确认gndA整合的引物(引物编码：7442)
SEQ ID NO:36用于确认6pgdh整合的引物(引物编码：7443)
SEQ ID NO:37用于确认6pgdh整合的引物(引物编码：7444)
SEQ ID NO:38用于确认gox1705整合的引物(引物编码：7445)
SEQ ID NO:39用于确认gox1705整合的引物(引物编码：7446)
SEQ ID NO:40用于修复寡核苷酸(ALD6敲除)的引物(引物编码：7608)
SEQ ID NO:41修复寡核苷酸(ALD6敲除)(引物编码：7609)
SEQ ID NO:42用于扩增pMEL11插入物(靶向ALD6)的引物(引物编码：7610)
SEQ ID NO:43用于扩增整合盒(eutE)的引物(引物编码：7991)
SEQ ID NO:44用于扩增整合盒(eutE)的引物(引物编码：7992)
SEQ ID NO:45用于确认eutE整合的引物(引物编码：8337)
SEQ ID NO:46用于确认eutE整合的引物(引物编码：8338)
SEQ ID NO:47醛氧化还原酶(Escherichia coli EutE)的氨基酸序列；
SEQ ID NO:48E.coli的甘油脱氢酶(Escherichia coli gldA)的氨基酸序列
SEQ ID NO:49经密码子优化的gndA(6-磷酸葡糖酸脱氢酶)(Methylobacillusflagellatus)的核苷酸序列
SEQ ID NO:50经密码子优化的gox1705(6-磷酸葡糖酸脱氢酶)(Bradyrhizobiumsp.)的核苷酸序列
SEQ ID NO:51经密码子优化的6pgdh(6-磷酸葡糖酸脱氢酶)(Bradyrhizobiumsp.)的核苷酸序列
SEQ ID NO:52经密码子优化的azf(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)(Haloferaxvolcanii)的核苷酸序列
SEQ ID NO:53经密码子优化的eutE(乙酰化乙醛脱氢酶)(E.coli)的核苷酸序列
详细说明
在本说明书和所附权利要求的通篇，词语“包括”、“包含”和“含有”应被解释为包含性的。换言之，在语境允许的情况下，这些词语意图传达的意思是：可以包括其它没有明确列举的要素或整体。
本文中不使用数量词修饰时指的是一个/种或多于一个/种(即一个/种或至少一个/种)语法对象。例如，“要素”可意味着一个/种要素或多于一个/种要素。例如，细胞在本文中可以是一个细胞，但也可以指细胞群或细胞株。
“真核细胞”在本文中被定义为任何真核微生物。真核生物属于真核生物域(Eukarya或Eukaryota)分类单元。将真核细胞与原核细胞(细菌和古细菌)区分开来的定义性特征是：它们具有膜结合细胞器，特别是核，核含有遗传物质，并被核膜封闭。核的存在赋予真核生物其名称，它来自希腊语ευ(eu，“好(well)”)和(karyon，“核心”或“核”)。真核细胞还含有其他膜结合细胞器，如线粒体和高尔基体。许多单细胞生物是真核生物，如原生动物和真菌。所有多细胞生物都是真核生物。单细胞真核生物在其整个生命周期中由单个细胞组成。微生物真核生物可以是单倍体或二倍体。优选地，真核细胞能够进行厌氧发酵，更优选厌氧醇性(alcoholic)发酵。
“NAD+依赖性”在本文中是由下式描述的蛋白质特异性特征：
1<KmNADP+/KmNAD+<∞(无穷大)。
NAD+依赖性在本文中等同于NAD+特异性。在一个实施方式中，KmNADP+/KmNADP+介于1-1000之间、介于1-500之间、介于1-200之间、介于1-100之间、介于1-50之间、介于1-10之间、介于5-100之间、介于5-50之间、介于5-20之间或介于5-10之间。
使用已知的分析技术、计算和方案，蛋白质(例如权利要求中的蛋白质a)、b)和c1)的Km在本文中被确定为分别针对NAD+和NADP+的蛋白质特异性。这些描述于本文中以及例如Lodish等,Molecular Cell Biology第6版,Freeman编,第80和81页,例如图3-22中。
“序列同一性”
当表现出某水平的相似性时，则称多个氨基酸序列或核苷酸序列是同源的。两个同源的序列指示了共同的进化起源。由分别为高或低的“百分比同一性”或“百分比相似度”来指示两个同源序列关系近还是关系较远。虽然尚有争议，但是“百分比同一性”或“百分比相似度”、“同源性水平”或“百分比同源性”经常可互换使用。可使用数学算法来完成序列比较以及两个序列之间的百分比同一性的确定。本领域技术人员应认识到以下事实，可使用几个不同的计算机程序来比对两个序列，以及确定两个序列之间的同源性。D.Sankoff和J.B.Kruskal,(编),Time warps,string edits and macromolecules:the theory andpractice of sequence comparison中的An overview of sequence comparison，第1-44页，Addison Wesley。可使用用于比对两个序列的Needleman和Wunsch算法来确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。该算法比对氨基酸序列以及核苷酸序列。已经在计算机程序NEEDLE中实施了Needleman-Wunsch算法。对于本发明的目的而言，使用来自EMBOSS包的NEEDLE程序(2.8.0或更高版本，EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,P.Longden,I.和Bleasby,A.Trends in Genetics 16,(6)第276-277页，http:// emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，EBLOSUM62用于替代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。可规定另一些矩阵。用于比对氨基酸序列的任选参数是空位开放罚分(gap-open penalty)10，以及空位延伸罚分(gap extension penalty)0.5。本领域技术人员应领会，所有这些不同参数将得到轻微不同的结果，但是当使用不同算法时，两个序列的总百分比同一性并不会显著改变。
全局同源性定义
同源性或同一性是两个全序列之间的针对包括任何间隔和延伸在内的总对齐区域的一致匹配百分比。按照以下计算两个经比对序列之间的同源性或同一性：比对中在两个序列中都示出相同氨基酸的对应位置数除以包括空位的比对总长度。本文定义的同一性可从NEEDLE得到，并且在该程序输出中标记为“同一性”。
最长同一性定义
按照以下计算两个经比对序列之间的同源性或同一性：比对中在两个序列中都示出相同氨基酸的对应位置数除以减去比对中的总空位数后的比对总长度。本文定义的同一性可从NEEDLE通过使用NOBRIEF选项得到，并且在该程序输出中标记为“最长同一性”。
本文公开的核苷酸或氨基酸序列的变体还可以被定义为与本文中(例如序列表中)具体公开的核苷酸或氨基酸序列相比具有一个或几个取代、插入和/或缺失的核苷酸或氨基酸序列。
任选地，在确定氨基酸相似性程度时，本领域技术人员还可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，本领域技术人员很清楚这一点。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的取代变体是其中所公开序列中的至少一个残基已被移除并在其位置插入不同残基的那些。优选地，氨基酸改变是保守的。每种天然存在的氨基酸的优选保守取代如下：Ala到ser；Arg到lys；Asn到gln或his；Asp到glu；Cys到ser或ala；Gln到asn；Glu到asp；Gly到pro；His到asn或gln；Ile到leu或val；Leu到ile或val；Lys到arg；gln或glu；Met到leu或ile；Phe到Met、leu或tyr；Ser到thr；Thr到ser；Trp到tyr；Tyr到trp或phe；以及Val到ile或leu。
本发明的核苷酸序列还可以通过它们分别在中等或优选地在严格杂交条件下与本文公开的特定核苷酸序列的部分杂交的能力来定义。严格杂交条件在本文中被定义为这样的条件：其允许至少约25个核苷酸，优选约50个核苷酸、75或100个核苷酸，最优选约200个或更多个核苷酸的核酸序列在约65℃温度下在包含约1M盐的溶液，优选6×SSC或具有相当离子强度的任何其他溶液中杂交，并在65℃下在包含约0.1M或更低浓度的盐的溶液，优选0.2×SSC或具有相当离子强度的任何其他溶液中洗涤。优选地，进行杂交过夜，即至少10小时；优选洗涤进行至少1小时，并至少更换洗涤溶液2次。这些条件通常允许具有约90％或更高序列同一性的序列的特异性杂交。
中等条件在本文中被定义为这样的条件：其允许至少50个核苷酸，优选约200个或更多个核苷酸的核酸序列在约45℃温度下在包含约1M盐的溶液，优选6×SSC或具有相当离子强度的任何其他溶液中杂交，并在室温下在包含约0.1M盐的溶液，优选6×SSC或具有相当离子强度的任何其他溶液中洗涤。优选地，进行杂交过夜，即至少10小时；优选洗涤进行至少1小时，并至少更换洗涤溶液2次。这些条件通常允许具有达到50％序列同一性的序列的特异性杂交。本领域技术人员能够修改这些杂交条件以特异性鉴定同一性在50％-90％之间变化的序列。
“核酸构建体”或“核酸载体”在本文中被理解为表示通过使用重组DNA技术产生的由人设计的核酸分子。因此，术语“核酸构建体”不包括天然存在的核酸分子，但核酸构建体可以包含天然存在的核酸分子(的部分)。术语“表达载体”或“表达构建体”是指能够影响宿主细胞或与这些序列相容的宿主生物体中基因的表达的核苷酸序列。这些表达载体通常至少包括合适的转录调控序列和任选的3’转录终止信号。也可以存在对实现表达有必要或有帮助的额外因子，例如表达增强子元件。将表达载体引入合适的宿主细胞中，其能够实现在宿主细胞的体外细胞培养物中表达编码序列。所述表达载体适合在本发明的宿主细胞或生物体中复制。
在本文中使用时，术语“启动子”或“转录调控序列”是指这样的核酸片段，其用于控制一个或更多个编码序列的转录，并且相对于编码序列的转录起始位点的转录方向位于上游，并且在结构上通过以下的存在进行鉴定：DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列(包括但不限于转录因子结合位点、阻遏物和激活物蛋白结合位点)以及本领域技术人员已知直接或间接起作用以调控从启动子开始的转录量的任何其他核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下持续有活性的启动子。“诱导型”启动子是受生理或发育(例如应用化学诱导剂)调控的启动子。
术语“选择标记”是本领域普通技术人员熟悉的术语，在本文中用于描述在表达时可用于选择含有所述选择标记的细胞的任何遗传实体。术语“报告子(reporter)”可与标记互换使用，但它主要用于指可见标记，如绿色荧光蛋白(GFP)。选择标记可以是显性的或隐性的或双向的。
在本文中使用时，术语“可操作地连接”是指有功能关系的多核苷酸元件的连接。当一种核酸被放置成与另一核酸序列有功能关系时，它被“可操作地连接”。例如，如果转录调控序列影响编码序列的转录，则其与编码序列可操作地连接。可操作地连接意味着被连接的DNA序列通常是连续的；当必须连接两个蛋白编码区时，被连接的DNA序列是连续的并且在读码框内。
术语“蛋白质”或“多肽”可互换使用，其是指由氨基酸链组成的分子，而不涉及特定的作用模式、尺寸、三维结构或来源。
酵母在本文中被定义为真核微生物，其包括主要以单细胞形式生长的真菌(Eumycotina)亚门的所有物种。酵母可以通过单细胞菌体出芽而生长，或者可以通过生物体裂殖而生长。用于本发明中的优选酵母细胞属于Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、Schizosaccharomyces、Hansenula、Kloeckera、Schwanniomyces和Yarrowia属。优选地，酵母能够厌氧发酵，更优选厌氧醇性发酵。
“真菌”在本文中被理解为异养型真核微生物，其在外部消化其食物，吸收营养分子进入其细胞中。真菌是真核生物的一个独立的界，包括酵母、霉菌和蘑菇。本文所用的术语真菌因此明确地包括酵母以及丝状真菌。
术语“基因”是指包含一个区域(转录区域)的DNA片段，其在细胞中被转录为RNA分子(例如mRNA)，与合适的调节区(例如启动子)可操作地连接。基因通常包含若干可操作地连接的片段，例如启动子、5’前导序列、编码区以及包含多聚腺苷酸化位点的3’非翻译序列(3’端)。“基因的表达”是指这样的过程，其中与合适的调节区、特别是启动子可操作地连接的DNA区域被转录成RNA，其具有生物活性，即其能够被翻译成生物活性蛋白质或肽。
当用于表明给定的(重组)核酸或多肽分子与给定的宿主生物或宿主细胞之间的关系时，术语“同源的”应当被理解为表示该核酸或多肽分子天然地由相同物种、优选地相同品种或株系的宿主细胞或生物生产。如果与宿主细胞同源，则与在其天然环境中相比，编码多肽的核酸序列通常(但不是必须)与另一(异源)启动子序列可操作地连接，并且如果合适的话，可以与另一(异源)分泌信号序列和/或终止子序列可操作地连接。应当理解：调控序列、信号序列、终止子序列等也可以与宿主细胞同源。在这种背景下，仅使用“同源的”序列元件允许构建“自身克隆的”经遗传修饰的生物(GMO's)(自身克隆在本文中如EuropeanDirective98/81/EC Annex II中所定义)。当用于表明两条核酸序列的相关性时，术语“同源的”意指一条单链核酸序列可以与互补的单链核酸序列杂交。杂交的程度可取决于许多因素，包括序列之间同一性的量以及杂交条件如温度和盐浓度，如稍后文所述。
关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用时，术语“异源的”和“外源的”是指这样的核酸或蛋白质，其不作为其存在于之中的生物体、细胞、基因组或者DNA或RNA序列的部分天然存在，或其被发现于与其天然被发现的细胞不同的细胞中或被发现于与其天然被发现的基因组或DNA或RNA序列中的位置不同的位置。异源和外源核酸或蛋白质对其被引入的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞或是以合成方式或重组方式生产的。在一个实施方式中，异源基因可以替代同源基因，特别是相应的同源基因(具有相同功能的表达酶，但在本文中具有不同的辅因子，即NAD+依赖性的)。或者，可以在细胞中修饰同源基因以成为NAD+依赖性的，例如，通过基因组中的一个或更多个点突变，例如，使用CRISPR CAS技术进行。通常但非必须地，这种核酸编码的蛋白质(即外源蛋白)一般不由DNA在其中转录或表达的细胞产生。类似地，外源RNA编码的蛋白质在该外源RNA所存在的细胞中一般不表达的。异源/外源核酸和蛋白质也可以被称为外来核酸或者蛋白质。本领域技术人员认为对于表达其的细胞而言是外来的任何核酸或者蛋白质在本文中均涵盖在术语异源或外源核酸或者蛋白质中。术语异源和外源也适用于核酸或者氨基酸序列的非天然组合，即其中至少两个组合序列彼此是外源的组合。
酶的“比活(specific activity)”在本文中被理解为是指每单位量的总宿主细胞蛋白质中特定酶的活性的量，通常以每mg总宿主细胞蛋白质的酶活性单位表示。在本发明的上下文中，特定酶的比活相较于(其它方面相同的)野生型宿主细胞中该酶的比活可以提高或降低。
“厌氧条件”或厌氧发酵过程在本文中被定义为这样的条件或发酵过程，其在缺氧条件下运行或其中基本上不消耗氧气，优选消耗少于5mmol/L/h、2.5mmol/L/h或1mmol/L/h，更优选0mmol/L/h(即氧消耗是不可检测的)，并且其中有机分子充当电子供体和电子受体。
“破坏”在本文中理解为意指对活性的任何破坏，包括但不限于缺失、突变、降低所破坏的基因的亲和力和与相应mRNA互补的反义RNA的表达。本文中的“真核细胞中天然的”被理解为基因在破坏之前存在于真核细胞中。其包括以下情形：真核细胞中天然的基因存在于野生型真核细胞、实验室真核细胞或工业真核细胞中。真核细胞在本文中也可以被称为真核细胞株或作为真核细胞株的部分。
“野生型”真核细胞意指本发明的真核细胞所源自的的具有正常水平的功能性NADP+依赖性基因的发酵戊糖的真核细胞株。在某些情况下，本专利申请中所定义的“野生型真核细胞”可以包括诱变的真核细胞。
本文的反应等式是非化学计量的。
现在描述本发明的某些实施方式：
在一个实施方式中，真核细胞具有一个或更多个编码D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的天然基因和/或编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的天然基因的破坏，其中所述天然是指在真核细胞中天然。在一个实施方式中，在真核细胞中，所述真核细胞中天然的D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶被异源D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶替代且/或其中所述真核细胞中天然的6-磷酸葡糖酸脱氢酶被异源6-磷酸葡糖酸脱氢酶替代。在一个实施方式中，在真核细胞中，为戊糖-磷酸通路的一部分的NADP+依赖性天然基因被破坏或缺失。要破坏或缺失的基因的例子是GND1、GND2和ZWF1。异源基因NAD+依赖性D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶可以是编码原核生物酶的合成基因或原核生物基因。在一个实施方式中，具有异源基因的真核细胞是来源于Methylobacillus、Gluconobacter、Bradyrhizobium和Haloferax(例如Methylobacillus flagellatus、Gluconobacter oxydans、Bradyrhizobium或Haloferaxvolcanii)的原核生物基因。
在一个实施方式中，真核细胞是酵母细胞，例如Saccharomyces细胞，例如Saccharomyces cerevisiae细胞。在一个实施方式中，在真核细胞中，乙醛脱氢酶-6(ALD6)被破坏。在一个实施方式中，真核细胞包含所述真核细胞中天然的基因gpp1、gpp2、gpd1和gpd2中的一个或更多个的破坏。
真核细胞可以包含：h)一种或更多种编码异源木糖异构酶(EC5.3.1.5)和/或i)阿拉伯糖通路基因的核苷酸序列、j)一种或更多种编码异源甘油脱氢酶(EC1.1.1.6)的核苷酸序列；和k)一种或更多种编码同源或异源二羟基丙酮激酶(E.C.2.7.1.28或E.C.2.7.1.29)的核苷酸序列。在一个实施方式中，真核细胞是能够同时厌氧消耗戊糖和葡萄糖的发酵戊糖和葡萄糖的真核细胞。在一个实施方式中，底物是木质纤维素材料的水解物，例如木质纤维素材料的酶促水解物，其中所述水解物包含乙酸盐/酯。水解物中乙酸盐/酯的浓度可以为0.3％(w/w)或更高。
本文描述的本发明的各种实施方式可以交叉组合。
在一个实施方式中，本发明提供了经遗传修饰的真核细胞，其包含：
a)D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和/或
b)6-磷酸葡糖酸脱氢酶；
c)葡萄糖脱氢酶、葡糖酸内酯酶和葡糖酸激酶，其中a)和b)以及c)中的葡萄糖脱氢酶是NAD+依赖性的；
d)一种或更多种编码异源NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10)的核苷酸序列；
e)一种或更多种编码同源或异源乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)的核苷酸序列；
f)所述真核细胞中天然的一种或更多种醛脱氢酶(E.C.1.2.1.4)的破坏；
g)与没有所述修饰的真核细胞相比，导致甘油3-磷酸磷酸水解酶和/或甘油3-磷酸脱氢酶活性降低的修饰；
h)一种或更多种编码异源木糖异构酶(E.C.5.3.1.5)的核苷酸序列；
i)阿拉伯糖通路基因
j)一种或更多种编码异源甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)的核苷酸序列；和/或
k)一种或更多种编码同源或异源二羟基丙酮激酶(E.C.2.7.1.28或E.C.2.7.1.29)的核苷酸序列。
下文更详细地描述了本发明的这些特征和其他实施方式。
a)NAD+依赖性D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
天然酶D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(在本文中缩写为G6PDH或ZWF1)是作为戊糖-磷酸通路(PPP通路)的氧化部分的一部分的酶。在真核细胞中，这种酶是NADP+依赖性的。由该天然酶催化的反应是：
D-葡萄糖-6-磷酸+NADP+<---ZWF1--->6-磷酸葡糖酸内酯+NADPH+H+(等式1)。
