MX2012012184A - Celula apropiada para la fermentacion de una composicion de azucares mixtos. - Google Patents

Celula apropiada para la fermentacion de una composicion de azucares mixtos.

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MX2012012184A
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Abstract

Célula apropiada para generar uno o más productos de fermentación a partir de una composición de azúcares que comprende glucosa, galactosa, arabinosa y xilosa, donde la célula comprende entre dos y quince copias de uno o más genes de xilosa isomerasa o entre dos y quince copias de uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, así como entre dos y diez copias de los genes araA, araB y araD, donde estos genes están integrados en el genoma de la célula.

Description

CÉLULA APROPIADA PARA LA FERMENTACIÓN DE UNA COMPOSICIÓN DE AZÚCARES MIXTOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con una célula (designada también en la presente como célula de azúcares mixtos) , apropiada para la fermentación de una composición de azúcares que comprende múltiples azúcares C5 y/o C6 (dicha composición también se designa en la presente como composición de azúcares mixtos) . La composición de azúcares mixtos puede originarse a partir de material lignocelulósico. La invención también se relaciona con un proceso para la producción de productos de fermentación a partir de la composición de azúcares mixtos usando la célula de azúcares mixtos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La mayor parte del etanol que se produce como alternativa para los combustibles fósiles actualmente se obtiene a partir de fermentación de sacarosa a base de almidón de maíz y caña de azúcar. Con el objeto de alcanzar los ambiciosos objetivos de producir combustibles renovables, se están desarrollando nuevas tecnologías para convertir biomasa no alimenticia en productos de fermentación tales como etanol. Saccharo yces cerevisiae es el organismo de elección en la industria del etanol, pero la misma no puede utilizar los azúcares de cinco carbonos que están contenidos en el componente de hemicelulosa de la materia prima de la biomasa. La hemicelulosa puede llegar hasta entre 20 y 30% de la biomasa, con xilosa y arabinosa siendo los azúcares C5 más abundantes. La expresión heteróloga de una xilosa isomerasa (XI) es una opción para permitir que las células de levadura metabolicen y fermenten xilosa. De forma similar, la expresión de los genes bacterianos araA, araB, y araD en cepas de S. cerevisiae resulta en la utilización y eficiente fermentación alcohólica de arabinosa. La galactosa es un azúcar C6 que también es un azúcar que con frecuencia está presente en la lignocelulosa, con frecuencia en cantidades (~4% del total de azúcares) que no son desechables por razones económicas.
J. van den Brink et al, Microbiology (2009)155, 1340-1350 expone que la glucosa es la fuente de carbono preferida por Saccharomyces cerevisiae y que ante el cambio de condiciones de fermentación limitadas por glucosa, con condición de exceso de galactosa bajo condición anaeróbica, la galactosa no se consumía.
Hasta ahora no se ha expuesto un proceso para convertir glucosa, arabinosa, xilosa y galactosa, en un producto de fermentación en el mismo proceso con glucosa.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objeto de la invención es proveer una célula que sea capaz de convertir glucosa, xilosa y galactosa y mañosa, es decir una mezcla de cuatro azúcares, en un producto de fermentación. Otro objeto de la invención es proporcionar dicha célula que es capaz de convertir glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa y mañosa, es decir una mezcla de cinco azúcares, en un producto de fermentación. Otro objeto de la invención es proveer dicha célula previamente definida que es estable. Otro objeto de la invención es proveer dicha cepa previamente definida que está libre de marcadores. Otro objeto de la invención es proveer un proceso en donde se convierte simultáneamente glucosa, xilosa, arabinosa, y galactosa en un producto de fermentación. Uno o más de estos objetos son alcanzados de acuerdo a la invención.
La presente invención provee una célula que es apropiada para la producción de uno o más productos de fermentación a partir de una composición de azúcares que comprende glucosa, galactosa, xilosa, arabinosa y mañosa, en donde la célula comprende entre dos y quince copias de uno o más genes de xilosa isomerasa o entre dos y quince copias de uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, y entre dos y diez copias de los genes araA, araB y araD, en donde estos genes se integran en el genoma de la célula.
La invención además provee un proceso para la producción de uno o más productos de fermentación a partir de una composición de azúcares que comprende glucosa, arabinosa y xilosa y opcionalmente galactosa y/o mañosa, que comprende los siguientes pasos: a) fermentar la composición de azúcares en presencia de una célula de azúcares mixtos que comprende entre dos y quince copias de uno o más genes de xilosa isomerasa y/o entre dos y quince copias de uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, en donde estos genes se integran en el genoma; y b) recuperar el producto de fermentación.
En una forma de realización, la célula de azúcares mixtos es del género Saccharomyces . En una forma de realización la célula de azúcares mixtos es una de la especie Saccharomyces cerevisiae . En una forma de realización, el producto de fermentación es etanol .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 exhibe un mapa físico del plásmido pPWT006.
La Figura 2 exhibe un mapa físico del plásmido pPWT018.
La Figura 3 exhibe un autoradiograma de transferencia Southern. Se digirió ADN cromosómico de la cepa de tipo salvaje CEN.PK113-7D (carril 1) y BIE104A2 (carril 2) tanto con EcoRI como con HindlII. La transferencia se hibridizó con una sonda específica para SIT2.
La Figura 4 exhibe un mapa físico del plásmido pPWT080, la secuencia del cual se da en SEQ ID NO: 8 La Figura 5 exhibe curvas de crecimiento bajo condiciones aeróbicas de BIE104P1A2 en medios diferentes. La cepa BIE104A2P1 se pre-desarrolló en YNB con galactosa al 2%. Se comenzó la curva de crecimiento con galactosa al 2% y arabinosa al 1%, seguido por el evento que se indica en la gráfica mediante el número (1) de transferencia a YNB con arabinosa al 2% como única fuente de carbono. Después de alcanzar una DO 600 mayor que 1, se transfirió el cultivo a medio fresco con una DO 600 inicial de 0.2. Después de tres transferencias en medio con arabinosa pura, la cepa resultante se designó como BIE104PlA2c.
La Figura 6 exhibe curvas de crecimiento bajo condiciones anaeróbicas de BlE104PlA2c en YNB con arabinosa al 2% como única fuente de carbono. Después de alcanzar una DO 600 mayor que 1, se transfirió el cultivo a medio fresco con una DO 600 inicial de 0.2. Después de varias transferencias, la cepa resultante se denomino BIE104PlA2d (= BIE201) .
La Figura 7 exhibe un mapa físico del plásmido pPWT042, la secuencia del cual se da en SEQ ID NO: 14.
La Figura 8 exhibe una curva de crecimiento bajo condiciones aeróbicas de una mezcla de transformación. Se transformó la cepa BIE201X9 con el fragmento X18-Tyl y se usó la mezcla de transformación para inocular medio Verduyn suplementado con xilosa al 2%. Después de alcanzar una DO 600 de aproximadamente 35, se usó una alícuota de cultivo para inocular un segundo recipiente con medio fresco. A partir del segundo recipiente, se aislaron colonias para análisis adicionales .
La Figura 9 exhibe el crecimiento de aislamientos de colonias individuales sobre medio Verduyn suplementado ya sea con glucosa al 2%, o bien con xilosa al 2%, o arabinosa al 2% o galactosa al 2%.
La Figura 10 exhibe el crecimiento de aislamientos de colonias individuales seleccionadas en medio Verduyn suplementado ya sea con xilosa al 2% o con arabinosa al 2%.
La Figura 11 exhibe la conversión de azúcar y la formación de producto de un cultivo mixto de cepas BIE104PlY9mc y BIE201 sobre medio sintético, en un experimento de lote alimentado. Se midió la producción de C02 en forma constante. Se monitoreó el crecimiento mediante seguimiento de la densidad óptica del cultivo. El precultivo se desarrolló en glucosa al 2%.
La Figura 12 exhibe la conversión de azúcar y la formación de producto de la cepa BIE252 sobre medio sintético, en un experimento de lote alimentado. Se midió la producción de C02 en forma constante. Se monitoreó el crecimiento mediante seguimiento de la densidad óptica del cultivo. El precultivo se desarrolló en glucosa al 2%.
La Figura 13 exhibe el C02 total que se produjo en los experimentos de lote alimentado.
La Figura 14 exhibe la conversión de azúcar y la formación de producto de un cultivo mixto de cepas BIE104PlY9mc y BIE201 sobre medio sintético, en un experimento en lote. Se midió la producción de C02 en forma constante. Se monitoreó el crecimiento mediante seguimiento de la densidad óptica del cultivo. El precultivo se desarrolló en glucosa al 2%.
La Figura 15 exhibe la conversión de azúcar y la formación de producto de un cultivo mixto de la cepa BIE252 sobre medio sintético, en un experimento en lote. Se midió la producción de C02 en forma constante. Se monitoreó el crecimiento mediante seguimiento de la densidad óptica del cultivo. El precultivo se desarrolló en glucosa al 2%.
La Figura 16 exhibe el C02 total que se produjo en los experimentos en lote.
La Figura 17 exhibe el desempeño de la cepa BIE252 en fibra de maíz hidrolizado a 13.8% d.m. Se muestran la tasa de producción de C02, la producción de etanol y la conversión de azúcares .
La Figura 18 exhibe el desempeño de la cepa BIE252 en residuos de maíz hidrolizado a 10% d.m. Se muestran la tasa de producción de C02, la producción de etanol y la conversión de azúcares.
La Figura 19 exhibe el desempeño de la cepa BIE252 en paja de trigo hidrolizado a 10% d.m. Se muestran la tasa de producción de C02, la producción de etanol y la conversión de azúcares .
La Figura 20a exhibe la conversión de azúcar (tasa) de la cepa BIE252.
La Figura 20b exhibe la conversión de azúcar (tasa) de un aislado de colonia individual de la cepa BIE252 después de cultivar por más de 100 generaciones en medio YEP con glucosa al 2%.
La Figura 20c exhibe la conversión de azúcar (tasa) de un aislado de colonia individual de la cepa BIE252 después de cultivo por más de 100 generaciones en medio YEP con glucosa al 2%.
La Figura 21 exhibe el mapa físico del plásmido pPWT148.
La Figura 22 exhibe el mapa físico del plásmido pPWT152.
La Figura 23 exhibe un gel CHEF teñido con bromuro de etidio. Se separaron los cromosomas por tamaño usando la técnica de CHEF. Las cepas que se analizaron son BIE104 (célula de levadura sin transformar) , BIE104A2Pla (transformante primario incapaz de consumir arabinosa, sinónimo de BIE104A2P1) , BIE104A2P1C, una cepa que deriva de BIE104A2P1 mediante evolución adaptativa, que es capaz de crecer en arabinosa, cepa BIE201, que deriva de BIE104A2P1C mediante evolución adaptativa, que puede crecer sobre arabinosa bajo condiciones anaeróbicas y la cepa BIE252, que es una cepa de azúcares mixtos . Se observan desplazamientos de los cromosomas (véase el texto) . La cepa YNN295 es una cepa marcadora (Bio-Rad) , que se usa como referencia para el tamaño de los cromosomas .
BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 exhibe la secuencia del plásmido pPWT018 SEQ ID NO: 2 exhibe la secuencia del cebador para la verificación de la integración de pPWT018.
SEQ ID NO: 3 exhibe la secuencia del cebador para la verificación de la integración de pPWT018 (con SEQ ID NO: 2) y para la verificación del número de copias de pPWT018 (con SEQ ID NO: 4) .
SEQ ID NO: 4 exhibe la secuencia del cebador para la verificación del número de copias de pPWT018 SEQ ID NO: 5 exhibe la secuencia del cebador para la verificación de la presencia de pPWT018 en el genoma en combinación con SEQ ID NO: 4.
SEQ ID NO: 6 exhibe la secuencia del cebador directo para la generación de la sonda SIT2 SEQ ID NO: 7 exhibe la secuencia del cebador reverso para la generación de la sonda SIT2 SEQ ID NO: 8 exhibe la secuencia del plásraido pP T080 SEQ ID NO: 9 exhibe la secuencia del cebador directo para la verificación de la integración correcta de pPWT080 al final del locus GRE3 (con SEQ ID NO: 10) y para la verificación del número de copias del plásmido pPWTOSO (con SEQ ID NO: 11) SEQ ID NO: 10 exhibe la secuencia del cebador reverso para la verificación de la integración correcta de pPWT080 al final del locus GRE3 SEQ ID NO: 11 exhibe la secuencia del cebador reverso para la verificación del número de copias del plásmido pPWT080 SEQ ID NO: 12 exhibe la secuencia del cebador directo para la generación de una sonda RKI1 SEQ ID NO: 13 exhibe la secuencia del cebador reverso para la generación de una sonda RKI1 SEQ ID NO: 14 exhibe la secuencia del plásmido pPWT042 SEQ ID NO: 15 exhibe la secuencia del cebador para la verificación de la integración de pPWT042 SEQ ID NO: 16 exhibe la secuencia del cebador para la verificación de la integración de pPWT042 SEQ ID NO: 17 exhibe la secuencia del cebador para la verificación de la integración de pPWT042 SEQ ID NO: 18 exhibe la secuencia del cebador para la verificación de la pérdida de marcador pPWT042 SEQ ID NO: 19 exhibe la secuencia del cebador para la amplificación del cásete xylA SEQ ID NO: 20 exhibe la secuencia del cebador para la amplificación del cásete xylA SEQ ID NO: 21 exhibe la secuencia del cebador para la amplificación del cásete kanMX SEQ ID NO: 22 exhibe la secuencia del cebador para la amplificación del cásete kanMX SEQ ID NO: 23 exhibe la secuencia de cebador para PCR cuantitativa SEQ ID NO: 24 exhibe la secuencia de cebador para PCR cuantitativa .
SEQ ID NO: 25 exhibe la secuencia de cebador para PCR cuantitativa SEQ ID NO: 26 exhibe la secuencia de cebador para PCR cuantitativa .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprende" e "incluye" y las variaciones tales como "comprende", "que comprende", "que incluye" son de interpretación en forma inclusiva. 0 sea que estas palabras intentan cubrir la posible inclusión de otros elementos o números enteros no mencionados específicamente, en donde el contexto lo permite.
Los artículos "un" y "uno" se usan en la presente para referirse a uno o más de uno (o sea a uno o al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento.
Las diferentes formas de realización de la invención que se describen en la presente se pueden combinar entre sí.
La composición de azúcares La composición de azúcares de acuerdo a la invención comprende glucosa, arabinosa y xilosa. Se puede usar cualquier composición de azúcares en la invención que cumpla con esos criterios. Azúcares opcionales para la composición de azúcares son galactosa y mañosa. En una forma de realización preferida, la composición de azúcares es un hidrolizado de uno o más materiales lignocelulósicos . La lignocelulosa en la presente incluye hemicelulosa y partes de hemicelulosa de biomasa. También la lignocelulosa incluye fracciones lignocelulósicas de biomasa. Se pueden encontrar materiales lignocelulósicos apropiados en la siguiente lista: iniciadores de huerta, chaparral, desechos de molino, desechos de madera urbanos, desechos municipales, desechos de podas, materiales de poda de bosques, cultivos de arbolados de rotación corta, desechos industriales, paja de trigo, paja de avena, paja de arroz, paja de cebada, paja de centeno, paja de lino, cáscara de soja, cascara de arroz, paja de arroz, alimento de gluten de trigo, cáscara de avena, azúcar de caña, residuos de maíz, cañas de maíz, mazorcas de maíz, vainas de maíz, pasto varilla, miscanthus, sorgo dulce, tallos de cañóla, tallos de soja, pasto de pradera, pasto gama, cola de zorro; pulpa de remolacha dulce, pulpa de frutas cítricas, cáscara de semillas, desechos animales celulósicos, recortes de césped, algodón, algas marinas, árboles, madera blanda, madera dura, álamo, pino, arbustos, hierbas, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, vainas de maíz, mazorcas de maíz, grano de maíz, fibra de granos, productos y subproductos de molido de granos secos o húmedos, desechos sólidos municipales, papel de desecho, desechos de patio, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, desechos sólidos municipales, desechos de papel, pulpa, residuos de molienda de papel, ramas, arbustos, cañas, maíz vainas de maíz, un cultivo energético, bosque, una fruta, una flor, un grano, una hierba, un cultivo herbáceo, una hoja, corteza, una espina, un tronco, una raíz, un árbol joven, un árbol achaparrado, pasto varilla, un árbol, un vegetal, piel de fruta, una vid, pulpa de remolacha dulce, cascarillas de trigo, cascara de avena, madera dura o blanda, material de desecho orgánico que se genera en un proceso industrial, desechos de madera de silvicultura, o una combinación de dos o más cualesquiera de los mismos.
En la Tabla 1 se da un resumen de algunas composiciones de azúcares apropiadas que derivan de lignocelulosa y la composición de azúcares de sus hidrolizados . Las lignocelulosas que se listan incluyen a: mazorcas de maíz, fibras de maíz, cascara de arroz, cáscara de melón, pulpa de remolacha dulce, paja de trigo, residuos de prensado de caña de azúcar, madera, hierbas y residuos de prensado de olivas.
Tabla 1: Resumen de composiciones de azúcares de materiales lignocelulósicos . Gal=galactosa, Xyl=xilosa, Ara=arabinosa, Man=manosa, Glu=glutamato, Rham=rhamnosa . Se da el porcentaje de galactosa (% de Gal) y la fuente de referencia . lignocelulosas hay presente una alta cantidad de azúcar en la forma de glucosa, xilosa, arabinosa y galactosa. La conversión de glucosa, xilosa, arabinosa y galactosa a producto de fermentación tiene por lo tanto una gran importancia económica. También hay presente mañosa en algunos materiales de lignocelulosa aunque usualmente en cantidades menores que los azucares que se mencionaron previamente. Ventajosamente, por lo tanto, la mañosa también es convertida por la célula de azúcares mixtos.
La célula de azúcares mixtos La célula de azúcares mixtos comprende entre dos y quince copias de uno o más genes de xilosa isomerasa o entre dos y quince copias de uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, y entre dos y quince copias de los genes araA, araB y araD, en donde estos genes están integrados en el genoma de la célula.
En una forma de realización, la célula de azúcares mixtos comprende aproximadamente ocho copias u ocho copias de xilosa isomerasa, en donde estos genes están integrados dentro del genoma de la célula de azúcares mixtos. En otra forma de realización, la célula de azúcares mixtos comprende ocho copias de una xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, en donde estos genes están integrados dentro del genoma de la célula de azúcares mixtos.
El número de copias puede ser determinado por una persona con experiencia mediante cualquier método conocido. En los ejemplos, se describe un método apropiado.
La célula de azúcares mixtos comprende entre dos y quince copias de los genes araA, araB and araD, en donde estos genes están integrados en el genoma de la célula, t es capaz de fermentar glucosa, arabinosa, xilosa y galactosa.
En una forma de realización, la célula de azúcares mixtos comprende dos copias, tres copias, cuatro copias, cinco copias, seis copias, siete copias, ocho copias, nueve copias o diez copias, entre dos y diez, entre dos y nueve, entre dos y ocho, entre dos y siente, entre dos y seis, entre dos y cinco, entre dos y cuatro, entre tres y diez, entre tres y nueve, entre tres y ocho, entre tres y siete, entre tres y seis, entre tres y cinco, entre cuatro y diez, entre cuatro y nueve, entre cuatro y ocho, entre cuatro y siete o entre cuatro y seis copias de cada uno de los genes araA, araB y araD, en donde estos genes están integrados en el genoma de la célula. En una forma de realización la célula de azúcares mixtos comprende aproximadamente cuatro, o cuatro copias de cada uno de los genes araA, araB y araD, en donde estos genes están integrados en el genoma de la célula.
