CN103119053A - 用于生产能够转化阿拉伯糖的细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于生产能够转化阿拉伯糖的细胞的方法,其包含下述步骤:a)将基因AraA、araB和araD引入不能够转化阿拉伯糖的宿主菌株,该细胞被命名为构建细胞;b)使构建细胞进行适应性进化直到获得转化阿拉伯糖的细胞;c)任选地,使第一阿拉伯糖转化细胞进行适应性进化,以改进阿拉伯糖转化;在步骤b)或c)中生产的细胞被命名为第一阿拉伯糖转化细胞;d)分析第一阿拉伯糖转化细胞和构建细胞的全基因组或部分基因组;e)鉴定第一阿拉伯糖转化细胞中的单核苷酸多态性(SNP);和f)在能够转化阿拉伯糖的细胞的合理设计中使用SNP的信息;g)构建在步骤f)中设计的能够转化阿拉伯糖的细胞。
Description
技术领域
本发明涉及用于生产能够转化阿拉伯糖的细胞的方法。本发明还涉及可通过所述方法生产的细胞。本发明进一步涉及其中使用这类细胞生产发酵产物例如乙醇的方法。
发明背景
最近几十年,传统化石燃料(基于石油的燃料)的大规模消耗造成了高水平的污染。这与化石燃料的世界储备并非有限的认识以及增长的环境意识一起刺激了研究替代性燃料(如乙醇)可行性的新动机,所述替代性燃料是以每升为基础比无铅汽油释放更少CO2的无粒子燃烧燃料来源。尽管生物量衍生的乙醇可以通过得自许多不同来源的己糖的发酵来生产,但是,典型地用于商业规模生产燃料醇的底物如甘蔗和玉米淀粉是昂贵的。因此,燃料乙醇生产的提高会需要使用更低成本的原料。目前,只有衍生自植物生物量的木质纤维素原料能够足量获得,用于代替目前用于乙醇生产的作物。在大部分木质纤维素材料中,在C6糖之后的第二常见的糖还包含相当大的量的C5糖(包括阿拉伯糖)。因此,对于经济上可行的燃料生产工艺而言,己糖和戊糖均必须被发酵形成乙醇。酵母Saccharomycescerevisia是有活力的并且充分适合乙醇生产,但是不能够转化阿拉伯糖。另外,没有一种天然存在的生物是已知能够以高乙醇产量以及高乙醇生产力将木糖发酵成乙醇的。因此,对下述生物存在需要,所述生物具有这些特性从而能够在商业上有活力地从木质纤维素原料生产乙醇。
发明内容
本发明的目的是提供能够转化阿拉伯糖的细胞,特别是酵母细胞。
根据本发明达到了该目的,本发明提供了用于生产能够转化阿拉伯糖的细胞的方法,所述方法包括下述步骤:
a)将基因araA、araB和araD引入不能够转化阿拉伯糖的宿主菌株,该细胞被命名为构建细胞;
b)使构建细胞进行适应性进化直到获得转化阿拉伯糖的细胞,
c)任选地,使第一阿拉伯糖转化细胞进行适应性进化,以改进阿拉伯糖转化;步骤b)或c)中产生的细胞被命名为第一阿拉伯糖转化细胞;
d)分析第一阿拉伯糖转化细胞和构建细胞的基因组的一部分或全基因组;
e)鉴定第一阿拉伯糖转化细胞中的单核苷酸多态性(SNP);并
f)在能够转化阿拉伯糖的细胞的合理设计中使用SNP信息;
g)构建在步骤f)中设计的能够转化阿拉伯糖的细胞。
除了酵母细胞BIE201外,本发明还提供了具有基因araA、araB和araD的酵母细胞,其中染色体VII具有通过电泳测定的从1300至1600Kb的大小。
本发明还涉及多肽,所述多肽属于下述多肽组成的组:
a.多肽,其具有由在SSY1中具有置换E455终止子的多核苷酸SEQ IDNO:14编码的序列,以及其变体多肽,其中一个或多个其他位置具有用AA反式超家族中已有的氨基酸的另一种氨基酸对氨基酸的突变;
b.多肽,其具有由在YJR154w中具有置换D171G的多核苷酸SEQ IDNO:16编码的序列,以及其变体多肽,其中一个或多个其他位置具有用PhyH超家族中已有的保守氨基酸的另一种氨基酸对氨基酸的突变;
c.多肽,其具有由在CEP3中具有置换S396G的多核苷酸SEQ ID NO:18编码的序列;
