CN106755035A - 一种基于高效低残糖发酵异丁醇的大肠杆菌合成菌株构建方法 - Google Patents

一种基于高效低残糖发酵异丁醇的大肠杆菌合成菌株构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种基于高效低残糖发酵异丁醇的大肠杆菌合成菌株构建方法。以大肠杆菌MG1655为宿主，构建异丁醇合成菌株E.coli LA09，采用代谢组学方法确定胞内的6‑磷酸果糖转化为1,6‑二磷酸果糖的反应为残糖转化的关键限制因素。构建来自运动单胞菌模式菌株Zymomonas mobilis ZM4的异源人工ED代谢途径上下游片段，结合合成生物学以人工启动子对ED上下游途径进行匹配调节，构建一株能够高效低残糖发酵异丁醇的大肠杆菌合成菌株E.coli ED；以45g/L初始葡萄糖浓度，30h完成发酵，异丁醇产量达到13.67g/L，发酵残糖浓度为0.87g/L，说明该方法具有实用性。

Description

一种基于高效低残糖发酵异丁醇的大肠杆菌合成菌株构建 方法
技术领域
本发明属于合成生物学和生物能源技术领域，具体涉及以大肠杆菌MG1655为研究对象，根据代谢组学数据检测和分析确定大肠杆菌异丁醇合成菌株残糖转化的限制因素后，利用合成生物学方法异源表达来自运动单胞菌的ED糖代谢途径，同时利用人工启动子进行ED途径上下游的匹配调节，最终获得一株高效低残糖发酵异丁醇的大肠杆菌合成菌株的方法。
背景技术
异丁醇作为重要的平台化合物，广泛的应用于食品、医药和化工等领域，具有能量密度高、辛烷值高、挥发性和腐蚀性小等优点。与第一代燃料乙醇相比，生物基异丁醇具有高的的可再生能源标示数(RNI)是理想的汽油添加剂或替代品。目前异丁醇生物合成研究主要从经济角度出发，大部分集中于异丁醇产量最大化和廉价原料多样化方面的菌株构建与改造，本课题组利用合成生物学方法设计异源Erhlich途径，以α-酮戊二酸为前体物质并且耦合分支氨基酸合成途径，构建了一株高产异丁醇的大肠杆菌工程菌株E.coli LA09(闻建平；刘蛟；齐海山。一种基于基因组尺度代谢网络模型指导胞内还原力调节的异丁醇合成菌株构建方法[P]。中国专利：CN104630250A，2014-12-23)。
残糖，即生物发酵完成后未能利用葡萄糖以及其他糖类底物原料，是生物燃料工业生产中重要的控制指标，发酵过程中残糖含量过高会导致代谢流量发生迁移从而影响产物的积累。相比于将发酵液中残糖回收再利用，提高生物合成中残糖转化和降低残糖浓度是更待解决的关键技术问题。与传统发酵工艺优化和菌种筛选的方法相比(孙东平；梁光芸；自强；顾炎；陈春涛；孙汴京；杨加志。一种以葡萄糖酸作为唯一碳源进行发酵生产细菌纤维素的优化方法[P]。中国专利：CN201610584286.1，2016-07-22。王倩；刘好宝；苏玉龙。耐受高浓度葡萄糖的葡萄球菌CGMCC No10671及其应用[P]。中国专利：CN201510579109.X，2015-09-06)，大多研究人员为了提高碳源底物利用效率倾向于采用基因工程调控糖转运系统增强对碳源物质的耐受性及吸收速率(R.R.-于克莫；A.C.科拉德；T.赫尔曼；喻晓辉；龚巍。利用用于糖输入的易化扩散生产琥珀酸和其他化学品的方法[P]。中国专利：CN201480041525.8，2014-07-22)，从而忽视了细胞内整体新陈代谢过程对碳源吸收利用的影响机理。虽然以上这些方法虽然在一定程度上提高原料的利用效率，但是并不能彻底解决发酵过程残糖浓度过高的问题。
目前针对残糖现象的机制研究未发现有足够的专利报道。因此为了实现异丁醇发酵单位最大化同时残糖浓度小于1g/L的目标，仅依赖提高菌株的糖吸收效率是远远不够的，如何源头上提高胞内糖转化效率是即本发明需要解决的关键问题。针对上述情况本发明创新性地提出了一种基于合成生物学理论的解决方案：即确定异丁醇生物合成菌株中限制残糖转化的关键步骤，然后针对限速途径进行合成生物学改造，并通过反复修饰与调节，直到在异丁醇生产最大化的条件下实现残糖浓度小于1g/L为止。
本发明是以课题组构建的高效异丁醇合成菌株E.coli LA09(专利号CN201410814025.5)为出发菌株，通过代谢组学得出在残糖转化过程中的限制因素为胞内的6-磷酸果糖转化为1,6－二磷酸果糖这一代谢步骤，本发明通过降低糖酵解途径的碳代谢通量从而缓解该限速步骤的胞内压力，首次采用合成生物学理性设计了来自运动单胞菌的异源人工Entner-Doudoroff(ED)糖代谢途径，并以人工启动子对ED上下游途径进行适配性表达调节，降低有毒中间代谢物2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸对细胞生长的抑制作用，最终获得了一株高效低残糖发酵异丁醇的大肠杆菌合成菌株。本发明所提供的基于合成生物学控制元件对提高残糖转化效率的研究未见有专利报道，因此本发明为指导构建高效低残糖的工业异丁醇合成菌株提供了重要的应用价值。
发明内容
本发明针对高产异丁醇的大肠杆菌合成菌株中残糖转化效率较低这一关键问题，提供了一种基于合成生物学方法设计一系列人工异源ED糖代谢元件以构建高效低残糖发酵的大肠杆菌异丁醇合成菌株的方法，该发明对于提高原料利用率和产品竞争力具有重要意义。
为了实现本发明的目的，采用了如下技术方案：
一种基于高效低残糖发酵合成异丁醇的大肠杆菌合成菌株的理性构建方法，其具体步骤如下：