En una forma de realización el número de copias del gen de xilosa isomerasa o xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa en la célula de azúcares mixtos es ocho o nueve. En una forma de realización el número de copias de los genes de araA, araB y araD en la célula de azúcares mixtos es 4 o 5.
En una forma de realización, la célula es capaz de convertir 90% o más de la glucosa, xilosa arabinosa, galactosa y mañosa disponible, en un producto de fermentación. En una forma de realización, la célula es capaz de convertir 91% o más, 92% o más, 94% o más, 95% o más, 96% o más, 97% o más, 98% o más o 100% de toda la glucosa, xilosa arabinosa, galactosa y mañosa disponibles, en un producto de fermentación.
En una forma de realización, la célula tiene una ruptura o delecíón del gen GAL80.
En una forma de realización de la invención la célula de azúcares mixtos es capaz de fermentar uno o más azúcares adicionales, preferentemente azúcar C5 y/o C6 por ejemplo mañosa. En una forma de realización de la invención la célula de azúcares mixtos comprende uno o más de: un gen xylA, gen XYL1 y gen XYL2 y/o gen XKS1, para permitir a la célula de azúcares mixtos fermentar xilosa; deleción del gen de aldosa reductasa (GRE3) ; sobreexpresión de genes PPP TAL1 , TKL1 , RPEl y RKIl para permitir el incremento del flujo a través de la ruta de las pentosas fosfato en la célula.
En una forma de realización, la célula de azúcares mixtos es una célula industrial, más preferentemente una levadura industrial . Una célula industrial y célula de levadura industrial se pueden definir como sigue. Los entornos vivientes de las células (de levadura) en los proceso industriales son significativamente diferentes de los de laboratorio. Las células de levadura industriales deben ser capaces de llevar desempeñarse bien bajo múltiples condiciones ambientales que pueden variar durante el proceso. Dichas variaciones incluyen cambios en las fuentes de nutrientes, pH, concentración de etanol, temperatura, concentración de oxígeno, etc., que juntos tienen un impacto potencial sobre el crecimiento celular y la producción de etanol de Saccharomyces cerevisiae . Bajo condiciones industriales adversas, las cepas tolerantes al entorno debieran permitir un crecimiento y producción robustos. Las cepas de levaduras industriales por lo general son más robustas a estos cambios de las condiciones ambientales que pueden existir en las aplicaciones en que se usan, tal como en la industria de la panadería, la industria cervecera, la industria de los vinos y la industria del etanol. En una forma de realización, la célula industrial de azúcares mixtos se construye en base a una célula huésped industrial, en donde la construcción se lleva a cabo como se describe más adelante en la presente. Los ejemplos de levaduras industriales {S. cerevisiae) son Ethanol Red® (Fermentis) Fermiol® (DSM) y Thermosacc® (Lallemand) .
En una forma de realización la célula de azúcares mixtos es tolerante a inhibidor. La tolerancia de inhibidores es la resistencia a compuestos de inhibición. La presencia y el nivel de los compuestos de inhibición en la lignocelulosa pueden variar ampliamente con la variación de la materia prima, método de pretratamiento y proceso de hidrólisis. Los ejemplos de categorías de inhibidores son ácidos carboxílieos , furanos y/o compuestos fenólicos. Los ejemplos de ácidos carboxílieos son ácido láctico, ácido acético o ácido fórmico. Los ejemplos de furanos son furfural y hidroxi- raetilfurfural . Los ejemplos de compuestos fenólicos son vanilina, ácido siríngico, ácido ferúlico y ácido cumárico. Las cantidades típicas de inhibidores son, para los ácidos carboxílicos : varios gramos por litro, hasta 20 gramos por litro o más, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de hidrólisis. Para los furanos : varios cientos de miligramos por litro hasta varios gramos por litro, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de hidrólisis.
Para los fenólicos: varias decenas de miligramos por litro, hasta un gramo por litro, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de hidrólisis.
Las cepas de azúcares mixtos de acuerdo a la invención son tolerantes a inhibidores, o sea las mismas puede soportar inhibidores comunes al nivel en que tienen típicamente con el pretratamiento y las condiciones comunes de hidrólisis, de modo que las cepas de azúcares mixtos pueden encontrar una amplia aplicación, o sea las mismas tienen alta aplicabilidad para diferentes materias primas, diferentes métodos de pretratamiento y diferentes condiciones de hidrólisis.
En una forma de realización, la célula industrial capaz de utilizar azúcares mixtos se construye en base a una célula huésped tolerante a inhibidores, en donde la construcción se lleva a cabo como se describe más adelante en la presente.
Las células huéspedes tolerantes a inhibidores se pueden elegir mediante cribado de cepas para crecimiento sobre materiales que contienen inhibidores, tal como se ilustra en Kadar et al, Appl . Biochem. Biotechnol. (2007), Vol . 136-140, 847-858, en donde se eligió la cepa tolerante a inhibidores S. cerevisiae ATCC 26602.
En una forma de realización, la célula de azúcares mixtos está libre de marcadores. Como se usa en la presente, el término "marcador" se refiere a un gen que codifica para un rasgo o fenotipo que permite la selección, o el cribado de una célula huésped que contiene el marcador. Libre de marcador significa que los marcadores están esencialmente ausentes en la célula de azúcares mixtos. Ser libre de marcadores es particularmente ventajoso cuando se han usado marcadores antibióticos en la construcción de la célula de azúcares mixtos y se los ha eliminado luego. La eliminación de los marcadores se puede hacer usando cualquier técnica apropiada del arte previo, por ejemplo, recombinación intramolecular. Un método apropiado para eliminación de marcador se ilustra en los ejemplos.
Una célula de azúcares mixtos puede ser capaz de convertir biomasa vegetal, celulosas, hemicelulosas , pectinas, rhamnosa, galactosa, frucosa, maltosa, maltodextrinas , ribosa, ribulosa, o almidón, derivados de almidón, sacarosa, lactosa y glicerol, por ejemplo en azúcares fermentables . Por consiguiente, una célula de azúcares mixtos puede expresar una o más enzimas tales como una celulasa (una endocelulasa o una exocelulasa) , una hemicelulasa (una endo- o exo-xilanasa o arabinasa) necesarias para la conversión de celulosa en monómeros de glucosa y hemicelulosa en monómeros de xilosa y arabinosa, una pectinasa capaz de convertir pectinas en ácido glucurónico y ácido galacturónico o una amilasa para convertir almidón en monómeros de glucosa.
La célula de azúcares mixtos además puede comprender aquellas actividades enzimáticas que se requieren para convertir piruvato al producto de fermentación que se desea, tal como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido itacónico, un aminoácido, 1 , 3 -propanodiol , etileno, glicerol, un antibiótico ß lactámico o una cefalosporina .
En una forma de realización, la célula de azúcares mixtos es una célula que naturalmente es capaz de fermentación alcohólica, preferentemente, fermentación alcohólica anaeróbica. Una célula de azúcares mixtos preferentemente tiene una alta tolerancia el etanol, una alta tolerancia al bajo pH (o sea capaz de crecer a un pH menor que aproximadamente 5 , aproximadamente 4 , aproximadamente 3 , o aproximadamente 2,5) y con orgánicos y/o una alta tolerancia a temperaturas elevadas.
Cualquiera de las características o actividades previas de una célula de azúcares mixtos puede estar presente en forma natural en la célula o se puede introducir o modificar por modificación genética.
Construcción de cepa de azúcares mixtos De acuerdo a una forma de realización, se pueden introducir los genes en la célula de azúcares mixtos mediante la introducción en una célula huésped de: a) una agrupación que consiste en los genes araA, araB y araD bajo el control de un promotor constitutivo fuerte b) una agrupación que consiste en los genes PPP TAL1, TKL1 , RPE1 y RKI1, opcionalmente bajo el control de un promotor constitutivo fuerte; y deleción de un gen de aldosa reductasa; c) una agrupación que consiste en un gen xylA y un gen XKS1 bajo el control de un promotor constitutivo fuerte; d) una construcción que comprende un gen xylA bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, que tiene la habilidad de integrarse al genoma en múltiples loci; y evolución adaptativa para producir la célula de azúcares mixtos. La célula anterior se puede construir usando técnicas de expresión recombinantes .
Expresión recombinante La célula de azúcares mixtos es una célula recombinante. 0 sea, una célula de azúcares mixtos comprende, o está genéticamente modificada con una secuencia de nucleótidos que no existe de manera natural en la célula de interés.
Las técnicas para la expresión recombinante de enzimas en una célula, así como también para las modificaciones genéticas adicionales de una célula de azúcares mixtos son bien conocidas para las personas con experiencia en el arte. Típicamente dichas técnicas involucran la transformación de una célula con construcción de ácidos nucleicos que comprende la secuencia relevante. Dichos métodos son, por ejemplo, conocidos a partir de textos estándar tales como Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ra edición) , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, o F. Ausubel et al., eds . , " Current protocols in molecular biology" , Green Publishing and iley Interscience, Nueva York (1987) . Los métodos para transformación y modificación genética de células huéspedes fúngicas son conocidos a partir de por ejemplo EP-A- 0635 574, WO 98/46772, WO 99/60102, WO 00/37671, O90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635574 y US 6.265.186.
Típicamente, la construcción de ácido nucleico puede ser un plasmido, por ejemplo un plásmido de bajo número de copias o un plásmido de alto número de copias . La célula de acuerdo a la presente invención puede comprender una copia simple o múltiples copias de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una enzima, por ejemplo mediante múltiples copias de una construcción de nucleótidos o mediante el uso de una construcción que tiene múltiples copias de la secuencia de la enzima.
La construcción de ácidos nucleicos se puede mantener episomalmente y por lo tanto comprende una secuencia para replicación autónoma, tal como una secuencia de replicación autosómica. Una construcción de ácido nucleico episomal apropiada puede por ejemplo basarse en los plásmidos de levadura 2µ o pKDl (Gleer et al., 1991, Biotechnology 9: 968-975), o los plásmidos AMA (Fierro et al., 1995, Curr Genet . 29:482-489). Alternativamente, cada construcción de acido nucleico se puede integrar en una o más copias en el genoma de la célula. La integración en el genoma de la célula puede ocurrir al azar mediante recombinación no homologa, pero preferentemente, la construcción de ácido nucleico se puede integrar en el genoma de la célula mediante recombinación homologa como bien se conoce en el arte (véase por ejemplo O90/14423, EP-A-0481008 , EP-A-0635 574 y US 6.265.186).
La mayoría de los plásmidos episomales o 2µ son relativamente inestables, perdiéndose en aproximadamente 1T2 o más células después de cada generación. Incluso bajo condiciones de crecimiento selectivo, solo el 60% de las células retienen el plásmido episomal. El número de copias de la mayoría de los plásmidos episomales está en el rango entre 20 y 100 por célula de huésped cir+. Sin embargo, los plásmidos no se distribuyen equivalentemente entre las células, y hay una alta varianza del número de copias por célula en las poblaciones. Las cepas transformadas con plásmidos integrativos son extremadamente estables, incluso en ausencia de presión selectiva. Sin embargo, la pérdida de plásmido ocurre a aproximadamente entre 10"3 y 10"4 frecuencias por recombinación homologa entre ADN repetitivo en tándem, lo que conduce a la pérdida por formación de bucle de la secuencia del vector. Preferentemente, el diseño del vector en el caso de integración estable es tal que, ante la pérdida de los genes marcadores de selección (que también ocurre mediante recombinación homologa intramolecular) esa pérdida por formación de bucle de la construcción integrada ya no es posible. Preferentemente los genes están, por lo tanto, integrados en forma estable. La integración estable se define en la presente como la integración dentro del genoma, en donde no es posible la pérdida por formación de bucle de la construcción integrada. Preferentemente los marcadores de selección están ausentes. Típicamente, la secuencia que codifica para la enzima estará conectada en forma operable con una o más secuencias de ácidos nucleicos, capaces de colaborar o de ayudar en la transcripción y/o traducción de la secuencia de la enzima.
El término "conectado en forma operable" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes que se describen están en una relación que les permite funcionar en la manera esperada. Por ejemplo, un promotor o potenciador está conectado en forma operable a una secuencia codificante de modo que dicho promotor o potenciador afecta la transcripción de la secuencia codificante.
Como se usa en la presente, el término "promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más genes, que se localiza corriente arriba con respecto a la dirección de transcripción del sitio de inicio de transcripción del gen, y que está estructuralmente identificado por la presencia de un sitio de unión para la ARN polimerasa dependiente de ADN, de sitios de inicio de la transcripción y de cualquier otra secuencia de ADN conocida por una persona con experiencia en el arte. Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo bajo la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está activo bajo regulación del ambiente o del desarrollo.
El promotor que se puede usar para conseguir la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica para una enzima de acuerdo a la presente invención, puede no ser natural de la secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima que se va a expresar, o sea un promotor que es heterólogo a la secuencia de nucleótidos (secuencia codificante) a la que el mismo está conectado en forma operable. Sin embargo, el promotor puede ser homólogo, o sea endógeno, a la célula huésped.
Los promotores están ampliamente disponibles y son conocidos para una persona con experiencia. Los ejemplos apropiados de dichos promotores incluyen a, por ejemplo, promotores de genes glicolíticos , tales como los promotores de fosfofructoquinasa (PFK) , triosa fosfato isomerasa (TPI) , gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa (GPD, TDH3 o GAPDH) , piruvato quinasa (PYK) , fosfoglicerato quinasa (PGK) de levaduras u hongos filamentosos; se pueden encontrar más detalles acerca de dichos promotores de levaduras en WO 93/03159. Otros promotores útiles son los promotores de genes que codifican para proteínas ribosomales, el promotor del gen de lactasa (LAC4) , promotores de alcohol deshidrogenasa (ADH1 , ADH4, y similares), y el promotor de enolasa (ENO) . Otros promotores, tanto constitutivos como inducibles, y potenciadores o secuencias de activación corriente arriba serán conocidos por las personas con experiencia en el arte. Los promotores que se usan en las células huéspedes de la invención se pueden modificar, si se desea, para afectar sus características de control. Promotores apropiados en este contexto incluyen tanto a promotores naturales constitutivos como inducibles como así también a promotores modificados por ingeniería, los cuales son bien conocidos por las personas con experiencia en el arte. Promotores apropiados para células huéspedes eucariotas pueden ser GAL!, GALIO, o GAL1 , CYC1, HIS3, ADH1 , PGL, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3 , LEU2, EN01 , TPI1, y A0X1. Otros promotores apropiados incluyen a PDC1, GPD1, PGK1, TEF1, y TDH3.
En una célula de azúcares mixtos, el extremo 3' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la enzima está preferentemente conectado en forma operable a la secuencia terminadora de la transcripción. Preferentemente la secuencia terminadora es operable en una célula huésped de elección, tal como por ejemplo las especies de levadura de elección. En cualquier caso, la elección del terminador no es crítica; el mismo puede ser, por ejemplo, de cualquier gen de levadura, a pesar de que a veces los terminadores pueden funcionar si son de un gen eucariota distinto a los de levadura. Usualmente, una secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima comprende un terminador. Preferentemente, dichos terminadores se combinan con mutaciones que previenen el decaimiento del ARNm mediado por elementos sin sentido en la célula huésped capaz de utilizar azúcares mixtos (véase por ejemplo: Shirley et al., 2002, Genetics 161:1465-1482).
La secuencia terminadora de la transcripción además preferentemente comprende una señal de poliadenilación .
Opcionalmente, puede haber presente un marcador de selección en una construcción de ácido nucleico apropiada para usar en la invención. Como se usa en la presente, el término "marcador" se refiere a un gen que codifica para un rasgo o un fenotipo que permite la selección de, o el cribado de una célula huésped que contiene al marcador. El gen marcador puede ser un gen de resistencia a antibióticos en donde se puede usar el antibiótico apropiado para seleccionar a células transformadas de entre células que no están transformadas. Los ejemplos de marcadores de resistencia a antibiótico incluyen a por ejemplo dihidrofolato reductasa, higromicina-B-fosfotransferasa, 3 ' -O- fosfotransferasa II (resistencia a kanamicina, neomicina y G418) . Los marcadores de resistencia a antibiótico pueden ser más convenientes para la transformación de células huéspedes poliploides. También se pueden usar marcadores no de resistencia a antibiótico, tales como marcadores auxotróficos ( URA3 , TRP1, LEU2) o el gen TPI de S. pombe (descrito por Russell P R, 1985, Gene 40: 125-130) . En una forma de realización preferida las células huéspedes transformadas con la construcción de ácido nucleico están libres de genes marcadores. Los métodos para construir células huéspedes microbianas recombinantes libres de genes marcadores se exponen en EP-A-0 635 574 y se basan en el uso de los marcadores bidireccionales tales como el gen de A. nidulans amdS (acetamidasa) o los genes de levadura URA3 y LYS2. Alternativamente, se puede incorporar un marcador cribable tal como Green Fluorescent Protein, lacL, luciferasa, cloramfenicol acetiltransferasa, beta-glucuronidasa en la construcción de ácido nucleico de la invención, lo que permite cribar las células transformadas.
Otros elementos adicionales que pueden estar presentes en la construcción de ácido nucleico apropiada para usar en la invención incluyen, pero no como limitación, a una o más secuencias líder, potenciadores , factores de integración, y/ genes reporteros, secuencias intrónicas, centrómeros, telómero y/o secuencias de pegado a matriz (MAR) . Las construcciones de ácido nucleico de la invención pueden comprender además una secuencia para replicación autónoma, tal como una secuencia ARS .
El proceso de combinación se puede ejecutar, por lo tanto, con técnicas de recombinación conocidas. Diferentes medios son conocidos para las personas con experiencia en el arte para la expresión y sobreexpresión de enzimas en una célula de azúcares mixtos. En particular, se puede sobreexpresar una enzima mediante el incremento del número de copias del gen que codifica para la enzima en la célula huésped, por ejemplo mediante la integración de copias adicionales del gen en el genoma de la célula huésped, mediante la expresión del gen desde un vector de expresión multicopia episomal o mediante la introducción de un vector de expresión episomal que comprende múltiples copias del gen.
Alternativamente, la sobreexpresión de enzimas en las células huéspedes de la invención se puede llevar a cabo mediante el uso de un promotor que no sea nativo de la secuencia codificante de la enzima a sobreexprear, o sea un promotor que sea heterólogo a la secuencia codificante a la que está conectado en forma operable. A pesar de que el promotor es preferentemente heterólogo a la secuencia codificante a la que está conectado en forma operable, también es preferible que el promotor sea homólogo, o sea endógeno a la célula huésped. Preferentemente el promotor heterólogo es capaz de producir un mayor nivel de estado estacionario del transcripto que comprende la secuencia codificante (o el mismo es capaz de producir más moléculas de transcripto, o sea moléculas de ARNm, por unidad de tiempo) de lo que lo hace el promotor que es nativo de la secuencia codificante. Promotores apropiados en este contexto incluyen tanto a promotores naturales constitutivos como inducibles así como también a promotores modificados por ingeniería.
En una forma de realización, la célula de azúcares mixtos está libre de marcadores, lo que significa que no hay presentes marcadores auxotroficos o dominantes, en particular marcadores de resistencia a antibióticos, en el genoma o extracromosomalmente .
La secuencia codificante que se usa para la sobreexpresión de las enzimas que se mencionaron previamente preferentemente puede ser homologa a la célula huésped. Sin embargo, se pueden usar secuencias codificantes que son heterólogas al huésped.