根据本发明使用的NAD+依赖性D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶使用NAD+作为辅因子。NAD+依赖性G6PDH酶的反应是：
D-葡萄糖-6-磷酸+NAD+<-----azf----->D-6-磷酸葡糖酸内酯+NADH+H+(等式2)。
在一个实施方式中，NAD+依赖性G6PDH(酶或基因)来源于原核生物。“来源于”在本文中被理解为包括a)从生物体分离或b)基于从基因序列或蛋白质获得的信息合成基因或蛋白质。
在一个实施方式中，G6PDH是编码D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的异源基因，其与SEQID NO:7具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性。在一个实施方式中，所述基因编码酶，所述酶是与SEQ ID NO:8具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。表1中给出了上述G6PDH酶的合适实例。
表1：合适的G6PDH酶以及与G6PDH WP_004044412.1的同一性
蛋白质 同一性(％) 登录号
NAD依赖性差向异构酶[Haloferax volcanii] 100 WP_004044412.1
糖差向异构酶/脱水酶样蛋白[Haloferax sulfurifontis] 98 WP_007274874.1
NAD依赖性差向异构酶[Haloferax mucosum] 94 WP_008319571.1
糖差向异构酶/脱水酶样蛋白[Haloferax larsenii] 91 WP_007544789.1
NAD依赖性差向异构酶[Halogeometricum borinquense] 81 WP_006056268.1
NAD依赖性差向异构酶[Halorubrum saccharovorum] 75 WP_004048754.1
二磷酸核苷-糖差向异构酶[Halonotius sp.J07HN6] 70 WP_021060497.1
NAD依赖性差向异构酶[Natronomonas pharaonis] 62 WP_011321883.1
b)6-磷酸葡糖酸脱氢酶
天然酶6-磷酸葡糖酸脱氢酶(在本文中缩写为6PGDH或GND1或GND2)是作为戊糖磷酸通路(PPP通路)的氧化部分的一部分的酶。在真核细胞中，这种酶是NADP+依赖性的。由该天然酶催化的反应是：
6-磷酸葡糖酸盐/酯+NADP+<-----GND1或GND2----->核酮糖-5-磷酸盐/酯+NADPH+H++CO2
(等式3)。
根据本发明使用的NAD+依赖性6-磷酸葡糖酸脱氢酶使用NAD+作为辅因子。由NAD+依赖性6PGDH酶催化的反应是：
6-磷酸葡糖酸盐/酯+NAD+<-----GND1或GND2(GndA)----->核酮糖-5-磷酸盐/酯+NADH+H++CO2
(等式4)。
在一个实施方式中，NAD+依赖性G6PDH(酶或基因)来源于原核生物。“来源于”在本文中被理解为包括a)从生物体分离或b)基于从基因序列或蛋白质获得的信息合成。
在一个实施方式中，6PGDH是编码D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的异源基因，其与SEQID NO:1具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性。在一个实施方式中，所述基因编码酶，所述酶是与SEQ ID NO:2具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。表2中给出了上述6PGDH酶的合适实例。
在一个实施方式中，6PGDH是编码D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的异源基因，其与SEQID NO:3具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性。在一个实施方式中，所述基因编码酶，所述酶是与SEQ ID NO:4具有60％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。表3中给出了上述6PGDH酶的合适实例。
在一个实施方式中，6PGDH是编码D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的异源基因，其与SEQID NO:5具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性。在一个实施方式中，所述基因编码酶，所述酶是与SEQ ID NO:6具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。表4中给出了上述6PGDH酶的合适实例。
在一个实施方式中，异源6PGDH酶或基因是来源于选自以下属列表的生物体的原核生物基因：Methylobacillus、Gluconobacter、Bradyrhizobium和Haloferax。在一个实施方式中，6PGDH酶或基因是来源于选自以下种列表的生物体的基因：Methylobacillusflagellatus、Gluconobacter oxydans、Bradyrhizobium和Haloferax volcanii。表2、3和4中给出了合适的6PGDH蛋白质的例子。
表2：合适的6PGDH酶以及与AAF34407.16-磷酸葡糖酸脱氢酶(Methylobacillus flagellates 6PGDH)的同一性
表3：合适的6PGDH蛋白以及与WP_011253227.16-磷酸葡糖酸脱氢酶 (Gluconobacter oxydans 6PGDH]的同一性；
蛋白质 同一性(％) 登录号
6-磷酸葡糖酸脱氢酶[Gluconobacter oxydans] 100 WP_011253227.1
6-磷酸葡糖酸脱氢酶[Gluconobacter oxydans] 99 WP_041112000.1
6-磷酸葡糖酸脱氢酶[Gluconobacter morbifer] 86 WP_008850548.1
6-磷酸葡糖酸脱氢酶[Gluconobacter oxydans] 84 WP_046899919.1
6-磷酸葡糖酸脱氢酶[Asaia astilbis] 77 WP_025823114.1
6-磷酸葡糖酸脱氢酶[Acetobacter cibinongensis] 76 WP_048838399.1
6-磷酸葡糖酸脱氢酶[Komagataeibacter xylinus] 75 WP_048857212.1
6-磷酸葡糖酸脱氢酶[Granulibacter bethesdensis] 67 WP_011631561.1
表4：合适的6PGDH蛋白以及与WP_011089498.16-磷酸葡糖酸脱氢酶 (Bradyrhizobium 6PGDH]的同一性
蛋白质 同一性(％) 登录号
多物种:6-磷酸葡糖酸脱氢酶[Bradyrhizobium] 100 WP_011089498.1
6-磷酸葡糖酸脱氢酶[Bradyrhizobium sp.WSM2254] 98 WP_027546897.1
6-磷酸葡糖酸脱氢酶[Bradyrhizobium japonicum] 95 WP_024339411.1
6-磷酸葡糖酸脱氢酶[Bradyrhizobium elkanii] 83 WP_028347094.1
6-磷酸葡糖酸脱氢酶[Rhodopseudomonas palustris] 77 WP_011440787.1
6-磷酸葡糖酸脱氢酶[Microvirga lupini] 75 WP_036351036.1
6-磷酸葡糖酸脱氢酶(decarboxylating)[Afipia felis] 72 WP_002718635.1
6-磷酸葡糖酸脱氢酶[Methylobacterium oryzae] 71 WP_043757546.1
c)葡萄糖脱氢酶、葡糖酸内酯酶和葡糖酸激酶
在一个实施方式中，细胞包含葡萄糖脱氢酶、葡糖酸内酯酶和葡糖酸激酶。这些基因的引入和相应酶的表达导致细胞中的以下反应：
葡萄糖+NAD+<-----葡萄糖脱氢酶----->葡糖酸内酯+NADH
(等式5)，然后是：
葡糖酸内酯+H2O<-----葡糖酸内酯酶----->葡糖酸盐/酯
(等式6)，然后是
葡糖酸盐/酯+ATP<-----葡糖酸激酶----->6-P-葡糖酸盐/酯+ADP++Pi
(等式7)，其完成了从葡萄糖到6-P-葡糖酸盐/酯的通路。
现在分别更详细地描述这些酶(称为c1)、c2)和c3)。
c1)NAD+依赖性葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.118)是催化以下化学反应的酶
因此，该酶的两种底物是D-葡萄糖和受体，而其两种产物是D-葡糖酸-1,5-内酯和还原的受体。该酶属于氧化还原酶家族，特别是与其他受体一起作用于供体的CH-OH基团的那些。该酶类别的系统名称是D-葡萄糖:受体1-氧化还原酶。常用的其他名称包括葡萄糖脱氢酶(Aspergillus)、葡萄糖脱氢酶(脱羧基)和D-葡萄糖:(受体)1-氧化还原酶。该酶参与戊糖磷酸通路。其使用一个辅助因子：FAD。
c2)葡糖酸内酯酶(EC 3.1.1.17)是一种催化以下化学反应的酶
因此，该酶的两种底物是D-葡糖酸-1,5-内酯和H2O，而其产物是D-葡糖酸盐/酯。该酶属于水解酶家族，特别是作用于羧酸酯键的那些。该酶类别的系统名称是D-葡糖酸-1,5-内酯内酯水解酶。常用的其他名称包括内酯酶、醛糖内酯酶(aldonolactonase)、葡糖酸-δ-内酯酶和古洛糖酸内酯酶(gulonolactonase)。该酶参与戊糖磷酸通路。
c3)葡糖酸激酶或葡萄糖酸激酶(EC 2.7.1.12)是一种催化以下化学反应的酶：
因此，该酶的两种底物是ATP和D-葡糖酸盐/酯，而其两种产物是ADP和6-磷酸-D-葡糖酸盐/酯。
该酶属于转移酶家族，特别是以醇基作为受体转移含磷基团的那些(磷酸转移酶)。该酶类别的系统名称是ATP:D-葡糖酸盐/酯6-磷酸转移酶。常用的其他名称包括葡萄糖酸激酶(磷酸化)和葡糖酸激酶。该酶参与戊糖磷酸通路。
d)乙醛脱氢酶(乙酰化)(EC 1.2.1.10)
本发明的细胞可还包含编码具有将乙酰CoA还原成乙醛的能力的酶的外源基因，该基因赋予细胞将乙酰CoA(和/或乙酸)转化为乙醇的能力。具有将乙酰CoA还原成乙醛的能力的酶在本文中被理解为催化以下反应的酶(ACDH；EC 1.2.1.10)：
因此，该酶催化乙酰CoA转化为乙醛(和反方向转化)，其也被称为(乙酰化NAD-依赖性)乙醛脱氢酶或乙酰-CoA还原酶。该酶可以是进一步催化乙醛转化为乙醇(和反方向转化；见下文)的双功能酶。为了方便起见，我们在本文中将至少具有将乙酰CoA还原成乙醛或乙醇的能力的酶称为“乙醛脱氢酶”。在本文中还应当理解：细胞具有内源性醇脱氢酶活性，所述活性允许被提供有乙醛脱氢酶活性的细胞完成乙酰-CoA到乙醇的转化。此外，细胞具有内源性或外源性乙酰-CoA合成酶，其允许被提供有乙醛脱氢酶活性的细胞完成乙酸(经由乙酰-CoA)到乙醇的转化。
外源基因可以编码仅具有乙醛脱氢酶活性的单功能酶(即，仅具有将乙酰CoA还原成乙醛的能力的酶)，例如，由E.coli mhpF基因或E.coli EutE基因(编码乙醛脱氢酶活性的部分)编码的乙醛脱氢酶。
表5中提供了包含具有乙醛脱氢酶活性的单功能酶的原核生物的合适实例。这些单功能酶的氨基酸序列可在公共数据库中获得，并且本领域技术人员可利用其设计编码相应单功能酶的密码子优化的核苷酸序列。
表5：具有乙醛脱氢酶活性且与E.coli mhpF具有同一性的合适酶
生物体 氨基酸同一性(％)
Escherichia coli K12菌株MG1655亚株 100％
Shigella sonnei 100％
Escherichia coli IAI39 99％
Citrobacter youngae ATCC 29220 93％
Citrobacter sp.30_2 92％
Klebsiella pneumoniae 342) 87％
Klebsiella variicola 87％
Pseudomonas putida 81％
Ralstonia eutropha JMP134 82％
Burkholderia sp.H160 81％
Azotobacter vinelandii DJ 79％
Ralstonia metallidurans CH34 70％
Xanthobacter autotrophicus Py2 67％
Burkholderia cenocepacia J2315 68％
Frankia sp.EAN1pec 67％
Polaromonas sp.JS666 68％
Burkholderia phytofirmans PsJN 70％
Rhodococcus opacus B4 64％
在一个实施方式中，细胞包含编码具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶的外源基因，该基因赋予细胞将乙酰CoA转化为乙醇的能力。使用具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶相较于使用独立的各具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的酶的优点在于：其允许在通路中催化连续反应的酶之间的中间体的直接传递(direct channeling)，使得有效、专一且受保护的代谢物递送方式成为可能。因此，底物传递减少了中间体的运输时间，防止中间体通过扩散而损失，保护不稳定的中间体免受溶剂作用，并预先阻止中间体进入竞争性代谢通路。因此，双功能酶相较于单独的乙醛脱氢酶和醇脱氢酶允许更有效地将乙酰CoA转化为乙醇。使用双功能酶的另一个优点是：它也可以在所用条件(厌氧条件和/或分解代谢物阻遏条件)下在具有很少或没有醇脱氢酶活性的细胞中使用。
具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶在本领域中是已知的。其可存在于原核生物和原生动物中，包括例如由Escherichia coli adhE和Entamoeba histolyticaADH2基因编码的双功能酶(参见例如Bruchaus和Tannich,1994,J.Biochem.303:743-748；Burdette和Zeikus,1994,J.Biochem.302:163-170；Koo等人,2005,Biotechnol.Lett.27:505-510；Yong等人,1996,Proc Natl Acad Sci USA,93:6464-6469)。具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶是由约900个氨基酸组成的较大蛋白质，其是双功能的，因为展示出乙醛脱氢酶(ACDH；EC 1.2.1.10)和醇脱氢酶活性(ADH；EC1.1.1.1)二者。E.coli adhE和Entamoeba histolytica ADH2显示出45％的氨基酸同一性。表6中给出了具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性且与E.coli adhE具有同一性的双功能酶的合适实例。表7中给出了具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性且与Entamoeba histolytica ADH2具有同一性的双功能酶的合适实例。
表6：具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性且与E.coli adhE具有同一性的合适双功能 酶
表7：具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性且与Entamoeba histolytica ADH2具有同 一性的合适双功能酶
生物体 氨基酸同一性(％)
Entamoeba histolytica HM-1:IMSS 99％
Entamoeba dispar SAW760 98％
Mollicutes bacterium D7 65％
Fusobacterium mortiferum ATCC 9817 64％
Actinobacillus succinogenes 130Z 63％
Pasteurella multocida Pm70 62％
Mannheimia succiniciproducens MBEL55E 61％
Streptococcus sp.2_1_36FAA] 61％
表8：具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性且与E.coli EutE具有同一性的合适酶
为了表达编码具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶或具有乙醛脱氢酶活性的酶的核苷酸序列，将(待表达的)核苷酸序列置于表达构建体中，其中所述核苷酸序列可操作地连接至合适的表达调控区/序列以确保将表达构建体转化到本发明的细胞中之后，酶表达(参见上文)。用于编码具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶或具有乙醛脱氢酶活性的酶的核苷酸序列的合适启动子包括这样的启动子：其优选对分解代谢物(葡萄糖)阻遏不敏感，在厌氧条件下有活性和/或优选不需要木糖或阿拉伯糖进行诱导。上文给出了这样的启动子的例子。
优选地，编码具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶或具有乙醛脱氢酶活性的酶的核苷酸序列适合根据目的细胞的密码子使用优化其密码子使用(如上所述)。
e)乙酰-CoA合成酶(EC 6.2.1.1)；
本发明的细胞可包含编码具有乙酰-CoA合成酶的特异活性的酶的基因。乙酰-CoA合成酶或乙酸酯-CoA连接酶是参与碳糖代谢的酶(EC6.2.1.1)。其属于酶的连接酶类别，这意味着其催化两个大分子之间新化学键的形成。
通过乙酰-CoA合成酶连接的两个分子是乙酸盐/酯和辅酶A(CoA)。包括底物和产物的反应是：
Acs1形式和Acs2形式的乙酰-CoA合成酶分别由基因ACS1和ACS2编码。
表9中提供了具有乙酰-CoA合成酶活性的酶的合适实例。
表9：与Saccharomyces cerevisiae的ACS2蛋白具有同一性的合适的ACS。
f)真核细胞中天然的一种或更多种醛脱氢酶(E.C.1.2.1.4)的破坏
根据本发明可以破坏的酶是真核细胞中天然的醛脱氢酶(E.C:1.2.1.4)。
在一个实施方式中，真核细胞中天然的醛脱氢酶是乙醛脱氢酶-6(ALD6)。
在本文中，ALD6是催化乙醛脱氢为乙酸盐/酯和反方向转化的任何Mg2+激活酶。
ALD6催化的反应是：
乙醛+NAD+/NADP++H2O<-----ALD6---->乙酸盐/酯+NAD/NADPH
(等式13)。
等式13中的酶ALD6产生NADPH和乙酸盐/酯。因此，在本发明的上下文中，ALD6的破坏或缺失是优选的实施方式。
如果根据本发明的菌株包含乙酰化乙醛脱氢酶(例如，adhE或ACDH)(参见d)以及WO2015028583和WO2015028582)，则ALD6缺失的其它优点是很明显的。根据本发明的真核细胞中乙酰化乙醛脱氢酶和ALD6的组合可导致消耗ATP的无效循环。ALD6缺失打破了无效循环，从而避免了无效循环的ATP消耗。在本发明的一个实施方式中，在真核细胞中缺失Saccharomyces cerevisiae的ALD6。如图4所示。
表10中给出了与Saccharomyces cerevisiae的ALD6核苷酸序列具有同一性的其他真核细胞中用于破坏的合适ALD6核苷酸序列。
表10：不同类型的真核细胞中存在的用于破坏的合适ALD6核苷酸序列
g)导致甘油3-磷酸磷酸水解酶和/或甘油3-磷酸脱氢酶活性降低的修饰
真核细胞还可以进一步包含这样的修饰，其导致与不含所述修饰的真核细胞相比，甘油3-磷酸磷酸水解酶和/或甘油3-磷酸脱氢酶活性降低。
在该实施方式中，细胞可以包含编码甘油3-磷酸磷酸水解酶和/或编码甘油3-磷酸脱氢酶基因的一种或更多种内源核苷酸序列的破坏。
在此类实施方式中，NADH-依赖性甘油合成所需的酶活性降低或缺失。可通过以下方法来实现这种酶活性的降低或缺失：修饰编码NAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶活性(GPD)的一个或更多个基因或编码甘油磷酸磷酸酶活性(GPP)的一个或更多个基因，以使得酶表达比在野生型中少得多，或者使得基因编码活性降低的多肽。
这种修饰可以使用公知的生物技术来进行，具体可以包括编码GPD和/或GPP的结构基因的启动子区或编码区的一个或更多个敲除突变或定点诱变。或者，可以通过随机诱变随后选择GPD和/或GPP活性降低或缺失的菌株来获得甘油产生缺陷的真核细胞株。S.cerevisiae GPD1、GPD2、GPP1和GPP2基因示于WO2011010923中，并且在本申请的SEQ IDNO:24-27中公开。