(1)以大肠杆菌MG1655为宿主，按照本课题组申请的专利中所述的方法构建高产异丁醇的大肠杆菌E.coli LA09(专利号为CN201410814025.5)。
(2)以高产异丁醇的大肠杆菌E.coli LA09为研究对象，在不同浓度的初始葡萄糖浓度下分批发酵，采用代谢组学方法确定胞内的6-磷酸果糖转化为1,6-二磷酸果糖这一代谢步骤为残糖转化的关键的限制因素。
(3)根据步骤(2)获得的限速步骤，利用对胞内的糖代谢通量进行分流以缓解限速步骤对细胞残糖转化的方法，通过合成生物学方法理性设计了来自运动单胞菌模式菌株Zymomonas mobilis ZM4的异源人工ED糖代谢途径上下游片段，并结合合成生物学方法以人工启动子对ED上下游途径进行匹配调节。
(4)通过基因重组构建一株能够高效低残糖发酵异丁醇的大肠杆菌合成菌株E.coli ED。
(5)将构建的大肠杆菌E.coli ED进行发酵合成异丁醇，发酵结束后残糖浓度小于1g/L，试验证明该合成菌株能够用于高效低残糖发酵合成异丁醇。
具体方法为：
(1)根据本课题组申请公开的专利(专利号CN201410814025.5)中所述的方法成功构建高产异丁醇的大肠杆菌合成菌株E.coli LA09，进而对其进行残糖转化的研究。
(2)以异丁醇合成菌株E.coli LA09为研究对象，开展一系列初始糖浓度由小到大分别为35、40、45、50、55和60g/L的分批发酵试验，采用GC-MS和LC-MS定性检测异丁醇合成菌株的胞内代谢物，并借助KEGG数据库进行代谢物分类，通过PCA方法和载荷图等方法理性分析异丁醇合成菌株胞内糖分解代谢物变化特征。采用的软件平台MATLAB R2008b进行主成成分析，得出关键标志物，对关键标志物所处的代谢途径进行胞内浓度比较分析，得出残糖转化具体的限制步骤。为6-磷酸果糖转化为1,6-二磷酸果糖途径。
(3)以运动单胞菌模式菌株Zymomonas mobilis ZM4基因组为模板，分别构建由不同启动子控制人工ED糖代谢上下游途径片段，其中上游片段是由编码glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase的ZM4-ZMf基因(片段ZMO0367，序列号为SEQ ID NO：3)和编码6-phosphogluconolactonase的ZM4-pgl基因(片段ZMO1478，序列号为SEQ ID NO：4)组成，而下游片段则由编码6-phosphogluconate dehydratase的ZM4-edd基因(片段ZMO0368，序列号为SEQ ID NO：1)和编码2-dehydro-3-deoxyphosphogluconate aldolase的ZM4-eda基因(片段ZMO0997，序列号为SEQ ID NO：2)组成。
人工ED代谢下游途径的构建：以运动单胞菌模式菌株Zymomonas mobilis ZM4基因组为模板，以z368-F/z368-R(引物序列内含有启动子BBa_J23119序列)、z997-F/z997-R两个引物对(引物序列编号分别为SEQ ID No：10和SEQ ID No：10)通过PCR扩增出带启动子BBa_J23119(来源于iGEM的人工标准元件库)的ZMO0368基因片段和ZMO0997基因片段(基因序列编号SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)，以XER2-F/XER2-R引物对(引物序列编号SEQ IDNO：12)，以pUCxer质粒为模板扩增出带dif位点的庆大霉素抗性片段。采用融合PCR方法将这三个片段整合成一个BBa_J23119启动子控制下的ZMO0368-ZMO0997-dif-Xer-dif操纵子片段。采用ack-pta-F1/ack-pta-R同源臂引物(引物序列编号SEQ ID NO：9)扩增该整合片段，获得ED下游途径突变盒片段。
人工ED糖代谢上游途径构建：以Z.mobilis ZM4基因组为模板，以z367-F/z367-R(引物序列内含有启动子BBa_J23118序列)、z1487-F/z1487-R两个引物对(引物序列编号分别为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)，扩增出带BBa_J23118启动子(来源于iGEM的人工标准元件库)的ZMO0367和ZMO1487基因片段(序列编号SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)，以XER-F/XER-R为引物(引物序列编号为SEQ ID NO：8)，以pUCxer质粒为模板扩增出带dif位点的庆大霉素抗性片段。以融合PCR将这三个片段整合成一个BBa_J23118启动子控制下的ZMO0367-ZMO1487-dif-Xer-dif操纵子片段，然后采用ldh-F1/ldh-R同源臂引物(引物序列编号SEQ ID NO：5)扩增该片段，获得ED上游途径突变盒片段。