La sobreexpresión de una enzima, cuando se refiere a la producción de la enzima en una célula genéticamente modificada, significa que la enzima se produce a un nivel mayor de actividad enzimática específica en comparación con la célula huésped sin modificar bajo condiciones idénticas. Usualmente esto significa que la proteína activa enzimáticamente (o proteínas en el caso de enzimas con unidades múltiples) se produce en cantidades mayores, o bien a un nivel de estado estacionario mayor en comparación con la célula huésped sin modificar, bajo condiciones idénticas. Similarmente , esto usualmente significa que el ARNm que codifica para la proteína activa enzimáticamente se produce en mayores cantidades, o nuevamente a un nivel de estado estacionario mayor, en comparación con la célula huésped sin modificar bajo condiciones idénticas. Preferentemente en un huésped, se sobreexpresa una enzima a ser sobreexpresada mediante al menos un factor de aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica excepto por la modificación genética que causa la sobreexpresión. Se comprenderá que estos niveles de sobreexpresión se pueden aplicar al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima, al nivel de estado estacionario de la proteína de la enzima así como también al nivel de estado estacionario del transcripto que codifica para la enzima.
Adaptación Adaptación es el proceso evolutivo mediante el cual una población se convierte en más apropiada (adaptada) para su hábitat o hábitats . Este proceso tiene lugar a lo largo de entre varias y muchas generaciones, y es uno de los fenómenos básicos de la biología.
El término adaptación también se puede referir a una característica que es especialmente importante para la sobrevida de un organismo. Dichas adaptaciones se producen en una población variable por parte de las formas mejor adaptadas que se reproducen más exitosamente, mediante selección natural.
Los cambios de las condiciones ambientales alteran el resultado de la selección natural, lo que afecta los beneficios selectivos de adaptaciones subsiguientes que mejoran la aptitud de un organismo bajo las nuevas condiciones. En el caso de un cambio ambiental extremo, la aparición y la fijación de adaptaciones beneficiosas puede ser esencial para a supervivencia. Un gran número de diferentes factores, tales como por ejemplo disponibilidad de nutrientes, temperatura, disponibilidad de oxígeno, etcétera, pueden impulsarla evolución adaptativa.
Aptitud Hay una relación clara entre adaptabilidad (el grado al cual un organismo es capaz de vivir y reproducirse en un grupo dado de hábitats) y la aptitud. La aptitud es un estimado y un predictor de la tasa de selección natural. Mediante la aplicación de la selección natural, las frecuencias relativas de fenotipos alternativos variarán con el tiempo, si los mismos son heredables.
Cambios genéticos Cuando la selección natural actúa sobre la variabilidad genética de la población, los cambios genéticos son el mecanismo subyacente. Esto significa que la población se adapta genéticamente a sus circunstancias. Los cambios genéticos pueden resultar en estructuras visibles, o pueden ajustar la actividad fisiológica del organismo en un modo que se adapte al hábitat cambiado.
Puede ocurrir que los hábitats cambien con frecuencia. Por lo tanto, se entiende que el proceso de adaptación nunca está finalmente completado. Con el tiempo, puede pasar que el ambiente cambie gradualmente, y la especie se adapte a su entorno mejor y mejor. Por otro lado, puede pasar que los cambios en el ambiente ocurran con relativa rapidez, y entonces la especie se vuelva menos y menos bien adaptada. La adaptación es un proceso genético, que está ocurriendo todo el tiempo en alguna extensión, también cuando la población no cambia el hábitat o ambiente.
La evolución adaptativa Las células capaces de utilizar azúcares mixtos en su preparación se pueden someter a evolución adaptativa. Una célula de azúcares mixtos se puede adaptar a la utilización de azúcares mediante selección de mutantes, ya sea espontáneos o inducidos (por ejemplo mediante radiación o químicos) , para crecer en un azúcar deseado, preferentemente como única fuente de carbono, y más preferentemente bajo condiciones anaeróbicas. La selección de mutantes se puede llevar a cabo mediante técnicas que incluyen transferencia serial de cultivos como por ejemplo lo descrito por Kuyper et al. (2004, FEMS Yeast Res. 4: 655-664) o mediante cultivo bajo presión selectiva en un cultivo quimiostático . Por ejemplo en una célula huésped preferida, al menos una de las modificaciones genéticas descritas previamente, incluyendo a las modificaciones que se obtienen mediante selección de mutantes, confieren a la célula huésped la habilidad de crecer sobre xilosa como fuente de carbono, preferentemente como única fuente de carbono, y preferentemente bajo condiciones anaeróbicas . Cuando se usa XI como gen para convertir xilosa, preferentemente la célula esencialmente no produce xilitol, por ejemplo el xilitol que se produce está por debajo del límite de detección o por ejemplo es menos de aproximadamente 5 , aproximadamente 2 , aproximadamente 1 , aproximadamente 0.5, o aproximadamente 0.3 % del carbono que se consume en base molar.
La evolución adaptativa también se describe por ejemplo en Wisselink H.W. et al, Applied and Environmental Microbiology Agosto 2007, p. 4881-4891 En una forma de realización de evolución adaptativa se aplica un régimen que consiste en cultivo en lote repetido con ciclos repetidos de crecimiento consecutivo en medios diferentes, por ejemplo tres medios con diferentes composiciones (glucosa, xilosa, y arabinosa; xilosa y arabinosa. Véase Wisselink et al. (2009) Applied and Environmental Microbiology, Feb. 2009, p. 907-914.
Transformación de levaduras y estabilidad genética La ingeniería genética, o sea la transformación de células de levadura con ADN recombinante, se volvió posible durante los primeros tiempos de 1978 [Beggs, 1978; Hinnen et al., 1978] . La tecnología de ADN recombinante en levaduras se ha establecido desde entonces. Una multitud de diferentes construcciones de vectores están disponibles. Por lo general, estos vectores plasmídicos, denominados vectores lanzadera, contienen material genético que deriva de vectores de E.coli que consisten en un origen de replicación y un marcador estable (con frecuencia el gen de Slactamasa, ampR) , que les permite propagarse en E.coli antes de su transformación en células de levadura. Además, los vectores lanzadera contienen un marcador de selección para selección en levaduras. Los marcadores pueden ser genes que codifican para enzimas para la síntesis de una secuencia particular de aminoácidos o de nucleótidos, de modo que las células que portan la correspondiente deleción genómica (o mutación) se complementan para auxotrofía o autotrofía. Alternativamente, estos vectores contienen marcadores de resistencia dominantes heterólogos, que proveen a las células de levadura recombinantes (o sea las células que han incorporado el ADN y que expresan el gen marcador) resistencia hacia ciertos antibióticos, como g418 (Geneticina) , higromicina B o fleomicina. Además, estos vectores pueden contener una secuencia (combinada) de sitios de restricción (sitio de clonado múltiple o MCS) que permitirá clonar ADN foráneo en estos sitios, a pesar de que también existen métodos alternativos .
Tradicionalmente , se pueden distinguir cuatro tipos de vectores lanzadera por la ausencia o presencia de elementos genéticos adicionales: Plásmidos integrativos (YIp) que se integran por recombinación homologa dentro del genoma del huésped en un locus del gen marcador u otro gen, cuando este se abre mediante restricción y se usa el ADN linealizado para la transformación de células de levadura. Esto por lo general resulta en la presencia de una copia de ADN foráneo que se inserta en este sitio particular del genoma.
Plásmidos episomales (YEp) que portan parte de la secuencia de ADN del plásmido 2 µ que es necesaria para la replicación autónoma en las células de levadura. Se propagan múltiples copias del plásmido transformado en la célula de levadura y se mantienen como episomas.
Plásmidos de replicación autónoma (YRp) que portan un origen de replicación para levaduras (ARS, secuencia replicada autónomamente) que permite que los plásmidos transformados se propaguen varios cientos de veces.
Plásmidos CEN (YCp) que portan además de una secuencia ARS una secuencia centromérica (que deriva de uno de los cromosomas nucleares) que normalmente garantiza la segregación mitótica estable y que usualmente reduce el número de copias de plásmido autoreplicado a solo una.
Estos plásmidos se introducen en las células de levadura mediante transformación. La transformación de células de levadura se puede llevar a cabo mediante varias técnicas diferentes, tales como permeabilización de las células con acetato de litio (Ito et al, 1983) y métodos de electroporación.
En la aplicación comercial de microorganismos recombinantes , la inestabilidad del plásmido es el problema más importante. La inestabilidad es la tendencia de las células transformadas para perder sus propiedades logradas por ingeniería debido a cambios o a perdida de plásmidos . Este punto se discute en detalle en Zhang et al (Plasmid stability in recombinant Saccharomyces cerevisiae .
Biotechnology Advances, Vol. 14, No. 4, pp. 401-435, 1996). Las cepas transformadas con plásmidos integrativos son extremadamente estables, incluso en ausencia de presión selectiva (Sherman, F. http : //dbb . urmc . rochester . edu/labs/sherman f/yeast/9. html y referencias en la misma) .
El ADN heterólogo usualmente se introduce en el organismo en la forma de plásmidos extracromosomales (YEp, YCp y YRp) . Desafortunadamente, se ha hallado, tanto con bacterias como con levaduras, que no se pueden retener las nuevas características, especialmente si la presión de selección no se aplica en forma continua. Esto es debido a la inestabilidad segregacional del plásmido híbrido cuando las células recombinantes crecen durante un periodo de tiempo largo. Esto conduce a una heterogeneidad de la población y a variabilidad clonal, y eventualmente a una población celular en la que la mayoría de las células han perdido las propiedades que se introdujeron mediante la transformación. Si se usan vectores con marcadores auxotróficos , el cultivo en medios ricos con frecuencia conduce a una perdida rápida del vector, debido a que el vector solo se retiene en medio mínimo. La alternativa, el uso de marcadores de resistencia antibiótica dominante, con frecuencia no es compatible con los procesos de producción. El uso de antibióticos puede ser no deseable desde el punto de vista del registro (la posibilidad de que cantidades traza del antibiótico termine en el producto final) o por razones económicas (costos del uso de antibióticos a escala industrial) .
La pérdida de vectores conduce a problemas en situaciones de producción a gran escala. Existen para levaduras métodos alternativos para la introducción de ADN, tales como el uso de plásmidos integrativos (YIp) . El ADN se integra en el genoma huésped mediante recombinación, lo que resulta en una alta estabilidad. (Caunt, P. Stability of recombinant plasmids in yeast. Journal of Biotechnology 9 (1988) 173 - 192). Los inventores han hallado que un método de integración que usa los transposones del huésped es una buena alternativa.
Transposones De acuerdo a la invención, entre dos y quince genes de xilosa isomerasa o genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa se integran en el genoma de la célula de azúcares mixtos. En una forma de realización la introducción inicial (o sea antes de la evolución adaptativa) de múltiples copias se puede ejecutar de cualquier forma conocida en el arte que conduce a la introducción de los genes. En una forma de realización, esto se puede llevar a cabo usando un vector con partes homologas a secuencias repetitivas (transposones) , de la célula huésped. Cuando la célula huésped es una célula de levadura, las secuencias repetitivas adecuadas son las repeticiones terminales largas (LTR) del elemento Ty, conocido como secuencia delta.
Los elementos Ty caen dentro de dos subfamilias algo similares denominadas Tyl y Ty2. Estos elementos son de aproximadamente 6 kilobases (kb) de longitud y están unidos mediante repeticiones terminales largas (LTR) , secuencias de aproximadamente 335 pares de bases (Boeke JD et al, The Saccharomyces cerevisiae Genome Contains Functional and Nonfunctional Copies of Transposon Tyl. Molecular and Cellular Biology, Abr. 1988, p. 1432-1442 Vol . 8, No. 4). En la cepa totalmente secuenciada de S. cerevisiae, S288c, los transposones más abundantes son Tyl (31 copias) y Ty2 (13 copias) (Gabriel A, Dapprich J, Kunkel M, Gresham D, Pratt SC, et al. (2006) Global mapping of transposon location. PLoS Genet 2(12): e212.doi : 10.1371/journal .pgen.0020212) . Estos transposones consisten en dos marcos de lectura abiertos solapados (ORFs) , cada uno de los cuales codifica para varias proteínas. Las regiones codificantes están flanquedas por los antes mencionados, casi idénticos LTRs . Otros elementos Ty, pero menos abundantes y más distintos en S. cereviaise comprenden Ty3 , Ty4 y Ty5. Para cada familia de elementos Ty de longitud completa hay un orden de magnitud más de elementos LTR solos dispersos a lo largo del genoma. Se cree que estos surgen de recombinación LTR-LTR de elementos de longitud completa, con una escisión por formación de bucle de las regiones internas que codifican para proteínas.
El mecanismo de retrotransposición del retrotransposón Ty se ha usado para integrar múltiples copias a lo largo del genoma (Boeke et al., 1988; Jacobs et al., 1988). Las repeticiones terminales largas (LTR) del elemento Ty, conocido como secuencia delta, también son buenos blancos para la integración mediante recombinación homologa ya que los mismos existen en aproximadamente entre 150 y 200 copias que están o bien asociadas a Ty o sitios solos (Boeke, 1989; Kingsman and Kingsman, 1988) . (Parekh R.N. (1996) . An Integrating Vector for Tunable, High Copy, Stable Integration into the Dispersed Ty DELTA Sites of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol . Prog. 1996, 12, 16-21). Mediante adaptación evolutiva, el número de copias puede cambiar.
La célula huésped La célula huésped puede ser cualquier célula huésped que sea apropiada para la producción de un producto útil. Una célula huésped puede ser cualquier célula apropiada, tal como una célula procariota, tal como bacteria, o una célula eucariota. Típicamente, la célula será una célula eucariota, por ejemplo una levadura y un hongo filamentoso.
Las levaduras se definen en la presente como microorganismos eucariotas e incluyen a todas las especies de la subdivisión Eumycotina (Alexopoulos , C. J.,1962, In Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc. , Nueva York) que crecen predominantemente en forma unicelular.
Las levaduras pueden crecer o bien mediante brotación de un tallo unicelular o pueden crecer mediante fisión del organismo. Una levadura preferida como célula de azúcares mixtos puede pertenecer al género Saccharo yces, Kluyvero yces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces o Yarrowía. Preferentemente la levadura es una que sea capaz de fermentación anaeróbica, más preferentemente una capaz de fermentación alcohólica anaeróbica.
Los hongos filamentosos se definen como microorganismos eucariotas e incluyen a todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina. Estos hongos se caracterizan por un micelio vegetativo compuesto de quitina, celulosa, y otros polisacáridos complejos.
Los hongos filamentosos que son apropiados para usar como célula de la presente invención son morfológicamente, fisiológicamente y genéticamente distintos de las levaduras. Las células de hongos filamentosos pueden usarse de forma ventajosa debido a que la mayoría de los hongos no requieren de condiciones estériles para la propagación y son no sensibles a las infecciones por bacteriófagos. El crecimiento vegetativo de los hongos filamentosos es mediante elongación de hifas y el metabolismo del carbono de la mayoría de los hongos filamentosos es obligadamente aeróbico. Los hongos filamentosos preferidos como célula huésped pueden pertenecer al género Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Acremoniurra, Fusarium o Penicillium. Más preferentemente, la célula de hongo filamentoso puede ser una célula de Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, un Penicillium chrysogenum, o Rhizopus oryzae .
En una forma de realización la célula huésped puede ser levadura .
Preferentemente el huésped es una célula industrial, más preferentemente una levadura industrial. Un huésped industrial y una levadura industrial se pueden definir como sigue. Los ambientes vivientes de células de levadura en procesos industriales son significativamente diferentes de los del laboratorio. Las células de levadura industriales deben ser capaces de desempeñarse bien bajo múltiples condiciones ambientales que pueden variar durante el proceso. Dichas variaciones incluyen cambios en las fuentes de nutrientes, pH, concentración de etanol, temperatura, concentración de oxígeno, etc., que juntos tienen un impacto potencial sobre el crecimiento celular y la producción de etanol de Saccharomyces cerevisiae . Bajo condiciones industriales adversas, las cepas tolerantes al entorno debieran permitir un crecimiento y producción robustos. Las cepas de levaduras industriales por lo general son más robustas a estos cambios de las condiciones ambientales que pueden existir en las aplicaciones en que se usan, tal como en la industria de la panadería, la industria cervecera, la industria de los vinos y la industria del etanol . Los ejemplos de levaduras industriales (S. cerevisiae) son Ethanol Red® (Fermentis) Fermiol® (DSM) y Thermosacc® (Lallemand) .
En una forma de realización el huésped es tolerante a inhibidor. Las células huéspedes tolerantes a inhibidor se pueden seleccionar mediante el cribado de cepas para crecimiento sobre materiales que contienen inhibidores, tal como se ilustra en Kadar et al, Appl. Biochem. Biotechnol . (2007), Vol . 136-140, 847-858, en donde se seleccionó una cepa tolerante a inhibidor de S. cerevisiae ATCC 26602.
Genes araA, araB y araD Una célula de azúcares mixtos es capaz de usar arabinosa. Una célula de azúcares mixtos por lo tanto es capaz de convertir L-arabinosa y L-ribulosa y/o xilulosa 5-fosfato y/o a un producto de fermentación que se desea, uno de los que se mencionan en la presente.
Se pueden producir organismos, por ejemplo cepas de S. cerevisiae, capaces de producir etanol a partir de L-arabinosa mediante modificación de una célula por introducción de los genes araA (L-arabinosa isomerasa) , araB (L-ribuloquinasa) y araD (L-ribulosa-5-P4-epimerasa) a partir de una fuente apropiada. Dichos genes se pueden introducir en una célula de azúcares mixtos con el objetivo de que la misma sea capaz de usar arabinosa. Dicha estrategia se describe en WO2003/095627. Se pueden usar los genes araA, araB y araD de Lactobacillus plantanum y se los expone en WO2008/041840. Se pueden usar el gen araA de Bacillus subtilis y los genes araB y araD de Escheríchia coli y se los expone en EP1499708. En otra forma de realización, los genes araA, araB y araD pueden derivar de al menos uno de los del género Clavibacter, Arthrobacter y/o Gramella, en particular uno de Clavibacter michiganensis , Arthrobacter aurescens, y/o Gramella forsetii, como se expone en WO 2009011591. genes PPP Una célula de azúcares mixtos puede comprender una o más modificaciones genéticas que incrementan el flujo de la ruta de las pentosas fosfato. En particular, la(s) modificaciones genéticas pueden conducir a un flujo incrementado a través de la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato. Una modificación genética que cause un flujo incrementado de la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato se entiende en la presente como designando a la modificación que incrementa el flujo en al menos un factor de aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 en comparación con el flujo en una cepa que es genéticamente idéntica excepto por la modificación genética que causa el flujo incrementado. El flujo de la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato se puede medir mediante crecimiento del huésped modificado sobre xilosa como única fuente de carbono, determinando la tasa de consumo específico de xilosa y restando la tasa específica de producción de xilitol de la tasa específica de consumo de xilosa, si es que se produce xilitol. Sin embargo, el flujo de la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato es proporcional a la tasa de crecimiento sobre xilosa como única fuente de carbono, preferentemente con la tasa de crecimiento anaeróbico sobre xilosa como única fuente de carbono. Hay una relación lineal entre la tasa de crecimiento sobre xilosa como única fuente de carbono (umax) y el flujo de la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato. La tasa específica de consumo de xilosa (Qs) es igual a la tasa de crecimiento (µ) dividido por el rendimiento de biomasa en azúcar (Yxs) debido a que el rendimiento de biomasa en azúcar es constante (bajo un grupo de condiciones dadas: anaeróbico, medio de crecimiento, pH, fondo genético de la cepa, etc.; o sea Qs = µ/ Yxs) . Por lo tanto el flujo incrementado de la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato se puede deducir a partir del incremento de la tasa de crecimiento máxima bajo estas condiciones a pesar del transporte (la captación es limitante) .