因此，在本发明的细胞中，可以减少特定的甘油3-磷酸磷酸水解酶和/或编码甘油3-磷酸脱氢酶的基因。在本发明的细胞中，在优选厌氧条件下，与除了导致比活降低的遗传修饰之外遗传上相同的菌株相比，甘油磷酸脱氢酶比活优选降低为至少0.8、0.5、0.3、0.1、0.05或0.01倍。甘油磷酸脱氢酶活性可以如Overkamp等人(2002,Eukaryotic cell 19:509-520)所述来测定。
编码甘油磷酸脱氢酶(其活性在本发明的细胞中应降低或失活)的优选基因是vanden Berg和Steensma所述的S.cerevisiae GPD1(1997,Eukaryotic cell 13:551-559)，其编码氨基酸序列GPD1及其在其他物种中的直系同源物。
表11中提供了属于Saccharomyces、Naumovozyna、Candida Vanderwaltozyma和Zygosaccharomyces属的具有甘油磷酸脱氢酶活性的酶的合适实例。
表11：具有甘油磷酸脱氢酶(GPD1)活性的合适的酶，其特征在于生物体来源以及 与S.cervisiae甘油磷酸脱氢酶(GPD1)的氨基酸同一性
生物体 氨基酸同一性(％)
S.cerevisiae 100％
Naumovozyma dairenensis 79％
Naumovozyma castellii 80％
Candida glabrata 77％
Vanderwaltozyma polyspora 77％
Zygosaccharomyces rouxii 74％
Saccharomycopsis fibuligera 61％
然而，在一些菌株(例如Saccharomyces、Candida和Zygosaccharomyces的菌株)中，编码甘油磷酸脱氢酶的第二基因(即GPD2)是有活性的。因此，编码甘油磷酸脱氢酶(其活性在本发明的细胞中应降低或失活)的另一优选基因是S.cerevisiae GPD2，其编码氨基酸序列GPD2及其在其他物种中的直系同源物。
表12中提供了属于(Zygo)Saccharomyces和Candida属的包含具有甘油磷酸脱氢酶活性的酶的生物体(宿主)的合适实例。
表12：具有甘油磷酸脱氢酶(GPD2)活性的合适的酶，其特征在于生物体来源以及 与S.cervisiae甘油磷酸脱氢酶(GPD2)的氨基酸同一性
生物体 氨基酸同一性(％)
S.cerevisiae 100％
Candida glabrata 75％
Zygosaccharomyces rouxii 73％
Spathaspora passalidarum 62％
Scheffersomyces stipites 61％
在一个实施方式中，细胞是真核细胞，其中真核细胞的基因组包含选自GPD1、GPD2、GPP1和GPP2的组的至少一个基因的突变，所述突变可以是敲除突变，所述敲除突变可以是与所述真核细胞的相应野生型真核细胞基因相比至少一个所述基因的完全缺失。
h)木糖异构酶(E.C.5.3.1.5)
在一个实施方式中，真核细胞可包含木糖异构酶((E.C.5.3.1.5)；xylA)。
“木糖异构酶”(E.C.5.3.1.5)在本文中被定义为催化D-木糖直接异构化为D-木酮糖和/或相反过程的酶。该酶也被称为D-木糖酮异构酶。本文的木糖异构酶还可以能够催化D-葡萄糖和D-果糖之间的转化(因此可以被称为葡萄糖异构酶)。通常，木糖异构酶需要二价阳离子(例如镁、锰或钴)作为辅因子。
i)阿拉伯糖通路酶(L-阿拉伯糖异构酶(araA)、L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶(araD))
在一个实施方式中，细胞包含表达L-阿拉伯糖发酵通路的酶的基因。EP 1499708公开了通过过表达L-阿拉伯糖通路来构建发酵L-阿拉伯糖的菌株。在所述通路中，酶L-阿拉伯糖异构酶(araA)、L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶(araD)分别参与将L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖、核酮糖-5-P和D-木酮糖-5-P。
j)甘油脱氢酶(EC1.1.1.6)
甘油脱氢酶在本文中被理解为催化以下化学反应的酶(EC 1.1.1.6)：
其他常用名包括甘油脱氢酶、NAD+-连接的甘油脱氢酶和甘油:NAD+2-氧化还原酶。优选地，遗传修饰引起甘油脱氢酶的过表达，例如，通过编码甘油脱氢酶的核苷酸序列的过表达。编码甘油脱氢酶的核苷酸序列对于细胞来说可以是内源的，或者可以是对细胞而言是异源的甘油脱氢酶。在本发明的细胞中可用于过表达甘油脱氢酶的核苷酸序列是例如来自S.cerevisiae的甘油脱氢酶基因(GCY1)，如例如Oechsner等人(1988,FEBSLett.238:123-128)或Voss等人(1997,Eukaryotic cell 13:655-672)所述。
k)一种或更多种编码同源或异源二羟丙酮激酶(E.C.2.7.1.28或E.C.2.7.1.29)的核苷酸序列
二羟丙酮激酶在本文中被理解为催化以下化学反应之一的酶：
EC 2.7.1.28ATP+D-甘油醛<＝>ADP+D-甘油醛3-磷酸酯
EC 2.7.1.29ATP+甘油酮<＝>ADP+甘油酮磷酸酯
甘油酮＝二羟丙酮。
其他常用名包括甘油酮激酶、ATP:甘油酮磷酸转移酶和(磷酸化)丙酮醇激酶。应当理解：甘油酮和二羟丙酮是同一种分子。优选地，遗传修饰(例如通过编码二羟丙酮激酶的核苷酸序列的过表达)引起二羟丙酮激酶的过表达。编码二羟丙酮激酶的核苷酸序列对于细胞而言可以是内源的，或者可以是对细胞而言是异源的二羟丙酮激酶。可用于在本发明的细胞中过表达二羟丙酮激酶的核苷酸序列是例如来自S.cerevisiae的二羟丙酮激酶基因(DAK1)和(DAK2)，如例如Molin等人(2003,J.Biol.Chem.278:1415-1423)所述。
表13中提供了具有甘油脱氢酶活性的酶的合适实例。
表13：与Saccharomyces cerevisiae GCY1的GCY1蛋白具有同一性的合适GCY
表14中提供了具有二羟丙酮激酶活性的酶的合适实例。
表14：与Saccharomyces cerevisiae的DAK1蛋白具有同一性的合适DAK
描述 同一性(％) 登录号
Dak1p[Saccharomyces cerevisiae S288c] 100 NP_013641.1
二羟丙酮激酶[Saccharomyces cerevisiae YJM789] 99 EDN64325.1
DAK1样蛋白[Saccharomyces kudriavzevii IFO 1802] 95 EJT44075.1
ZYBA0S11-03576g1_1[Zygosaccharomyces bailii CLIB 213] 77 CDF91470.1
推定蛋白[Kluyveromyces lactis NRRL Y-1140] 70 XP_451751.1
推定蛋白[Candida glabrata CBS 138] 63 XP_449263.1
Dak2p[Saccharomyces cerevisiae S288c] 44 NP_116602.1
现在更详细地描述本发明的其它实施方式。
本发明还涉及如本文所述的真核细胞在酿酒工业中的发酵中的用途。
在另一个实施方式中，本发明涉及如本文所述的真核细胞在生物燃料工业中的发酵中的用途。
此外，本发明涉及一种在酿酒生物燃料工业中利用如本文所述的真核细胞发酵底物以生产发酵产物的方法，其中相对于利用野生型真核细胞的相应发酵，乙酸盐/酯消耗增加至少10％、至少20％或至少25％。在其一个实施方式中，乙醇产率比利用相应野生型真核细胞的方法的乙醇产率高至少约0.5％或至少1％。在所述方法中，优选共发酵戊糖和葡萄糖。在所述方法中，可以发酵木质纤维素材料的水解物。所述水解物可以是木质纤维素材料的酶促水解物。所述水解物可以包含乙酸盐/酯。包含乙酸盐/酯的水解物可具有0.3％(w/w)或更高的乙酸盐/酯浓度。
真核细胞可含有对真核细胞而言非天然的戊糖代谢通路的基因和/或允许真核细胞转化戊糖的基因。在一个实施方式中，真核细胞可以包含一个或或两个或更多个拷贝的一种或更多种木糖异构酶和/或一个或两个或更多个拷贝的一种或更多种木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因，从而允许真核细胞转化木糖。在其一个实施方式中，这些基因可以整合到真核细胞基因组中。在另一个实施方式中，真核细胞包含基因araA、araB和araD。然后其能够发酵阿拉伯糖。在本发明的一个实施方式中，真核细胞包含xylA-基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1-基因，以允许真核细胞发酵木糖；缺失醛糖还原酶(GRE3)基因；过表达PPP-基因、TAL1、TKL1、RPE1和RKI1以允许细胞中通过戊糖磷酸通路的通量增加，和/或过表达GAL2和/或缺失GAL80。因此，虽然包含上述基因，但是可以将(野生型)真核细胞中非天然的合适的戊糖或其它代谢通路引入真核细胞中。根据一个实施方式，下列基因可通过引入宿主细胞中而引入真核细胞中：
1)由PPP-基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1组成的集合，任选地受强组成型启动子的控制；
2)受强组成型启动子控制的由xylA-基因组成的集合；
3)受强组成型启动子控制的包含XKS1-基因的集合；
4)受强组成型启动子控制的由基因araA、araB和araD组成的集合；
5)醛糖还原酶基因的缺失。
上述细胞可以使用已知的重组表达技术来构建。辅因子修饰可以在任何1)-5)的修饰之前、同时或之后进行。
可以使根据本发明的真核细胞经受进化工程以改善其性质。进化工程方法是已知的方法。进化工程是这样的一种方法，其中通过合理地建立自然选择的过程，可以使微生物(本文中是真核细胞)的工业相关表型与比生长速率和/或对营养物的亲和性偶联。例如Kuijper,M等人,FEMS Eukaryotic cell Research 5(2005)925-934、WO2008041840和WO2009112472中详细描述了进化工程。在进化工程之后分离产生的发酵戊糖的真核细胞。分离可以以任何已知的方式执行，例如，通过从进化工程中使用的真核细胞培养液中分离细胞，例如通过取细胞样品或通过过滤或离心。
在一个实施方式中，真核细胞不含标记。在本文中使用时，术语“标记”是指编码允许选择或筛选含有标记的宿主细胞的性状或表型的基因。不含标记意味着标记基本上不存在于真核细胞中。当抗生素标记已用于构建真核细胞并且随后被去除时，不含标记是特别有利的。可以使用任何合适的现有技术(例如，分子内重组)去除标记。
在一个实施方式中，基于抑制剂耐受的宿主细胞构建工业真核细胞，其中构建如下文所述进行。抑制剂耐受的宿主细胞可以通过筛选菌株在含有抑制剂的材料上的生长来选择，例如,Appl.Biochem.Biotechnol.(2007),第136-140卷,847-858中所示，其中选择了抑制剂耐受的S.cerevisiae菌株ATCC 26602。
真核细胞还可包含将丙酮酸转化为期望的发酵产物所需的那些酶活性，所述发酵产物例如乙醇、丁醇(例如正丁醇、2-丁醇和异丁醇)、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸、衣康酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素或头孢菌素。
在一个实施方式中，真核细胞来源于工业真核细胞。工业细胞和工业真核细胞可以如下所定义。(真核细胞)细胞在工业方法中的生存环境与在实验室中的生存环境显著不同。工业真核细胞必须能够在多种环境条件下表现良好，所述环境条件可以在方法期间变化。这种变化包括营养源、pH、乙醇浓度、温度、氧浓度等的变化，它们共同对Saccharomycescerevisiae的细胞生长和乙醇生产具有潜在的影响。在不利的工业条件下，环境耐受菌株应当允许稳健的生长和生产。对于使用工业酵母菌株的应用中(诸如烘焙工业、酿造工业、酿酒和生物燃料乙醇工业中)可能出现的这些环境条件变化，工业真核细胞株通常更稳健。在一个实施方式中，基于工业宿主细胞构建工业真核细胞，其中构建如下文所述进行。工业真核细胞(S.cerevisiae)的例子有Ethanol (Fermentis)(DSM)和(Lallemand)。
根据本发明的真核细胞优选是抑制剂耐受的，即它们能经得起在使用常见预处理和水解条件时典型水平的常见抑制剂，使得真核细胞能够具有广泛的应用，即其具有针对不同原料、不同预处理方法和不同水解条件的高应用性。在一种实施方式中，真核细胞是抑制剂耐受的。抑制剂耐受是对抑制性化合物的抗性。木质纤维素中抑制性化合物的存在和水平可随着原料、预处理方法、水解过程的变化而广泛改变。抑制剂类别的例子是羧酸、呋喃和/或酚类化合物。羧酸的例子是乳酸、乙酸或甲酸。呋喃的例子是糠醛和羟基-甲基糠醛。酚类化合物的例子是香草醛(vannilin)、丁香酸、阿魏酸和香豆酸。抑制剂的典型用量对于羧酸而言是每升若干克到每升20克或更多，取决于原料、预处理和水解条件。对呋喃而言是每升数百毫克到每升数克，取决于原料、预处理和水解条件。对酚类而言是每升数十毫克到每升一克，取决于原料、预处理和水解条件。
在一个实施方式中，真核细胞是天然能够进行醇性发酵、优选地能够进行厌氧醇性发酵的细胞。真核细胞优选地具有对乙醇的高度耐受，对低pH(即能够在低于约5、约4、约3、或约2.5的pH下生长)和对有机酸的高度耐受，和/或对提高的温度的高度耐受。
此外，本发明涉及一种在酿酒工业中利用如本文所述的真核细胞发酵底物以生产发酵产物的方法，其中甘油产率比利用相应野生型真核细胞的方法的甘油产率高至少5％、至少10％或至少10％、至少20％或至少30％。在所述方法的一个实施方式中，乙醇产率相较于利用相应野生型真核细胞的方法的乙醇产率不提高或降低。
真核细胞的任何上述特征或活性可天然存在于细胞中，或可通过遗传修饰被引入或修饰。
重组表达
真核细胞是重组细胞。也就是说，真核细胞包含不天然地存在于所讨论的细胞中的核苷酸序列，或用所述核苷酸序列转化，或用所述核苷酸序列遗传修饰。
用于在细胞中重组表达酶以及用于对真核细胞进行其他遗传修饰的技术是本领域技术人员公知的。通常，此类技术涉及用包含相关序列的核酸构建体转化细胞。此类方法例如从标准手册中获知，例如Sambrook和Russel(2001)"Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第3版),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press或者F.Ausubel等人编,"Current protocols in molecular biology",Green Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。转化和遗传修饰真菌宿主细胞的方法从例如EP-A-0635 574、WO 98/46772、WO 99/60102、WO 00/37671、WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US 6,265,186中获知。
生物制品生产
许多年来，已经建议引入多种生物体用于从作物糖生产生物乙醇。然而在实践中，所有主要的生物乙醇生产方法继续使用Saccharomyces属的真核细胞作为乙醇生产者。这归因于Saccharomyces种对工业方法而言的许多有吸引力的特征，即高度的酸耐性、乙醇耐性和渗透耐性，厌氧生长的能力，以及当然其高醇性发酵能力。作为宿主细胞的优选的真核细胞物种包括S.cerevisiae、S.bulderi、S.barnetti、S.exiguus、S.uvarum、S.diastaticus、K.lactis、K.marxianus或K.fragilis。
真核细胞可以是适合生产乙醇的细胞。然而，真核细胞可适用于生产除乙醇以外的发酵产物。
这类非乙醇发酵产物原则上包括可由真核微生物如真核细胞或丝状真菌生产的任何大宗化学品(bulk chemical)或精细化学品。
用于生产非乙醇发酵产物的优选真核细胞是下述宿主细胞，所述宿主细胞含有导致降低的醇脱氢酶活性的遗传修饰。
木质纤维素
可以被认为是潜在的可再生原料的木质纤维素通常包含多糖纤维素(葡聚糖)和半纤维素(木聚糖、杂木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外，一些半纤维素可以作为葡甘露聚糖(glucomannans)存在于例如木材衍生的原料中。这些多糖成为可溶糖(包括单体和多聚体，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和其他己糖和戊糖)的酶促水解发生于共同作用的不同酶的作用下。
另外，果胶和其他果胶物质如阿拉伯聚糖(arabinans)可占来自非木本植物组织典型的细胞壁干物质的可观的比例(约四分之一到一半的干物质可以是果胶)。
预处理
在酶处理之前，可对木质纤维素材料进行预处理。预处理可包括将木质纤维素材料暴露于酸、碱、溶剂、热、过氧化物、臭氧、机械击打、粉碎、研磨或快速降压，或其中任何两种或更多种的组合之下。这种化学预处理通常与热预处理(例如150-220℃之间1到30分钟)组合。
酶促水解
通常使预处理的材料经受酶促水解以释放根据本发明可被发酵的糖。这可用常规方法进行，例如与纤维素酶，例如纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和任选地其他酶接触。可在环境温度或更高温度下，在释放足够量的糖的反应时间下，进行利用纤维素酶的转化。酶促水解的结果是在本文中被命名为糖组合物的包含C5/C6糖的水解产物。
糖组合物
根据本发明使用的糖组合物包含葡萄糖以及一种或更多种戊糖，例如阿拉伯糖和/或木糖。在本发明中可以使用满足这些标准的任何糖组合物。糖组合物中任选的糖是半乳糖和甘露糖。在一种优选的实施方式中，糖组合物是一种或更多种木质纤维素材料的水解物。此处木质纤维素包括半纤维素和生物质的半纤维素部分。木质纤维素还包括生物质的木质纤维素级分。合适的木质纤维素材料可存在于以下列表中：果园底料，树丛，磨坊废弃物，城市木材废弃物，市政废弃物，伐木废弃物，森林疏伐废弃物，短期轮种木本作物，工业废弃物，小麦秸，燕麦秸，水稻秸，大麦秸，黑麦秸，亚麻秸，大豆壳，稻壳，水稻秸，玉米谷蛋白饲料，燕麦壳，甘蔗，玉米秸秆，玉米杆，玉米芯，玉米壳，柳枝稷，芒草，高粱，芸苔茎，大豆茎，牧场草，磨擦禾，狐尾草；甜菜浆，柑橘果实浆，种子壳，纤维素动物粪便，草坪修剪废弃物，棉花，海草，树木，软木材，硬木材，白杨，松树，灌木丛，草，小麦，小麦秸，甘蔗渣，玉米，玉米壳，玉米棒，玉米粒，来自谷粒的纤维，来自谷物湿磨或干磨的产物和副产物，市政固体废弃物，废纸，庭院废弃物，草本材料，农业残余物，林业残余物，市政固体废弃物，废纸，纸浆，造纸厂残余物，树枝，灌木，甘蔗，玉米，玉米壳，能源作物，森林，水果，鲜花，谷物，草，草本作物，叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，藤蔓，甜菜浆，小麦麸皮，燕麦壳，硬木材或软木材，由农业加工产生的有机废弃物材料，林业木材废弃物，或其中任意两种或更多种的组合。
表15中给出了源自木质纤维素的一些合适的糖组合物及其水解物的糖组合物的概况。所列出的木质纤维素包括：玉米芯、玉米纤维、稻壳、瓜皮(melon shells)、甜菜浆、小麦秸、甘蔗渣、木材、草和橄榄压制物(olive pressings)。
表15：来自木质纤维素材料的糖组合物的概况。Gal＝半乳糖，Xyl＝木糖，Ara＝阿拉伯糖，Man＝甘露糖，Glu＝谷氨酸盐/酯，Rham＝鼠李糖。给出了半乳糖百分比(％Gal)和文献来源。
表15表明：在这些木质纤维素中，大量糖以葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖的形式存在。葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖向发酵产物的转化因而具有巨大的经济重要性。甘露糖也在一些木质纤维素材料中存在，其通常比上述提到的糖以较低的量存在。因而甘露糖也被真核细胞转化是有利的。
预期可进一步操作处理本发明的真核细胞，以实现其他期望的特征或甚至更高的总乙醇产率。
通过在含有水解物的培养基上对真核细胞传代选择改进的真核细胞已导致具有增强的发酵率的改进的真核细胞。使用本发明的教导，人们可容易地得到此类改进的菌株。
含有戊糖的材料表示包含戊糖的任何基质，不管是液体还是固体。合适的含戊糖的材料包括木质纤维素生物质，比如玉米壳、木材、纸、农业副产物等等或多糖的水解物。
本文中使用的“水解物”表示已通过添加水而被解聚形成单糖和寡糖的多糖。通过含多糖的材料的酶促水解或酸水解，可产生水解物。