(4)根据不同强度的人工启动子分别调节人工ED途径的上下游部分，将ED下游途径突变盒片段电转化进入已诱导重组酶的E.coli LA09的感受态中，通过庆大霉素抗性筛选，获得同源重组阳性转化子E.coli LA09ΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997)。将ED上游途径突变盒片段电转化进入E.coli LA09ΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997)感受态中，获得同源重组阳性转化子E.coli LA09ΔldhA::(BBa_J23118::ZMO0367-ZMO1487)ΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997)，最终构建获得了携带整个人工ED途径的异丁醇合成菌株E.coli ED。
(5)对E.coli ED进行批次发酵试验，试验结果显示该方法构建的菌株达到残糖小于1g/L的预期目标，说明该方法具有实际应用价值。
低残糖异丁醇合成菌株E.coli ED的培养条件为：培养温度为37℃，转速为250rpm，当细胞OD600增长到0.7时，加入0.1～1mM的IPTG进行异丁醇诱导，后续培养条件为30℃,200rpm。发酵培养基成分为：45g/L葡萄糖、5g/L酵母浸粉、1000稀释的Trace mix A5微量元素母液、100μg/ml氨卡青霉素、20μg/ml氯霉素、17g/L Na2HPO4·12H2O、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl、0.24g/L MgSO4和0.011g/L CaCl2。Trace mix A5微量元素母液成分为2.86g/L H3BO3、1.81g/L MnCl2·4H2O、0.222g/L ZnSO4·7H2O、0.39g/L NaMoO4·2H2O、0.079g/L CuSO4·5H2O和49.4mg/L Co(NO3)2·6H2O。
本发明获得的高效低残糖异丁醇合成菌株E.coli ED，以45g/L初始葡萄糖浓度经30h完成发酵，异丁醇产量达到13.67g/L，比E.coli LA09(8.74g/L)提升了56％，发酵残糖浓度为0.87g/L，达到了残糖浓度小于1g/L的目标。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应当视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中菌株Z.mobilisZM4、E.coli MG1655、质粒pKD46和质粒pUCxer均有市售。以下实施例中未注明的具体的试验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验手册》中所述的方法或者厂商提供的方法进行。
实施例1异丁醇合成菌株LA09的构建和影响残糖转化的限速步骤解析
(1)异丁醇合成菌株LA09的构建严格按照专利CN201410814025.5所述的方法进行。
(2)以异丁醇合成菌株LA09为研究对象，开展一系列初始糖浓度由小到大分别为35、40、45、50、55和60g/L的分批发酵试验，确定异丁醇合成菌株LA09最优初始葡萄糖浓度为45g/L。培养方法：在培养温度为37℃，转速为250rpm条件下培养细菌，当细胞OD600增长到0.6～0.8时，加入0.1～1mM的IPTG进行异丁醇诱导，后续培养条件为30℃，200rpm。
(3)提取细胞内外的代谢物进行GC-MS和LC-MS分析，通过GC-MS系统内置软件对得到的总离子流图中的每个代谢物峰进行峰面积自动积分与手动修正,可得到各个代谢物原始峰面积数据，并识别计算内标代谢物的峰面积数据。LC-MS数据则参照平台自建的标准品图库进行定性分析，采用Analyst software进行分析，获得每个代谢物和内标物的原始峰面积数据。将每个代谢物的原始峰面积除以样品干重，并除以相应图谱中内标物峰面积，得到标准化处理后的数据。然后通过归一化和尺度化的计算，采用的软件平台MATLAB R2008b进行主成成分析，得出关键标志物，对关键标志物所处的代谢途径进行胞内浓度比较分析，得出残糖转化具体的限制步骤。
实施例2人工ED上下游途径片段的构建
(1)以运动单胞菌Z.mobilis ZM4的ED下游途径基因片段ZMO0368(序列号为SEQID NO：1)为模板设计引物z368-F/z368-R(引物序列号为SEQ ID NO：10)，经PCR扩增获得由启动子BBa_J23119控制的ZMO0368基因片段，以引物z997-F/z997-R(引物序列号为SEQ IDNO：11)扩增来自运动单胞菌ZM4的ED下游途径另一个基因片段ZMO0997(序列号为SEQ IDNO：2)。
启动子构建：启动子BBa_J23119序列包含在引物z368-F中，直接由华大基因合成，启动子BBa_J23119用于调控ED下游途径(ZMO0368-ZMO0997)。
PCR反应体系：上下游引物(10μM)分别为1μL，模板1μL，dNTP(2.5mM)溶液2μL，10×缓冲液2μL，DNA聚合酶0.5μL，ddH2O为12.5μL。
PCR反应条件：预变性95℃3min,变性95℃30s,引物退火45～65℃30s,引物延伸72℃t min(t＝DNA片段长度/聚合酶扩增速度),循环数30～35次,最后延伸72℃10min，具体温度和时间参数调整参照引物报告单。
(2)以XER2-F/XER2-R(引物序列号为SEQ ID NO：12)为引物，以pUCxer质粒为模板扩增出带dif位点的庆大霉素抗性片段。通过核酸定量仪进行测定基因片段产物浓度，利用融合PCR扩增出由启动子BBa_J23119调控下的ZMO0368-ZMO0997-dif-Xer-dif基因操纵子片段，并通过基因测序表明整合片段的序列正确性。