d.多肽,其具有由在GAL80中具有置换T146P的SEQ ID NO:20编码的序列;和其变体多肽,其中一个或多个其他位置可具有用NADB Rossmann超家族中已有的保守氨基酸的氨基酸对氨基酸的突变。
附图简述
图1展示了载体pPWT006的物理图谱。
图2展示了质粒pPWT018的物理图谱,其序列在SEQ ID NO:1中给出。
图3展示了显示杂交实验结果的放射自显影图,所述杂交实验显示了在CEN.PK113-7D中的质粒pPWT080的一个拷贝的正确整合;
图4展示了质粒pPWT080的物理图谱,其序列在SEQ ID NO:8中给出。
图5展示了在作为唯一碳源的2%阿拉伯糖上的参照菌株BIE104A2P1的需氧生长曲线,
图6展示了在作为唯一碳源的2%阿拉伯糖上的BIE104A2P1c的厌氧生长曲线,
图7展示了BIE104的生长曲线(OD600的糖-、乙醇-和甘油浓度)和产生的CO2(ml/hr,第二轴),BIE104在2%葡萄糖上预培养并在具有5%葡萄糖、5%木糖、3.5%阿拉伯糖和1%半乳糖的Verduyn培养基中生长,所有%以w/w的形式。
图8展示了BIE104A2P1c的生长曲线(OD600的糖-、乙醇-和甘油浓度)和产生的CO2(ml/hr,第二轴),BIE104A2P1c在2%葡萄糖上预培养并在具有5%葡萄糖、5%木糖、3.5%阿拉伯糖和1%半乳糖的Verduyn培养基中生长。
图9展示了BIE201的生长曲线(OD600的糖-、乙醇-和甘油浓度)和产生的CO2(ml/hr,第二轴),其在2%葡萄糖上预培养并在具有5%葡萄糖、5%木糖、3.5%阿拉伯糖和1%半乳糖的Verduyn培养基中生长,所有%以w/w的形式。
图10展示了杂交的示意图。
图11展示了“标准化熔融曲线”(熔融曲线;上图)和“标准化熔融峰”曲线(下图)的例子。后者源于第一图并显示作为温度函数的荧光信号的变化。展示菌株BIEl04A2P1和BIE201。在该图中测试的基因是YJR154w。两个测试的菌株BIE201和BIE104A2P1之间探针的熔融温度的不同是清楚的。
图12展示了在菌株BIE201中染色体VII的示意图(覆盖图)。读取深度阐释为沿着染色体的位置的函数。染色体VII的一些部分表示为多重拷贝,即2倍或3倍重复出现。
图13展示了用溴化乙锭染色的CHEF凝胶。按照它们的大小使用CHEF技术将染色体分开。分析的菌株是BIE104(未转化的酵母细胞)、BIE104A2P1a(不能消耗阿拉伯糖的初次转化体,BIE104A2P1的同义词)、通过适应性进化源自BIE104A2P1的菌株BIE104A2P1c,其能够在阿拉伯糖上生长和通过适应性进化源自BIE104A2P1c的菌株BIE201,其在厌氧条件下可在阿拉伯糖上生长。观察到染色体的转变(见正文)。菌株YNN295是标记物菌株(Bio-Rad)。
图14展示了用araA探针印迹和杂交的CHEF凝胶。按照它们的大小使用CHEF技术将染色体分开。分析的菌株是BIE104(未转化的酵母细胞)、BIE104A2P1a(不能消耗阿拉伯糖的初次转化体,BIE104A2P1的同义词)、BIE104A2P1c,通过适应性进化源自BIE104A2P1的菌株,其能够在阿拉伯糖上生长和通过适应性进化源自BIE104A2P1c的菌株BIE201,其在厌氧条件下可在阿拉伯糖上生长。观察到染色体的转变(见正文)。菌株YNN295是标记物菌株(Bio-Rad),用作染色体大小的参照。
图15展示了用ACT1探针印迹和杂交的CHEF凝胶。按照它们的大小使用CHEF技术将染色体分开。分析的菌株是BIE104(未转化的酵母细胞)、BIE104A2P1a(不能消耗阿拉伯糖的初次转化体,BIE104A2P1的同义词)、BIE104A2P1c、通过适应性进化源自BIE104A2P1的菌株,其能够在阿拉伯糖上生长和通过适应性进化源自BIE104A2P1c的菌株BIE201,其在厌氧条件下可在阿拉伯糖上生长。观察到染色体的转变(见正文)。菌株YNN295是标记物菌株(Bio-Rad),用作染色体大小的参照。