优选地，真核细胞能在与工业戊糖来源中发现的那些条件类似的条件下生长。当含有戊糖的材料可用真核细胞变体接种而没有过多的操作时，本发明的方法是最经济的。例如，制浆工业产生大量的纤维素废物。通过酸水解对纤维素糖化产生可用在发酵反应中的己糖和戊糖。但是，水解物或亚硫酸盐液含有天然存在于木材中的高浓度的亚硫酸盐和酚类抑制剂，抑制或防止大多数生物的生长。下文的例子描述了通过本发明的真核细胞的硬木材和软木材的酸水解物(亚硫酸盐废液)中的戊糖的发酵。可以合理地预期：能在亚硫酸盐废液中生长的真核细胞株预计能在几乎任何其他生物质水解物中生长。
增殖
本发明还涉及有氧增殖消耗乙酸盐/酯的真核细胞的方法，特别是有氧增殖真核细胞株的方法。
本文中的增殖是导致起始真核细胞群体增加的任何真核细胞生长的方法。增殖的主要目的是利用真核细胞作为活的生物体的自然繁殖能力来增加真核细胞群体。可存在其它的增殖原因，例如，如果使用干真核细胞，那么在使其生长之前，利用增殖来使真核细胞再水化和适应(condition)。新鲜真核细胞(活性干真核细胞或湿饼(wet cake))可被加入以直接启动增殖。
增殖条件对最佳的真核细胞生产和随后的发酵(例如将木质纤维素水解物发酵为乙醇)很关键。它们包括适当的碳源、通气、温度和营养添加。增殖罐的尺寸通常在(木质纤维素水解物向乙醇)发酵器尺寸的2％和5％之间。
在增殖过程中，真核细胞需要碳源。在本文中，碳源可以包含甘油、乙醇、乙酸盐/酯和/或糖(C6和C5糖)。也可以使用其他碳源。细胞壁生物合成以及蛋白质和能量的生产需要碳源。
增殖是有氧过程，因此增殖罐必须适当通气以维持一定水平的溶氧。通常通过在进入增殖罐的管道上安装空气引导器来实现适当的通气，所述引导器在增殖罐进料时和循环期间将空气引入增殖混合物中。增殖混合物保持溶氧的能力是加入空气的量和混合物的稠度的函数，这就是为什么经常以50:50至90:10之间的糊状物与水的比率加入水。“粘稠的”增殖混合物(80:20的糊状物与水的比率以及更高)经常需要加入压缩空气以弥补降低的保持溶氧的能力。增殖混合物中溶氧的量还是气泡大小的函数，因此一些乙醇工厂通过喷洒器加入空气，所述喷洒器与空气引导器相比产生较小气泡。伴随较低的葡萄糖，适当通气对促进有氧呼吸很重要，这与发酵的相对厌氧的环境不同。通气不足或高葡萄糖浓度的一个标志是增殖罐中提高的乙醇产率。
通常在增殖期间，真核细胞需要舒适的温度来生长和代谢，例如增殖反应器中的温度在25-40℃之间。较低温度通常导致较慢的代谢和减少的增殖，而较高温度能够引起压力化合物(stress compounds)的产生和减少的增殖。在一种实施方式中，增殖罐在室内并被保护不受盛夏或寒冬温度的伤害，因此维持在30-35℃范围内之间的最适温度通常不是难题。
可以像正常增殖真核细胞那样进行进一步增殖。
发酵
本发明涉及发酵根据本发明的真核细胞的方法，其中甘油产率提高，这在酿酒工业中是有利的。其还可导致增加的乙酸盐/酯水平降低和/或提高的发酵产物(例如，乙醇)产率，这在生物燃料工业中是有利的。
在一个实施方式中，根据本发明的真核细胞可以是发酵戊糖和葡萄糖的真核细胞，包括但不限于能够同时厌氧消耗戊糖和葡萄糖的那些细胞。在所述方法的一个实施方式中，含戊糖的材料包含木质纤维素材料的水解物。所述水解物可以是木质纤维素材料的酶促水解物。
发酵方法可以是需氧或厌氧的发酵方法。厌氧发酵方法在本文中被定义为这样的发酵方法，其在不存在氧时运行，或者其中基本不消耗氧，优选地消耗少于约5mmol/L/h、约2.5mmol/L/h或约1mmol/L/h，更优选地消耗0mmol/L/h(即氧消耗不可检出)，并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种用途。在不存在氧时，糖酵解和生物质形成中产生的NADH不能够被氧化性磷酸化反应氧化。为了解决这一问题，许多微生物使用丙酮酸或其衍生物之一作为电子和氢受体，从而再生NAD+。
因此，在一种优选的厌氧发酵方法中，丙酮酸被用作电子(和氢受体)，并且被还原成发酵产物如乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、苹果酸、延胡索酸、氨基酸和乙烯。
发酵方法优选地在对细胞而言最适的温度下进行。因此，对大部分真核细胞或真菌宿主细胞而言，发酵方法在低于约50℃、低于约42℃或低于约38℃的温度下进行。对真核细胞或丝状真菌宿主细胞而言，发酵方法优选地在低于约35、约33、约30或约28℃的温度且高于约20、约22或约25℃的温度下进行。
在所述方法中，基于木糖和/或葡萄糖的乙醇产率优选地为至少约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，约95％或约98％。乙醇产率在本文中被定义为理论最大产率的百分比。
本发明还涉及用于生产发酵产物的方法。
根据本发明的方法可以在需氧和厌氧条件下进行。在一种实施方式中，所述方法在微需气(micro-aerophilic)或氧受限的条件下进行。
厌氧发酵方法在本文中被定义为这样的发酵方法，其在不存在氧时进行，或其中基本不消耗氧，优选地消耗少于约5mmol/L/h、约2.5mmol/L/h或约1mmol/L/h，并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种作用。
氧受限的发酵方法是下述方法，其中氧消耗受到从气体到液体的氧转移的限制。氧受限的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际混合/物量转移特性决定。优选地，在氧受限条件下的方法中，氧消耗速率为至少约5.5mmol/L/h、更优选地至少约6mmol/L/h、如至少7mmol/L/h。本发明的方法可包括发酵产物的回收。
在一个优选的方法中，细胞发酵木糖以及葡萄糖二者，优选地同时发酵，在这种情况下优选地使用下述细胞，所述细胞对葡萄糖阻遏不敏感从而防止二次生长(diauxicgrowth)。除了作为碳源的木糖(和葡萄糖)来源以外，发酵培养基还会包含细胞生长所需的适当成分。用于微生物(如真核细胞)生长的发酵培养基的组成是本领域公知的。
发酵方法可以以分批、补料分批或连续的方式进行。也可以使用分离水解和发酵(SHF)方法或同时糖化和发酵(SSF)方法。也可以使用这些发酵方法模式的组合以获得最佳生产力。这些方法在下文更详细地描述。
SSF模式
对同时糖化和发酵(SSF)的模式而言，液化/水解或预糖化步骤的反应时间取决于实现期望产率(即纤维素向葡萄糖的转化产率)的时间。这类产率优选地尽可能高，优选地为60％或更多，65％或更多，70％或更多，75％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多，99％或更多，甚至99.5％或更多或99.9％或更多。
根据本发明，在SHF模式下实现了非常高的糖浓度，在SSF模式下实现了非常高的产物浓度(例如乙醇)。在SHF操作中，葡萄糖浓度是25g/L或更高，30g/L或更高，35g/L或更高，40g/L或更高，45g/L或更高，50g/L或更高，55g/L或更高，60g/L或更高，65g/L或更高，70g/L或更高，75g/L或更高，80g/L或更高，85g/L或更高，90g/L或更高，95g/L或更高，100g/L或更高，110g/L或更高，120g/L或更高，或者可以例如是25g/L-250g/L，30gl/L-200g/L，40g/L-200g/L，50g/L-200g/L，60g/L-200g/L，70g/L-200g/L，80g/L-200g/L，90g/L-200g/L。
SSF模式中的产物浓度
在SSF操作中，产物浓度(g/L)取决于生产的葡萄糖量，但因为在SSF中糖被转化成产物，所以这是不可见的，并且产物浓度与潜在的葡萄糖浓度乘以理论最大产率(以gr产物/克葡萄糖计的Yps最大)相关。
发酵产物的理论最大产率(以gr产物/克葡萄糖计的Yps最大)可源自生物化学教科书。对乙醇而言，1摩尔葡萄糖(180gr)根据真核细胞中正常的糖酵解发酵通路产生2摩尔乙醇(＝2x46＝92gr乙醇)。因此，基于葡萄糖的乙醇的理论最大产率为92/180＝0.511gr乙醇/gr葡萄糖。
对丁醇(MW 74gr/摩尔)或异丁醇而言，理论最大产率是每摩尔葡萄糖1摩尔丁醇。因此，(异)丁醇的Yps最大＝74/180＝0.411gr(异)丁醇/gr葡萄糖。
对乳酸而言，纯乳酸发酵(homolactic fermentation)的发酵产率是每摩尔葡萄糖2摩尔乳酸(MW＝90gr/摩尔)。根据所述化学计量法，Yps最大＝1gr乳酸/gr葡萄糖。
对于C5/C6发酵可以进行类似的计算，在C5/C6发酵中，除了葡萄糖之外还包括戊糖，例如木糖和/或阿拉伯糖。
对其他发酵产物而言，可以进行类似的计算。
SSF模式
在SSF操作中，产物浓度为25g*Yps g/L/L或更高，30*Yps g/L或更高，35g*Yps/L或更高，40*Yps g/L或更高，45*Yps g/L或更高，50*Yps g/L或更高，55*Yps g/L或更高，60*Yps g/L或更高，65*Yps g/L或更高，70*Yps g/L或更高，75*Yps g/L或更高，80*Yps g/L或更高，85*Yps g/L或更高，90*Yps g/L或更高，95*Yps g/L或更高，100*Yps g/L或更高，110*Yps g/L或更高，120g/L*Yps或更高，或者可以例如是25*Yps g/L-250*Yps g/L，30*Yps gl/L-200*Yps g/L，40*Yps g/L-200*Yps g/L，50*Yps g/L-200*Yps g/L，60*Yps g/L-200*Yps g/L，70*Yps g/L-200*Yps g/L，80*Yps g/L-200*Yps g/L，90*Yps g/L，80*Ypsg/L-200*Yps g/L。
因此，本发明提供了用于制备发酵产物的方法，所述方法包括：
a.使用本文所述的方法降解木质纤维素；和
b.发酵所得到的材料，
从而制备发酵产物。
发酵产物
本发明的发酵产物可以是任何有用的产物。在一种实施方式中，其为选自以下的产物：乙醇，正丁醇，2-丁醇，异丁醇，乳酸，3-羟基-丙酸，丙烯酸，乙酸，琥珀酸，富马酸，苹果酸，衣康酸，马来酸，柠檬酸，己二酸，氨基酸例如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸，1,3-丙二醇，乙烯，甘油，β-内酰胺抗生素和头孢菌素，维生素，药物，动物饲料补充剂，特种化学品，化学原料，塑料，溶剂，燃料包括生物燃料和沼气或有机聚合物，和工业酶例如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂合酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。
发酵产物的回收
对发酵产物的回收而言，使用现有的技术。对不同的发酵产物而言，适用不同的回收方法。现有的从水性混合物中回收乙醇的方法通常使用分级和吸附技术。例如，可以使用发酵醪蒸馏器(beer still)加工在水性混合物中含有乙醇的发酵产物，以生产富集的含有乙醇的混合物，所述富集的含有乙醇的混合物随后进行分级(例如分级分馏或其他类似的技术)。接着，含有最高浓度乙醇的级分可以经过吸附剂，从乙醇中去除大部分(如果不是所有的话)剩余的水。在一个实施方式中，除了回收发酵产物之外，还可以回收酵母。
以下非限制性实施例旨在仅仅是示例性的。
实施例
实施例1
1.材料和方法
1.1.菌株和维护
本申请中使用的所有S.cerevisiae菌株(表16)均基于CEN.PK谱系(van Dijken等，2000)。在合成培养基(Verduyn等，1992)或YP培养基(10g L-1Bacto酵母提取物，20g L- 1Bacto蛋白胨)中增殖S.cerevisiae的储备培养物。在上述培养基中补充20g L-1葡萄糖作为碳源。在补充有100μg ml-1氨苄青霉素或50μg ml-1卡那霉素的LB培养基(10g L-1Bacto胰蛋白胨，5g L-1Bacto酵母提取物，5g L-1NaCl)中增殖E.coli DH5a的储备培养物。向稳定期培养物中加入30％v/v甘油后，将冷冻的菌株储备物储存在-80℃。
表16.本研究中使用的S.cerevisiae菌株
1.2.质粒和盒构建
使用嵌合CRISPR/Cas9基因组编辑系统进行酵母遗传修饰(DiCarlo等，2013)。质粒pMEL11(Mans等，2015)被用于GND1、GND2和ALD6的单个缺失。质粒pROS11(Mans等，2015)被用于GPD1和GPD2的单个缺失。基于(DiCarlo等，2013)提供的序列表鉴定每个基因中独特的CRISPR/Cas9靶序列。本文中使用的引物是SEQ ID NO's 10-46，其中给出了引物编号。分别使用引物组合5792-5980和5793-5793(Sigma-Aldrich)PCR扩增pMEL11和pROS11的质粒骨架。通过PCR获得表达20bp gRNA靶向序列的质粒插入序列，其中利用引物组合5979-7365(对于GND1)、5979-7231(对于GND2)和5979-7610(对于ALD6)，使用pMEL11作为模板。通过PCR获得表达靶向GPD1和GPD2的gRNA序列的插入序列，其中分别使用引物组合6965-6965和6966-6966，利用pROS11作为模板。使用Hot Start II High Fidelity DNAPolymerase(Thermo Scientific,Waltham,MA)，根据制造商的指南，进行用于构建所有质粒和盒的PCR扩增。在预组装质粒的情况下，使用Gibson Cloning kit(NewEngland Biolabs,MA)；根据供应商的流程进行反应(规模缩减至10μl)。产生的PCR片段的5'端和3'端的同源序列使得能够进行组装。pMEL11骨架与编码靶向GND1和GND2的gRNA的插入序列的组装分别产生质粒pUDR122和pUDR123。在每种情况下，在Gene PulserXcellElectroporation System(Biorad)中，使用1μl Gibson组装混合物进行E.coli DH5a细胞的电穿孔。使用Sigma GenElute Plasmid试剂盒(Sigma-Aldrich)从E.coli培养物中再次分离质粒。通过诊断PCR(Thermo Scientific)或限制性分析来验证质粒。使用的所有质粒的完整列表可见于表17中。在每种情况下，不预组装表达ALD6、GPD1和GPD2gRNA的质粒；将骨架和插入片段直接转化到酵母中，并在体内组装质粒。
基于高表达糖酵解基因的密码子组成，对Methylobacillus flagellatus KTgndA(AF167580_1)、Gluconobacter oxydans 621H gox1705(AAW61445.1)和Bradyrhizobium japonicum USDA 1106pgdh的序列进行密码子优化。在B.japonicum的情况下，6pgdh的序列是通过将其翻译的基因组序列(NC_004463.1)与其他两种蛋白(相似性分别为45％和57％)进行比对而获得的。上述基因的酵母整合盒侧翼为TPI1启动子和CYC1终止子。包括启动子、基因和终止子序列的完整盒由GeneArt GmbH(Regensburg，德国)合成并在pMK-RQ载体(GeneArt)中递送。在E.coli中克隆后，再次分离质粒并将其用作PCR扩增整合盒的模板。通过PCR获得整合盒TPI1p-gndA-CYC1t、TPI1p-6pgdH-CYC1t和TPI1p-gox1705-CYC1t，其中使用引物组合7380-7381并分别使用质粒pMK-RQ-gndA、pMK-RQ-6pgdH和pMK-RQ-gox1705作为模板。对于gox1705蛋白，Km NADP+为440μM且Km NAD+为64μM，因此比值Km NADP+/Km NAD+＝6.88。gox1705蛋白是NAD+依赖性的。
通过XhoI/SpeI限制性酶切从pBOL199获得S.cerevisiae密码对优化的eutE，并将其连接在pAG426GPD-ccdB(Addgene，Cambridge，MA)中，从而产生了多拷贝质粒pUDE197。对于整合盒制备，使用SacI/EagI切割pRS406(Addgene，Cambridge，MA)作为质粒骨架，并将其与来自pUDE197的通过相同限制性模式获得的TDH3p-eutE-CYC1t盒连接，从而产生了质粒pUDI076。
使用引物组合7991-7992并使用质粒pUDI076作为模板来获得整合盒TDH3p-eutE-CYC1t。设计上述引物以在PCR产物的5'端和3'端添加60bp DNA序列，其对应于紧邻S.cerevisiae基因组中靶标基因座的开放阅读框的上游和下游的序列。TPI1p-gndA-CYC1t、TPI1p-6pgdH-CYC1t和TPI1p-gox1705-CYC1t表达盒靶向GND1的基因座，TDH3p-eutE-CYC1t盒靶向GPD2的基因座。
表17.本研究中使用的质粒
1.3.菌株构建
使用乙酸锂方法(Gietz和Woods，2002)进行酵母转化。如(Solis-Escalante等，2013)中所述，在补充有20g L-1葡萄糖并补充有乙酰胺作为唯一氮源的合成培养基琼脂板(2％Bacto Agar,Difco)(Verduyn等，1992)上进行突变体选择。在每种情况下，通过诊断PCR确认成功的整合，其中使用在靶向基因座外以及在整合盒的ORF内结合的引物组合。如(Solis-Escalante等，2013)中所述进行每次转化后的质粒回收。
凭借共转化gRNA表达质粒pUDR123和修复寡核苷酸7299-7300，通过基于无标记CRISPR/Cas9的GND2敲除获得菌株IMK643。将TPI1p-gndA-CYC1t、TPI1p-6pgdH-CYC1t和TPI1p-gox1705-CYC1t整合盒与gRNA表达质粒pUDR122一起转化到IMK643中，从而分别产生了菌株IMX705、IMX706和IMX707。将pMEL11骨架、靶向ALD6的gRNA表达质粒插入物和修复寡核苷酸7608-7609共转化到菌株IMX705和IMX585中分别产生了菌株IMX756和IMX899，其中ALD6缺失而标记未整合。将pROS11骨架、靶向GPD2的gRNA表达质粒插入物和TDH3p-eutE-CYC1t整合盒共转化到菌株IMX756和IMX585中分别产生了菌株IMX817和IMX883。通过共转化pROS11骨架、靶向GPD1的gRNA表达质粒插入物和修复寡核苷酸6967-6968进行菌株IMX817和IMX883中GPD1的无标记缺失，从而分别产生了菌株IMX860和IMX888。
1.4.培养和培养基
在含有100ml补充有2g L-1葡萄糖的合成基本培养基(Verduyn等，1992)的500ml烧瓶中进行需氧摇瓶培养。通过添加2M KOH将pH值调节至6，然后通过在120℃下高压灭菌20分钟进行灭菌。将葡萄糖溶液单独在110℃下高压灭菌20分钟并加入无菌烧瓶中。将维生素溶液单独过滤灭菌并加入无菌烧瓶中。使培养物在30℃和200rpm下生长。在每种情况下，从冷冻储备物接种初始预培养摇瓶。8-12小时后，从初始烧瓶接种新鲜的预培养瓶。以这种方式制备的培养物被用于需氧摇瓶实验中或用作厌氧发酵的接种物。从指数生长的预培养瓶将生物反应器接种至OD值为0.2-0.3。在2L Applikon生物反应器(Applikon，Schiedam，NL)中进行厌氧分批发酵，工作体积为1L。所有厌氧分批发酵均在合成基本培养基(20g L-1葡萄糖)中进行，所述合成基本培养基以与烧瓶培养基相同的方式制备。厌氧生长培养基另外补充有0.2g L-1无菌消泡剂C(Sigma-Aldrich)、麦角甾醇(10g L-1)和吐温80(420mg L-1)，分开加入。在30℃下进行发酵并以800rpm搅拌。氮气(<10ppm氧气)被用于鼓泡(0.5L min-1)。通过自动添加2M KOH将发酵pH维持在5。生物反应器配备有Nonprene管和Viton O形环，以尽量减少培养基中的氧扩散。所有发酵都重复(in duplicate)进行。
1.5.分析方法
使用Libra S11分光光度计(Biochrom，Cambridge，UK)测定660nm处的光密度。如(Medina等，2010)中所述进行尾气分析、干重测量和培养上清液的HPLC分析，包括针对乙醇蒸发的校正。
1.6.酶活性测定
如前所述(Kozak等，2014)，制备用于体外测定酶活性的无细胞提取物。实验在30℃下进行；通过监测340nm处NADH的氧化(对于EutE)或NAD+/NADP+的还原(对于6PGDH)来测量酶活性。总体积为1ml的NADP+连接的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性实验混合物含有50mMTris-HCl(pH 8.0)、5mM MgCl2、0.4mM NADP+和50μl或100μl细胞提取物。通过添加5mM葡萄糖-6-磷酸盐/酯来开始反应。总体积为1ml的NAD+/NADP+连接的6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性实验混合物含有50mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM MgCl2、0.4mM NAD+/NADP+和50μl或100μl细胞提取物。通过添加5mM 6-磷酸葡糖酸盐/酯来开始反应。所有实验都重复进行，反应速率与添加的细胞提取物的量成正比。