Se pueden introducir una o más modificaciones genéticas que incrementen el flujo de la ruta de las pentosas fosfato en la célula huésped de varias maneras . Estas incluyen por ejemplo conseguir mayores niveles de actividad de estado estacionario de xilulosa quinasa y/o uno o más de las enzimas de la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato y/o un nivel reducido en estado estacionario de la actividad inespecífica de aldosa reductasa. Estos cambios en los niveles de actividad de estado estacionario pueden estar afectados por la selección de los mutantes (espontáneos o inducidos por químicos o por radiación) y/o mediante tecnología de ADN recombinante por ejemplo mediante sobreexpresión o inactivación, respectivamente, de genes que codifican para las enzimas o factores que regulan a estos genes .
En una célula huésped preferida, la modificación genética comprende la sobreexpresión de al menos una enzima de la (parte no oxidativa) ruta de las pentosas fosfato. Preferentemente la enzima se elige del grupo que consiste en las enzimas que codifican para ribulosa-5- fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa . Se pueden sobreexpresar diferentes combinaciones de las enzimas de la (parte no oxidativa) ruta de las pentosas fosfato. Por ejemplo las enzimas que se sobreexpresan pueden ser al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y ribulosa-5-fosfato epimerasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y transcetolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato epimerasa y transcetolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5 - fosfato epimerasa y transaldolasa; o al menos las enzimas transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5 - fosfato isomerasa, transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa- 5 - fosfato isomerasa, ribulosa- 5 - fosfato epimerasa, y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5- fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, y transcetolasa. En una forma de realización de la invención se sobreexpresa cada una de las enzimas ribulosa- 5- fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa en la célula huésped. Se prefiere más una célula huésped en donde la modificación genética comprende al menos la sobreexpresión de ambas enzimas transcetolasa y transaldolasa de modo que una célula huésped ahora es capaz de llevar a cabo crecimiento anaeróbico sobre xilosa. De hecho, bajo algunas condiciones las células huéspedes que sobreexpresan solo la transcetolasa y la transaldolasa ya tienen la misma tasa de crecimiento anaeróbico sobre xilosa como lo hacen las células huéspedes que sobreexpresan las cuatro enzimas, o sea la ribulosa- 5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa. Más aun, las células huéspedes que sobreexpresan ambas enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y ribulosa-5- fosfato epimerasa se prefieren sobre las células huéspedes que sobreexpresan solo la isomerasa o solo la epimerasa ya que la sobreexpresión de solo una de estas enzimas puede producir desbalances metabólicos.
La enzima "ribulosa 5-fosf to epimerasa" (EC 5.1.3.1) se define en la presente como una enzima que cataliza la epimerización de D-xilulosa 5-fosfato a D-ribulosa 5- fosfato y vice versa. La enzima también se conoce como fosforibulosa epimerasa; eritrosa-4 -fosfato isomerasa; fosfocetopentosa 3-epimerasa; xilulosa fosfato 3 -epimerasa; fosfocetopentosa epimerasa; ribulosa 5-fosfato 3- epimerasa; D-ribulosa fosfato-3-epimerasa; D-ribulosa 5-fosfato epimerasa; D-ribulosa-5-? 3 -epimerasa; D-xilulosa-5-fosfato 3-epimerasa; pentosa-5-fosfato 3 -epimerasa; o D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa. Una ribulosa 5-fosfato epimerasa también se puede definir por su secuencia de aminoácidos. De forma similar una ribulosa 5-fosfato epimerasa se puede definir por una secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima así como también por una secuencia de nucleótidos que hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica para una ribulosa 5-fosfato epimerasa. La secuencia de nucleótidos que codifica para ribulosa 5-fosfato epimerasa se designa en la presente como RPEl .
La enzima "ribulosa 5-fosfato isomerasa" (EC 5.3.1.6) se define en la presente como una enzima que cataliza la isomerización directa de D-ribosa 5-fosfato a D-ribulosa 5-fosfato y vice versa. La enzima también se conoce como fosfopentosisomerasa; fosforiboisomerasa; ribosa fosfato isomerasa; 5 - fosforibosa isomerasa; D- ribosa 5-fosfato isomerasa; D-ribosa-5-fosfato cetol-isomerasa; o D-ribosa-5-fosfato aldosa-cetosa- isomerasa . Una ribulosa 5-fosfato isomerasa también se puede definir por su secuencia de aminoácidos. De forma similar una ribulosa 5-fosfato isomerasa se puede definir por una secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima así como también por una secuencia de nucleótidos que hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica para una ribulosa 5-fosfato isomerasa. La secuencia de nucleótidos que codifica para ribulosa 5-fosfato isomerasa se designa en la presente como RKI1.
La enzima " transcetolasa" (EC 2.2.1.1) se define en la presente como una enzima que cataliza la reacción: D-ribosa 5-fosfato + D-xilulosa 5-fosfato <-> sedoheptulosa 7-fosfato + D-gliceraldehído 3-fosfato y vice versa. La enzima también se conoce como glicolaldehídotransferasa o sedoheptulosa-7-fosfato: D-gliceraldehído-3 -fosfato glicolaldehídotransferasa . Una transcetolasa también se puede definir por sus aminoácidos. De forma similar una transcetolasa se puede definir por una secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima así como también por una secuencia de nucleótidos que hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica para una transcetolasa. La secuencia de nucleótidos que codifica para transcetolasa se designa en la presente como TKL1.
La enzima " transaldolasa" (EC 2.2.1.2) se define en la presente como una enzima que cataliza la reacción: sedoheptulosa 7-fosfato + D-gliceraldehído 3-fosfato <-> D-eritrosa 4-fosfato + D-fructosa 6-fosfato y vice versa. La enzima también se conoce como dihidroxiacetonatransferasa; dihidroxiacetona sintasa; formaldehído transcetolasa; o sedoheptulosa-7-fosfato: D-gliceraldehído-3-fosfato glicerina transferasa. Una transaldolasa también se puede definir por su secuencia de aminoácidos. De forma similar una transaldolasa se puede definir por una secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima así como también por una secuencia de nucleótidos que hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica para una transaldolasa. La secuencia de nucleótidos que codifica para transcetolasa se designa en la presente como TAL1.
Genes de xilosa isomerasa o xilosa reductasa De acuerdo a la invención, entre dos y quince copias de uno o más genes de xilosa isomerasa y/o uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa se introducen en el genoma de la célula huésped. La presencia de estos entre dos y quince elementos genéticos confiere a la célula la habilidad de convertir xilosa mediante isomerización o reducción .
En una forma de realización, las entre dos y quince copias de uno o más genes de xilosa isomerasa se introducen en el genoma de la célula huésped.
Una "xilosa isomerasa" (EC 5.3.1.5) se define en la presente como una enzima que cataliza la isomerización directa de D-xilosa en D-xilulosa y/o vice versa. La enzima también se conoce como una D-xilosa cetoisomerasa . Una xilosa isomerasa de la presente también puede ser capaz de catalizar la conversión de D-glucosa y D-fructosa (y por consiguiente puede por lo tanto denominarse como una glucosa isomerasa) . Una xilosa isomerasa de la presente puede requerir un catión bivalente, tal como magnesio, manganeso y cobalto como cofactor .
Por consiguiente, dicha una célula de azúcares mixtos es capaz de isomerizar xilosa a xilulosa. La habilidad para isomerizar xilosa a xilulosa se confiere a la célula huésped mediante transformación de la célula huésped con una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una xilosa isomerasa definida. Una célula de azúcares mixtos isomeriza xilosa a xilulosa mediante la isomerización directa de xilosa a xilulosa.
Una unidad (U) de actividad de xilosa isomerasa se puede definir en la presente como la cantidad de enzima que produce 1 nmol de xilulosa por minuto, bajo condiciones como las que se describieron en Kuyper et al. (2003, FEMS Yeast Res. 4: 69-78) .
El gen de xilosa isomerasa puede tener diferentes orígenes, tales como por ejemplo de Pyromyces sp. como se expone en WO2006/00943 . Otros orígenes apropiados son Bacteroides, en particular Bacteroides uniformis como se describe en PCT/EP2009/52623 , Bacillus, en particular Bacillus stearothermophilus como se describe en PCT/EP2009/052625.
En otra forma de realización, los entre dos y quince copias de uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa se introducen en el genoma de la célula huésped. En esta forma de realización la conversión de xilosa se lleva a cabo en una conversión de dos pasos de xilosa a xilulosa a través de un intermediario de xilitol catalizado por xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, respectivamente. En una forma de realización de la misma, se pueden sobreexpresar xilosa reductasa (XR) , xilitol deshidrogenasa (XDH) , y xiloquinasa (XK) , y opcionalmente se activan uno o más de genes que codifican para enzimas que producen NADPH y se activan uno o más de los genes que codifican para enzimas que consumen NADH, como se expone en WO 2004085627.
Gen XKS1 Una célula de azúcares mixtos puede comprender una o más modificaciones genéticas que incrementan la actividad específica de xilulosa quinasa. Preferentemente la modificación o modificaciones genéticas causan la sobreexpresión de una xilulosa quinasa, por ejemplo mediante sobreexpresión de una secuencia de nucleótidos que codifica para una xilulosa quinasa. El gen que codifica para la xilulosa quinasa puede ser endógeno a la célula huésped o puede ser una xilulosa quinasa que es heterologa a la célula huésped. Una secuencia de nucleótidos que se usa para la sobreexpresión de xilulosa quinasa en la célula huésped es una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido con actividad de xilulosa quinasa.
La enzima "xilulosa quinasa" (EC 2.7.1.17) se define en la presente como una enzima que cataliza la reacción ATP + D-xilulosa = ADP + D-xilulosa 5-fosfato. La enzima también se conoce como una xiluloquinasa fosforilante, D-xiluloquinasa o ATP :D- xilulosa 5 - fosfotransferasa . Una xilulosa quinasa de la invención también se puede definir por su secuencia de aminoácidos. De forma similar una xilulosa quinasa se puede definir por una secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima así como también por una secuencia de nucleótidos que hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica para una xilulosa quinasa.
En una célula de azúcares mixtos, una modificación o modificaciones genéticas que incrementa (n) la actividad específica de xilulosa quinasa se puede combinar con cualquiera de las modificaciones que incrementan el flujo de la ruta de las pentosas fosfato como se describió previamente. Esto no es, sin embargo, esencial.
Por lo tanto, una célula huésped puede comprender solo una modificación genética o modificaciones genéticas que incrementen la actividad específica de xilulosa quinasa. Los diferentes medios disponibles en el arte para conseguir y para analizar la sobreexpresion de una xilulosa quinasa en las células huéspedes de la invención son los mismos que se describieron previamente para las enzimas de la ruta de las pentosas fosfato. Preferentemente en las células huéspedes de la invención, una xilulosa quinasa a sobreexpresarse se sobreexpresa mediante al menos un factor de aproximadamente 1.1, aproximadamente 1.2, aproximadamente 1.5, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica excepto por la (las) modificación (es) genética (s) que causan la sobreexpresioon. Se comprenderá que estos niveles de sobreexpresion se pueden aplicar al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima, al nivel de estado estacionario de la proteína de la enzima así como también al nivel de estado estacionario del transcripto que codifica para la enzima.
Deleción de gen de aldosa reductasa (GRE3) En una forma de realización, en donde XI se usa como gen para convertir xilosa, puede ser ventajoso reducir la actividad de aldosa reductasa. Una célula de azúcares mixtos por lo tanto puede contener una o más modificaciones genéticas que reduzcan la actividad inespecífica de aldosa reductasa en la célula huésped. Preferentemente, la actividad inespecífica de aldosa reductasa se reduce en la célula huésped mediante una o más modificaciones genéticas que reducen la expresión o que inactivan un gen que codifica para una aldosa reductasa inespecífica. Preferentemente, la(s) modificación (es) genética (s) reducen o inactiva la expresión de cada copia endógena de un gen que codifica para una aldosa reductasa inespecífica en la célula huésped (en la presente denominada deleción de GRE3) . Las células capaces de utilizar azúcares mixtos pueden comprender múltiples copias de genes que codifican para aldosas reductasas inespecíficas como resultado de di-, poli- o aneuploidía, y/o la célula huésped puede contener varias (iso) enzimas con actividad de aldosa reductasa que difieren en su secuencia de aminoácidos y que codifican cada una para un gen diferente. También en dichas instancias se reduce o se inactiva preferentemente la expresión de cada gen que codifica para una aldosa reductasa inespecífica. Preferentemente, el gen se inactiva mediante deleción de al menos parte del gen o mediante ruptura del gen, en donde en este contexto el término gen también incluye a cualquier secuencia no codificante corriente arriba o corriente abajo de la secuencia codificante, cuya deleción (parcial) o inactivación resulta en una reducción de la expresión de la actividad inespecífica de aldosa reductasa en la célula huésped.
Una secuencia de nucleótidos que codifica para una aldosa reductasa cuya actividad se va a reducir en la célula huésped es una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido con actividad de aldosa reductasa.
Por lo tanto, una célula huésped que comprende solo una modificación o modificaciones genéticas que reduzca (n) la actividad inespecífica de aldosa reductasa en la célula huésped está especialmente incluida en la invención.
La enzima "aldosa reductasa" (EC 1.1.1.21) se define en la presente como una enzima que es capaz de reducir xilosa o xilulosa a xilitol. En el contexto de la presente invención una aldosa reductasa puede ser cualquier aldosa reductasa inespecífica que sea nativa (endógena) a una célula huésped de la invención y que sea capaz de reducir xilosa o xilulosa a xilitol. Las aldosa reductasas inespecíficas catalizan la reacción : aldosa + NAD (P) H + H+ «? alditol + NAD(P) + La enzima tiene una amplia especificidad y también se conoce como aldosa reductasa; poliol deshidrogenasa (NADP+) ; alditol :NADP oxidoreductasa; alditol :NADP+ 1- oxidoreductasa; NADPH-aldopentosa reductasa; o NADPH-aldosa reductasa.
Un ejemplo particular de dicha aldosa reductasa inespecífica es endógena a S. cerevisiae y codifica para el gen GRE3 (Traff et al., 2001, Ap l . Environ. Microbiol . 67: 5668-74) . Por lo tanto, una aldosa reductasa de la invención también se puede definir por su secuencia de aminoácidos. De forma similar una aldosa reductasa se puede definir por la secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima así como también por una secuencia de nucleótidos que hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica para una aldosa reductasa.
Identidad de secuencia Se dice que las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos son homologas, cuando exhiben un cierto nivel de similitud. Dos secuencias que son homologas indican un origen evolutivo común. Si dos secuencias homologas están relacionadas cercanamente o más distantemente, está indicado por el "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", que es alto o bajo respectivamente. Aunque con disputas, la indicación de "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", "nivel de homología" o "porcentaje de homología", con frecuencia se usan en forma intercambiable.
Los términos "homología", "porcentaje de homología", "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud" se usan en forma intercambiable en la presente. Para el propósito de esta invención, se define en la presente que con el objetivo de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, se alinean las secuencias completas para propósitos de comparación óptima. Con el objetivo de optimizar el alineamiento entre las dos secuencia, se pueden introducir faltas de coincidencias en cualquiera de las dos secuencias que se comparan. Dichos alineamiento se lleva a cabo a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se están comparando. Alternativamente, El alineamiento se puede llevar a cabo sobre una longitud más corta, por ejemplo sobre aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más ácidos nucleicos/bases o aminoácidos. La identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias a lo largo de la región alineada que se informa.
Una comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático. La persona con experiencia será consciente del hecho de que hay disponibles varios programas de computación diferentes para alinear dos secuencias y determinar la homología entre dos secuencias (Kruskal, J. B. (1983) An overview of squence comparison In D. Sankoff y J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules : the theory and practice of sequence comparison, p. 1-44 Addison Wesley) . El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch para el alineamiento de dos secuencias. (Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). El algoritmo alinea secuencias de aminoácidos así como también secuencias de nucleótidos . El algoritmo de Needleman-Wunsch se ha implementado en el programa de computadora NEEDLE . Para el propósito de esta invención se usó el programa NEEDLE del paquete EMBOSS (versión 2.8.0 o superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp 276-277, http : //emboss . bioinformatics . ni/ ) . Para las secuencias de proteínas, se usó EBLOSUM62 como matriz de sustitución. Para las secuencias de nucleótidos, se usó EDNAFULL. Se pueden especificar otras matrices. Los parámetros óptimos que se usaron para el alineamiento de secuencias de aminoácidos son una penalidad por falta de coincidencia abierta de 10 y una penalidad por extensión de falta de coincidencia de 0.5. La persona con experiencia apreciará que todos estos diferentes parámetros darán resultados levemente diferentes pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se altera significativamente cuando se usan diferentes algoritmos.
Definición de homología global La homología o identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias completas a lo largo de la región alineada total que incluye cualquier falta de coincidencia o extensión. La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula como sigue: Número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestran un aminoácido idéntico e ambas secuencias dividido por la longitud total del alineamiento incluyendo las faltas de coincidencia. La identidad como se define en la presente se puede obtener de NEEDLE y se rotula a la salida del programa como "IDENTITY" .
Definición de identidad más larga La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula como sigue: número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido por la longitud total del alineamiento después de la sustracción del número total de faltas de coincidencia en el alineamiento. La identidad como se define en la presente se puede obtener de NEEDLE mediante el uso de la opción NOBRIEF y se rotula a la salida del programa como "identidad más larga" . Para los propósitos de la invención el nivel de identidad (homología) entre dos secuencias (de aminoácidos o de nucleótidos) se calcula de acuerdo a la definición de "identidad más larga" como se puede llevar acabo usando el programa NEEDLE.
Las secuencias de proteínas que se usan en la presente invención se pueden usar además como una "secuencia de consulta" para llevar a cabo una búsqueda contra bases de datos de secuencias, por ejemplo para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas se pueden llevar a cabo usando los programas BLAST. Los programas para llevar a cabo los análisis por BLAST están públicamente disponibles a través del National Center for Biotechnology Information (htt : //www. ncbi . nlm.nih.gov) . BLASTP se usa para secuencias de aminoácidos y BLASTN para secuencias de nucleótidos. El programa BLAST usa como parámetros por omisión: -Costo por falta de coincidencia abierta: por omisión = 5 para nucleótidos/ 11 para proteínas -Costo por extensión de falta de coincidencia: por omisión = 2 para nucleótidos/ 1 para proteínas -penalidad por no coincidencia de nucleótido: por omisión = -3 -Recompensa por coincidencia de nucleótido: por omisión = 1 -Valor esperado: por omisión = 10 -Tamaño de palabra: por omisión = 11 para nucleótidos/ 28 para megablast/ 3 para proteínas Más aun, el grado de identidad local (homología) entre la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de consulta y las secuencias homologas obtenidas se determina mediante el programa BLAST. Sin embargo, solo se comparan aquellos segmentos de secuencia para dar una coincidencia por sobre un cierto umbral. Por consiguiente el programa calcula la identidad solo para estos segmentos coincidentes. Por lo tanto, la identidad que se calcula de este modo se denomina como identidad local.