图16展示了用PNC1探针印迹和杂交的CHEF凝胶。按照它们的大小使用CHEF技术将染色体分开。分析的菌株是BIE104(未转化的酵母细胞)、BIE104A2P1a(不能消耗阿拉伯糖的初次转化体,BIE104A2P1的同义词)、BIE104A2P1c,通过适应性进化源自BIE104A2P1的菌株,其能够在阿拉伯糖上生长和通过适应性进化源自BIE104A2P1c的菌株BIE201,其在厌氧条件下可在阿拉伯糖上生长。观察到染色体的转变(见正文)。菌株YNN295是标记物菌株(Bio-Rad),用作染色体大小的参照。
图17展示了用HSF1探针印迹和杂交的CHEF凝胶。按照它们的大小使用CHEF技术将染色体分开。分析的菌株是BIE104(未转化的酵母细胞)、BIE104A2P1a(不能消耗阿拉伯糖的初次转化体,BIE104A2P1的同义词)、BIE104A2P1c,通过适应性进化源自BIE104A2P1的菌株,其能够在阿拉伯糖上生长和通过适应性进化源自BIE104A2P1c的菌株BIE201,其在厌氧条件下可在阿拉伯糖上生长。观察到染色体的转变(见正文)。菌株YNN295是标记物菌株(Bio-Rad),用作染色体大小的参照。
图18展示了用YGR031w探针印迹和杂交的CHEF凝胶。按照它们的大小使用CHEF技术将染色体分开。分析的菌株是BIE104(未转化的酵母细胞)、BIE104A2P1a(不能消耗阿拉伯糖的初次转化体,BIE104A2P1的同义词)、BIE104A2P1c,通过适应性进化源自BIE104A2P1的菌株,其能够在阿拉伯糖上生长和通过适应性进化源自BIE104A2P1c的菌株BIE201,其在厌氧条件下可在阿拉伯糖上生长。观察到染色体的转变(见正文)。菌株YNN295是标记物菌株(Bio-Rad),用作染色体大小的参照。
图19展示了来自杂交BIE104A2P1×BIE201的10个剥离的子囊的例子。子囊用Singer Micromanipulator剥离。每个子囊由4个子囊孢子组成。这些子囊孢子彼此分开并以不同的距离放在琼脂平板上。理论上,4个单倍体孢子分离物可产生4个单独菌落。在一个“圆柱体”中的4个菌落起源于1个子囊。
图20图解菌株BIE252在BAM(生物活性监测器,Halotec,TheNetherlands)中的性能。菌株在Verduyn培养基2%葡萄糖中预培养。BAM中的应用在厌氧条件下,在补充5%葡萄糖、5%木糖、3.5%阿拉伯糖、1%半乳糖和0.5%甘露糖的pH4.2的Verduyn培养基上进行。
图21图解菌株BIE252ΔGAL80在BAM中的性能。菌株在Verduyn培养基2%葡萄糖中预培养。BAM中的应用在厌氧条件下,在补充5%葡萄糖、5%木糖、3.5%阿拉伯糖、1%半乳糖和0.5%甘露糖的pH4.2的Verduyn培养基上进行。
图22展示了将完全己二酸路径双交换整合进入基因组的示意图。
图23展示了用分析方法测量的己二酸标准物和样品产生的色谱图。
图24展示了质粒pGBS416ARABD的物理图谱。
序列表简述
SEQ ID NO:1展示了pPWT018的序列;
SEQ ID NO:2展示了用于检查pPWT018整合的引物序列;
SEQ ID NO:3展示了用于检查pPWT018整合(用SEQ ID NO:2)并且用于检查pPWT018拷贝数(用SEQ ID NO:4)的引物;
SEQ ID NO:4展示了用于检查pPWT018拷贝数的引物序列;
SEQ ID NO:4展示了结合SEQ ID NO:4用于检查基因组中的pPWT018的存在的引物序列;
SEQ ID NO:6展示了用于产生SIT2探针的正向引物序列;
SEQ ID NO:7展示了用于产生SIT2探针的反向引物序列;
SEQ ID NO:8展示了质粒pPWT080的序列;
SEQ ID NO:9展示了用于检查GRE3-基因座的3’-末端处的pPWT080的正确整合(用SEQ ID NO:10)并且用于检查质粒pPWT080的拷贝数(用SEQID NO:11)的正向引物序列;