1.7异源NAD+依赖性6-磷酸葡糖酸脱氢酶的表达
为了将6-磷酸葡糖酸脱氢酶的辅因子特异性从NADP+变为NAD+，缺失分别编码S.cerevisiae中6-磷酸葡糖酸脱氢酶的主要同种型和次要同种型的GND1和GND2。将编码NAD+依赖性(M.flagellatus和B.japonicum)或NAD+偏好(G.oxydans)酶的异源基因针对在S.cerevisiae中表达进行密码子优化并整合在GND1的基因座中，受强组成型启动子TPI1控制。在需氧合成培养基摇瓶(20g L-1葡萄糖)中进行的工程菌株的生长实验并未表明：与亲本菌株IMX585相比，过表达异源基因对最大比生长速率有显著影响(生长速率为亲本菌株的约95％)，例外是IMX706，其表达来自B.japonicum的酶(表18)。
表18.在30℃、200rpm的含有20g L-1葡萄糖的需氧合成培养基摇瓶(pH 6)中获得的平均比生长速率(μ)(实验重复进行，指出了重复的平均偏差)。
菌株 相关基因型 平均值μ(h-1)
IMX585 GND1GND2 0.38±0.01
IMX705 gnd2Δgnd1:gndA 0.36±0.00
IMX706 gnd2Δgnd1::6pgdh 0.28±0.01
IMX707 gnd2Δgnd1:gox1705 0.36±0.00
为了研究S.cerevisiae中异源6-磷酸葡糖酸脱氢酶的功能性表达，在无细胞提取物中进行酶促试验，所述无细胞提取物是由工程菌株的指数生长需氧摇瓶培养物(在OD为4-5时收获)制备的。进行试验以量化葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性，以及NAD+和NADP+依赖性6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性。进行葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的测定作为无细胞提取物的品质检查，酶活性测定显示了所有产生的菌株中有功能的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶(图1)。所有工程菌株均显示出高NAD+依赖性和低残留NADP+依赖性6PGDH活性，这与预期的异源酶的功能表达以及GND1和GND2的缺失一致。表达来自Methylobacillusflagellatus的gndA的菌株IMX705显示出最高的体外NAD+依赖性6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性(0.49±0.1μmol mg生物质-1min-1)。
此外，与对照菌株IMX585相比，所有工程菌株均显示出NAD+/NADP+连接的6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性的比值显著提高(表18)。除了最高的体外NAD+依赖性6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性之外，菌株IMX705还显示出所有工程菌株中最高的比值(46±10)。
表18A.来自在OD＝4到5时收获的指数生长摇瓶培养物的无细胞提取物的NAD+/NADP+连接特异性6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性比值。培养物在补充有20g L-1葡萄糖、pH 6、30℃、200rpm的合成培养基中生长。数据来自独立的重复实验，误差线表示重复的平均偏差。
菌株 相关基因型 NAD+/NADP+连接的活性比值
IMX585 GND1GND2 <0.01
IMX705 gnd2Δgnd1::gndA 46±10
IMX706 gnd2Δgnd1::6pgdh 5±0.2
IMX707 gnd2Δgnd1:gox1705 11±0.5
酶促试验结果指出表达gndA的菌株是表现最好的菌株；为此，进一步表征菌株IMX705。
1.8厌氧分批实验
酶促试验结果指出：6-磷酸葡糖酸脱氢酶的辅因子特异性成功从NADP+变为NAD+。
为了研究6-磷酸葡糖酸脱氢酶的辅因子特异性变化对S.cerevisiae的厌氧生理学的影响，在生物反应器中进行厌氧分批实验。使菌株IMX585(GND1GND2)和IMX705(gnd2Δgnd1::gndA)在补充有20g L-1葡萄糖的合成培养基中生长。工程菌株IMX705的生长速率与参照菌株的生长速率相似(IMX585的约95％(表19))。另外，糖消耗曲线类似，葡萄糖在约12小时后耗尽(图2)。与IMX585相比，利用菌株IMX705的厌氧批次导致基于葡萄糖的甘油产率增加19.8％(表19)。此外，利用菌株IMX705的发酵中单位生物质形成的甘油量比利用菌株IMX585的发酵中单位生物质形成的甘油量高24.1％。
与参照菌株IMX585相比，在菌株IMX705的厌氧发酵中，观察到每单位形成的生物质对应产生的细胞外乙酸盐/酯增加约9％(表19)。细胞外乙酸盐/酯的增加可能是细胞溶质NADP+依赖性醛脱氢酶上调的结果，所述NADP+依赖性醛脱氢酶催化乙醛+NADP+→乙酸盐/酯+NADPH+H+反应，由ALD6编码。除了磷酸戊糖通路的氧化分支之外，Ald6p为细胞的细胞溶质中NADPH再生提供了另一条主要途径。已经证明：在zwf1Δ菌株中过表达ALD6会导致基于葡萄糖的生长速率增加；此外，zwf1Δald6Δ双重突变体不能存活。此外，在菌株IMX705中的甘油形成通路已被乙酸还原通路替代的情况下，Ald6p可通过参与细胞溶质中ATP驱动的转氢酶样循环而干扰细胞溶质中额外NADH的产生(图3)。在这个循环中，通过Acs1p和Acs2p催化的反应将1mol乙酸盐/酯转化为1mol乙酰基-CoA，净代价(net expense)为2mol ATP。然后，通过乙酰化乙醛脱氢酶催化的反应将1mol乙酰-CoA还原成1mol乙醛，同时将1molNADH氧化为NAD+。然后，可通过Ald6p将1mol乙醛氧化回1mol乙酸盐/酯，同时将1mol NADP+还原成NADPH。以这种方式，两种辅因子都可以以ATP为代价而再生。去除由Ald6p催化的反应能够防止发生这种潜在的循环。
在野生型菌株中，由Ald6p催化的反应对于NADPH产生以及乙酰-CoA的前体乙酸盐/酯的形成是重要的。在ald6Δ菌株IMX756中，乙酸盐/酯可能通过由细胞溶质Ald2p和Ald3p或由线粒体Ald4p和Ald5p同种型催化的反应形成。Ald2p和Ald3p是NAD+依赖性的，通过由这些酶催化的反应形成生长所需的乙酸盐/酯可能导致额外形成细胞溶质NADH。Ald4p可利用NAD+和NADP+二者作为辅因子。烟酰胺辅因子通常不能跨越内部线粒体膜。在S.cerevisiae的厌氧生长培养物中，通过由Ald4p催化的乙酸盐/酯形成产生的NADH的再氧化需要跨越线粒体膜转移还原当量。这可以例如通过线粒体穿梭系统实现，例如乙醛-乙醇穿梭，其将还原当量转移至细胞溶质NAD+。过量的细胞溶质NADH然后可通过增加的甘油形成而被再氧化。
为了去除由Ald6p催化的替代性NADPH再生途径，在菌株IMX705中缺失ALD6，从而产生了菌株IMX756。我们发现：ALD6缺失可能有益于产生小号乙酸盐/酯的菌株，因为它可以去除细胞的细胞溶质中由Acs1p/Acs2p、EutEp和Ald6p产生的潜在的ATP驱动的转氢酶样反应(图4)。为了研究Ald6p对野生型S.cerevisiae的厌氧生理学的影响，在菌株IMX585中也缺失ALD6，从而产生了菌株IMX899。
在与利用菌株IMX585和IMX705进行的批次相同的条件下，在厌氧分批实验中表征菌株IMX899和IMX756。IMX899和IMX756的生长速率为参照菌株IMX585的生长速率的约90％和81％。在利用两种菌株的发酵的早期阶段，细胞外乙酸盐/酯的形成受到严重影响；在发酵的稍后阶段，其浓度降至低于检测水平(数据未显示)。与参照菌株IMX585相比，利用菌株IMX899的厌氧批次导致基于葡萄糖的甘油产率增加1％，并且单位生物质形成的甘油增加5.3％(表19A)，从而指示缺失对产生额外的细胞溶质NADH的微小影响。然而，与参照菌株IMX585相比，利用菌株IMX756(其中ALD6缺失与gndA的过表达以及GND1和GND2的缺失相结合)的发酵导致基于葡萄糖的甘油产率提高39％，并且每单位形成的生物质对应形成的甘油增加55％(表19A)。
该研究提供了可以在S.cerevisiae中功能性表达不同的异源NAD+依赖性6-磷酸葡糖酸脱氢酶这一原理的证据。此外，在gnd1Δgnd2Δ菌株中过表达gndA导致每单位形成的生物质所对应的甘油形成增加，这表明每单位形成的生物质所对应的细胞溶质NADH形成增加。在菌株IMX705中进一步缺失ALD6显示：与对照相比，在突变菌株的厌氧培养物中，基于葡萄糖的甘油产率以及每单位形成的生物质所对应的甘油形成明显提高。工程策略仅导致突变菌株的最大比生长速率略微下降。这表明：该策略可直接应用于工业菌株，并可能用于增加水解物中的乙酸消耗。
表19.最大比生长速率(μ)、主要产物产率以及甘油和乙酸盐/酯形成与所形成的生物质的比值。数据获自在生物反应器中利用菌株IMX585、IMX705、IMX899和IMX756进行的厌氧分批发酵。在补充有20g L-1葡萄糖的合成培养基中进行发酵。在pH 5，鼓吹500ml min-1N2，30℃的条件下进行各批次。由在指数生长期收集的数据计算产率和比值，作为测量值的曲线的斜率。乙醇产率的计算基于针对蒸发校正的数据。数据表示为独立重复实验的平均值。
计算时考虑乙醇蒸发，用mmol代替g进行比值计算，并添加IMX899的数据，数据列于表19A中：
表19A
实施例2
2.1 6PGDH的辅因子特异性变化与乙酸盐/酯还原通路相结合
在厌氧分批发酵中，与对照菌株IMX585相比，菌株IMX756中6-磷酸葡糖酸脱氢酶的辅因子特异性从NADP+到NAD+和ALD6缺失的组合变化导致基于葡萄糖的甘油产率提高37.7％。该结果与以下情况下预计的基于葡萄糖的甘油产率提高40.5％一致：基于所提出的策略在细胞溶质中产生过量NADH并且甘油形成通路仍然完整。作为下一步，研究了用乙酸盐/酯还原通路替代甘油形成通路对以IMX756作为亲本的菌株可消耗的乙酸盐/酯的量的影响。
为了用乙酸盐/酯还原通路替代甘油形成通路，在菌株IMX756中缺失GPD1和GPD2(编码甘油-3-磷酸脱氢酶)，并过表达eutE(编码E.coli乙酰化乙醛脱氢酶)，从而产生了菌株IMX860。此外，在IMX585中缺失GPD1和GPD2并过表达eutE产生了乙酸盐/酯还原对照菌株IMX888。
在乙酸盐/酯还原菌株IMX888中，6-磷酸葡糖酸脱氢酶是NADP+依赖性的。基于本文中进行的理论分析，在利用葡萄糖作为碳源的厌氧发酵中，预期该菌株消耗5.51mmol(乙酸盐/酯)/g所形成的生物质。在其中辅因子特异性改变的菌株IMX860中，预期消耗8.75mmol(乙酸盐/酯)/g所形成的生物质。
在这个实验中，研究了在这种情况下提出的工程策略对厌氧乙酸盐/酯消耗的影响。使菌株IMX860和IMX888在补充有20g L-1葡萄糖和3g L-1乙酸的生物反应器中的厌氧发酵中生长。鼓泡、pH控制以及温度与利用菌株IMX585、IMX705和IMX756进行的批次相同。基于理论分析，与IMX888相比，预期IMX860菌株中单位所形成生物质消耗的乙酸盐/酯增加59％。此外，菌株IMX860中的工程策略应该导致基于葡萄糖的乙醇产率比菌株IMX888理论上提高3％，比野生型菌株理论上提高22.4％。结果在表20、20A和21中给出。对于表20A，计算菌株IMX888(使用Medina等，2010中的策略)与菌株IMX860(使用本实施例中的策略)之间基于葡萄糖和单位所形成生物质的乙酸盐/酯消耗增加，从计算值中减去对照菌株IMX585(其不包含eutE)的表观消耗。
表20.最大比生长速率、主要产物产率以及消耗的乙酸盐/酯与消耗的葡萄糖和形成的生物质的比值。数据获自在生物反应器中利用菌株IMX585、IMX888和IMX860的进行的厌氧分批发酵。在补充有20g L-1葡萄糖和3g L-1乙酸的合成培养基中进行发酵。在pH 5，鼓吹500ml min-1N2，30℃的条件下进行各批次。由在指数生长期收集的数据计算产率和比值。乙醇产率的计算基于针对蒸发校正的数据。数据表示为独立重复实验的平均值。
计算时考虑乙醇蒸发，用mmol代替g进行比值计算，并添加IMX899和IMX860的甘油/葡萄糖(g g-1)数据，数据列于表20A中。
表20A
2.2.G6PDH的辅因子特异性改变对产生额外的细胞溶质NADH和乙酸盐还原通路的影响
最近，在古细菌Haloferax volcanii中表征了一种名为azf的NAD+依赖性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Pickl 2015)。在该实施例中，为了研究葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的辅因子从NADP+变为NAD+对每单位形成的生物质所对应的额外细胞溶质NADH产生的影响，在S.cerevisiae zwf1Δ背景中过表达azf。基于理论分析和本申请中进行的实验，预期与6-磷酸葡糖酸脱氢酶的辅因子变化相同的理论影响。
基于高表达糖酵解基因的组成(Wiedemann和Boles，2008)，使用来自Haloferaxvolcanii DS2的Azfp(ADE03728.1)的蛋白质序列来产生酵母密码子优化版本的azf。合成受强组成型糖酵解启动子控制的过表达盒并克隆到质粒中。该质粒被用作产生PCR产物的模板，其中过表达盒侧翼是与ZWF1的紧邻上游区域和下游区域同源的60bp序列。然后利用CRISPR/Cas9系统，使用PCR产物作为修复片段，缺失ZWF1的基因座，从而产生了zwf1::azf菌株。
如前所述(Pickl和2015)进行zwf1::azf菌株中Azfp酶活性的测定。此外，以与本申请中菌株IMX705、IMX706和IMX707的测定方法相同的方式研究用azf替代ZWF1对工程菌株的需氧最大比生长速率的影响。
所产生的zwf1::azf菌株的特征在于：相较于其亲本菌株，以及菌株IMX705，在含有20g L-1葡萄糖作为碳源的生物反应器中的厌氧发酵。预期该菌株与菌株IMX705在基于葡萄糖的甘油产率和基于所形成生物质的甘油形成方面性能类似，并且与其亲本野生型菌株相比，基于葡萄糖的甘油产率提高至少22.6％。
使用与构建菌株IMX888的情况相同的步骤，通过缺失GPD1和GPD2以及在GPD2基因座中引入eutE来进一步工程化zwf1::azf菌株。所得菌株的相关基因型为gpd1Δgpd2::eutE zwf1::azf。
在后续实验中，研究了这种情况下提出的工程策略对厌氧乙酸盐/酯消耗的影响。使gpd1Δgpd2::eutE zwf1::azf菌株在补充有20g L-1葡萄糖和3g L-1乙酸的生物反应器中的厌氧发酵中生长。鼓泡、pH控制以及温度与利用菌株IMX585、IMX705和IMX756进行的批次相同。基于理论分析并且类似于菌株IMX888，预期：与乙酸盐/酯还原菌株IMX860(其中没有改变葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或6-磷酸葡糖酸脱氢酶的辅因子)相比，该菌株中每单位形成的生物质对应消耗的乙酸盐/酯增加59％。
2.2 G6PDH和6PGDH的辅因子特异性同时改变对产生额外的细胞溶质NADH和乙酸还原通路的影响
为了研究葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶的辅因子同时从NADP+变为NAD+对每单位形成的生物质对应的额外细胞溶质NADH产生的影响，在zwf1Δgnd1Δgnd2Δ菌株中过表达azf和gndA。
如先前在本申请中所述产生azf过表达盒。菌株构建与关于zwf1::azf菌株所述的菌株构建相同。在这种情况下，菌株IMX705被用作亲本。所得菌株的相关基因型为gnd2Δgnd1::gndA zwf1::azf。
如前所述(Pickl和2015)进行zwf1::azf菌株中Azfp酶活性的测定。如本申请所述进行GndAp酶活性的测定。
所产生的gnd2Δgnd1::gndA zwf1::azf菌株的特征在于：相较于其亲本菌株IMX705，以及菌株IMX585(无辅因子特异性变化)，在含有20g L-1葡萄糖作为碳源的生物反应器中的厌氧发酵。在这种情况下，NADPH主要通过Ald6p催化的反应产生。每单位形成的生物质所对应产生的额外NADH的量由通过戊糖磷酸通路的氧化部分的葡萄糖的通量决定。在这种情况下，假定对NAD+具有100％特异性，通过磷酸戊糖通路的氧化部分的通量不再与NADPH产生偶联。在酶优选使用NAD+，但也显示出对NADP+的活性的情况下，通过该通路的通量仍可与NADPH提供相关。预期：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶二者的辅因子都变化与任一个辅因子单独变化相比，会导致每单位形成的生物质对应的细胞溶质NADH形成额外增加。
使用与构建菌株IMX888的情况相同的步骤，通过缺失GPD1和GPD2以及在GPD2基因座中引入eutE来进一步工程化gnd2Δgnd1::gndA zwf1::azf菌株。所得菌株的相关基因型为gpd1Δgpd2::eutE gnd2Δgnd1::gndA zwf1::azf。
在后续实验中，研究了这种情况下提出的工程策略对厌氧乙酸盐/酯消耗的影响。使gpd1Δgpd2::eutE gnd2Δgnd1::gndA zwf1::azf菌株在补充有20g L-1葡萄糖和3g L-1乙酸的生物反应器中的厌氧发酵中生长。鼓泡、pH控制以及温度与利用菌株IMX585、IMX705和IMX756进行的批次相同。在这种情况下，预期与菌株IMX860和gpd1Δgpd2::eutE zwf1::azf相比，每单位形成的生物质对应的乙酸盐/酯消耗增加。
表21中总结了如实施例中所示的根据本发明菌株的优点。
表21：与野生型菌株相比，对于乙酸盐/酯情景(生物燃料)和甘油情景(酒)，乙醇和甘油的产率提高和消耗的和乙酸盐/酯以及理论计算值(括号内)。
从表21可以明显看出：可以获得实质性的优点。
对于生物燃料工业中的应用，乙酸盐/酯消耗增加28％且乙醇产率提高1.3％是有利的。
对于酿酒工业中的应用，甘油产率增加达到38％且乙醇产量相同或较低是有利的。
基于表19A和20A的数据和计算，如同总结表21，以下为总结表21A：
表21A
从表21A可以明显看出：可以获得实质性的优点。
对于生物燃料工业中的应用，每克所形成生物质对应的乙酸盐/酯消耗增加44％且基于葡萄糖的乙醇产率增加3％是有利的。
对于酿酒工业中的应用，甘油产率增加达到39％且乙醇产量相同或较低是有利的。
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Solis-Escalante D,Kuijpers NGA,Bongaerts N,Bolat I,Bosman L,Pronk JT,Daran JM,Daran-Lapujade P.2013.amdSYM,a new dominant recyclable markercassette for Saccharomyces cerevisiae.FEMS Yeast Res 13:126-139.(Solis-Escalante et al.2013)；
DiCarlo JE,Norville JE,Mali P,Rios X,Aach J,Church GM.2013.Genomeengineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.NucleicAcids Research1-8.(DiCarlo et al.2013)；
Maris R,van Rossum HM,Wijsman M,Backx A,Kuijpers NG,van den Broek M,Daran-Lapujade P,Pronk JT,van Maris AJ,Daran JM.2015.CRISPR/Cas9:a molecularSwiss army knife for simultaneous introduction of multiple geneticmodifications in Saccharomyces cerevisiae.FEMS Yeast Research；15:fov004(Mariset al.2015)；
Pickl et al.FEMS Biotechnology Letters,Volume 361,Issue 1,p.76–83,December 2014:Identification and characterization of 2-keto-3-deoxygluconatekinase and 2-keto-3-deoxygalactonate kinase in the haloarchaeon Haloferaxvolcanii(Pickl and 2015).