融合PCR反应：步骤1、98℃2min，步骤2、98℃20s，步骤3、70℃(-1℃/cycle)20s，步骤4、72℃Length*30s/kb，步骤5、返回步骤2(15cycles)，步骤6、98℃20s，步骤7、55℃20s，步骤8、72℃Length*30s/kb，步骤9、返回步骤6(15cycles)，步骤10、72℃5min。
(3)分别采用ack-pta-F/ack-pta-R(引物序列号为SEQ ID NO：9)同源臂引物扩增出由BBa_J23119启动子控制的ZMO0368-ZMO0997-dif-Xer-dif片段，获得的ED下游途径突变盒片段。
(4)以运动单胞菌Z.mobilis ZM4的ED上游途径基因片段ZMO0367(序列号为SEQID NO：3)为模板设计引物z367-F/z367-R(引物序列号为SEQ ID NO：6))，获得由启动子BBa_J23118控制的ZMO0367，以引物z1487-F/z1487-R(引物序列号为SEQ ID NO：7)扩增来自运动单胞菌ZM4的ED上游途径的另一个基因片段ZMO1487(序列号为SEQ ID NO：4)。
启动子构建：启动子序列包含在引物z367-F中，直接由华大基因合成，引物z367-F含有启动子BBa_J23118，用于调控ED上游途径(ZMO0367-ZMO1487)。
(5)以XER2-F/XER2-R(引物序列号为SEQ ID NO：12)为引物，以pUCxer质粒为模板扩增出带dif位点的庆大霉素抗性片段。通过核酸定量仪进行测定基因片段产物浓度，利用融合PCR扩增出由启动子BBa_J23118调控下的ZMO0367-ZMO1487-dif-Xer-dif基因操纵子片段，并通过基因测序表明整合片段的序列正确性。
(6)分别采用ldh-F/ldh-R同源臂引物(引物序列号为SEQ ID NO：5)扩增出由BBa_J23118启动子控制的ZMO0368-ZMO0997-dif-Xer-dif片段，获得由BBa_J23118启动子调解的ED上游途径突变盒片段。
实施例3含有异源ED糖代谢途径的大肠杆菌异丁醇合成菌株E.coli ED的构建
(1)E.coli LA09重组系统的构建及感受态制备。
Red重组系统构建：将质粒pKD46导入E.coli LA09中，接种于LB液体培养基中，添加氨苄青霉素，30℃，200rpm培养过夜。以1％的接种量接入50mL LB液体培养基中，添加氨苄青霉素抗性(100μg/mL)和加入终浓度为2mM的L-阿拉伯糖，30℃，200rpm培养至OD600为0.7，停止培养。
感受态的制备：菌液冰上预冷20min，在4℃，4000rpm离心10min，收集菌体。加入20mL冰预冷的10％(v/v)甘油溶液中，保持低温，轻柔重悬细胞，4℃，4000rpm离心10min，重复洗涤2次。剩余菌体重悬于0.1mL冰预冷的10％甘油中，按每管50μL分装于冰预冷的1.5mL离心管中，制得感受态细胞可直接用于电转化或保存于-80℃中以备用。
(2)将由启动子BBa_J23119控制的ED下游途径突变盒片段电转化进入已诱导重组酶的E.coli LA09感受态中，通过庆大霉素抗性筛选，并以菌落PCR(引物为Test2-F/Test2-R，引物序列号为SEQ ID NO:14)进行验证，获得同源重组阳性转化子E.coli MG1655ΔpflBΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997)。
电转化系统：冰上融化制备好的电转化感受态细胞，加入待转化的DNA片段5μL，轻柔混合，转入预冷的0.1cm电转杯中，设置电压1.8kv，时间5ms，进行电击。电击完立刻加入1mL常温含有1mM的L-阿拉伯糖的LB液体培养基，置于30℃恒温箱中，培养2～4h。将转化后的菌体均匀涂布在含有庆大霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜，挑取转化子。
(3)将启动子BBa_J23118控制的ED上游途径突变盒片段电转化进入构建好的E.coli
LA09ΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997)感受态中，通过庆大霉素抗性筛选，并以菌落PCR(引物为Test1-F/Test1-R，引物序列号为SEQ ID NO:13)进行验证，获得同源重组阳性转化子E.coli
MG1655ΔldhA::(BBa_J23118::ZMO0367-ZMO1487)ΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997)，最终构建由启动子BBa_J23118控制ED途径上游片段和BBa_J23119控制的整合型ED下游途径的异丁醇合成菌株E.coli ED。
实施例4高效低残糖异丁醇合成菌株的分批发酵试验
(1)所有异丁醇合成菌株分批发酵具体过程均为：在试管中加入3ml M9培养基，接种异丁醇合成菌株于37℃250rpm过夜培养，获得异丁醇合成菌株种子。异丁醇分批发酵在250mL三角瓶中进行，每瓶中加入20mL培养基，异丁醇合成菌株种子的接种量为1％(体积分数)，37℃250rpm培养约4h以后，培养液OD600值增长到0.7-0.8时加入0.05mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导异丁醇合成，继续在30℃250rpm条件下发酵生成异丁醇。