SEQ ID NO:10展示了用于检查GRE3-基因座的3’-末端处的pPWT080的正确整合的反向引物序列;
SEQ ID NO:11展示了检查质粒pPWT080的拷贝数(用SEQ ID NO:10)的反向引物序列;
SEQ ID NO:12展示了用于产生RKI1-探针的正向引物序列;
SEQ ID NO:13展示了用于产生RKI1-探针的反向引物序列;
SEQ ID NO:14展示了针对在野生型菌株BIE104中的SSY1基因的序列的序列;
SEQ ID NO:15展示了在菌株BIE104A2P1c和BIE201中的SSY1基因的序列;
SEQ ID NO:16展示了在野生型菌株BIE104中的YJR154w基因的序列;
SEQ ID NO:17展示了在菌株BIE104A2P1c和BIE201中的YJR154w基因的序列;
SEQ ID NO:18展示了在野生型菌株BIE104中的CEP3基因的序列;
SEQ ID NO:19展示了在菌株BIE104A2P1c和BIE201中的CEP3基因的序列;
SEQ ID NO:20展示了在野生型菌株BIE104中的YPL277c基因的序列;
SEQ ID NO:21展示了在菌株BIE104A2P1c和BIE201中的YPL277c基因的序列;
SEQ ID NO:22展示了在野生型菌株BIE104中的GAL80基因的序列;
SEQ ID NO:23展示了在菌株BIE201中的GAL80基因的序列;
SEQ ID NO 24展示了正向引物SSY1的序列;
SEQ ID NO 25展示了反向引物SSY1的序列;
SEQ ID NO 26展示了正向引物YJR154w的序列;
SEQ ID NO 27展示了反向引物YJR154w的序列;
SEQ ID NO 28展示了正向引物CEP3的序列;
SEQ ID NO 29展示了反向引物CEP3的序列;
SEQ ID NO 30展示了正向引物YPL277c的序列;
SEQ ID NO 31展示了反向引物YPL277c的序列;
SEQ ID NO 32展示了正向引物GAL80的序列;
SEQ ID NO 33展示了反向引物GAL80的序列;
SEQ ID NO 34展示了Hi-Res探针SSY1的序列;
SEQ ID NO 35展示了Hi-Res探针YJR154w的序列;
SEQ ID NO 36展示了Hi-Res探针CEP3的序列;
SEQ ID NO 37展示了Hi-Res探针YPL277c的序列;
SEQ ID NO 38展示了Hi-Res探针GAL80的序列;
SEQ ID NO 39展示了正向引物YGL057c的序列;
SEQ ID NO 40展示了反向引物YGL057c的序列;
SEQ ID NO 41展示了正向引物SDS23的序列;
SEQ ID NO 42展示了反向引物SDS23的序列;
SEQ ID NO 43展示了正向引物ACT1的序列;
SEQ ID NO 44展示了反向引物ACT1的序列;
SEQ ID NO 45展示了正向引物araA的序列;
SEQ ID NO 46展示了反向引物araA的序列;
SEQ ID NO 47展示了正向引物ACT1的序列;
SEQ ID NO 48展示了反向引物ACT1的序列;
SEQ ID NO 49展示了正向引物PNC1的序列;
SEQ ID NO 50展示了反向引物PNC1的序列;
SEQ ID NO 51展示了正向引物HSF1的序列;
SEQ ID NO 52展示了反向引物HSF1的序列;
SEQ ID NO 53展示了正向引物YGR031w的序列;
SEQ ID NO 54展示了反向引物YGR031w的序列;
SEQ ID NO 55展示了正向引物(matA,mata)的序列;
SEQ ID NO 56展示了反向引物matA的序列;
SEQ ID NO 57展示了反向引物mata(alpha)的序列;
SEQ ID NO 58展示了正向引物GAL80::kanMX的序列;