序列表
<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司
<120> 发酵产物产生增加的真核细胞
<130> 31463-WO-PCT
<150> EP15188645.4
<151> 2015-10-06
<160> 53
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 1819
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gndA cassette
<400> 1
gcgataccct gcgatcttcg agacctaact acatagtgtt taaagattac ggatatttaa 60
cttacttaga ataatgccat ttttttgagt tataataatc ctacgttagt gtgagcggga 120
tttaaactgt gaggacctta atacattcag acacttctgc ggtatcaccc tacttattcc 180
cttcgagatt atatctagga acccatcagg ttggtggaag attacccgtt ctaagacttt 240
tcagcttcct ctattgatgt tacacctgga cacccctttt ctggcatcca gtttttaatc 300
ttcagtggca tgtgagattc tccgaaatta attaaagcaa tcacacaatt ctctcggata 360
ccacctcggt tgaaactgac aggtggtttg ttacgcatgc taatgcaaag gagcctatat 420
acctttggct cggctgctgt aacagggaat ataaagggca gcataattta ggagtttagt 480
gaacttgcaa catttactat tttcccttct tacgtaaata tttttctttt taattctaaa 540
tcaatctttt tcaatttttt gtttgtattc ttttcttgct taaatctata actacaaaaa 600
acacatacat aaactaaaaa tgaagttggc tattattggt ttgggtaaga tgggtggtaa 660
catggctaga agattgttga agcacggtat tgaagttgtt ggtttcgact tcaaccaaga 720
cgctgttaac caaatttctt tgaccaacgg tatgattcca gcttcttctg ttgaagacgc 780
tgtttctaag ttgtctggtg aaccaagaaa gattgtttgg attatgttgc catctggtga 840
cattaccgaa aaccaaatta aggacttggt tccattgttg tctaagggtg acattattgt 900
tgacggtggt aactctaact acaagcactc tcaaagaaga ggtgcttggt tggctgaaca 960
cggtattgaa ttcattgact gtggtacctc tggtggtatt tggggtttgg acaacggtta 1020
ctgtttgatg tacggtggtt ctaaggacgc tgctgacgct gttgttccaa ttatgcaagc 1080
tttggctcac gctgacagag gttgggctca cgttggtcca gttggttctg gtcacttcac 1140
caagatgatt cacaacggta ttgaatacgg tatgatgcaa gctttcgctg aaggtttgga 1200
cttgttgaag ggtaaggaag aattcaactt ggacttggct caaattaccg aattgtggag 1260
acacggttct gttgttagat cttggttgtt ggacttgacc gctgaagctt tggctcacga 1320
ccaagaattg tctgctattg ctccatacgt tgctgactct ggtgaaggta gatggaccgt 1380
tgttgaagct gttgaccaag gtgttgctgc tccagttttg accttggctt tgcaaatgag 1440
attcgcttct caagaagaca ccggttactc ttacaagttg ttgtctatga tgagaaacgc 1500
tttcggtggt cacgctgtta agaccaagta acaggcccct tttcctttgt cgatatcatg 1560
taattagtta tgtcacgctt acattcacgc cctcccccca catccgctct aaccgaaaag 1620
gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc cctatttatt tttttatagt tatgttagta 1680
ttaagaacgt tatttatatt tcaaattttt cttttttttc tgtacaaacg cgtgtacgca 1740
tgtaacatta tactgaaaac cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa ggctttaatt 1800
tgcttcgcta atctgcgcg 1819
<210> 2
<211> 303
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GndA protein (Methylobacillus flagellates)
<400> 2
Met Lys Leu Ala Ile Ile Gly Leu Gly Lys Met Gly Gly Asn Met Ala
1 5 10 15
Arg Arg Leu Leu Lys His Gly Ile Glu Val Val Gly Phe Asp Phe Asn
20 25 30
Gln Asp Ala Val Asn Gln Ile Ser Leu Thr Asn Gly Met Ile Pro Ala
35 40 45
Ser Ser Val Glu Asp Ala Val Ser Lys Leu Ser Gly Glu Pro Arg Lys
50 55 60
Ile Val Trp Ile Met Leu Pro Ser Gly Asp Ile Thr Glu Asn Gln Ile
65 70 75 80
Lys Asp Leu Val Pro Leu Leu Ser Lys Gly Asp Ile Ile Val Asp Gly
85 90 95
Gly Asn Ser Asn Tyr Lys His Ser Gln Arg Arg Gly Ala Trp Leu Ala
100 105 110
Glu His Gly Ile Glu Phe Ile Asp Cys Gly Thr Ser Gly Gly Ile Trp
115 120 125
Gly Leu Asp Asn Gly Tyr Cys Leu Met Tyr Gly Gly Ser Lys Asp Ala
130 135 140
Ala Asp Ala Val Val Pro Ile Met Gln Ala Leu Ala His Ala Asp Arg
145 150 155 160
Gly Trp Ala His Val Gly Pro Val Gly Ser Gly His Phe Thr Lys Met
165 170 175
Ile His Asn Gly Ile Glu Tyr Gly Met Met Gln Ala Phe Ala Glu Gly
180 185 190
Leu Asp Leu Leu Lys Gly Lys Glu Glu Phe Asn Leu Asp Leu Ala Gln
195 200 205
Ile Thr Glu Leu Trp Arg His Gly Ser Val Val Arg Ser Trp Leu Leu
210 215 220
Asp Leu Thr Ala Glu Ala Leu Ala His Asp Gln Glu Leu Ser Ala Ile
225 230 235 240
Ala Pro Tyr Val Ala Asp Ser Gly Glu Gly Arg Trp Thr Val Val Glu
245 250 255
Ala Val Asp Gln Gly Val Ala Ala Pro Val Leu Thr Leu Ala Leu Gln
260 265 270
Met Arg Phe Ala Ser Gln Glu Asp Thr Gly Tyr Ser Tyr Lys Leu Leu
275 280 285
Ser Met Met Arg Asn Ala Phe Gly Gly His Ala Val Lys Thr Lys
290 295 300
<210> 3
<211> 1906
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gox1705 cassette
<400> 3
gcgataccct gcgatcttcg agacctaact acatagtgtt taaagattac ggatatttaa 60
cttacttaga ataatgccat ttttttgagt tataataatc ctacgttagt gtgagcggga 120
tttaaactgt gaggacctta atacattcag acacttctgc ggtatcaccc tacttattcc 180
cttcgagatt atatctagga acccatcagg ttggtggaag attacccgtt ctaagacttt 240
tcagcttcct ctattgatgt tacacctgga cacccctttt ctggcatcca gtttttaatc 300
ttcagtggca tgtgagattc tccgaaatta attaaagcaa tcacacaatt ctctcggata 360
ccacctcggt tgaaactgac aggtggtttg ttacgcatgc taatgcaaag gagcctatat 420
acctttggct cggctgctgt aacagggaat ataaagggca gcataattta ggagtttagt 480
gaacttgcaa catttactat tttcccttct tacgtaaata tttttctttt taattctaaa 540
tcaatctttt tcaatttttt gtttgtattc ttttcttgct taaatctata actacaaaaa 600
acacatacat aaactaaaaa tgagaattgg tattattggt ttgggtagaa tgggtggtaa 660
cattgctgtt agattgacca gacacggtca cgacgttgtt gttcacgaca gaacctctga 720
agttaccacc tctgttgttg gtagatgtga agctggtaga gctaccccag ctgacacctt 780
ggctgacatg gctaagttgt tggaaggtga cgaacacaga gttgtttggg ttatgttgcc 840
agctggtgct attaccgaag actgtgttca acaattgggt ggtttgttgg gtagaggtga 900
cattattatt gacggtggta acacctacta caaggacgac gttagaagat ctgctgaatt 960
ggctgaaaag ggtatttctt acgttgacgt tggtacctct ggtggtgttt ggggtttgga 1020
aagaggttac tgtatgatgt tcggtggtac caaggaaacc gctgaataca ttgacccaat 1080
tttgtctgct ttggctccag gtattggtga cgttccaaga accccaggta gagacgaagc 1140
tggtcacgac ccaagagctg aacaaggtta cttgcactgt ggtccagctg gttctggtca 1200
cttcgttaag atggttcaca acggtattga atacggtatg atgcaagctt tcgctgaagg 1260
tttcgacatt atgaagtcta agaactctcc aattttggct gaaaaggaca gattcgaatt 1320
gaacatgggt gacattgctg aagtttggag aagaggttct gttgtttctt cttggttgtt 1380
ggacttgacc gctgaagctt tgaccagatc tgaaaccttg aacgaattct ctggtgaagt 1440
tgctgactct ggtgaaggta gatggaccat tgaagctgct attgaagaag acgttccagc 1500
tccagttatg accgctgctt tgttcaccag attcagatct agatctggta acaacttcgc 1560
tgaaaagatt ttgtctgctc aaagattcgg tttcggtggt cacgttgaaa agaagtaaca 1620
ggcccctttt cctttgtcga tatcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca ttcacgccct 1680
ccccccacat ccgctctaac cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt ctaggtccct 1740
atttattttt ttatagttat gttagtatta agaacgttat ttatatttca aatttttctt 1800
ttttttctgt acaaacgcgt gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt gcttgagaag 1860
gttttgggac gctcgaaggc tttaatttgc ttcgctaatc tgcgcg 1906
<210> 4
<211> 332
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gox1705 protein (Gluconobacter oxydans 621H)
<400> 4
Met Arg Ile Gly Ile Ile Gly Leu Gly Arg Met Gly Gly Asn Ile Ala
1 5 10 15
Val Arg Leu Thr Arg His Gly His Asp Val Val Val His Asp Arg Thr
20 25 30
Ser Glu Val Thr Thr Ser Val Val Gly Arg Cys Glu Ala Gly Arg Ala
35 40 45
Thr Pro Ala Asp Thr Leu Ala Asp Met Ala Lys Leu Leu Glu Gly Asp
50 55 60
Glu His Arg Val Val Trp Val Met Leu Pro Ala Gly Ala Ile Thr Glu
65 70 75 80
Asp Cys Val Gln Gln Leu Gly Gly Leu Leu Gly Arg Gly Asp Ile Ile
85 90 95
Ile Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Lys Asp Asp Val Arg Arg Ser Ala
100 105 110
Glu Leu Ala Glu Lys Gly Ile Ser Tyr Val Asp Val Gly Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Val Trp Gly Leu Glu Arg Gly Tyr Cys Met Met Phe Gly Gly Thr
130 135 140
Lys Glu Thr Ala Glu Tyr Ile Asp Pro Ile Leu Ser Ala Leu Ala Pro
145 150 155 160
Gly Ile Gly Asp Val Pro Arg Thr Pro Gly Arg Asp Glu Ala Gly His
165 170 175
Asp Pro Arg Ala Glu Gln Gly Tyr Leu His Cys Gly Pro Ala Gly Ser
180 185 190
Gly His Phe Val Lys Met Val His Asn Gly Ile Glu Tyr Gly Met Met
195 200 205
Gln Ala Phe Ala Glu Gly Phe Asp Ile Met Lys Ser Lys Asn Ser Pro
210 215 220
Ile Leu Ala Glu Lys Asp Arg Phe Glu Leu Asn Met Gly Asp Ile Ala
225 230 235 240
Glu Val Trp Arg Arg Gly Ser Val Val Ser Ser Trp Leu Leu Asp Leu
245 250 255
Thr Ala Glu Ala Leu Thr Arg Ser Glu Thr Leu Asn Glu Phe Ser Gly
260 265 270
Glu Val Ala Asp Ser Gly Glu Gly Arg Trp Thr Ile Glu Ala Ala Ile
275 280 285
Glu Glu Asp Val Pro Ala Pro Val Met Thr Ala Ala Leu Phe Thr Arg
290 295 300
Phe Arg Ser Arg Ser Gly Asn Asn Phe Ala Glu Lys Ile Leu Ser Ala
305 310 315 320
Gln Arg Phe Gly Phe Gly Gly His Val Glu Lys Lys
325 330
<210> 5
<211> 1906
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6pgdh cassette
<400> 5
gcgataccct gcgatcttcg agacctaact acatagtgtt taaagattac ggatatttaa 60
cttacttaga ataatgccat ttttttgagt tataataatc ctacgttagt gtgagcggga 120
tttaaactgt gaggacctta atacattcag acacttctgc ggtatcaccc tacttattcc 180
cttcgagatt atatctagga acccatcagg ttggtggaag attacccgtt ctaagacttt 240
tcagcttcct ctattgatgt tacacctgga cacccctttt ctggcatcca gtttttaatc 300
ttcagtggca tgtgagattc tccgaaatta attaaagcaa tcacacaatt ctctcggata 360
ccacctcggt tgaaactgac aggtggtttg ttacgcatgc taatgcaaag gagcctatat 420
acctttggct cggctgctgt aacagggaat ataaagggca gcataattta ggagtttagt 480
gaacttgcaa catttactat tttcccttct tacgtaaata tttttctttt taattctaaa 540
tcaatctttt tcaatttttt gtttgtattc ttttcttgct taaatctata actacaaaaa 600
acacatacat aaactaaaaa tgcaattggg tatgattggt ttgggtagaa tgggtggtaa 660
cattgttaga agattgatga gacacggtca ctctaccgtt gtttacgaca aggacgctaa 720
ggctgttgct ggtttggctg ctgacggtgc tgttggttct gctaccttgg aagaattcgt 780
tgctaagttg gaaagaccaa gaaccgcttg ggttatgttg ccagctggta gaattaccga 840
aaccaccatt gacaccattg ctggtgttat gcaagaaggt gacgttatta ttgacggtgg 900
taacaccttc tggcaagacg acgttagaag aggtaaggct ttgaaggcta gaggtattca 960
ctacgttgac gttggtacct ctggtggtgt ttggggtttg gacagaggtt actgtatgat 1020
gattggtggt gaaaagcaag ttgttgacag attggaccca attttcgctg ctttggctcc 1080
aggtgctggt gacattccaa gaaccgaagg tagagaaggt agagacccaa gaattgaaca 1140
aggttacatt cacgctggtc cagttggtgc tggtcacttc gttaagatga ttcacaacgg 1200
tattgaatac ggtttgatgc aagcttacgc tgaaggtttc gacattttga agaacgctaa 1260
cattgacgct ttgccagctg accacagata cgacttcgac ttggctgaca ttgctgaagt 1320
ttggagaaga ggttctgtta ttccatcttg gttgttggac ttgacctcta ccgctttggc 1380
tgactctcca gctttggctg aatactctgg tttcgttgaa gactctggtg aaggtagatg 1440
gaccgttaac gctgctattg acgaagctgt tccagctgaa gttttgaccg ctgctttgta 1500
caccagattc agatctagaa aggaacacac cttcgctgaa aagattttgt ctgctatgag 1560
agctggtttc ggtggtcaca aggaaccaaa gcaaccaggt gcttctaagc caaagtaaca 1620
ggcccctttt cctttgtcga tatcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca ttcacgccct 1680
ccccccacat ccgctctaac cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt ctaggtccct 1740
atttattttt ttatagttat gttagtatta agaacgttat ttatatttca aatttttctt 1800
ttttttctgt acaaacgcgt gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt gcttgagaag 1860
gttttgggac gctcgaaggc tttaatttgc ttcgctaatc tgcgcg 1906
<210> 6
<211> 332
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6pgdh protein WP_011089498.1 (Multispecies [Bradyrhizobium])
<400> 6
Met Gln Leu Gly Met Ile Gly Leu Gly Arg Met Gly Gly Asn Ile Val
1 5 10 15
Arg Arg Leu Met Arg His Gly His Ser Thr Val Val Tyr Asp Lys Asp
20 25 30
Ala Lys Ala Val Ala Gly Leu Ala Ala Asp Gly Ala Val Gly Ser Ala
35 40 45
Thr Leu Glu Glu Phe Val Ala Lys Leu Glu Arg Pro Arg Thr Ala Trp
50 55 60
Val Met Leu Pro Ala Gly Arg Ile Thr Glu Thr Thr Ile Asp Thr Ile
65 70 75 80
Ala Gly Val Met Gln Glu Gly Asp Val Ile Ile Asp Gly Gly Asn Thr
85 90 95
Phe Trp Gln Asp Asp Val Arg Arg Gly Lys Ala Leu Lys Ala Arg Gly
100 105 110
Ile His Tyr Val Asp Val Gly Thr Ser Gly Gly Val Trp Gly Leu Asp
115 120 125
Arg Gly Tyr Cys Met Met Ile Gly Gly Glu Lys Gln Val Val Asp Arg
130 135 140
Leu Asp Pro Ile Phe Ala Ala Leu Ala Pro Gly Ala Gly Asp Ile Pro
145 150 155 160
Arg Thr Glu Gly Arg Glu Gly Arg Asp Pro Arg Ile Glu Gln Gly Tyr
165 170 175
Ile His Ala Gly Pro Val Gly Ala Gly His Phe Val Lys Met Ile His
180 185 190
Asn Gly Ile Glu Tyr Gly Leu Met Gln Ala Tyr Ala Glu Gly Phe Asp
195 200 205
Ile Leu Lys Asn Ala Asn Ile Asp Ala Leu Pro Ala Asp His Arg Tyr
210 215 220
Asp Phe Asp Leu Ala Asp Ile Ala Glu Val Trp Arg Arg Gly Ser Val
225 230 235 240
Ile Pro Ser Trp Leu Leu Asp Leu Thr Ser Thr Ala Leu Ala Asp Ser
245 250 255
Pro Ala Leu Ala Glu Tyr Ser Gly Phe Val Glu Asp Ser Gly Glu Gly
260 265 270
Arg Trp Thr Val Asn Ala Ala Ile Asp Glu Ala Val Pro Ala Glu Val
275 280 285
Leu Thr Ala Ala Leu Tyr Thr Arg Phe Arg Ser Arg Lys Glu His Thr
290 295 300
Phe Ala Glu Lys Ile Leu Ser Ala Met Arg Ala Gly Phe Gly Gly His
305 310 315 320
Lys Glu Pro Lys Gln Pro Gly Ala Ser Lys Pro Lys
325 330
<210> 7
<211> 789
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> azf gene codon optimized
<400> 7
atggaccaac cagttttgtt gaccggtgct ggtggtagag ttggtcaagc tattttgggt 60
cacattggtg acgcttacga ctggagattg ttggacagag aaccattgtc tgacgaaaag 120
attccagact ctgttgactc taccgaagtt tacgttgctg acgttaccga cgaaaccgct 180
gttagaaacg ctatggacgg tgttcacgct gttattcact tggctggtga cccaagacca 240
gaagctccat gggactctgt tttgagaaac aacattgacg gtacccaaca aatgttcgac 300