(2)培养基和检测方法
培养基成分：45g/L葡萄糖、5g/L酵母浸粉、1000稀释的Trace mix A5微量元素母液、100μg/ml氨卡青霉素、20μg/ml氯霉素、17g/L Na2HPO4·12H2O、3g/L KH2PO4、0.5g/LNaCl、1g/L NH4Cl、0.24g/L MgSO4和0.011g/L CaCl2。Trace mix A5微量元素母液成分为2.86g/L H3BO3、1.81g/L MnCl2·4H2O、0.222g/L ZnSO4·7H2O、0.39g/L NaMoO4·2H2O、0.079g/L CuSO4·5H2O和49.4mg/L Co(NO3)2·6H2O。
检测方法：异丁醇合成菌株浓度通过分光光度计测定的发酵液600nm下的吸光度测定，并将吸光度数转化为细胞干重表征菌体增长。细胞干重标准曲线的测定方法为取适当的体积不同OD600值的菌液，12000rpm离心获得菌体，在80℃恒温干燥至恒重，OD600值与干重之间计算关系测定为1OD＝0.332g/L(细胞干重)。其发酵液中的葡萄糖浓度采用生物传感分析仪测定。发酵液经离心(12000rpm，10min)取上清液测定异丁醇浓度，按照气相色谱内标法进行测定，以正丁醇为内标物。
序列表
天津大学
一种基于高效低残糖发酵异丁醇的大肠杆菌合成菌株构建方法
SEQ ID NO: 1
ZMO0368
ATGACTGATCTGCATTCAACGGTAGAAAAGGTTACCGCGCGCGTTATTGAACGCTCGCGGGAAACCCGTAAGGCTTATCTGGATTTGATCCAGTATGAGCGGGAAAAAGGCGTAGACCGTCCAAACCTGTCCTGTAGTAACCTTGCTCATGGCTTTGCGGCTATGAATGGTGACAAGCCAGCTTTGCGCGACTTCAACCGCATGAATATCGGCGTCGTGACTTCCTACAACGATATGTTGTCGGCTCATGAACCATATTATCGCTATCCGGAGCAGATGAAAGTATTTGCTCGCGAAGTTGGCGCAACGGTTCAGGTCGCCGGTGGCGTGCCTGCTATGTGCGATGGTGTGACCCAAGGTCAGCCGGGCATGGAAGAATCCCTGTTTAGCCGCGATGTTATCGCTTTGGCTACCAGCGTTTCTTTGTCTCATGGTATGTTTGAAGGGGCTGCCCTTCTCGGTATCTGTGACAAGATTGTCCCTGGTCTGTTGATGGGCGCTCTGCGCTTTGGTCACCTGCCGACCATTCTGGTCCCATCAGGCCCGATGACGACTGGTATCCCGAACAAAGAAAAAATCCGTATCCGTCAGCTCTATGCTCAGGGTAAAATCGGCCAGAAAGAACTTCTGGATATGGAAGCGGCTTGCTACCATGCTGAAGGTACCTGCACCTTCTATGGTACGGCAAACACCAACCAGATGGTTATGGAAGTCCTCGGTCTTCATATGCCAGGTTCGGCATTTGTTACCCCGGGTACCCCGCTCCGCCAGGCTCTGACCCGTGCTGCTGTGCATCGCGTTGCTGAATTGGGTTGGAAGGGCGACGATTATCGTCCGCTTGGTAAAATCATTGACGAAAAATCAATCGTCAATGCTATTGTTGGTCTGTTGGCAACCGGTGGTTCCACCAACCATACCATGCATATTCCGGCCATTGCTCGTGCTGCTGGTGTTATCGTTAACTGGAATGACTTCCATGATCTTTCTGAAGTTGTTCCGTTGATTGCCCGCATTTACCCGAATGGCCCGCGCGACATCAATGAATTCCAGAATGCAGGCGGCATGGCTTATGTCATCAAAGAACTGCTTTCTGCTAATCTGTTGAACCGTGATGTCACGACCATTGCCAAGGGCGGTATCGAAGAATACGCCAAGGCTCCGGCATTAAATGATGCTGGCGAATTGGTCTGGAAGCCAGCTGGCGAACCTGGTGATGACACCATTCTGCGTCCGGTTTCTAATCCTTTCGCAAAAGATGGCGGTCTGCGTCTCTTGGAAGGTAACCTTGGCCGTGCAATGTACAAGGCCAGTGCGGTTGATCCTAAATTCTGGACCATTGAAGCACCGGTTCGCGTCTTCTCTGACCAAGACGATGTTCAGAAAGCCTTCAAGGCTGGCGAATTGAACAAAGACGTTATCGTTGTTGTTCGTTTCCAGGGCCCGCGCGCAAACGGTATGCCTGAATTGCATAAGCTGACCCCGGCTTTGGGTGTTCTGCAGGATAATGGCTACAAAGTTGCTTTGGTAACTGATGGTCGTATGTCCGGTGCTACCGGTAAAGTTCCGGTTGCTTTGCATGTCAGCCCAGAAGCTCTTGGCGGTGGTGCCATCGGTAAATTACGTGATGGCGATATCGTCCGTATCTCGGTTGAAGAAGGCAAACTTGAAGCTTTGGTTCCAGCTGATGAGTGGAATGCTCGTCCGCATGCTGAAAAACCGGCTTTCCGTCCGGGAACCGGACGCGAATTGTTTGATATCTTCCGTCAGAATGCTGCTAAAGCTGAAGACGGTGCAGTCGCAATATATGCAGGTGCCGGTATCTAA