Producción de bioproductos A lo largo de los años se han hecho sugerencias para la introducción de diferentes organismos para la producción de bio-etanol a partir de azúcares de cultivo. En la práctica, sin embargo, todos los procesos de bioproducción de etanol han continuado usando las levaduras del género Saccharomyces como productores de etanol. Esto es debido a las muchas características atractivas de las especies de Saccharomyces para los procesos industriales, o sea, una alta capacidad de crecimiento anaeróbico con tolerancia a ácido, etanol y osmolaridad, y por supuesto, su alta capacidad fermentadora de alcoholes. Las especies de levaduras preferidas como células huéspedes incluyen a S. cerevisiae, S. bulderi , S. barnetti , S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus o K fragilis .
Una célula de azúcares mixtos puede ser una célula apropiada para la producción de etanol. Una célula de azúcares mixtos puede, sin embargo, ser apropiada para la producción de productos de fermentación distintos a etanol Dichos productos de fermentación no etanólicos incluyen a en principio, cualquier químico a granel o refinado que se pueda producir mediante un microorganismo eucariota tal como una levadura o un hongo filamentoso.
Una célula de azúcares mixtos que se puede utilizar para la producción de productos de fermentación no etanólicos es una célula huésped que contiene una modificación genética que resulta en una menor actividad de alcohol deshidrogenasa .
En una forma de realización la célula de azúcares mixtos se puede usar en un proceso en donde azúcares que se originan en lignocelulosa se convierten a etanol.
Lignocelulosa La lignocelulosa, que se puede considerar como una materia prima potencialmente renovable, por lo general comprende los polisacáridos celulosa (glucanos) y hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xyloglucanos) . Además, algo de la hemicelulosa puede estar presente como glucomananos , por ejemplo en materias primas que derivan de madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos a azúcares solubles, incluyendo tanto monómeros como multímeros, por ejemplo glucosa, celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, mañosa, rhamnosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico y otras hexosas y pentosas ocurre bajo la acción de diferentes anzimas que actúan en concierto.
Además, pectinas y otras sustancias pécticas tales como arabinanos pueden representar una proporción considerable de la masa seca de paredes celulares típicas de tejidos vegetales distintos a la madera (aproximadamente entre un cuarto y la mitad de la masa seca puede ser pectinas) .
Pretratamiento Antes del tratamiento enzimático, el material lignocelulósico se puede pretratar. El pretratamiento puede comprender exponer el material lignocelulósico a un ácido, una base, un solvente, calor, un peróxido, ozono, ruptura mecánica, afinado, molienda o despresurización rápida, o una combinación de dos o más cualquiera de los mismos. Este pretratamiento químico se combina frecuentemente con pretratamiento con calor, por ejemplo entre 150 y 220°C entre 1 y 30 minutos.
Hidrólisis enzimática El material pretratado comúnmente se somete a hidrólisis enzimática para liberar azúcares que se pueden fermentar de acuerdo a la invención. Esto se puede llevar a cabo con métodos convencionales, por ejemplo poniendo en contacto con celulasas, por ejemplo celobiohidrolasa (s ) , endoglucanasa ( s ) , beta-glucosidasa ( s ) y opcionalmente otras enzimas. La conversión con las celulasas se puede llevar a cabo a temperatura ambiente o a temperaturas más altas, a un tiempo de reacción para liberar suficientes cantidades de azúcar (es) . El resultado de la hidrólisis enzimática es un producto de hidrólisis que comprende azúcares C5/C6, en la presente designados como la composición de azúcares.
Fermentación El proceso de fermentación puede ser un proceso de fermentación aeróbico o anaeróbico. Un proceso de fermentación anaeróbico se define en la presente como un proceso de fermentación que se corre en ausencia de oxígeno o en donde sustancialmente no se consume oxígeno, o preferentemente se consume menos de aproximadamente 5, aproximadamente 2,5 o aproximadamente 1 mmol/L/h, más preferentemente 0 mmol/L/h (o sea el consumo de oxígeno no es detectable) , y en donde las moléculas orgánicas sirven tanto como donores de electrones como aceptores de electrones. En ausencia de oxígeno, el NADH que se produce en la glicolisis y la formación de biomasa, no se puede oxidar mediante la fosforilación oxidativa. Para resolver este problema, muchos microorganismos usan piruvato o uno de sus derivados como aceptor de electrones y de hidrógeno requiriendo por lo tanto NAD+.
Por lo tanto, en un proceso de fermentación anaeróbico preferido se usa piruvato como aceptor de electrones (e hidrógenos) y se reduce a productos de fermentación tales como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3 -hidroxi-propiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, un aminoácido, 1, 3-propano-diol, etileno, glicerol, un antibiótico ß-lactámico y una cefalosporina .
El proceso de fermentación se corre preferentemente a una temperatura que es óptima para la célula. Por lo tanto, para la mayoría de las células de levadura o de hongos, el proceso de fermentación se lleva a cabo a una temperatura que es menor que aproximadamente 42°C, preferentemente menos de aproximadamente 38°C. Para las células huéspedes de levaduras o de hongos filamentosos, el proceso de fermentación se lleva a cabo preferentemente a una temperatura que es menor que aproximadamente 35, aproximadamente 33, aproximadamente 30 o aproximadamente 28°C y a una temperatura que es mayor que aproximadamente 20, aproximadamente 22, o aproximadamente 25°C.
El rendimiento de etanol en xilosa y/o glucosa en el proceso preferentemente es de al menos aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 95 o aproximadamente 98%. El rendimiento de etanol se define en la presente como un porcentaje del rendimiento teórico máximo.
La invención también se relaciona con un proceso para producir a producto de fermentación.
El proceso de fermentación de acuerdo a la presente invención se puede correr bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas . En una forma de realización, el proceso se lleva a cabo bajo condiciones microaerófilas o limitadas en oxígeno .
Un proceso de fermentación anaeróbico se define en la presente como un proceso de fermentación que se corre en ausencia de oxígeno o en el que sustancialmente no se consume oxígeno, preferentemente menos de aproximadamente 5, aproximadamente 2.5 o aproximadamente 1 mmol/L/h, y en donde las moléculas orgánicas sirven tanto como donadores como aceptores de electrones.
Un proceso de fermentación limitado en oxígeno es un proceso en donde el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno desde el gas hacia el líquido. El grado de limitación de oxígeno se determina mediante la cantidad y composición del gas entrante así como también del de las propiedades de mezclado/transferencia de masa del equipo de fermentación que se usa. Preferentemente, en un proceso bajo condiciones limitadas de oxígeno, la tasa de consumo de oxígeno es de al menos aproximadamente 5.5, más preferentemente al menos aproximadamente 6, tal como al menos 7 mmol/L/h. Un proceso de la invención puede comprender la recuperación del producto de fermentación.
En un proceso preferido, la célula fermenta tanto la xilosa como la glucosa, preferentemente en forma simultánea en cuyo caso preferentemente se usa una célula que no es sensible a la represión por glucosa para prevenir el crecimiento diáuxico. Además de una fuente de xilosa (y glucosa) como fuente de carbono, el medio de fermentación además comprenderá el ingrediente apropiado que se requiere para el crecimiento de la célula. Las composiciones de medio de fermentación para el crecimiento de microorganismos tales como levaduras, son bien conocidos en el arte.
Los procesos de fermentación se pueden llevar a cabo en modo de lote, lote alimentado o continuo. También se puede aplicar un proceso de hidrólisis y fermentación (SHF) separados o un proceso de sacarificación y fermentación (SSF) simultáneos. También es posible una combinación de estos modos de procesos de fermentación para una óptima productividad. Estos procesos se describen a continuación en la presente en más detalle.
Modo SSF Para el modo . de Sacarificación y Fermentación Simultáneos (SSF) , el tiempo de reacción para el paso de licuefacción/hidrólisis o presacarificación es dependiente del tiempo para lograr un rendimiento deseado, o sea el rendimiento de conversión de celulosa y glucosa. Dichos rendimiento es preferentemente tan alto como sea posible, preferentemente 60% o más, 65% o más, 70% o más, 75% o más 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más, 96% o más, 97% o más, 98% o más, 99% o más, aun 99.5% o más o 99.9% o más.
De acuerdo a la invención se logran muy altas concentraciones de azúcar en el modo SHF y muy altas concentraciones de producto (por ejemplo etanol) en el modo SSF. En la operación por SHF la concentración de glucosa es de 25g/L o más, 30 g/L o más, 35g/L o más, 40 g/L o más, 45 g/L o más, 50 g/L o más, 55 g/L o más, 60 g/L o más, 65 g/L o más, 70 g/L o más , 75 g/L o más, 80 g/L o más, 85 g/L o más, 90 g/L o más, 95 g/L o más, 100 g/L o más, 110 g/L o más, 120 g/L o más e puede ser por ejemplo entre 25g/L y 250 g/L, entre 30gl/L y 200 g/L, entre 40 g/L y 200 g/L, entre 50 g/L y 200 g/L, entre 60 g/L y 200 g/L, entre 70 g/L y 200 g/L, entre 80 g/L y 200 g/L, 90 g/L , entre 80 g/L y 200 g/L.
Concentración de producto en modo SSF En la operación por SSF, la concentración de producto (g/L) depende de la cantidad de glucosa que se produce, pero esto no es visible debido a que los azúcares se convierten a producto en el SSF, y las concentraciones de productos se pueden relacionar con la concentración subyacente de glucosa por multiplicación con el rendimiento máximo teórico (Yps máximo en gramos de producto por gramo de glucosa) El rendimiento máximo teórico (Yps máximo en gramos de producto por gramo de glucosa) de un producto de fermentación se puede derivar de textos de bioquímica. Para etanol, 1 mol de glucosa (180 gramos) rinde de acuerdo a la vía normal de fermentación por glicolisis en levaduras 2 moles de etanol (= 2x46 = 92 gramos de etanol. El rendimiento máximo teórico de etanol en glucosa es por lo tanto de 92/180 = 0,511 gramos de etanol/gramos de glucosa.
Para butanol (MW 74 gramos/mol) o isobutanol, el rendimiento teórico máximo es de 1 mol de butanol por mol de glucosa. Por lo tanto, el Yps máximo para ( iso- ) butanol = 74/180 = 0.411 gramos de ( iso- ) utanol/gramos de glucosa.
Para el ácido láctico el rendimiento de fermentación para fermentación homoláctica es de 2 moles de ácido láctico (MW = 90 gramos/mol) por mol de glucosa. De acuerdo a esta estequiometria, el Yps máximo = 1 gramos de ácido láctico/gramos de glucosa.
Para otros productos de fermentación se puede hacer un cálculo similar.
Modo SSF En la operación por SSF la concentración de producto es de 25 g* Yps g/L /L o más, 30 * Yps g/L o más, 35 g* Yps /L o más, 40 * Yps g/L o más, 45 * Yps g/L o más, 50 * Yps g/L o más, 55 * Yps g/L o más, 60 * Yps g/L o más, 65 * Yps g/L o más, 70 * Yps g/L o más , 75 * Yps g/L o más, 80 * Yps g/L o más, 85 * Yps g/L o más, 90 * Yps g/L o más, 95 * Yps g/L o más, 100 * Yps g/L o más, 110 * Yps g/L o más, 120 g/L * Yps o más o puede ser por ejemplo entre 25 * Yps g/L y 250 * Yps g/L, entre 30 * Yps gl/L y 200 * Yps g/L, entre 40 * Yps g/L y 200 * Yps g/L, entre 50 * Yps g/L y 200 * Yps g/L, entre 60 * Yps g/L y 200 * Yps g/L, entre 70 * Yps g/L y 200 * Yps g/L, entre 80 * Yps g/L y 200 * Yps g/L, 90 * Yps g/L , entre 80 * Yps g/L y 200 * Yps g/L Por consiguiente, la invención provee un método para la preparación de un producto de fermentación, en donde el método comprende : degragadar lignocelulosa usando un método como se describe en la presente; y fermentar el material resultante, para de ese modo de preparar un producto de fermentación.
Producto de fermentación El producto de fermentación de la invención puede ser cualquier producto útil. En una forma de realización, el mismo es un producto que se elige del grupo que consiste en etanol, n-butanol, isobutanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxipropiónico , ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacónico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido adípico, un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptofano, treonina, y ácido aspártico, 1 , -propano-diol , etileno, glicerol, un antibiótico ß-lactámico y una cefalosporina, vitaminas, fármacos, suplementos para alimento animal, especialidades químicas, materias primas químicas, plásticos, solventes, combustibles, incluyendo biocombustibles y biogas o polímeros orgánicos, y una enzima industrial, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidoreductasa, una transferasa o una xilanasa. Por ejemplo, los productos de fermentación se pueden producir mediante células de acuerdo a la invención, siguiendo el arte previo para métodos de preparación de células y procesos de fermentación, cuyos ejemplos, sin embargo, no se deben interpretar como limitantes de la presente. El n-butanol se puede producir mediante células como se describe en WO2008121701 o WO2008086124 ; el ácido láctico como se describe en US2011053231 o US2010137551 ; el ácido 3 -hidroxipropiónico como se describe en WO2010010291 ; el ácido acrílico como se describe en WO2009153047 el ácido acético como se describe en ... , el ácido succínico como se describe en.... las células del mutante deficiente en fumarasa que fermentan glucosa acumularon ácido fumárico extracelular Recuperación del producto de fermentación Para la recuperación del producto de fermentación se usan tecnologías existentes. Para diferentes productos de fermentación son apropiados diferentes procesos de recuperación. Los métodos existentes para recuperar etanol de mezclas acuosas comúnmente usan técnicas de fraccionamiento y adsorción. Por ejemplo, se puede usar aun una cerveza para procesar un producto fermentado, que contiene etanol en una mezcla acuosa, para producir una mezcla enriquecida que contiene etanol que luego se somete a fraccionamiento (por ejemplo, destilación fraccionada u otras técnicas) . Luego, las fracciones que contienen las mayores concentraciones de etanol se pueden pasar a través de un absorbente para eliminar la mayoría, sino toda el agua remanente del etanol.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención: EJEMPLOS A menos que se indique lo contrario, los métodos que se describen en la presente son técnicas bioquímicas convencionales. Los ejemplos de manuales apropiados de metodología general incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995) , John Wiley & Sons, Inc.
Composición del medio Experimentos de cultivo. Las cepas de Saccharomyces cerevisiae se cultivan en un medio que tiene la siguiente composición: 0,67% (p/v) de base nitrogenada o medio sintético para levaduras (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992) y glucosa, arabinosa, galactosa o xilosa, o una combinación de estos sustratos, en concentraciones variables (los detalles pueden hallarse en los ejemplos respectivos; las concentraciones se expresan como el porcentaje en peso/volumen (p/v) ) . Para las placas con agar, al medio se le agrega 2% (p/v) de agar bacteriológico.
Producción de etanol Los precultivos se prepararon inoculando 25 mi del medio de Verduyn (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992) con la adición de glucosa al 2% en un frasco de agitación de 100 mi, con un cultivo madre congelado o con una colonia individual de una placa con agar. Después de incubar a 30°C en un agitador orbital (a 280 rpm) durante aproximadamente 24 horas, este cultivo se cosechó y se usó para determinar la evolución de CO2 y la producción de etanol en sendos experimentos .
Los cultivos para analizar la producción de etanol se llevaron a cabo a 30 °C, en 100 mi de un medio modelo sintético (el medio de Verduyn (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992), con 5% de glucosa, 5% de xilosa, 3,5% de arabinosa y 1% de galactosa) , en el dispositivo BAM (monitor de la actividad biológica, Países Bajos) . El pH del medio se ajustó en 4.2 con NaOH/H2S04 2 M antes de la esterilización. Al medio sintético para el cultivo anaeróbico se le agregaron 0.01 g l"1 de ergosterol y 0.42 g l"1 de Tween 80 disuelto en etanol (Andreasen y Stier. J. Cell Physiol. 41:23-36, 1953; y Andreasen y Stier. J. Cell Physiol. 43:271-281, 1954). El medio fue inoculado en una OD600 inicial de aproximadamente 2. Los cultivos se agitaron con un agitador magnético. Las condiciones anaeróbicas se desarrollaron rápidamente durante la fermentación, ya que los cultivos no fueron aireados. La producción de C02 se monitoreó constantemente. La conversión de los azúcares y la formación de los productos (etanol, glicerol) se analizaron por RMN. El crecimiento se monitoreó siguiendo la densidad óptica del cultivo a 600 nm, en un espectrofotómetro LKB Ultrospec K.
Transformación de S. cerevisiae La transformación de S. cerevisiae se realizó como se describe en Gietz y oods (2002; Transformation of the yeast by the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Methods in Enzymology 350 : 87-96) .
PCR de las colonias Se tomó una colonia individual aislada con un palillo plástico y se la suspendió nuevamente en 50 µ? de agua milliQ. La muestra se incubó durante 10 minutos a 99°C. Se usaron 5 µ? de la muestra incubada como molde para la reacción de PCR, donde se empleó la ADN polimerasa Phusion® (Finnzymes) , de acuerdo con las instrucciones provistas por el fabricante.
Condiciones para la reacción de PCR paso 1 3' 98°C paso 2 10" 98°C paso 3 15" 58°C se repiten los pasos 2 a 4 durante 30 ciclos paso 4 30" 72°C paso 5 4' 72°C paso 6 30" 20°C Aislamiento del ARN cromosómico Las células de levadura se cultivaron en un medio YEP que contenía 2% de glucosa, en un agitador rotativo (durante la noche, a 30°C y a 280 rpm en un agitador orbital) . Se transfirieron 1,5 mi de estos cultivos a un tubo Eppendorf y se centrifugó durante 1 minuto a velocidad máxima. Se decantó el sobrenadante y se suspendió nuevamente el precipitado en 200 µ? de un medio YCPS (0,1% SB3-14 (Sigma Aldrich, Países Bajos) en Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 m ) y 1 µ? de ARNasa (20 mg/ml de ARNasa A de páncreas bovino, Sigma, Países Bajos) . La suspensión celular se incubó durante 10 minutos a 65 °C. La suspensión se centrifugó en una centrífuga Eppendorf durante 1 minuto a 7000 rpm. Se descartó el sobrenadante. El precipitado se disolvió cuidadosamente en 200 µ? de CLS (EDTA 25 mM, 2% de SDS) y 1 µ? de ARNasa A. Después de incubar a 65°C durante 10 minutos, se enfrió la suspensión en hielo. Luego se agregaron 70 µ? de PPS (acetato de amonio 10 M) , y posteriormente se mezclaron exhaustivamente las soluciones en un agitador Vortex. Una vez completa la centrifugación (durante 5 minutos en una centrífuga Eppendorf a velocidad máxima) , se mezcló el sobrenadante con 200 µ? de isopropanol helado. Se precipitó rápidamente el ADN por centrifugación (durante 5 minutos a velocidad máxima) . El precipitado se lavó con 400 µ? de etanol al 70% helado. El precipitado se secó a temperatura ambiente y se disolvió en 50 µ? de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM) .
Transformación de las células de levadura por electroporación Las células de levadura se cultivaron inoculando 25 mi de un medio YEP que contenía 2% de glucosa con una colonia individual de levadura. El frasco se incubó durante la noche a 30°C.