gctgctgttg acgttggtgt tgaaaagttc gctttcgctt cttctaacca cgctgttggt 360
gcttacgaaa ccaccgacag aaccccagac atgtacagac cacaccacga attcagattg 420
gacggtaccg aattgccaag accatctaac ttgtacggtg tttctaaggc tgctggtgaa 480
accttgggta gatactacca cgaccaccac gacatttctg ttgttaacgt tagaattggt 540
aacttgaccc aacaccaccc accaaaggaa tacgaaagag gtcaagctat gtggttgtct 600
tacagagact gtggtcactt gttcgaatgt tgtattgaag ctgactacga ctacgaaatt 660
gtttacggta tttctgacaa cgacagaaag tactactcta ttgacagagc tagagctgtt 720
ttgggttacg acccacaaga caactctgct gaattcacct tcgaaggtga accattggac 780
gaagcttaa 789
<210> 8
<211> 262
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> azf protein (ADEE03728.1, Haloferax volcanii)
<400> 8
Met Asp Gln Pro Val Leu Leu Thr Gly Ala Gly Gly Arg Val Gly Gln
1 5 10 15
Ala Ile Leu Gly His Ile Gly Asp Ala Tyr Asp Trp Arg Leu Leu Asp
20 25 30
Arg Glu Pro Leu Ser Asp Glu Lys Ile Pro Asp Ser Val Asp Ser Thr
35 40 45
Glu Val Tyr Val Ala Asp Val Thr Asp Glu Thr Ala Val Arg Asn Ala
50 55 60
Met Asp Gly Val His Ala Val Ile His Leu Ala Gly Asp Pro Arg Pro
65 70 75 80
Glu Ala Pro Trp Asp Ser Val Leu Arg Asn Asn Ile Asp Gly Thr Gln
85 90 95
Gln Met Phe Asp Ala Ala Val Asp Val Gly Val Glu Lys Phe Ala Phe
100 105 110
Ala Ser Ser Asn His Ala Val Gly Ala Tyr Glu Thr Thr Asp Arg Thr
115 120 125
Pro Asp Met Tyr Arg Pro His His Glu Phe Arg Leu Asp Gly Thr Glu
130 135 140
Leu Pro Arg Pro Ser Asn Leu Tyr Gly Val Ser Lys Ala Ala Gly Glu
145 150 155 160
Thr Leu Gly Arg Tyr Tyr His Asp His His Asp Ile Ser Val Val Asn
165 170 175
Val Arg Ile Gly Asn Leu Thr Gln His His Pro Pro Lys Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg Gly Gln Ala Met Trp Leu Ser Tyr Arg Asp Cys Gly His Leu Phe
195 200 205
Glu Cys Cys Ile Glu Ala Asp Tyr Asp Tyr Glu Ile Val Tyr Gly Ile
210 215 220
Ser Asp Asn Asp Arg Lys Tyr Tyr Ser Ile Asp Arg Ala Arg Ala Val
225 230 235 240
Leu Gly Tyr Asp Pro Gln Asp Asn Ser Ala Glu Phe Thr Phe Glu Gly
245 250 255
Glu Pro Leu Asp Glu Ala
260
<210> 9
<211> 2466
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eutE casette
<400> 9
gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc 60
gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggagct cagtttatca ttatcaatac 120
tcgccatttc aaagaatacg taaataatta atagtagtga ttttcctaac tttatttagt 180
caaaaaatta gccttttaat tctgctgtaa cccgtacatg cccaaaatag ggggcgggtt 240
acacagaata tataacatcg taggtgtctg ggtgaacagt ttattcctgg catccactaa 300
atataatgga gcccgctttt taagctggca tccagaaaaa aaaagaatcc cagcaccaaa 360
atattgtttt cttcaccaac catcagttca taggtccatt ctcttagcgc aactacagag 420
aacaggggca caaacaggca aaaaacgggc acaacctcaa tggagtgatg caacctgcct 480
ggagtaaatg atgacacaag gcaattgacc cacgcatgta tctatctcat tttcttacac 540
cttctattac cttctgctct ctctgatttg gaaaaagctg aaaaaaaagg ttgaaaccag 600
ttccctgaaa ttattcccct acttgactaa taagtatata aagacggtag gtattgattg 660
taattctgta aatctatttc ttaaacttct taaattctac ttttatagtt agtctttttt 720
ttagttttaa aacaccagaa cttagtttcg acggattcta gaactagtaa aaaatgaacc 780
aacaagatat cgaacaagtt gtcaaggctg tcttgttgaa aatgcaatct tctgacactc 840
catctgctgc tgtccacgaa atgggtgttt tcgcttcttt ggacgacgct gttgctgctg 900
ccaaggttgc tcaacaaggt ttgaaatctg ttgccatgag acaattggcc attgctgcca 960
tcagagaagc tggtgaaaag catgccagag acttggctga attggctgtc tccgaaaccg 1020
gtatgggtag agttgaagac aaattcgcta agaacgttgc tcaagctaga ggtactccag 1080
gtgtcgaatg tttgtctcca caagtcttga ccggtgataa tggtttgact ttgattgaaa 1140
atgctccatg gggtgttgtt gcttccgtca ccccatctac caacccagct gctactgtca 1200
tcaacaacgc catctctttg attgctgctg gtaactccgt tatcttcgct ccacacccag 1260
ctgccaagaa ggtttctcaa agagccatca ctctattgaa ccaagccatt gttgctgctg 1320
gtggtccaga aaacttgttg gtcactgttg ccaacccaga tatcgaaact gctcaaagat 1380
tattcaagtt cccaggtatc ggtctattag tcgtcactgg tggtgaagct gttgttgaag 1440
ctgccagaaa gcacaccaac aagagattga ttgctgctgg tgctggtaac cctcctgttg 1500
ttgtcgatga aaccgctgat ttggccagag ctgctcaatc cattgtcaag ggtgcttctt 1560
tcgacaacaa catcatctgt gctgacgaaa aggttttgat tgttgttgac tccgttgctg 1620
acgaattgat gagattgatg gaaggtcaac atgccgtcaa gttgactgct gaacaagctc 1680
aacaattgca accagttttg ttgaagaaca tcgatgaaag aggtaagggt accgtctcca 1740
gagactgggt tggtagagat gctggtaaga ttgctgctgc catcggtttg aaggttccac 1800
aagaaaccag attattattc gtcgaaacca ccgctgaaca cccatttgct gtcactgaat 1860
tgatgatgcc agtcttacca gttgtccgtg ttgctaacgt tgctgacgct attgctttgg 1920
ctgtcaaatt ggaaggtggt tgtcaccaca ctgctgccat gcactccaga aacatcgaaa 1980
acatgaacca aatggctaac gccattgaca cttccatctt tgtcaagaac ggtccatgta 2040
tcgctggttt gggtttgggt ggtgaaggtt ggaccaccat gaccatcacc accccaactg 2100
gtgaaggtgt cacttctgcc agaactttcg tcagattacg tcgttgtgtt ttggtcgatg 2160
ctttcagaat tgtttaaact gcagtcgact cgagtcatgt aattagttat gtcacgctta 2220
cattcacgcc ctccccccac atccgctcta accgaaaagg aaggagttag acaacctgaa 2280
gtctaggtcc ctatttattt ttttatagtt atgttagtat taagaacgtt atttatattt 2340
caaatttttc ttttttttct gtacagacgc gtgtacgcat gtaacattat actgaaaacc 2400
ttgcttgaga aggttttggg acgctcgaag gctttaattt gcggccgctc tagaactagt 2460
ggatcc 2466
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer confirmation of GPD2 deletion
<400> 10
ccaaatgcga catgagtcac 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer confirmation of GPD2 deletion
<400> 11
acggacctat tgccattg 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer confirmation of GND1 deletion
<400> 12
cctgtttgcc tttccttacg 20
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer confirmation of GND1 deletion
<400> 13
aaatgggcct gatgttcg 18
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer confirmation of ALD6 deletion
<400> 14
atcccgggtg gaaactaaac 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer confirmation of ALD6 deletion
<400> 15
aggcacaagc ctgttctc 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer confirmation of GPD1 deletion
<400> 16
tcctcggtag atcaggtcag 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer confirmation of GPD1 deletion
<400> 17
acggtgagct ccgtattatc 20
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Amplication of pMEL11 backbone
<400> 18
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aag 33
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Amplication of pROS11 backbone
<400> 19
gatcatttat ctttcactgc ggag 24
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Amplication of pMEL11 insert sequence
<400> 20
tattgacgcc gggcaagagc 20
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Amplication of pMEL11 backbone
<400> 21
cgaccgagtt gctcttg 17
<210> 22
<211> 104
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Amplication of pROS11 insert sequence (GPD1 targeting)
<400> 22
gtgcgcatgt ttcggcgttc gaaacttctc cgcagtgaaa gataaatgat cgggcaagga 60
cgtcgaccat agttttagag ctagaaatag caagttaaaa taag 104
<210> 23
<211> 104
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Amplication of pROS11 insert sequence (GPD2 targeting)
<400> 23
gtgcgcatgt ttcggcgttc gaaacttctc cgcagtgaaa gataaatgat cccaagaatt 60
cccattattc ggttttagag ctagaaatag caagttaaaa taag 104
<210> 24
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Repair oligonucleotide (GPD1 knockout)
<400> 24
tggtattggc agtttcgtag ttatatatat actaccatga gtgaaactgt tacgttacct 60
gcattatgtc atttctcata actactttat cacgttagaa attacttatt attattaaat 120
<210> 25
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Repair oligonucleotide (GPD1 knockout)
<400> 25
atttaataat aataagtaat ttctaacgtg ataaagtagt tatgagaaat gacataatgc 60
aggtaacgta acagtttcac tcatggtagt atatatataa ctacgaaact gccaatacca 120
<210> 26
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Amplification of pMEL11 insert (GND2 targeting)
<400> 26
gttgataacg gactagcctt attttaactt gctatttcta gctctaaaac tatgatctgg 60
cagcttcgcg gatcatttat ctttcactgc ggagaagttt cgaacgccga aacatgcgca 120
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Confirmation of GND2 deletion
<400> 27
tctgacaggt ggcagtttcc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Confirmation of GND2 deletion
<400> 28
atccgaaagg cggcaatagg 20
<210> 29
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Repair oligonucleotide (GND2 knockout)
<400> 29
aagaattcgt aggtgcaggt gagcatattg ccggataagt gtagttacgc aactacaatt 60
gttactaagg cccaatccgg ttggagaaga actattgccc ttgctgctac ttacggtatt 120
<210> 30
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Repair oligonucleotide (GND2 knockout)
<400> 30
aataccgtaa gtagcagcaa gggcaatagt tcttctccaa ccggattggg ccttagtaac 60
aattgtagtt gcgtaactac acttatccgg caatatgctc acctgcacct acgaattctt 120
<210> 31
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Amplification of pMEL11 insert (GND1 targeting)
<400> 31
gttgataacg gactagcctt attttaactt gctatttcta gctctaaaac tcggatttag 60
cagagatgga gatcatttat ctttcactgc ggagaagttt cgaacgccga aacatgcgca 120
<210> 32
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Amplification of integration cassette (gndA, 6pgdh,
gox1705)
<400> 32
taaacctgta ttgttgccat tacagaaaaa agccactttc tatacaaaaa ctacaataaa 60
gcgataccct gcgatcttc 79
<210> 33
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Amplification of integration cassette (gndA, 6pgdh,
gox1705)
<400> 33
gatatggata tccttgtcta ctggcaagtt gtcagaagca cattctggca acactctgaa 60
cgcgcagatt agcgaagc 78
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Confirmation of gndA integration
<400> 34
aagaagaggt gcttggttgg 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Confirmation of gndA integration
<400> 35
tccaaacctt cagcgaaagc 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Confirmation of 6pgdh integration
<400> 36
cgacgttaga agaggtaagg 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Confirmation of 6pgdh integration
<400> 37
ccttcggttc ttggaatgtc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Confirmation of gox1705 integration
<400> 38
ggacgacgtt agaagatctg 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Confirmation of gox1705 integration
<400> 39
gtattcagcg gtttccttgg 20
<210> 40
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Repair oligonucleotide (ALD6 knockout)
<400> 40
tagaagaaaa aacatcaaga aacatcttta acatacacaa acacatacta tcagaataca 60
tgtaccaacc tgcatttctt tccgtcatat acacaaaata ctttcatata aacttacttg 120
<210> 41
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Repair oligonucleotide (ALD6 knockout)
<400> 41
caagtaagtt tatatgaaag tattttgtgt atatgacgga aagaaatgca ggttggtaca 60
tgtattctga tagtatgtgt ttgtgtatgt taaagatgtt tcttgatgtt ttttcttcta 120
<210> 42
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Amplification of pMEL11 insert (ALD6 targeting)
<400> 42
gttgataacg gactagcctt attttaactt gctatttcta gctctaaaac aattcagagc 60
tgttagccat gatcatttat ctttcactgc ggagaagttt cgaacgccga aacatgcgca 120
<210> 43
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Amplification of integration cassette (eutE)
<400> 43
gtattttggt agattcaatt ctctttccct ttccttttcc ttcgctcccc ttccttatca 60
cacaggaaac agctatgacc 80
<210> 44
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Amplification of integration cassette (eutE)
<400> 44
ataactgtag taatgttact agtagtagtt gtagaacttg tgtataatga taaattggtt 60
gccgcaaatt aaagccttcg 80
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Confirmation of eutE integration
<400> 45
cgaacaagtt gtcaaggctg 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for Confirmation of eutE integration
<400> 46
gcatcgacca aaacacaacg 20
<210> 47
<211> 464
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<220>
<223> Amino acid sequence of E.coli oxidoreductase of (Escherichia coli
eutE)
<400> 47
Met Asn Gln Gln Asp Ile Glu Gln Val Val Lys Ala Val Leu Leu Lys
1 5 10 15
Met Gln Ser Ser Asp Thr Pro Ser Ala Ala Val His Glu Met Gly Val
20 25 30
Phe Ala Ser Leu Asp Asp Ala Val Ala Ala Ala Lys Val Ala Gln Gln
35 40 45
Gly Leu Lys Ser Val Ala Met Arg Gln Leu Ala Ile Ala Ala Ile Arg
50 55 60
Glu Ala Gly Glu Lys His Ala Arg Asp Leu Ala Glu Leu Ala Val Ser
65 70 75 80
Glu Thr Gly Met Gly Arg Val Glu Asp Lys Phe Ala Lys Asn Val Ala
85 90 95
Gln Ala Arg Gly Thr Pro Gly Val Glu Cys Leu Ser Pro Gln Val Leu
100 105 110
Thr Gly Asp Asn Gly Leu Thr Leu Ile Glu Asn Ala Pro Trp Gly Val
115 120 125
Val Ala Ser Val Thr Pro Ser Thr Asn Pro Ala Ala Thr Val Ile Asn
130 135 140
Asn Ala Ile Ser Leu Ile Ala Ala Gly Asn Ser Val Ile Phe Ala Pro
145 150 155 160
His Pro Ala Ala Lys Lys Val Ser Gln Arg Ala Ile Thr Leu Leu Asn
165 170 175
Gln Ala Ile Val Ala Ala Gly Gly Pro Glu Asn Leu Leu Val Thr Val
180 185 190
Ala Asn Pro Asp Ile Glu Thr Ala Gln Arg Leu Phe Lys Phe Pro Gly
195 200 205
Ile Gly Leu Leu Val Val Thr Gly Gly Glu Ala Val Val Glu Ala Ala
210 215 220
Arg Lys His Thr Asn Lys Arg Leu Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Pro
225 230 235 240
Pro Val Val Val Asp Glu Thr Ala Asp Leu Ala Arg Ala Ala Gln Ser
245 250 255
Ile Val Lys Gly Ala Ser Phe Asp Asn Asn Ile Ile Cys Ala Asp Glu
260 265 270
Lys Val Leu Ile Val Val Asp Ser Val Ala Asp Glu Leu Met Arg Leu