SEQ ID NO: 2
ZMO0997
ATGCGTGATATCGATTCCGTAATGCGTTTGGCACCGGTTATGCCGGTCCTCGTCATTGAAGATATTGCTGATGCAAAACCTATCGCAGAAGCTTTGGTTGCTGGTGGTCTGAACGTTCTTGAAGTAACGCTTCGCACCCCTTGTGCTCTTGAAGCCATCAAGATCATGAAAGAAGTTCCGGGTGCCGTTGTTGGTGCCGGTACGGTTCTGAACGCAAAAATGCTCGACCAAGCTCAGGAAGCTGGTTGCGAATTTTTCGTTAGCCCGGGTCTGACCGCTGACCTCGGCAAGCATGCTGTTGCCCAGAAAGCAGCTTTGCTTCCAGGTGTTGCTAATGCTGCTGATGTGATGCTTGGTCTTGACCTTGGTCTTGATCGCTTCAAATTCTTCCCGGCTGAAAATATCGGTGGTTTACCTGCCCTGAAGTCCATGGCTTCTGTTTTCCGTCAGGTTCGTTTCTGCCCGACCGGCGGTATCACCCCGACGTCAGCTCCTAAATATCTTGAAAACCCGTCCATTCTTTGCGTCGGTGGTAGCTGGGTTGTTCCGGCTGGCAAACCAGATGTCGCAAAAATCACGGCACTCGCTAAAGAAGCTTCTGCTTTCAAGCGCGCTGCTGTTGCCTAA
SEQ ID NO: 3
ZMO0367
ATGACAAATACCGTTTCGACGATGATATTGTTTGGCTCGACTGGCGACCTTTCACAGCGTATGCTGTTGCCGTCGCTTTATGGTCTTGATGCCGATGGTTTGCTTGCAGATGATCTGCGTATCGTCTGCACCTCTCGTAGCGAATACGACACAGATGGTTTCCGTGATTTTGCAGAAAAAGCTTTAGATCGCTTTGTCGCTTCTGACCGGTTAAATGATGACGCTAAAGCTAAATTCCTTAACAAGCTTTTCTACGCGACGGTCGATATTACGGATCCGACCCAATTCGGAAAATTAGCTGACCTTTGTGGCCCGGTCGAAAAAGGTATCGCCATTTATCTTTCGACTGCGCCTTCTTTGTTTGAAGGGGCAATCGCTGGCCTGAAACAGGCTGGTCTGGCTGGTCCAACTTCTCGCCTGGCGCTTGAAAAACCTTTAGGTCAAGATCTTGCTTCTTCCGATCATATTAATGATGCGGTTTTGAAAGTTTTCTCTGAAAAGCAAGTTTATCGTATTGACCATTATCTGGGTAAAGAAACGGTTCAGAATCTTCTGACCCTGCGTTTTGGTAATGCTTTGTTTGAACCGCTTTGGAATTCAAAAGGCATTGACCACGTTCAGATCAGCGTTGCTGAAACGGTTGGTCTTGAAGGTCGTATCGGTTATTTCGACGGTTCTGGCAGCTTGCGCGATATGGTTCAAAGCCATATCCTTCAGTTGGTCGCTTTGGTTGCAATGGAACCACCGGCTCATATGGAAGCCAACGCTGTTCGTGACGAAAAGGTAAAAGTTTTCCGCGCTCTGCGTCCGATCAATAACGACACCGTCTTTACGCATACCGTTACCGGTCAATATGGTGCCGGTGTTTCTGGTGGTAAAGAAGTTGCCGGTTACATTGACGAACTGGGTCAGCCTTCCGATACCGAAACCTTTGTTGCTATCAAAGCGCATGTTGATAACTGGCGTTGGCAGGGTGTTCCGTTCTATATCCGCACTGGTAAGCGTTTACCTGCACGTCGTTCTGAAATCGTGGTTCAGTTTAAACCTGTTCCGCATTCGATTTTCTCTTCTTCAGGTGGTATCTTGCAGCCGAACAAGCTGCGTATTGTCTTACAGCCTGATGAAACCATCCAGATTTCTATGATGGTGAAAGAACCGGGTCTTGACCGTAACGGTGCGCATATGCGTGAAGTTTGGCTGGATCTTTCCCTCACGGATGTGTTTAAAGACCGTAAACGTCGTATCGCTTATGAACGCCTGATGCTTGATCTTATCGAAGGCGATGCTACTTTATTTGTGCGTCGTGACGAAGTTGAGGCGCAGTGGGTTTGGATTGACGGAATTCGTGAAGGCTGGAAAGCCAACAGTATGAAGCCAAAAACCTATGTCTCTGGTACATGGGGGCCTTCAACTGCTATAGCTCTGGCCGAACGTGATGGAGTAACTTGGTATGACTGA
SEQ ID NO: 4
ZMO1487