Se determinó la densidad óptica a 600 nm y se transfirió la cantidad necesaria para obtener una densidad óptica de 0.2 a 100 mi de un medio YEP con 2% de glucosa. Las células se cultivaron durante 4-5 horas para alcanzar una densidad óptica de aproximadamente 1.2-1.3, lo que corresponde a 2 ó 3 generaciones. Se recolectaron las células por centrifugación y se suspendieron nuevamente en 28 mi de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.5) . Se agregaron 3 mi de una solución de LiAC 1 M (con un pH fijado en 7.5 con HAc concentrado) . Las células se agitaron suavemente en una incubadora rotativa (a 150 rpm y 30°C) durante 45 minutos. Después de agregar 500 µ? de una solución 1 M de DTT (ditiotreitol) , las células se incubaron una vez más bajo estas condiciones, durante 15 minutos. El volumen se llevó hasta 100 mi con agua milliQ helada estéril. Se recolectaron las células por centrifugación.
Se descartó el sobrenadante y se lavaron las células precipitadas con 50 mi de agua milliQ helada estéril, después de lo cual se las recolectó por centrifugación. Se aplicó un tratamiento de lavado subsiguiente con 30 mi de una solución 1 M de sorbitol helado. Después de la centrifugación, se descartó el sobrenadante y se suspendió nuevamente el precipitado celular en 4 mi de una solución 1 M de sorbitol helado. Después de la centrifugación, se descartó el sobrenadante y se suspendió nuevamente el precipitado celular en 300 µ? de una solución 1 M de sorbitol helado.
Para cada transformación, se transfieren 40 µ? de la suspensión celular a tubos Eppendorf helados. Se agrega el ADN para la transformación y 5 µ de ADN de esperma de salmón (como ADN de transporte) , con un volumen combinado máximo de 20 µ? . El ADN debería disolverse en TE. Se golpea cuidadosamente el tubo Eppendorf para mezclar los contenidos suavemente. Se transfieren los contenidos a una cubeta de electroporación enfriada con antelación (en hielo) con un orificio de 0.2 cm. Se aplica un pulso (usando, por ejemplo, un dispositivo de electroporación BioRad) de 1.5 kV, 200 Ohm y 25 F. La duración del pulso debería ser de aproximadamente 5 ms .
Las células se transfieren de inmediato a 200 µ? de sorbitol 1 M. Se agregan 4 mi de un medio YEP con 2% de glucosa y se incuba a 30°C durante 1 hora. Se recolectan las células por centrifugación, se descarta el sobrenadante y se suspende nuevamente el precipitado en 4 mi de sorbitol 1 M. Se recolectan las células por centrifugación, se descarta el sobrenadante y se suspende nuevamente el precipitado en 300 µ? de sorbitol 1 M. Las células se diluyen en la medida apropiada y se dispersan en placas de selección o se aplican sobre el medio de selección.
Prueba de aplicación de la levadura sobre hidrolizados reales Las muestras de rastrojos de maíz y de paja de trigo diluidas y tratadas con antelación con ácido se sometieron a una hidrólisis enzimática usando una preparación de celulasa experimental de amplio espectro, a 60 °C durante 3 días (72 horas) . El pH al comienzo de la hidrólisis fue de 5.0. El contenido de materia seca al comienzo de la hidrólisis fue de 10% p/p.
Las condiciones para la hidrólisis de las muestras de fibras de maíz tratadas con antelación fueron esencialmente idénticas, excepto que la temperatura empleada en la hidrólisis fue de 50 °C y el contenido de materia seca al comienzo de la hidrólisis fue de 13,8%.
Después de la hidrólisis (72 horas) , las muestras se dejaron enfriar hasta la temperatura ambiente. El pH se ajustó en 5.5 usando NaOH al 10%. Luego se agregó 1 mililitro de una solución con 200 gramos por litro de (NH4)2S04 y 1 mililitro de una solución con 100 gramos por litro de KH2P04. Finalmente, las muestras de levadura se procesaron de manera tal de obtener un contenido de materia seca de levadura de 1 gramo por kilogramo de hidrolizado. La evolución de C02 en el tiempo se siguió usando un dispositivo AFM (monitor de la fermentación del alcohol; HaloteC Instruments BV, Veenendaal, Países Bajos) . Los experimentos se llevaron a cabo al menos por triplicado, durante 72 horas a 33 °C. Se tomaron muestras de una de las réplicas a intervalos regulares para poder analizar la formación de etanol y las concentraciones de azúcares residuales. Estos datos pueden usarse para calcular los rendimientos de la fermentación. No se toman muestras del caldo de los otros dos experimentos. En lugar de esto, al final de la fermentación, el caldo se destila usando una unidad de destilación Buchi K-355, con 45% de vapor durante 15 minutos. El alcohol producido se determina usando un medidor de densidad Antón Paar DMA 5000 (Antón Paar Benelux BVBA, Dongen, Países Bajos) .
PCR cuantitativa Se llevaron a cabo reacciones de PCR cuantitativa para determinar la cantidad de copias de los genes que estaban presentes en el genoma, especialmente en el caso de los genes de xilosa isomerasa. Con este propósito, se usó el sistema Bio-Rad iCycler iQ de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EEUU) . Se empleó el reactivo iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) . Los experimentos se prepararon como se sugiere en el manual del proveedor. Como cebadores para detectar el gen de la xilosa isomerasa, se usaron los cebadores de SEQ ID N° 23 y SEQ ID N° 24.
A continuación se detallan las condiciones de la PCR. una incubación a 95 °C durante 3 minutos 40 ciclos de 10 segundos a 95°C, 45 segundos a 58°C y 45 segundos a 72 °C una incubación a 95 °C durante 1 minuto una incubación a 65 °C durante 1 minuto La curva de fusión se determina comenzando a medir la fluorescencia a 65 °C durante 10 segundos. La temperatura se incrementa 0.5°C cada 10 segundos, hasta que se alcanza una temperatura de 95 °C. La cantidad de copias del gen de interés puede calcularse y/o estimarse a partir de las lecturas. El método presenta limitaciones con relación a la determinación precisa de una cantidad de copias superior a un umbral determinado, como ha de ser conocido para aquellos versados en la técnica.
Ejemplo 1. Construcción de la cepa BIE104A2P1 1.1. Construcción de un vector de expresión que contenía los genes de la vía de la arabinosa El plásmido pPWT018, que se ilustra en la figura 2, se construyó como se describe a continuación. Se digirió el vector pPWT006 (figura 1, que consiste en un locus SIT2 (Gottlin-Ninfa y Kaback (1986) Molecular and Cell Biology, vol . 6, N° 6, 2185-2197) y los marcadores que permiten seleccionar las transformantes con el antibiótico G418, y que confiere la capacidad de crecimiento en acetamida) con las enzimas de restricción BsiWl y Mlul . El marcador kanMX, que confiere resistencia a G418, se aisló a partir de p427TEF (Dualsystems Biotech) . En la literatura se ha descripto un fragmento que contiene el marcador amdS (Swinkels, B.W., Noordermeer, A.C.M. y Renniers, A.C.H.M (1995) The use of the amdS cDNA of Aspergillus nidulans as a dominant, bidirectional selection marker for yeast transformatio . Yeast, volumen 11, número 1995A, página S579; y US 6051431) . Los genes que codifican la arabinosa isomerasa (araA) , la L-ribuloquinasa (araB) y la L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa (ara£>) de Lactojacillus plantarum, que se describen en la solicitud de patente WO2008/041840 , fueron sintetizados por BaseClear (Leiden, Países Bajos) . Se sintetizó un fragmento grande que alojaba los tres genes que se mencionaron con anterioridad, bajo el control de promotores fuertes de S. cerevisiae (o en unión operativa con ellos) , es decir, el promotor TDH3 , que controla la expresión del gen araA, el promotor ENOl , que controla el gen araB, y el promotor PGJ1, que controla el gen araD. Este fragmento estaba rodeado por las enzimas de restricción únicas Acc&ST. y Mlul. pP T006, que contenía el fragmento clonado, se digirió con Mlul y BsiWI para obtener el plásmido pPWT018 (figura 2) . La secuencia del plásmido pPWT018 se detalla en SEQ ID N° 1. 1.2. Transformación de la levadura Se transformó CEN.PK113-7D (MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2) con el plásmido pPWT018, que había sido linealizado con antelación con Sfil (New England Biolabs) , de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se introdujo un sitio sintético para Sfil en el flanco 5' del gen SIT2 (véase la figura 2) . Las mezclas para la transformación se sembraron en agar YPD (10 gramos por litro de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa, 20 gramos por litro de agar) que contenía 100 pg de G418 (Sigma Aldrich) por mi. Después de 2-4 días, aparecieron colonias en las placas, mientras que el control negativo (es decir, la muestra en la que no se había colocado ADN durante el experimento de transformación) resultó en placas YPD/G418 vacías. La integración del plásmido pPWT018 tuvo lugar en el locus SIT2. Las transformantes se caracterizaron usando técnicas de PCR y de transferencia Southern.
Las reacciones de PCR para determinar la integración correcta de una copia del plásmido pPWT018 se llevaron a cabo con los cebadores de SEQ ID N° 2 y SEQ ID N° 3 y de SEQ ID N° 3 y SEQ ID N" 4. Con el par de cebadores de SEQ ID N° 2 y SEQ ID N° 3 se verificó la integración correcta en el locus SIT2. Si el plásmido pPWT018 se hubiera integrado en múltiples copias (una integración de cabeza-a-cola) , el par de cebadores de SEQ ID N° 3 y SEQ ID N° 4 proveería un producto en la PCR. La ausencia de este producto en la PCR reflejaría la integración de una copia de pPWT018. Una cepa donde se integró una copia del plásmido pP T018 en el locus SIT2 se designó BIE104R2. 1.3. Rescate de los marcadores Para poder transformar la cepa de levadura con otras construcciones usando los mismos marcadores de selección, es necesario eliminar los marcadores de selección. El diseño del plásmido pPWT018 fue tal que, al integrarse pPWT018 en el cromosoma, las secuencias homologas quedaran próximas. Este diseño permite que los marcadores de selección se pierdan debido a la recombinación intramolecular espontánea entre estas regiones homologas .
Cuando ocurra el crecimiento vegetativo, tendrá lugar la recombinación intramolecular, pero en una frecuencia baja. La frecuencia de esta recombinación depende de la extensión de la homología y del locus en el genoma (resultados no publicados) . Después de realizar la transferencia consecutiva de una subfracción del cultivo a un medio fresco, se acumularán los recombinantes intramoleculares con el correr del tiempo.
Con este objetivo, se cultivó la cepa BIE104R2 en un medio YPD (10 gramos por litro de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa) a partir de una colonia individual aislada. Se usaron 25 µ? de un cultivo que se había desarrollado durante la noche para inocular un medio YPD fresco. Después de al menos cinco de estas transferencias en serie, se determinó la densidad óptica del cultivo y se diluyeron las células hasta una concentración de aproximadamente 5000 por mi. Se sembraron 100 µ? de la suspensión celular en un medio de carbono básico para levadura (Difco) que contenía KPi 30 mM (pH 6.8), 0.1% de (NH4)2S04, fluoro-acetamida 40 mM (Amersham) y 1.8% de agar (Difco) . Las células idénticas a las células de la cepa BIE104R2, es decir, las que no presentan una recombinación intracelular, todavía contienen el gen amdS. Para estas células, la fluoro-acetamida es tóxica. Estas células no podrán desarrollarse y no formarán colonias en un medio que contenga fluoro-acetamida . Sin embargo, si ha ocurrido la recombinación intramolecular, las variantes de BIE104R2 que hayan perdido los marcadores de selección podrán desarrollarse en el medio con fluoro-acetamida , ya que no podrán convertir la fluoro-acetamida en compuestos que inhiban el crecimiento. Estas células formarán colonias en el medio con agar.
Las colonias resistentes a fluoro-acetamida obtenidas se sometieron a un análisis de PCR con los cebadores de SEQ ID N° 2 y SEQ ID N° 3 y de SEQ ID N° 4 y SEQ ID N° 5. Los cebadores de SEQ ID N° 2 y SEQ ID N° 3 proveerán una banda cuando haya ocurrido la recombinación deseada de los marcadores de selección. Como resultado, el cásete con los genes araA, aras y araD bajo el control de promotores fuertes para levadura se habrá integrado en el locus SIT2 del genoma de la cepa huésped. En este caso, una reacción de PCR con los cebadores de SEQ ID N" 4 y SEQ ID N° 5 no debería resultar en un producto, ya que el cebador 4 actúa sobre una región que debería perderse debido a la recombinación. La obtención de una banda con estos últimos cebadores refleja la presencia del plásmido pP T018 completo en el genoma, lo que es indicativo de la ausencia de recombinación.
Si los cebadores de SEQ ID N° 2 y SEQ ID N° 3 no dan como resultado un producto en la PCR, habrá ocurrido la recombinación, pero de una manera tal que el plásmido pPWT018 completo habrá sido eliminado del genoma por recombinación. No solamente se habrán perdido los marcadores, sino también los genes relacionados con la arabinosa. De hecho, se habrá recuperado una levadura salvaje.
Los aislados que presentaron resultados en la PCR acordes con la integración de una copia de pPWT018 se sometieron a un análisis de transferencia Southern. El ADN cromosómico de la cepa CEN.PK113-7D y de las recombinantes correctas se digirió con EcoRI y Hindlll (digestión doble) .
Se preparó una sonda para SIT2 con los cebadores de SEQ ID N° 6 y SEQ ID N" 7, usando ADN cromosómico de la cepa CEN.PK113-7D como molde. El resultado del experimento de hibridación se ilustra en la figura 3.
En la cepa salvaje se observa una banda de 2.35 kb, lo que concuerda con el tamaño esperado del gen salvaje. Una vez ocurrida la integración y la pérdida parcial del plásmido pPWT018 por recombinación, ha de esperarse una banda de 1.06 kb. En efecto, se observa esta banda, como se ilustra en la figura 3 (carril 2) .
Una de las cepas que presentó el patrón de bandas correcto en la transferencia Southern (como puede deducirse a partir de la figura 3) es la cepa denominada BIE104A2. 1.4. Introducción de cuatro genes con expresión constitutiva de la vía no oxidativa de las pentosas fosfato Se transformó Saccharomyces cerevisiae BIE104A2, a partir de la cual se expresan de manera constitutiva los genes araA, araB y araD, con el plásmido pPWT080 (figura 4) . La secuencia del plásmido pPWT080 se detalla en SEQ ID N° 8. El procedimiento para la transformación y la selección, después de seleccionar una transformante con la integración de una copia, son idénticos a los que se describieron con anterioridad en las secciones 1.1, 1.2 y 1.3. En resumen, se transformó BIE104A2 con pPWT080 digerido con Sfil. Las mezclas para la transformación se sembraron en agar YPD (10 gramos por litro de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa, 20 gramos por litro de agar) que contenía 100 g de G418 (Sigma Aldrich) por mi .
Después de 2-4 días, aparecieron colonias en las placas, mientras que el control negativo (es decir, la muestra en la que no se había colocado ADN durante el experimento de transformación) resultó en placas YPD/G418 vacías.
La integración del plásmido pP T018 tuvo lugar en el locus GRE3. Las transformantes se caracterizaron usando técnicas de PC y de transferencia Southern. La integración correcta del plásmido pPWT080 en el locus GRE3 se verificó por PCR usando el par de cebadores de SEQ ID N° 9 y SEQ ID N° 10. Se empleó el par de cebadores de SEQ ID N" 9 y SEQ ID N° 11 para detectar la integración de una o múltiples copias del plásmido pPWT080. Para el análisis Southern, se preparó una sonda por PCR usando SEQ ID N° 12 y SEQ ID N° 13, de manera tal de amplificar una parte del gen RKI1 de S. cerevisiae . Junto con el gen RKI1 nativo, se obtuvo una señal adicional como resultado de la integración del plásmido pPWT080 (datos no presentados) Una transformante que presentó la integración correcta de una copia del plásmido pPWT080, de acuerdo con el patrón de hibridación esperado, se denominó BIE104A2F1. Con el fin de remover los marcadores de selección que se habían introducido mediante la integración del plásmido pPWTOSO, se cultivó la cepa BIE104A2F1 en un medio YPD, a partir de una colonia individual aislada. Se usaron 25 µ? de un cultivo que se había desarrollado durante la noche para inocular un medio YPD fresco. Después de cinco de transferencias en serie, se determinó la densidad óptica del cultivo y se diluyeron las células hasta una concentración de aproximadamente 5000 por mi. Se sembraron 100 µ? de la suspensión celular en un medio de carbono básico para levadura (Difeo) que contenía KPi 30 mM (pH 6.8), 0,1% de (NH4)2S04, fluoro-acetamida 40 mM (Amersham) y 1.8% de agar (Difco) . Las colonias resistentes a fluoro-acetamida se sometieron a un análisis de PCR con los cebadores de SEQ ID N° 9 y SEQ ID N° 10. En los casos donde se obtuvieron los perfiles de PCR correctos, se llevó a cabo un análisis de transferencia Southern para verificar la integración correcta, nuevamente usando la sonda del gen RKI1. Una de las cepas que presentó el patrón de bandas correcto en las transferencias Southern es la cepa que se conoce como BIE104A2P1.
Ejemplo 2. Evolución adaptativa para producir BIE104A2Plc y BIE201 en frascos de agitación 2.1. Evolución adaptativa (aeróbica) Se usó una colonia individual aislada de la cepa BIE104A2P1 para inocular un medio YNB (Difco) con la adición de 2% de galactosa. El precultivo se incubó durante aproximadamente 24 horas a 30°C y a 280 rpm en un agitador orbital. Las células se cosecharon y se inocularon en un medio YNB que contenía 1% de galactosa y 1% de arabinosa, con una OD600 inicial de 0,2 (figura 5). Las células se cultivaron a 30 °C y a 280 rpm en un agitador orbital. La densidad óptica a 600 nm se monitoreó de manera regular.
Cuando la densidad óptica alcanzó un valor de 5 , se transfirió una alícuota a un medio YNB fresco con la misma composición. La cantidad de células agregadas fue tal que la OD500 inicial del cultivo fue de 0.2. Una vez alcanzada una OD600 de 5, se transfirió una alícuota del cultivo a un medio YNB que contenía 2% de arabinosa como única fuente de carbono (momento que se indica con (1) en la figura 5) .
Al realizarse la transferencia al medio YNB con 2% de arabinosa como única fuente de carbono, fue posible observar crecimiento después de aproximadamente dos semanas. Cuando la densidad óptica a 600 nm alcanzó un valor de al menos 1, las células se transfirieron a un frasco de agitación con un medio YNB fresco al que se había agregado 2% de arabinosa, con una OD600 inicial de 0.2 (figura 5, día 28) .
Se realizaron tres transferencias consecutivas, como se indica en la figura 5. La cepa resultante, que podía desarrollarse con velocidad en arabinosa, se denominó BIE104A2P1C . 2.2. Evolución adaptativa (anaeróbica) Después de la adaptación al cultivo en arabinosa bajo condiciones aeróbicas, se inoculó una colonia individual de la cepa BIE104A2P1C en un medio YNB con la adición de 2% de glucosa. El precultivo se incubó durante aproximadamente 24 horas a 30°C y a 280 rpm en un agitador orbital. Las células se cosecharon y se inocularon en un medio YNB que contenía 2% de arabinosa, con una densidad óptica OD600 inicial de 0,2. Los frascos se cerraron con tapones impermeables para asegurar que hubiera condiciones de cultivo anaeróbicas una vez que se hubiera eliminado el oxígeno del medio y del espacio de cabeza. Cuando se alcanzó una OD600 mínima de 3, se transfirió una alícuota del cultivo a un medio YNB fresco que contenía 2% de arabinosa (figura 6) , en cada ocasión con una OD600 inicial con un valor de 0,2. Después de varias transferencias, la cepa resultante se denominó BIE104A2Pld (=BIE201) .