SEQ ID NO 59展示了反向引物GAL80::kanMX的序列;
SEQ ID NO 60展示了用于扩增INT1LF的正向引物序列;
SEQ ID NO 61展示了用于扩增与Adi21表达盒具有50bp重叠侧翼的INT1LF的反向引物序列;
SEQ ID NO 62展示了用于扩增具有50bp侧翼INT1LF的Adi21表达盒的正向引物序列;
SEQ ID NO 63展示了用于扩增Adi21表达盒的反向引物序列;
SEQ ID NO 64展示了用于扩增Adi22表达盒的正向引物序列;
SEQ ID NO 65展示了用于扩增Adi22表达盒的反向引物序列;
SEQ ID NO 66展示了用于扩增Adi23表达盒的正向引物序列;
SEQ ID NO 67展示了用于扩增Adi23表达盒的反向引物序列;
SEQ ID NO 68展示了用于扩增来自pUG7的与Adi23具有50bp侧翼重叠的kanMX标记物的正向引物序列;
SEQ ID NO 69展示了用于扩增来自pUG7的与Adi8具有50bp侧翼重叠的kanMX标记物的反向引物序列;
SEQ ID NO 70展示了用于扩增与pUG7的kanMX具有25bp侧翼重叠的Adi8表达盒的正向引物序列;
SEQ ID NO 71展示了Adi8表达盒的反向引物序列;
SEQ ID NO 72展示了用于扩增Adi24表达盒的正向引物序列;
SEQ ID NO 73展示了用于扩增Adi24表达盒的反向引物序列;
SEQ ID NO 74展示了用于扩增Adi25表达盒的正向引物序列;
SEQ ID NO 75展示了用于扩增与SucC具有50bp重叠的Adi25表达盒的反向引物序列;
SEQ ID NO 76展示了用于扩增与Adi25具有50bp重叠的SucC的正向引物序列;
SEQ ID NO 77展示了用于扩增SucC表达盒的反向引物序列;
SEQ ID NO 78展示了用于扩增SucD表达盒的正向引物序列;
SEQ ID NO 79展示了用于扩增SucD表达盒的反向引物序列;
SEQ ID NO 80展示了用于扩增acdh67表达盒的正向引物序列;
SEQ ID NO 81展示了用于扩增与INTRF具有50bp侧翼重叠的acdh67构建体的反向引物序列;
SEQ ID NO 82展示了用于扩增酵母基因组上INT1LF位点的正向引物序列;
SEQ ID NO 83展示了反向引物用于扩增酵母基因组上INT1LF位点的序列;
SEQ ID NO 84展示了ADI21 PCR片段的序列;
SEQ ID NO 85展示了ADI22 PCR片段的序列;
SEQ ID NO 86展示了ADI23 PCR片段的序列;
SEQ ID NO 87展示了ADI8 PCR片段的序列;
SEQ ID NO 88展示了ADI24 PCR片段的序列;
SEQ ID NO 89展示了ADI25 PCR片段的序列;
SEQ ID NO 90展示了SUCC PCR片段的序列;
SEQ ID NO 91展示了SUCD PCR片段的序列;
SEQ ID NO 92展示了ACDH67PCR片段的序列;
SEQ ID NO 93展示了KANMX标记物片段的序列;
SEQ ID NO 94展示了INT1LF PCR片段的序列;
SEQ ID NO 95展示了INT1RF PCR片段的序列;
SEQ ID NO 96展示了araABD表达盒的正向引物序列;
SEQ ID NO 97展示了araABD表达盒的反向引物序列
SEQ ID NO 98展示了Ty1::araABD的正向引物序列;
SEQ ID NO 99展示了TY1::araABD的反向引物序列;
SEQ ID NO 100展示了Ty1::kanMX的正向引物序列;
SEQ ID NO 101展示了Ty1::kanMX的反向引物序列。
发明详述