TTAAGGGGGCATCGTTGCCTGTGGCATTTGCATCAATGCAGGGCGAGCCAACAAAAAACCTTGCATCAAATCAACACCAAGATCTTGCAAAACTTTAAATTCTTCTATTGTTTCGACGCCTTCGACGACAAAATCAATACCAAGATCGCGACATAGGCCTACCATCGCTTTGACAACGGCACGCCGTCTTTTGTCATGTTCGATGCCAACAACATAATGCCGATCGAGCTTGATGATATCGGGATGATAGGCTGTCAAAAGATTAAAATTCGAATAAAGGCCGCCGAAATCATCAAAAGCAACTTTAAAATTTAAATGCTTATAGCGTGAGATAACATGGCGAATATGGTCATATTCGGTGAGATATTCTTTTTCCGACCATTCAAAAATAAGGCGAGCAGGATTGATCCCCAGCTTTTCACAAGTGGATAACGTCTGGCTAAGGCAATATTCGGGATAATAAACGGCATTCGGCATGAAGTTGATGCTGATAGCACCATCCCAATTACAGGATAATGCCGATTGCAGGGCTTTATCACGGGCTTTCTGGTCAAAACTATAGCGATTATTTTCATCAATTCGGGAAAGAATGCTGTGAGCCCCCTCGCCCTTTAATCCACGGACTAAGGCTTCTTGCGCGTAAATGTGGCCATTCTTGATATTGACGATGGGCTGGAAAGCAAAAATAAAATTGAAGTCGAAGGGCTGTGGGTCTCGATTGTCGCCGCAAGGTGACGTGCTGTCATACCCTTGTATCGGTTGTTGAATCTGCCCCAT
SEQ ID NO: 5
ldh-F1
5’-ATGAAACTCGCCGTTTATAGCACAAAACAGTACGACAAGAAGTACCTGCAACAGGTGAACCTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGC-3’
ldh-R
5’-CCATACCCAACGAACCAATTTTCTGATTTTTCAGCGCTTCAATTGCTGCCTGAGA-3’
SEQ ID NO: 6
z367-F
5’-CTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCCTTTTAAGGACGAGAATAATGAC-3’
z367-R
5’-CTCCATTGATACCTGCCAGGATCAGTCATACCAAGTTACTCC-3’
SEQ ID NO: 7
z1478-F
5’-GGAGTAACTTGGTATGACTGATCCTGGCAGGTATCAATGGAG-3’
z1478-R
5’-CTAGAGTCGACCTGCAGGCTTATTTGCTCCAGTACACG-3’
SEQ ID NO: 8
XER-F
5’-CGTGTACTGGAGCAAATAAGCCTGCAGGTCGACTCTAG-3’
XER-R
5’-GCGCTTCAATTGCTGCCTGAGATTACGAATTCGAGCTCGGTA-3’
SEQ ID NO: 9
ack-pta-F
5’-CAACTTTATCGTTAATACTATTCTGGCACAAAAACCAGAACTGTCTGCGCAGCTGACTGCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGC-3’
ack-pta-R
5’-GATCATCAGGTCAGGACGTTTTTCCTGCGCCAGACGAGTTGCTTCGCGAACTTTTTCTACCAATCACCGGATCGTAACGACGAACC-3’
SEQ ID NO: 10
z368-F
5’-TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCGCCGAACGTGAAGGAGGAACTTGGTATG-3’
z368-R
5’-CACGCATCTTAGCCTCCTGCCGCTGGAAAAATTAGATACCGGCACCTGC-3’
SEQ ID NO: 11
z997-F
5’-GCAGGTGCCGGTATCTAATTTTTCCAGCGGCAGGAGGCTAAGATGCGTG-3’
z997-R
5’-CCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCTTAGGCAACAGCAGCGCGCTTGAAAG-3’
SEQ ID NO: 12
XER2-F
5’-CTTTCAAGCGCGCTGCTGTTGCCTAAGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGG-3’
XER2-R
5’-CAATCACCGGATCGTAACGACGAACCCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTAC-3’
SEQ ID NO: 13
Test1-F
5’-ATGAAACTCGCCGTTTATAG-3’
Test1-R
5’-CCAGTTCGTTCGGGCAGG-3’
SEQ ID NO: 14
Test2-F
5’-CGTATCAATTATAGGTACTTCC-3’
Test2-R
5’-CGTTAACCGGCTTGCGCATACC-3’

Claims (5)