275 280 285
Met Glu Gly Gln His Ala Val Lys Leu Thr Ala Glu Gln Ala Gln Gln
290 295 300
Leu Gln Pro Val Leu Leu Lys Asn Ile Asp Glu Arg Gly Lys Gly Thr
305 310 315 320
Val Ser Arg Asp Trp Val Gly Arg Asp Ala Gly Lys Ile Ala Ala Ala
325 330 335
Ile Gly Leu Lys Val Pro Gln Glu Thr Arg Leu Leu Phe Val Glu Thr
340 345 350
Thr Ala Glu His Pro Phe Ala Val Thr Glu Leu Met Met Pro Val Leu
355 360 365
Pro Val Val Arg Val Ala Asn Val Ala Asp Ala Ile Ala Leu Ala Val
370 375 380
Lys Leu Glu Gly Gly Cys His His Thr Ala Ala Met His Ser Arg Asn
385 390 395 400
Ile Glu Asn Met Asn Gln Met Ala Asn Ala Ile Asp Thr Ser Ile Phe
405 410 415
Val Lys Asn Gly Pro Cys Ile Ala Gly Leu Gly Leu Gly Gly Glu Gly
420 425 430
Trp Thr Thr Met Thr Ile Thr Thr Pro Thr Gly Glu Gly Val Thr Ser
435 440 445
Ala Arg Thr Phe Val Arg Leu Arg Arg Cys Val Leu Val Asp Ala Phe
450 455 460
<210> 48
<211> 366
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<220>
<223> Amino acid sequence of E.coli glycerol dehydrogenase
((Escherichia coli gldA)
<400> 48
Met Asp Arg Ile Ile Gln Ser Pro Gly Lys Tyr Ile Gln Gly Ala Asp
1 5 10 15
Val Ile Asn Arg Leu Gly Glu Tyr Leu Lys Pro Leu Ala Glu Arg Trp
20 25 30
Leu Val Val Gly Asp Lys Phe Val Leu Gly Phe Ala Gln Ser Thr Val
35 40 45
Glu Lys Ser Phe Lys Asp Ala Gly Leu Val Val Glu Ile Ala Pro Phe
50 55 60
Gly Gly Glu Cys Ser Gln Asn Glu Ile Asp Arg Leu Arg Gly Ile Ala
65 70 75 80
Glu Thr Ala Gln Cys Gly Ala Ile Leu Gly Ile Gly Gly Gly Lys Thr
85 90 95
Leu Asp Thr Ala Lys Ala Leu Ala His Phe Met Gly Val Pro Val Ala
100 105 110
Ile Ala Pro Thr Ile Ala Ser Thr Asp Ala Pro Cys Ser Ala Leu Ser
115 120 125
Val Ile Tyr Thr Asp Glu Gly Glu Phe Asp Arg Tyr Leu Leu Leu Pro
130 135 140
Asn Asn Pro Asn Met Val Ile Val Asp Thr Lys Ile Val Ala Gly Ala
145 150 155 160
Pro Ala Arg Leu Leu Ala Ala Gly Ile Gly Asp Ala Leu Ala Thr Trp
165 170 175
Phe Glu Ala Arg Ala Cys Ser Arg Ser Gly Ala Thr Thr Met Ala Gly
180 185 190
Gly Lys Thr Gln Ala Ala Leu Ala Leu Ala Glu Leu Cys Tyr Asn Thr
195 200 205
Leu Leu Glu Glu Gly Glu Lys Ala Met Leu Ala Ala Glu Gln His Val
210 215 220
Val Thr Pro Ala Leu Glu Arg Val Ile Glu Ala Asn Thr Tyr Leu Ser
225 230 235 240
Gly Val Gly Phe Glu Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala His Ala Val His
245 250 255
Asn Gly Leu Thr Ala Ile Pro Asp Ala His His Tyr Tyr His Gly Glu
260 265 270
Lys Val Ala Phe Gly Thr Leu Thr Gln Leu Val Leu Glu Asn Ala Pro
275 280 285
Val Glu Glu Ile Glu Thr Val Ala Ala Leu Ser His Ala Val Gly Leu
290 295 300
Pro Ile Thr Leu Ala Gln Leu Asp Ile Lys Glu Asp Val Pro Ala Lys
305 310 315 320
Met Arg Ile Val Ala Glu Ala Ala Cys Ala Glu Gly Glu Thr Ile His
325 330 335
Asn Met Pro Gly Gly Ala Thr Pro Asp Gln Val Tyr Ala Ala Leu Leu
340 345 350
Val Ala Asp Gln Tyr Gly Gln Arg Phe Leu Gln Glu Trp Glu
355 360 365
<210> 49
<211> 912
<212> DNA
<213> Methylobacillus flagellatus
<220>
<223> Nucleotide sequence of gndA (6-phosphoglucanate dehydrogenase
<400> 49
atgaagttgg ctattattgg tttgggtaag atgggtggta acatggctag aagattgttg 60
aagcacggta ttgaagttgt tggtttcgac ttcaaccaag acgctgttaa ccaaatttct 120
ttgaccaacg gtatgattcc agcttcttct gttgaagacg ctgtttctaa gttgtctggt 180
gaaccaagaa agattgtttg gattatgttg ccatctggtg acattaccga aaaccaaatt 240
aaggacttgg ttccattgtt gtctaagggt gacattattg ttgacggtgg taactctaac 300
tacaagcact ctcaaagaag aggtgcttgg ttggctgaac acggtattga attcattgac 360
tgtggtacct ctggtggtat ttggggtttg gacaacggtt actgtttgat gtacggtggt 420
tctaaggacg ctgctgacgc tgttgttcca attatgcaag ctttggctca cgctgacaga 480
ggttgggctc acgttggtcc agttggttct ggtcacttca ccaagatgat tcacaacggt 540
attgaatacg gtatgatgca agctttcgct gaaggtttgg acttgttgaa gggtaaggaa 600
gaattcaact tggacttggc tcaaattacc gaattgtgga gacacggttc tgttgttaga 660
tcttggttgt tggacttgac cgctgaagct ttggctcacg accaagaatt gtctgctatt 720
gctccatacg ttgctgactc tggtgaaggt agatggaccg ttgttgaagc tgttgaccaa 780
ggtgttgctg ctccagtttt gaccttggct ttgcaaatga gattcgcttc tcaagaagac 840
accggttact cttacaagtt gttgtctatg atgagaaacg ctttcggtgg tcacgctgtt 900
aagaccaagt aa 912
<210> 50
<211> 999
<212> DNA
<213> Gluconobacter oxydans
<220>
<223> Nucleotide sequence of gox1705 (6-phosphoglucanate dehydrogenase
<400> 50
atgagaattg gtattattgg tttgggtaga atgggtggta acattgctgt tagattgacc 60
agacacggtc acgacgttgt tgttcacgac agaacctctg aagttaccac ctctgttgtt 120
ggtagatgtg aagctggtag agctacccca gctgacacct tggctgacat ggctaagttg 180
ttggaaggtg acgaacacag agttgtttgg gttatgttgc cagctggtgc tattaccgaa 240
gactgtgttc aacaattggg tggtttgttg ggtagaggtg acattattat tgacggtggt 300
aacacctact acaaggacga cgttagaaga tctgctgaat tggctgaaaa gggtatttct 360
tacgttgacg ttggtacctc tggtggtgtt tggggtttgg aaagaggtta ctgtatgatg 420
ttcggtggta ccaaggaaac cgctgaatac attgacccaa ttttgtctgc tttggctcca 480
ggtattggtg acgttccaag aaccccaggt agagacgaag ctggtcacga cccaagagct 540
gaacaaggtt acttgcactg tggtccagct ggttctggtc acttcgttaa gatggttcac 600
aacggtattg aatacggtat gatgcaagct ttcgctgaag gtttcgacat tatgaagtct 660
aagaactctc caattttggc tgaaaaggac agattcgaat tgaacatggg tgacattgct 720
gaagtttgga gaagaggttc tgttgtttct tcttggttgt tggacttgac cgctgaagct 780
ttgaccagat ctgaaacctt gaacgaattc tctggtgaag ttgctgactc tggtgaaggt 840
agatggacca ttgaagctgc tattgaagaa gacgttccag ctccagttat gaccgctgct 900
ttgttcacca gattcagatc tagatctggt aacaacttcg ctgaaaagat tttgtctgct 960
caaagattcg gtttcggtgg tcacgttgaa aagaagtaa 999
<210> 51
<211> 999
<212> DNA
<213> Bradyrhizobium sp.
<220>
<223> Nucleotide sequence of 6pgdh (6-phosphoglucanate dehydrogenase
<400> 51
atgcaattgg gtatgattgg tttgggtaga atgggtggta acattgttag aagattgatg 60
agacacggtc actctaccgt tgtttacgac aaggacgcta aggctgttgc tggtttggct 120
gctgacggtg ctgttggttc tgctaccttg gaagaattcg ttgctaagtt ggaaagacca 180
agaaccgctt gggttatgtt gccagctggt agaattaccg aaaccaccat tgacaccatt 240
gctggtgtta tgcaagaagg tgacgttatt attgacggtg gtaacacctt ctggcaagac 300
gacgttagaa gaggtaaggc tttgaaggct agaggtattc actacgttga cgttggtacc 360
tctggtggtg tttggggttt ggacagaggt tactgtatga tgattggtgg tgaaaagcaa 420
gttgttgaca gattggaccc aattttcgct gctttggctc caggtgctgg tgacattcca 480
agaaccgaag gtagagaagg tagagaccca agaattgaac aaggttacat tcacgctggt 540
ccagttggtg ctggtcactt cgttaagatg attcacaacg gtattgaata cggtttgatg 600
caagcttacg ctgaaggttt cgacattttg aagaacgcta acattgacgc tttgccagct 660
gaccacagat acgacttcga cttggctgac attgctgaag tttggagaag aggttctgtt 720
attccatctt ggttgttgga cttgacctct accgctttgg ctgactctcc agctttggct 780
gaatactctg gtttcgttga agactctggt gaaggtagat ggaccgttaa cgctgctatt 840
gacgaagctg ttccagctga agttttgacc gctgctttgt acaccagatt cagatctaga 900
aaggaacaca ccttcgctga aaagattttg tctgctatga gagctggttt cggtggtcac 960
aaggaaccaa agcaaccagg tgcttctaag ccaaagtaa 999
<210> 52
<211> 789
<212> DNA
<213> Haloferax volcanii
<220>
<223> Nucleotide sequence of azf (glucose- 6-phosphate dehydrogenase
<400> 52
atggaccaac cagttttgtt gaccggtgct ggtggtagag ttggtcaagc tattttgggt 60
cacattggtg acgcttacga ctggagattg ttggacagag aaccattgtc tgacgaaaag 120
attccagact ctgttgactc taccgaagtt tacgttgctg acgttaccga cgaaaccgct 180
gttagaaacg ctatggacgg tgttcacgct gttattcact tggctggtga cccaagacca 240
gaagctccat gggactctgt tttgagaaac aacattgacg gtacccaaca aatgttcgac 300
gctgctgttg acgttggtgt tgaaaagttc gctttcgctt cttctaacca cgctgttggt 360
gcttacgaaa ccaccgacag aaccccagac atgtacagac cacaccacga attcagattg 420
gacggtaccg aattgccaag accatctaac ttgtacggtg tttctaaggc tgctggtgaa 480
accttgggta gatactacca cgaccaccac gacatttctg ttgttaacgt tagaattggt 540
aacttgaccc aacaccaccc accaaaggaa tacgaaagag gtcaagctat gtggttgtct 600
tacagagact gtggtcactt gttcgaatgt tgtattgaag ctgactacga ctacgaaatt 660
gtttacggta tttctgacaa cgacagaaag tactactcta ttgacagagc tagagctgtt 720
ttgggttacg acccacaaga caactctgct gaattcacct tcgaaggtga accattggac 780
gaagcttaa 789
<210> 53
<211> 1404
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<223> Nucleotide sequence eutE (Acetylating acetaldehyde dehydrogenase
<400> 53
atgaaccaac aagatatcga acaagttgtc aaggctgtct tgttgaaaat gcaatcttct 60
gacactccat ctgctgctgt ccacgaaatg ggtgttttcg cttctttgga cgacgctgtt 120
gctgctgcca aggttgctca acaaggtttg aaatctgttg ccatgagaca attggccatt 180
gctgccatca gagaagctgg tgaaaagcat gccagagact tggctgaatt ggctgtctcc 240
gaaaccggta tgggtagagt tgaagacaaa ttcgctaaga acgttgctca agctagaggt 300
actccaggtg tcgaatgttt gtctccacaa gtcttgaccg gtgataatgg tttgactttg 360
attgaaaatg ctccatgggg tgttgttgct tccgtcaccc catctaccaa cccagctgct 420
actgtcatca acaacgccat ctctttgatt gctgctggta actccgttat cttcgctcca 480
cacccagctg ccaagaaggt ttctcaaaga gccatcactc tattgaacca agccattgtt 540
gctgctggtg gtccagaaaa cttgttggtc actgttgcca acccagatat cgaaactgct 600
caaagattat tcaagttccc aggtatcggt ctattagtcg tcactggtgg tgaagctgtt 660
gttgaagctg ccagaaagca caccaacaag agattgattg ctgctggtgc tggtaaccct 720
cctgttgttg tcgatgaaac cgctgatttg gccagagctg ctcaatccat tgtcaagggt 780
gcttctttcg acaacaacat catctgtgct gacgaaaagg ttttgattgt tgttgactcc 840
gttgctgacg aattgatgag attgatggaa ggtcaacatg ccgtcaagtt gactgctgaa 900
caagctcaac aattgcaacc agttttgttg aagaacatcg atgaaagagg taagggtacc 960
gtctccagag actgggttgg tagagatgct ggtaagattg ctgctgccat cggtttgaag 1020
gttccacaag aaaccagatt attattcgtc gaaaccaccg ctgaacaccc atttgctgtc 1080
actgaattga tgatgccagt cttaccagtt gtccgtgttg ctaacgttgc tgacgctatt 1140
gctttggctg tcaaattgga aggtggttgt caccacactg ctgccatgca ctccagaaac 1200
atcgaaaaca tgaaccaaat ggctaacgcc attgacactt ccatctttgt caagaacggt 1260
ccatgtatcg ctggtttggg tttgggtggt gaaggttgga ccaccatgac catcaccacc 1320
ccaactggtg aaggtgtcac ttctgccaga actttcgtca gattacgtcg ttgtgttttg 1380
gtcgatgctt tcagaattgt ttaa 1404

Claims (29)

1.经遗传修饰的真核细胞，其包含一种或更多种异源基因，所述异源基因编码：
a)D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和/或
b)6-磷酸葡糖酸脱氢酶；和/或
c)葡萄糖脱氢酶、葡糖酸内酯酶和葡糖酸激酶，
其中a)、b)和c)中的葡萄糖脱氢酶是NAD+依赖性的。
2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的真核细胞，其包含一种或更多种异源基因，所述异源基因编码：
a)D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和/或
b)6-磷酸葡糖酸脱氢酶；
其中a)和b)是NAD+依赖性的。
3.根据权利要求1或2所述的真核细胞，其包含：
d)一种或更多种编码异源NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10)的核苷酸序列和
e)一种或更多种编码同源或异源乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)的核苷酸序列；和任选的，
g)导致所述真核细胞中天然的甘油3-磷酸磷酸水解酶(E.C.3.1.3.21)和/或h)甘油3-磷酸脱氢酶(E.C.1.1.1.8或E.C.1.1.5.3)活性降低的修饰。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的真核细胞，其中，
f)乙醛脱氢酶-6(ALD6)被破坏。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的真核细胞，其中所述真核细胞中天然的D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶被异源NAD+D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶替代且/或其中所述真核细胞中天然的6-磷酸葡糖酸脱氢酶被异源NAD+6-磷酸葡糖酸脱氢酶替代。
6.根据权利要求5所述的真核细胞，其中所述天然基因是戊糖-磷酸通路的部分，其是NADP+依赖性的且选自：GND1、GND2和ZWF1。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的真核细胞，其中所述异源基因是原核生物基因或是编码原核生物酶的合成基因。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的真核细胞，其中所述一种或更多种异源基因编码与SEQ ID NO:8具有至少60％、至少70％或至少80％同一性的D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的真核细胞，其中所述异源基因编码与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6具有至少60％、至少70％或至少80％同一性的6-磷酸葡糖酸脱氢酶。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的真核细胞，其中所述异源基因是来源于选自以下属列表的生物体的权利要求1的基因a)和/或b)：Methylobacillus、Gluconobacter、Bradyrhizobium和Haloferax。
11.根据权利要求10所述的真核细胞，其中所述异源基因是来源于选自以下种列表的生物体的基因：Methylobacillus flagellatus、Gluconobacter oxydans、Bradyrhizobium和Haloferax volcanii。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的真核细胞，其中所述真核细胞是酵母细胞。
13.根据权利要求12所述的真核细胞，其中所述酵母细胞是Saccharomyces细胞或Saccharomyces cerevisiae细胞。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的真核细胞，其中所述真核细胞包含所述真核细胞中天然的基因gpp1、gpp2、gpd1和gpd2中的一个或更多个的破坏。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的真核细胞，其中所述真核细胞包含：
i)一种或更多种编码异源木糖异构酶(E.C.5.3.1.5)的核苷酸序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的真核细胞，其中所述真核细胞还包含：
j)一种或更多种编码异源甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)的核苷酸序列。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的真核细胞，其中所述真核细胞还包含：
k)一种或更多种编码同源或异源二羟丙酮激酶(E.C.2.7.1.28或E.C.2.7.1.29)的核苷酸序列。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的真核细胞，其中所述真核细胞是能够同时厌氧消耗戊糖和葡萄糖的发酵戊糖和葡萄糖的真核细胞。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的真核细胞在酿酒工业中的发酵中的用途。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的真核细胞在生物燃料工业中的发酵中的用途。
21.在酿酒生物燃料工业中利用根据权利要求1-18中任一项所述的真核细胞发酵底物以生产发酵产物的方法，其中相对于利用野生型真核细胞的相应发酵，乙酸盐/酯消耗增加至少10％、至少20％或至少25％。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述发酵产物是乙醇，并且乙醇产率比利用相应野生型真核细胞的方法的乙醇产率高至少约0.5％或至少1％。
23.根据权利要求21或22中任一项所述的方法，其中共发酵戊糖和葡萄糖。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中发酵木质纤维素材料的水解物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述水解物是木质纤维素材料的酶促水解物。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述水解物包含乙酸盐/酯。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述包含乙酸盐/酯的水解物的乙酸盐/酯浓度为0.3％(w/w)或更高。
28.在酿酒工业中利用根据权利要求1-18中任一项所述的真核细胞发酵底物以生产发酵产物的方法，其中甘油产率比利用相应野生型真核细胞的方法的甘油产率高至少5％、至少10％或至少20％或至少30％。
29.根据权利要求28所述的方法，其中乙醇产率相较于利用相应野生型真核细胞的方法的乙醇产率不提高或降低。
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