在本说明书和附带的权利要求书中,词语“包含”和“包括”及其变体如“包含”(″comprises″,″包含″)、“包括”(″包括″和″包括″)应被解释为包含在内。也就是说,在上下文允许时,这些词语旨在传达可能包括未明确指出的其它元素或整数。
冠词“一个”(“a”和“an”)在本文中被用于表示一个或多于一个(即一个或至少一个)所述冠词的语法客体。例如,“一个元件”可表示一个元件或多于一个元件。
本文所述的本发明的多个实施方式可以交叉组合。
本发明提供了用于生产能够转化阿拉伯糖的细胞的方法,所述方法包括步骤a)至g),这些将在本文中详细描述:
步骤a)将基因araA、araB和araD引入不能够转化阿拉伯糖的宿主菌株,该细胞被命名为构建细胞;
步骤a)将在说明书中下文详细描述并将通过例子阐释。
步骤b)和c)使构建细胞进行适应性进化直到获得转化阿拉伯糖的细胞,任选地,使第一阿拉伯糖转化细胞进行适应性进化,以改进阿拉伯糖转化;步骤b)或c)中产生的细胞被命名为第一阿拉伯糖转化细胞;
步骤b)和c)将在适应性进化下在说明书中下文详细描述并通过例子阐释。
步骤d)分析第一阿拉伯糖转化细胞和构建细胞的基因组的一部分或全基因组;
使用基因组重测序通常技术进行该步骤d)。
步骤e)鉴定第一阿拉伯糖转化细胞中的单核苷酸多态性(SNP);
通过查看第一阿拉伯糖转化细胞和其构建细胞之间的差异来进行步骤e)
步骤f)使用在能够转化阿拉伯糖的合理设计的细胞中的SNP的信息;
在步骤f)中,技术人员将知道哪种SNP阿拉伯糖转化是有贡献的,并基于该信息能用常用技术设计改进的菌株。
在步骤e)、f)和/或g)中技术人员优选地使用表现分型技术,即鉴定具有期望特征的细胞并结合基因分型技术,即鉴定与选择的特征关联的候选基因。
表现分型技术的例子是在单糖或糖混合物的存在下在摇瓶或发酵罐中的生长实验。可应用在固体琼脂培养基上的生长检验。但是,可使用合适已知方法。
基因分型技术的例子是重测序技术比如Solexa等等、定量PCR、Southern印迹。但可使用其他合适的已知方法。
步骤g)构建在步骤f)中设计的能够转化阿拉伯糖的细胞。
在步骤g)中,可使用构建新菌株的所有常用技术。在一种实施方式中,使不同的菌株(亲本)合并,以使亲本的有利特性合并。例如可使用杂交技术,包括步骤b)或c)的菌株与与不具有在步骤b)或c)的菌株中存在的所有SNP的菌株杂交。
例如,通过称为适应性进化的方法,用对发酵阿拉伯糖的能力而言必要的基因或增强发酵阿拉伯糖的能力的基因(所有基因一起命名为ARA)转化的单倍体酵母菌株可被增强。在适应性进化方法期间,三个命名为mut1、mut2和mut3的突变已被引入基因组。此类酵母菌株的基因型可被写为mut1 mut2 mut3 ARA。
此类酵母菌株可与另一单倍体酵母菌株杂交,所述另一单倍体酵母菌株还包含就阿拉伯糖转化而言需要的基因,但尚不能进行阿拉伯糖转化,因为其缺少进行阿拉伯糖转化的额外突变。但是,该菌株可具有另一有益特性,比如对抑制剂的耐受性。该特性被命名为ABC。此种方法在图10中阐释。
在一种实施方式中,在上述方法中,能够转化阿拉伯糖的酵母细胞具有较之宿主菌株而言扩增的染色体,其中扩增的染色体具有与其中araA、araB和araD基因被引入宿主菌株的染色体相同的数目。在一种实施方式中扩增的染色体是染色体VII。在一种实施方式中,在酵母细胞中,(较之宿主菌株)扩增了动粒周围的部分染色体VII。在一种实施方式中,染色体VII左臂上的区域扩增了三次。在一种实施方式中,染色体VII的部分右臂扩增了两次并且邻近部分扩增了三次(见图12)。
扩增三次的染色体VII右臂上的部分含有在强构建型启动子控制下的阿拉伯糖表达盒,即基因araA、araB和araD。
除了酵母细胞BIE201外,本发明还涉及具有araA、araB和araD基因的酵母细胞,其中染色体VII具有如通过电泳测定的从1300至1600Kb的大小。菌株BIE201已在WO2011003893中公开。
BIE201具有所有单核苷酸多态性:SSY1基因中的G1363T、YJR154w基因中的A512T、CEP3基因中的A1186G和GAL80基因中的A436C。