1.一种基于高效低残糖发酵的大肠杆菌异丁醇合成菌株理性构建方法，其特征步骤如下：
(1)以以大肠杆菌MG1655为基础，构建高产异丁醇合成菌株E.coli LA09；
(2)以高产异丁醇的大肠杆菌E.coli LA09为研究对象，在不同浓度(35～40g/L)的初始葡萄糖浓度下分批发酵，采用代谢组学方法确定胞内的6-磷酸果糖转化为1,6-二磷酸果糖这一代谢步骤为残糖转化的关键的限制因素；
(3)利用胞内的糖代谢通量分流来缓解限速步骤对细胞残糖转化的方法，通过合成生物学方法理性设计了来自运动单胞菌的异源人工Entner-Doudoroff(ED)糖代谢途径上下游片断；
(4)结合合成生物学方法以人工启动子对ED上下游途径进行匹配调节，构建高效人工ED途径的异丁醇合成菌株；
(5)对合成的高效低残糖大肠杆菌异丁醇合成菌株进行发酵试验，发酵液中残糖低于1g/L，符合生产目的；。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于：以大肠杆菌MG1655为宿主，按照CN201410814025.5申请专利的方法构建高产异丁醇合成菌株E.coli LA09；通过代谢组学技术解析胞内残糖转化的关键限制因素为6-磷酸果糖到1,6-二磷酸果糖这一代谢步骤。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于：以运动单胞菌模式菌株Zymomonas mobilisZM4基因组为模板，分别构建人工ED糖代谢途径的上下游片段，并导入高产异丁醇合成菌株LA09内，构建低残糖发酵菌株E.coli ED；其中ED途径上游片段是由编码glucose-6-phosphate1-dehydrogenase的ZM4-ZMf基因片段ZMO0367，序列号为SEQ ID NO：3和编码6-phosphogluconolactonase的ZM4-pgl基因片段ZMO1478，序列号为SEQ ID NO：4组成，而下游片段则由编码6-phosphogluconate dehydratase的ZM4-edd基因片段ZMO0368，序列号为SEQ ID NO：1和编码2-dehydro-3-deoxyphosphogluconate aldolase的ZM4-eda基因片段ZMO0997，序列号为SEQ ID NO：2组成。
4.权利要求3所述的方法，其特征是具体步骤如下：
(1)以运动单胞菌Z.mobilis ZM4的ED下游途径基因片段ZMO0368为模板设计引物z368-F/z368-R(引物z368-F含启动子BBa_J23119)，PCR扩增获得由启动子BBa_J23119控制的ZMO0368，以引物z997-F/z997-R扩增来自运动单胞菌ZM4的ED下游途径另一个基因片段ZMO0997；
(2)以运动单胞菌Z.mobilis ZM4的ED上游途径基因片段ZMO0367为模板设计引物z367-F/z367-R，引物z367-F含BBa_J23118；获得分别由启动子BBa_J23118控制的ZMO0367，以引物z1487-F/z1487-R扩增来自运动单胞菌ZM4的ED上游途径的另一个基因片段ZMO1487；
(3)采用融合PCR方法将基因片段ZMO0368，ZMO0997和pUCxer质粒上带有dif位点的庆大霉素抗性片段整合成一个BBa_J23119启动子控制下的ZMO0368-ZMO0997-dif-Xer-dif操纵子片段，通过ack-pta-F/ack-pta-R同源臂引物扩增该整合片段，获得ED下游途径突变盒片段，将ED下游途径突变盒片段电转化进入已诱导重组酶的E.coli LA09感受态中，通过庆大霉素抗性筛选，获得同源重组阳性转化子E.coli LA09ΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997)；
(4)采用融合PCR方法基因片段ZMO0367，ZMO1487和pUCxer质粒上带dif位点的庆大霉素抗性片段整合成由BBa_J23118启动子控制的ZMO0367-ZMO1487-dif-Xer-dif操纵子片段，然后用ldh-F/ldh-R同源臂引物扩增该片段，获得ED上游途径突变盒片段，将该片段电转化到E.coli LA09ΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997)感受态获得同源重组阳性转化子E.coliLA09ΔldhA::(BBa_J23118::ZMO0367-ZMO1487)ΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997)，构建获得了带有整合型ED上下游途径的异丁醇合成菌株E.coli ED。
5.权利要求1所述的方法，其特征为：对获得的低残糖大肠杆菌异丁醇合成菌株E.coliED进行发酵试验验证，培养温度为37℃，转速为250rpm条件下培养细菌，当细胞OD600增长到0.6～0.8时，加入0.1～1mM的IPTG进行异丁醇诱导后继续在200rpm和30℃条件下发酵；结果显示当培养基中葡萄糖初始浓度为45g/L，发酵时间为30h，培养基中残糖为0.87g/L，异丁醇产量达到了13.67g/L，比菌株E.coli LA09(8.74g/L)提升了56％。
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