Ejemplo 3. Construcción de la cepa BIE201X9 3.1. Transformación de la cepa BIE201 La cepa BIE201 se transformó con el plásmido pPWT042. El mapa físico del plásmido pPWT042 se ilustra en la figura 7.
El plásmido pPWT042 (SEQ ID N° 14) contiene un inserto de 4630 bp que comprende un gen xylA de Bacteroides uniformis con un uso de codones optimizado bajo el control del promotor TPI1, así como un gen XKS1 de S. cerevisiae bajo el control del promotor TDH1. Antes de a transformación de BIE201, se linealizó pPWT042 usando la enzima de restricción Sfil, de acuerdo con las instrucciones provistas por el fabricante. Las mezclas de transformación se sembraron en agar YPD (10 gramos por litro de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa, 20 gramos por litro de agar) que contenía 100 pg de G418 (Sigma Aldrich) por mi .
Después de 2-4 días, aparecieron colonias en las placas, mientras que el control negativo (es decir, la muestra en la que no se había colocado ADN durante el experimento de transformación) resultó en placas YPD/G418 vacías.
Una vez digerido el plásmido pPWT042 con Sfil, su integración tuvo lugar en el locus SIT4 (Gottlin-Ninfa y Kaback (1986) Molecular and Cellular Biology Vol . 6, N° 6, 2185-2197) en el genoma . Las transformantes se caracterizaron usando técnicas de PCR y de transferencia Southern. Las reacciones de PCR con la ADN polimerasa Phusion® (Finnzymes) para determinar la integración correcta de una copia del plásmido pPWT042 se llevaron a cabo con los cebadores de SEQ ID N° 15 y 16 (con el fin de determinar la integración correcta de pPWT042 en el locus SIT4) y de SEQ ID N° 16 y 17 (con los que solamente aparecería una banda en el caso en que se hubieran integrado múltiples copias) . Una cepa con una copia del plásmido pPWT042 integrada en el genoma se denominó BIE201Y9. 3.2. Rescate de los marcadores Para remover los marcadores de selección que se habían introducido mediante la integración del plásmido pPWT042, se puso en práctica el procedimiento que se detalla a continuación. El diseño del plásmido pPWT042 es tal que, al integrarse pPWT042 en el cromosoma, las secuencias homólogas quedan próximas. Este diseño permite que los marcadores de selección se pierdan debido a la recombinación intramolecular espontánea entre estas regiones homólogas. Cuando ocurra el crecimiento vegetativo, tendrá lugar la recombinación intramolecular, pero en una frecuencia baja. La frecuencia de esta recombinación depende de la extensión de la homología y del locus en el genoma (resultados no publicados) . Después de realizar la transferencia consecutiva de una subfracción del cultivo a un medio fresco, se acumularán los recombinantes intramoleculares con el correr del tiempo.
Con este objetivo, se cultivó la cepa BIE201Y9 en un medio YPD con 2% de glucosa, a partir de una colonia individual aislada. Se usaron 25 µ? de un cultivo que se había desarrollado durante la noche para inocular un medio YPD fresco con 2% de glucosa. Después de cinco de transferencias en serie, se determinó la densidad óptica del cultivo y se diluyeron las células hasta una concentración de aproximadamente 5000 por mi. Se sembraron 100 µ? de la suspensión celular en un medio de carbono básico para levadura (Difco) que contenía KPi 30 mM (pH 6.8), 0.1% de (NH4)2S04, fluoro-acetamida 40 mM (Amersham) y 1.8% de agar (Difco) . Las células idénticas a las células de la cepa BIE201Y9, es decir, las que no presentan una recombinación intracelular, todavía contienen el gen amdS . Para estas células, la fluoro-acetamida es tóxica. Estas células no podrán desarrollarse y no formarán colonias en un medio que contenga fluoro-acetamida . Sin embargo, si ha ocurrido la recombinación intramolecular, las variantes de BIE201Y9 que hayan perdido los marcadores de selección podrán desarrollarse en el medio con fluoro-acetamida, ya que no podrán convertir la fluoro-acetamida en compuestos que inhiban el crecimiento. Estas células formarán colonias en el medio con agar.
Las colonias resistentes a fluoro-acetamida obtenidas se sometieron a un análisis de PCR con los cebadores de SEQ ID N° 15 y SEQ ID N° 16 y de SEQ ID N° 17 y SEQ ID N° 18. Los cebadores de SEQ ID N° 15 y SEQ ID N° 16 proveerán una banda cuando haya ocurrido la recombinación deseada de los marcadores de selección. Como resultado, los genes xylA y XKSl se habrán integrado en el locus SIT4. En este caso, una reacción de PCR con los cebadores de SEQ ID N° 17 y SEQ ID N° 18 no debería resultar en un producto, ya que el cebador 17 actúa sobre una región que debería perderse debido a la recombinación. La obtención de una banda con estos últimos cebadores refleja la presencia del plásmido pP T042 completo en el genoma, lo que es indicativo de la ausencia de recombinación .
Si los cebadores de SEQ ID N° 15 y SEQ ID N° 16 no dan como resultado un producto en la PCR, habrá ocurrido la recombinación, pero de una manera tal que el plásmido pP T042 completo ha sido eliminado del genoma por recombinación. No solamente se habrán perdido los marcadores, sino también los genes xylA y XKSl. De hecho, se habrá recuperado una levadura salvaj e .
Los aislados que presentaron los resultados esperados en la PCR se sometieron a un análisis de transferencia Southern (véase la descripción anterior) . Una de las cepas que presentó el patrón de bandas correcto en la transferencia Southern se denomina BIE201X9.
Ejemplo 4. Construcción y selección de la cepa BIE252 4.1. Amplificación del cásete con xylA Con el propósito de introducir copias adicionales del gen xylA en el genoma, se llevó a cabo una reacción de PCR usando la ADN polimerasa Phusion® DNA (Finnzymes) , con el plásmido pPWT042 como molde y los oligonucleótidos de SEQ ID N° 19 y SEQ ID N° 20 como cebadores. Con estos cebadores, se amplifica el cásete con xylA, que comprende el promotor TPI1, el gen xylA con un uso de codones optimizado y el terminador PMA1. El diseño de los cebadores es tal que los flancos del fragmento que se obtenga por PCR serán homólogos a las secuencias de consenso delta del transposón Ty-1 de la levadura. Estas secuencias pueden obtenerse en el NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y pueden alinearse usando un conjunto de software apropiado, tal como, por ejemplo, Clone Manager 9 Professional Edition (Scientific & Educational Software, Cary, EEUU) .
El cásete con xylA no contiene un marcador de selección con el que pueda seleccionarse la integración en el genoma. Con el fin de estimar la frecuencia de la transformación, se realizó una segunda transformación de control con el marcador kanMX. Para esto, se amplificó el cásete con kanMX a partir del plásmido p427TEF (Dualsystems Biotech) , en una reacción de PCR donde se usaron los cebadores de SEQ ID N° 21 y SEQ ID N° 22. 4.2. Transformación de BIE201X9 BIE201X9 se transformó de acuerdo con el protocolo de electroporación (que se describió con anterioridad) , con fragmentos que comprendían 30 µg del cásete con xylA (denominado X18-Tyl) o 10 pg del cásete con kanMX. La mezcla de transformación con kanMX se colocó en agar YPD (10 gramos por litro de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa, 20 gramos por litro de agar) que contenía 100 g de G418 (Sigma Aldrich) por mi. Después de 2-4 días, aparecieron colonias en las placas, mientras que el control negativo (es decir, la muestra en la que no se había colocado ADN durante el experimento de transformación) resultó en placas YPD/G418 vacías. La frecuencia de la transformación pareció ser superior a 600 colonias por pg del c sete con kanMX.
Se usó la mezcla de transformación con X18-Tyl para inocular un frasco de agitación que contenía 100 mi de un medio de Verduyn con la adición de 2% de xilosa. Como control, se usó el control negativo de la transformación (es decir, sin la adición de ADN en el experimento de transformación) . Los frascos de agitación se incubaron a 30 "C y a 280 rpm en un agitador orbital. El crecimiento se siguió midiendo la densidad óptica a 600 nm de manera regular.
El resultado de la curva de crecimiento se ilustra en la figura 8. Como puede observarse, entre los días 20 y 25, la densidad óptica en el frasco de agitación con X18-Tyl se incrementó de manera espectacular, mientras que el crecimiento en el control negativo aún estaba ausente. El día 25, se inoculó un frasco que contenía un medio de Verduyn fresco con la adición de 2% de xilosa, junto con una muestra del cultivo X18-Tyl, con una densidad óptica inicial a 600 nm de 0,15. A partir de la figura 8, queda claro que, cuando se realizó la re-inoculación, el cultivo comenzó a desarrollarse en xilosa de inmediato y rápidamente. Como era probable que el cultivo consistiera en una mezcla de subcultivos, es decir, que consistiera en células con diferencias en la cantidad de copias del cásete X18-Tyl y en la velocidad de crecimiento en xilosa, las células se diluyeron en agua milliQ y se sembraron en placas con agar YPD para obtener colonias individuales aisladas. Se evaluó la capacidad de las colonias individuales aisladas de utilizar distintas fuentes de carbono . 4.3. Selección de la cepa ???252 Con el propósito de seleccionar una cepa que hubiera adquirido una capacidad de crecimiento mejorada en xilosa como única fuente de carbono, sin perder su capacidad de utilizar otros azúcares importantes (glucosa, arabinosa y galactosa) , se sembraron nuevamente diez colonias individuales aisladas del cultivo de evolución adaptativa en agar YPD. Luego se realizó un precultivo en un medio YPD con la adición de 2% de glucosa. Los diez cultivos se desarrollaron durante la noche a 30°C y a 280 rpm. Se usaron alícuotas de cada cultivo para inocular un medio de Verduyn fresco con la adición de 2% de glucosa, 2% de xilosa, 2% de arabinosa o 2% de galactosa, con una densidad óptica inicial de 0,15. Como controles, en el experimento se incluyeron las cepas BIE201 y BIE201X9 y la población mixta (de la cual se habían obtenido las diez colonias individuales aisladas) . Las células se cultivaron a 30 °C y a 280 rpm en un agitador orbital. El crecimiento se evaluó sobre la base de mediciones de la densidad óptica a 600 nm. Los resultados de la densidad óptica a 600 nm después de 19 horas de incubación se presentan en la figura 9.
A partir de los resultados de figura 9, puede concluirse que el cultivo mixto y las diez colonias individuales aisladas presentan una mayor densidad óptica final a 600 nm en xilosa. Aunque estas cepas se desarrollaron en arabinosa como única fuente de carbono, la densidad óptica final a 600 nm fue menor que la que se obtuvo con las cepas progenitoras , BIE201 y BIE201X9, 19 horas después de la inoculación. Después de un crecimiento prolongado, durante varios días, se seleccionó la colonia 3 debido a que había alcanzado la densidad óptica más alta, en comparación con los cultivos de las otras colonias individuales aisladas (datos no presentados) . El crecimiento en xilosa no fue diferente entre las colonias evaluadas .
El cultivo de la colonia 3 se diluyó y se sembró en agar YPD . Se evaluó la capacidad de once colonias individuales aisladas de desarrollarse en un medio de Verduyn con la adición de 2% de arabinosa o 2% de xilosa. Con este fin, se llevó a cabo un precultivo en un medio de Verduyn con 2% de glucosa. Las células se cultivaron durante la noche a 30 °C y a 280 rpm en un agitador orbital. Se transfirió una alícuota a un medio de Verduyn con la adición de 2% de arabinosa o 2% de xilosa, en una densidad óptica inicial de 0,15. Como control, en esta prueba se incluyó un cultivo de la colonia 3. Las células se cultivaron durante la noche a 30°C y a 280 rpm en un agitador orbital. El crecimiento se evaluó sobre la base de mediciones de la densidad óptica a 600 nm. Los resultados de la densidad óptica a 600 nm después de 4 días de incubación se presentan en la figura 10.
A partir de los resultados, puede demostrarse que la colonia 3.7 alcanzó una densidad óptica en xilosa similar a la del cultivo control, la colonia 3. Además, su capacidad de desarrollarse en arabinosa como única fuente de carbono mejoró en gran medida con relación al cultivo de la colonia 3. Las otras colonias individuales aisladas también presentan un crecimiento mejorado en arabinosa, aparentemente a expensas de su capacidad de desarrollarse en xilosa. Al cultivo de la colonia individual aislada 3.7 se le asignó el nombre de cepa BIE252. Se determinó el SNP y la amplificación en BIE252 con procedimientos idénticos a los que se describen en la solicitud co-pendiente PCT que reivindica prioridad sobre EP10160647.3 , que se presentó el 19 de Abril de 2011. Con esta prueba, se demostró que BIE252 presenta los siguientes SNP: G1363T en el gen SSY1, A512T en el gen YJR154W, A1186G en el gen CEP3 y A436C en el gen GAL80. Son idénticos a los de BIE201. En BIE252 hay una amplificación en el cromosoma VII, que también se halla en BIE201. Esto se ilustra en la figura 23.
Ejemplo 5. Evaluación del desempeño en un BAM Para evaluar el desempeño de la cepa seleccionada, BIE252, se la inoculó en un medio de Verduyn que contenía 2% de glucosa. Como controles, se incluyeron las cepas BIE201 y BIE104PlY9mc . La primera es una cepa que puede fermentar glucosa, galactosa y arabinosa (véase la descripción anterior) , y la última es una cepa que puede fermentar glucosa, galactosa y xilosa.
Después de realizar una incubación durante la noche a 30°C y a 280 rpm en un agitador rotativo, se cosecharon las células por centrifugación y se llevaron a cabo cultivos para analizar la producción de C02 a 33 °C, en 100 mi de un medio de Verduyn con la adición de 5% de glucosa, 5% de xilosa, 3.5% de arabinosa y 1% de galactosa, en un BAM (monitor de la actividad biológica) . En un experimento, el experimento por lotes, las células se agregaron a 100 mi del medio de Verduyn que contenía los azúcares. En un segundo experimento, el experimento alimentado por lotes, se agregaron 100 mi del medio de Verduyn que contenía los azúcares a las células, a una velocidad de 3 mi por minuto. Se monitoreó la producción de C02 constantemente a intervalos regulares y se tomaron muestras para el análisis (se analizó la densidad óptica a 600 nm, el etanol y los azúcares residuales) . Las cepas BIE201 y BIE104PlY9mc se mezclaron en una proporción de 1:1, sobre la base de la densidad óptica, justo antes del experimento con el BAM.
Los resultados del experimento con el BAM se ilustran en las figuras 11, 12, 13, 14, 15 y 16.
El desempeño de las cepas mixtas (BIE201 y BIE104PlY9mc) en el modo alimentado por lotes (figura 11) refleja que, a pesar de que la xilosa y la arabinosa se acumulan en una medida determinada con el correr del tiempo, la velocidad de consumo es mayor que la velocidad de alimentación desde antes del final del período de alimentación (aproximadamente después de 33 horas) . Después de 72 horas, se ha convertido la totalidad de la arabinosa, pero no se ha consumido por completo la xilosa. La glucosa y la galactosa siempre se hallan en el nivel de detección o cerca de él, lo que refleja que estos azúcares resultan preferibles sobre las pentosas arabinosa y xilosa.
A partir del desempeño de la cepa BIE252, evaluado en el modo alimentado por lotes en el BAM (véase figura 12) , pueden comprobarse esencialmente las mismas características que para el cultivo de las cepas mixtas. Sin embargo, la xilosa y la arabinosa se acumulan en mayores concentraciones, pero la conversión subsiguiente en etanol tiene lugar a una velocidad mayor, lo que da como resultado la misma titulación de etanol y una producción acumulativa de C02 idéntica después de 120 horas (figura 13) .
En el modo por lotes, el desempeño de las cepas mixtas (BIE201 y BIE104PlY9mc) refleja que la glucosa se consume rápidamente después del inicio del experimento de fermentación (figura 14). Posteriormente, la galactosa, la arabinosa y la xilosa son fermentadas de manera concurrente. La galactosa se consumió después de aproximadamente 30 horas. La arabinosa también se consumió por completo después de aproximadamente 72 horas. Estos dos hechos constituyen una contribución significativa a la formación de C02 y etanol. El consumo de xilosa, y por lo tanto, la producción de etanol y C02, se desaceleró significativamente una vez agotada la arabinosa. La cepa BIE252 presentó un desempeño mejor en este aspecto (figura 15) . Inmediatamente después del agotamiento de la glucosa a las 10 horas, la galactosa, la arabinosa y la xilosa fueron fermentadas rápida y eficientemente de manera simultánea. Incluso después del agotamiento de la galactosa, las pentosas arabinosa y xilosa fueron fermentadas por completo de manera concurrente, lo que contribuyó a la producción de C02 y a la formación de etanol. La fermentación de todos los azúcares se completó después de aproximadamente 72 horas en el caso de la cepa BIE252. Esto resultó en una mayor producción acumulativa de C02 para la cepa BIE252, en comparación con el cultivo de las cepas mixtas (BIE201 y BIE104PlY9mc) , como se ilustra en la figura 16.
Ejemplo 6. Evaluación del desempeño en hidrolizados reales La evaluación del desempeño en hidrolizados reales se llevó a cabo usando la cepa BIE252, que se cultivó durante la noche en frascos de agitación que contenían un medio YEP con la adición de 2% de glucosa. Las células se cosecharon por centrifugación y se suspendieron nuevamente en una concentración de 50 gramos de materia seca por litro.
La materia prima evaluada consistió en lotes de fibras de maíz, de rastrojos de maíz y de paja de trigo. La hidrólisis y la fermentación se llevaron a cabo como se describe en la sección de materiales y métodos.
Los resultados se presentan en las figuras 17 (fibras de maíz) , 18 (rastrojos de maíz) y 19 (paja de trigo) . En el caso de los rastrojos de maíz y la paja de trigo, a partir de una materia prima con una cantidad relativamente baja de galactosa y arabinosa, que consistía principalmente en glucosa y xilosa, se observó la conversión de la totalidad de los azúcares en C02 y etanol en un período de 72 horas. En el caso de las fibras de maíz (figura 17) , hay una cantidad residual baja de arabinosa, galactosa y xilosa.
En las tablas a continuación se detalla el cálculo del r rendimiento de la fermentación sobre la base de los azúcares que se liberaron al final de la hidrólisis y la cantidad de etanol que se produjo al final de la fermentación.
Tabla 2. Azúcares totales liberados (g/1) , etanol producido (g/1) y rendimiento de etanol (getanoi/<Jazúcar) de la fermentación de BIE252, determinados en un BAM, a partir de distintos tipos de materia prima lignocelulosica *azúcares monoméricos liberados al comienzo fermentación El rendimiento general de la hidrólisis y la fermentación se calculó sobre la base de la cantidad de etanol que se produjo al final de la fermentación, que se determinó con un medidor de la densidad Antón Paar DMA 5000, y sobre la base de la cantidad de materia prima pretratada usada. Los valores se detallan en la tabla 3.
Tabla 3. Rendimiento general de la hidrólisis y la fermentación (galones de etanol por tonelada de materia seca) de BIE252, determinados en un BAM, a partir de distintos tipos de materia prima lignocelulosica Ejemplo 7. Evaluación de la estabilidad de la cepa BIE252 7.1. Estabilidad de la cepa BIE252 Con el fin de evaluar la estabilidad de la cepa BIE252, se usó una colonia individual aislada para inocular 25 mi de un medio YEP con 2% de glucosa. Se midió la densidad óptica del cultivo a 600 nm. El cultivo se incubó durante la noche a 30°C y a 280 rpm en un agitador rotativo.
Se determinó la densidad óptica después de incubar durante la noche. La cantidad de generaciones producidas durante las incubaciones se calculó sobre la base de los valores de la OD600 antes y después de la incubación. Se usaron 25 µ? de un cultivo que se había desarrollado durante la noche para inocular un frasco que contenía 25 mi de un medio fresco. El cultivo se incubó nuevamente bajo condiciones idénticas a las que se describieron con anterioridad. Se repitió el procedimiento hasta obtener un cultivo donde las células estaban separadas al menos cien generaciones de la colonia individual aislada inicial. Se seleccionó un medio YEP con la adición de 2% de glucosa debido a que, bajo estas condiciones, no se aplica presión de selección para mantener los genes introducidos en la cepa BIE252, que son necesarios para convertir la arabinosa y la xilosa .
El cultivo celular que se obtuvo después de al menos 100 generaciones se diluyó y se sembró en agar YPD . Se inocularon dos colonias individuales aisladas en un medio de Verduyn con 2% de glucosa. Como control, se incluyó la cepa progenitora BIE252. Los cultivos se incubaron durante la noche a 30°C y a 280 rpm en un agitador rotativo. Se usó una alícuota del cultivo que se había desarrollado durante la noche para inocular un frasco que contenía 25 mi de un medio de Verduyn con la adición de 1% de glucosa, 1% de xilosa, 0,7% de arabinosa, 0.3% de galactosa y 0.1% de mañosa, con una densidad óptica inicial de 0.15. A intervalos regulares, se tomaron muestras para realizar mediciones de la densidad óptica a 600 nm y para determinar los azúcares residuales por RMN. Los resultados, que se ilustran en las figuras 20a (el cultivo de BIE252 previo a la evaluación de la estabilidad) , 20b (el cultivo de una colonia de BIE252 después de más de 100 generaciones) y 20c (el cultivo de una segunda colonia de BIE252 después de más de 100 generaciones) , permiten demostrar que el comportamiento de las tres cepas cultivadas es virtualmente idéntico bajo las condiciones evaluadas. En otras palabras, el desempeño en este medio de cultivo no ha cambiado: la cepa todavía puede utilizar cinco azúcares diferentes con velocidades idénticas después de un cultivo durante más de 100 generaciones, lo que refleja que la cepa es genéticamente estable.
Además, se realizó un experimento de PCR cuantitativa (Q-PCR) para evaluar la cantidad de copias de BIE252 antes y después de 100 generaciones de cultivo en un medio YEP con la adición de 2% de glucosa. El análisis de Q-PCR se llevó a cabo usando el sistema Bio-Rad iCycler iQ de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EEUU). Se empleó el reactivo iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) . Los experimentos se prepararon como se sugiere en el manual del proveedor.
La estabilidad de la cepa BIE252 se evaluó determinando la cantidad de copias del gen xylA, que codifica la xilosa isomerasa. Como gen de referencia con una sola copia, se seleccionó el gen ACTl.
A continuación se detallan los cebadores que se emplearon para detectar los genes xylA y ACTl. cebador directo para xylA, SEQ ID N° 23 cebador inverso para xylA, SEQ ID N° 24 cebador directo para ACTl, SEQ ID N° 25 cebador inverso para ACTl, SEQ ID N° 26 Los resultados reflejan que la cantidad de copias en BIE252 es de aproximadamente 8 copias del gen xylA, con relación al gen ACTl. La cantidad de copias se determinó antes y después de un cultivo durante 100 generaciones en un medio YEP con la adición de 2% de glucosa, y pareció ser esencialmente igual, si se tienen en cuenta las limitaciones del análisis de PCR cuantitativa.
Se aisló el ADN cromosómico de diversas colonias, antes y después de 100 generaciones de cultivo en un medio YEP con la adición de 2% de glucosa. El ADN cromosómico se cortó con Xbal . Se realizó un análisis de transferencia Southern usando el producto de una PCR con el par de cebadores de SEQ ID N° 23 y SEQ ID N° 24 como sondas. A partir del autorradiogrrama resultante, puede demostrarse que el patrón de bandas no ha cambiado, lo que refleja que la cepa es genéticamente estable después de 100 generaciones de cultivo bajo condiciones no selectivas .
Experimento comparativo A 7.2. Estabilidad de BIE201X9 transformada con los vectores YEp e YCp La cepa BIE201X9 se transformó con los vectores pP T148 (un plásmido YCp) y pPWT152 (un plásmido YEp) . El mapa físico del plásmido pPWT148 se ilustra en la figura 21. El mapa físico del plásmido pPWT152 se ilustra en la figura 22. Las mezclas de transformación se sembraron en agar YPD (10 gramos por litro de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa, 20 gramos por litro de agar) que contenía 100 g de G418 (Sigma Aldrich) por mi. Después de 2-4 días, aparecieron colonias en las placas, mientras que el control negativo (es decir, la muestra en la que no se había colocado ADN durante el experimento de transformación) resultó en placas YPD/G418 vacías.
Se usaron tres colonias de cada transformación como una mezcla para evaluar la estabilidad. Con este propósito, se emplearon las colonias mixtas para inocular un medio YEP con la adición de 2% de glucosa y 100 g/ml de G418. Las células se incubaron durante la noche a 30°C y a 280 rpm en un agitador rotativo. La densidad óptica se midió a 600 nm. Se usó un cultivo que se había desarrollado durante la noche para inocular un medio YEP fresco con la adición de 2% de glucosa y un medio idéntico pero con la adición de 100 pg/ml de G418, hasta alcanzar una densidad óptica inicial a 600 nm de 0.02. Sobre la base de los datos que se proveen en la literatura (véase la descripción anterior) , se espera que la mayoría de células que hayan sido cultivadas en presencia de G418 (es decir, con la aplicación de presión de selección) retengan el plásmido. Sin embargo, en ausencia de G418, se espera que las células pierdan rápidamente el plásmido.
Los cultivos se incubaron durante la noche a 30 °C y a 280 rpm en un agitador rotativo. La densidad óptica se midió a 600 nm. Sobre la base de las mediciones de la densidad óptica, se calculó que el cultivo se había desarrollado durante 8 generaciones en ambos medios (es decir, con G418 y sin él) . Se realizaron diluciones y se las sembró en placas con el medio YPD, con 100 g/ml de G418 y sin él. Las placas se incubaron a 30°C durante aproximadamente dos días o durante un período más prolongado, según fuera necesario, para obtener colonias que pudieran observarse y contarse .
Además, se usaron 25 µ? de un cultivo que se había desarrollado durante la noche para inocular 25 mi de un medio YEP fresco con la adición de 2% de glucosa y un medio idéntico pero con la adición de 100 g/ml de G418. Los cultivos se incubaron durante la noche a 30°C y a 280 rpm en un agitador rotativo. La densidad óptica se midió a 600 nm. Sobre la base de las mediciones de la densidad óptica, se calculó que el cultivo se había desarrollado durante 8 generaciones adicionales en ambos medios (es decir, con G418 y sin él) . Se realizaron diluciones y se las sembró en placas con el medio YPD, con 100 pg/ml de G418 y sin él. Las placas se incubaron a 30 °C durante aproximadamente dos días o durante un período más prolongado, según fuera necesario, para obtener colonias que pudieran observarse y contarse .
Sobre la base de las colonias que se contaron en el agar YDP con G418 y sin él, se calculó la estabilidad después de 8 y 16 generaciones, en presencia o ausencia de G418. Los resultados se resumen en la tabla 4.
Tabla 4. Estabilidad de las cepas en el experimento comparativo A (% de clones resistentes a G418) BIE201X9- BIE201X9- pPWT148 pPWT152 % de clones resistentes a G418 4 12 después de 8 generaciones de cultivo en un medio YEP con 2% de glucosa % de clones resistentes a G418 1 5 después de 16 generaciones cultivo en un medio YEP con 2% de glucosa % de clones resistentes a G418 9 33 después de 8 generaciones cultivo en un medio YEP con 2% de glucosa y 100 g/ml de G418 % de clones resistentes a G418 28 40 después de 16 generaciones de cultivo en un medio YEP con 2% de glucosa y 100 µ /p?1 de G418 A partir de esta tabla, puede observarse que los plásmidos YCp e YEp (es decir, pPWT148 y pPWT152, respectivamente) no se mantienen de manera estable en las células de levadura transformadas, incluso cuando se aplica presión de selección durante el cultivo, en este caso, mediante la adición de G418 al medio de cultivo. Sin embargo, vale destacar que la pérdida del plásmido es mucho más severa en ausencia de presión de selección.
En combinación con el ejemplo 7, este experimento permite demostrar que la integración de los genes de la xilosa isomerasa en los cromosomas del genoma es necesaria para obtener transformantes estables de levadura.
Ejemplo 8. La supresión de GAL80 da como resultado una mejor conversión de la arabinosa En el ejemplo 4, se había demostrado que el SNP que se había identificado en el gen GAL80 presentaba un efecto positivo aditivo sobre el crecimiento en arabinosa si también había presente una amplificación de una parte del cromosoma VII .
GAL80 codifica un represor de la transcripción que participa en la regulación de la transcripción en respuesta a la galactosa (Timson DJ, et al. (2002) Biochem. J. 363 (parte 3):515-20). En combinación con Gal4p y Gal3p, Gal80p regula de manera coordinada la expresión de los genes que contienen un sitio de activación de GAL hacia el extremo 5' del promotor (UAS-GAL) , lo que afecta a los genes del metabolismo de GAL GALl, GALIO, GAL2 y GAL7 (puede hallarse una revisión en Lohr D, et al. (1995) FASEB J 9 ( 9 ) : 777 -87 ) . En las células nulas para gal80 se expresan de manera constitutiva genes GAL, incluso en medios no inductores (Torchia TE, et al. (1984) Mol. Cell Biol . 4 (8) : 1521-7) .
La hipótesis es que el SNP identificado en el gen GAL80 influye en la interacción entre Gal80p, Gal3p y Gal4p. Por consiguiente, la expresión de los genes del metabolismo de la galactosa, incluyendo GAL2 , que codifica la galactosa permeasa, cambiará con relación a una levadura con un alelo GAL80 salvaje. Gal2p (la galactosa permeasa) es el transportador principal para la arabinosa (Kou et al. (1970) J. Bacteriol. 103 (3 ): 671-678 ; Becker y Boles (2003) Ap l . Environ. Microbiol . 69(7): 4144-4150) .
Aparentemente, el SNP en el gen GAL80 presenta un efecto positivo sobre la capacidad de convertir L-arabinosa. Con el objeto de investigar si el fenotipo de crecimiento en arabinosa podía ser mejorado en mayor medida, se suprimió la secuencia codificante del gen GAL80 por completo usando una estrategia de reemplazo de genes mediada por PCR. 8.1. Alteración del gen GAL80 Se usaron los cebadores de SEQ ID N° 58 y 59 (los cebadores directo e inverso, respectivamente) para amplificar el marcador kanMX del plásmido p427-TEF (Dualsystems Biotech, Solieren, Suiza) . Los flancos de los cebadores son homólogos a la región 5' y la región 3 del gen GAL80. Una vez ocurrida la recombinación homologa, el ORF del gen GAL80 será reemplazado por el marcador kanMX, de una manera similar a la descripta por Wach (Wach et al. (1994) Yeast 10, 1793-1808) . El fragmento obtenido se conoce como el fragmento GAL80 : : kanMX .
La cepa de levadura BIE252 se transformó con el fragmento GAL80::kanMX purificado de acuerdo con el protocolo descripto por Gietz y Woods (2002) , Methods in Enzymology 350: 87-96). La construcción de la cepa BIE252 ha sido descripta en EP10160622.6. La cepa BIE252 es una cepa de S. cerevisiae que puede fermentar xilosa y arabinosa y que deriva de BIE201. La cepa BIE252 también contiene el SNP de GAL80.
Las células transformadas se sembraron en agar YEPD que contenía 100 yg/ml de G418 para la selección. Las placas se incubaron a 30 °C hasta observar colonias. Se incluyó el plásmido p427-TEF como control positivo y se obtuvieron numerosas colonias. Se incluyó MilliQ (es decir, sin ADN) como control negativo y no se obtuvieron colonias. Con el fragmento GAL80 : : kanMX, se obtuvieron numerosas colonias. Se evaluaron dos colonias independientes por medio de una transferencia Southern para verificar la integración correcta (datos no presentados) . Una colonia con la supresión correcta del gen GAL80 se denominó BIE252AGAL80. 8.2. Efecto del reemplazo del gen GAL80 sobre el desempeño en el BAM Se llevó a cabo un experimento con un BAM (monitor de la actividad biológica; Halotec BV, Veenendaal, Países Bajos) . Se usaron colonias individuales aisladas de la cepa BIE252 y la cepa BIE252AGAL80 (una transformante donde el ORF del gen GAL80 había sido reemplazado correctamente por el marcador kanMX) para inocular un medio de Verduyn (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992) con la adición de 2% de glucosa. Los precultivos se incubaron durante aproximadamente 24 horas a 30°C y a 280 rpm. Las células se cosecharon y se inocularon en un medio modelo sintético (un medio de Verduyn con la adición de 5% de glucosa, 5% de xilosa, 3.5% de arabinosa, 1% de galactosa y 0.5% de mañosa, pH 4.2), en una densidad celular de aproximadamente 1 gramo de peso seco por kg del medio. La producción de C02 se monitoreó constantemente. La conversión de los azúcares y la formación de los productos se analizaron por RMN. Los datos representan la cantidad residual de azúcares (glucosa, arabinosa, galactosa, mañosa y xilosa, en gramos por litro) en los puntos de tiempo indicados y la formación de los ( sub) roductos (etanol, glicerol y semejantes) . El crecimiento se monitoreó siguiendo la densidad óptica del cultivo a 600 nm. El experimento se prolongó durante aproximadamente 72 horas.
Los gráficos se proveen en las figuras 23 (BIE252) y 24 (BIE252AGAL80) .
Con los experimentos, se demostró claramente que la cepa de referencia BIE252 convirtió rápidamente la glucosa y la mañosa. Una vez agotada la glucosa (lo que demoró aproximadamente 10 horas) , comenzó la conversión de la xilosa y la arabinosa. Parte de la galactosa ya estaba siendo fermentada aproximadamente después de 10 horas, lo que podría deberse a la presencia del SNP de GAL80 en esta cepa, que permitiría la utilización (parcial) simultánea de glucosa y galactosa. Al final del experimento, que se prolongó durante aproximadamente 72 horas, se habían convertido prácticamente todos los azúcares (aproximadamente 99%) . Se obtuvo un rendimiento de etanol de 0.37 gramos de etanol por gramo de azúcar .
La cepa BIE252AGAL80 puede convertir los azúcares más rápidamente que la cepa BIE252. También en el caso de esta cepa, la mañosa y la glucosa son convertidas durante las primeras horas de la fermentación. Sin embargo, en contraste con la cepa BIE252, en esta transformante hay un consumo concurrente parcial de glucosa, galactosa y mañosa con la arabinosa y especialmente la xilosa. En general, el consumo de los azúcares es más veloz, lo que da como resultado un uso más completo de los azúcares disponibles . Esto también resulta evidente a partir de la evolución de C02 en el tiempo. En el caso de BIE252, se observa un primer pico que es básicamente el C02 que se forma a partir de la glucosa y la mañosa. Una vez que se alcanza un máximo apenas superior a 10 ml/hora (figura 20), se observa un segundo pico más plano. Sin embargo, en el caso de BIE252AGAL80 (figura 21), el segundo pico parece ser una cola del primer pico, debido a un uso concurrente intensificado de la glucosa, la xilosa, la arabinosa, la mañosa y la galactosa, lo que es evidente a partir del análisis de los azúcares por RMN. En la cepa progenitora BIE252, el uso de los distintos azúcares es más secuencial. Por lo tanto, el rendimiento de la cepa BIE252AGAL80 es mayor al final del experimento (72 horas) : 0.40 gramos de etanol por gramo de azúcar.
En conclusión, la supresión del ORF del gen GAL80 resultó en un desempeño mejorado en mayor medida, lo que se comprobó en la cepa BIE252.

Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes. REIVINDICACIONES
1. Una célula caracterizada porque es apropiada para generar uno o más productos de fermentación a partir de una composición de azúcares que comprende glucosa, galactosa, xilosa, arabinosa y mañosa, en donde la célula comprende entre dos y quince copias de uno o más genes de xilosa isomerasa o entre dos y quince copias de uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, así como entre dos y diez copias de los genes araA, a.ra.B y a.ra.D, en donde estos genes están integrados en el genoma de la célula.
2. La célula de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque la célula puede convertir 90% o más de glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa y mañosa disponibles en un producto de fermentación.
3. La célula de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque la célula presenta una alteración o una supresión del gen GAL80.
4. La célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la célula es del género Saccharomyces, opcionalmente de la especie Saccharomyces cerevisiae .
5. La célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque la célula comprende los siguientes genes de PPP sobreexpresados : TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1.
6. La célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque la célula comprende un gen XKS1.
7. La célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque el gen de aldosa reductasa se elimina.
8. La célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque todos los genes exógenos con relación a la célula están integrados en el genoma de la célula.
9. La célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque los genes han sido introducidos en la célula por medio de la introducción en una célula huésped: a) de un conjunto que consiste en los genes araA, araB y araD bajo el control de un promotor constitutivo fuerte; b) de un conjunto que consiste en los genes de PPP TAL1, TKL1, RPEl y RKI1 , opcionalmente bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, en combinación con la supresión de un gen de aldosa reductasa; c) de un conjunto que consiste en un gen xylA y un gen XKSl bajo el control de un promotor constitutivo fuerte; d) de un constructo que comprende un gen xylA bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, que puede integrarse en múltiples loci en el genoma; seguida por la evolución adaptativa del constructo de azúcares mixtos, con el fin de producir una célula de azúcares mixtos .
10. la célula de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada porque la célula es una célula resistente a inhibidores .
11. La célula de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, caracterizada porque la célula es una célula industrial.
12. Un proceso para elaborar uno o más productos de fermentación a partir de una composición de azúcares que comprende glucosa, galactosa, arabinosa y xilosa, caracterizado porque comprende fermentar la composición de azúcares con una célula de azúcares mixtos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
13. El proceso de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque la composición de azúcares se produce a partir de materia prima lignocelulósica a través de los siguientes pasos: a) el pretratamiento de uno o más tipos de materia prima lignocelulósica para producir una materia prima lignocelulósica pretratada; b) el tratamiento enzimático de la materia prima lignocelulósica pretratada para producir la composición de azúcares .
14. El proceso de acuerdo con las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado porque la fermentación se efectúa de manera anaeróbica .
15. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-14, caracterizado porque el producto de fermentación se selecciona del grupo que consiste de etanol, n-butanol, isobutanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacónico, ácido maléico, ácido cítrico, ácido adípico, un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptofano, treonina y ácido aspártico, 1,3-propanodiol, etileno, glicerol, antibiótico de ß-lactama y una cefalosporina, vitaminas, fármacos, suplementos para pienso, agentes químicos especializados, sustancias químicas que pueden usarse como materias primas, plásticos, solventes, combustibles, que incluyen biocombustibles y biogás o polímeros orgánicos, y una enzima industrial, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidorreductasa, una transferasa o una xilanasa.
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