在一种实施方式中,在酵母细胞中,araA、araB和araD基因的拷贝数是每种2至10个,在一种实施方式中,每种2至8个或3至5个。araA、araB和araD基因的拷贝数可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10个。拷贝数可以用对技术人员而言已知的方法测定,合适的方法在实施例中阐释,并且结果在例如图12中示出。
在一种实施方式中,酵母细胞的单核苷酸多态性的两种或多种但不是不是全部选自由下述突变组成的组:SSY1基因中的G1363T、YJR154w基因中的A512T、CEP3基因中的A1186G和GAL80基因中的A436C。在一种实施方式中,酵母细胞具有单种多态性GAL80基因中的A436C。在一种实施方式中,酵母细胞具有单种多态性CEP3基因中的A1186G。
性接合
通过可扩散分子、信息素介导的酵母中的交配可容易证明(Manney,Duntze & Betz 1981)。当在培养皿中的琼脂生长培养基表面上混合相反交配型的细胞时,2至3个小时内变化显而易见。由于每一类型的细胞将其信息素分泌进培养基,其对由相反类型产生的信息素有反应(MacKay &Manney 1974)。它们各自通过分化为专门的功能形式——配子起反应。细胞停止分裂并改变它们的形状。它们伸长并成为梨形的。这些特征性细胞已被称为“梨形细胞(shmoos)”。接触或近似靠近的相反交配型的细胞在表面上结合并融合在一起形成具有中心缢痕的特征性“花生”形状,即两个梨形细胞在它们的小末端处融合。每一结合对内的两个单倍体核融合成为二倍体核,形成真正的合子。二倍体迅速在缢痕处发芽,形成特征性的“三叶草”图。人们在显微镜下能容易地观察到所有这些阶段。
通过单倍体细胞分泌的交配信息素是通过琼脂扩散的小的肽分子(Betz,Manney & Duntze 1981)。因此,它们的存在和对相反交配型的细胞的作用易于证明。如果交配型α(alpha)的细胞在琼脂培养基上过夜培养,高浓度的信息素在生长周围的琼脂中累积。如果交配型a(matA或mata)的细胞位于该琼脂上,它们在两个小时内开始经历“梨形细胞”转化。可在其中已生长交配型α(alpha)细胞的液体培养基中证明相同的作用。
减数分裂
梨形细胞是酵母中的配子。只有当存在相反交配型的细胞时,所述梨形细胞从正常营养性单倍体细胞中分化。以类似方式,任何二倍体细胞可经历减数分裂形成具有成为配子的潜能的单倍体(Esposito & Klapholz1981;Fowell 1969)。减数分裂是孢子形成的一部分过程,其发生在当二倍体细胞转移至营养不平衡培养基上时,但是当子囊变得相当突出时,只有在3-5天之后该变化在显微镜下变得显而易见。理论上,所有的子囊应当包含4个孢子,但实际上,一些仅仅包含2个或3个。子囊具有特征性形状。用容易获得的消化酶粗制制剂(例如酵母裂解酶,蜗牛酶)处理孢子形成混合物将去除子囊的壁,释放孢子。当在子囊中的或被释放的孢子回到营养充足的环境时,它们萌发并在稳定的单倍体阶段经历营养生长。在称为a和α(alpha)的2个交配型中出现单倍体菌。每个子囊中,2个孢子是正常的交配型a(matA)并且另外2个是α(mata(alpha))型。当一种交配型的细胞遇到另一种交配型的细胞时,它们启动一系列的事件导致接合(见性接合)。结果是二倍体细胞,其通过在稳定的二倍体阶段的有丝细胞分裂生长。如果人们仅仅将形成孢子的细胞培养物转移至生长培养基,结果是单倍体菌株和新的二倍体菌株的混合种群,所述二倍体菌株与来自二倍体高级生物体之间的杂交的生殖相似。
通常,酵母遗传学家随机或通过微操作分离孢子,以保护单倍体菌株交配并形成下一代二倍体菌株。该控制程度和在单倍体阶段观察遗传特性的能力使得酵母的遗传分析有力和有效。
适应(adaption)
适应是一种进化过程,藉此种群变得更加适合(适应)其一种或多种栖息地(栖息地)。该过程在若干到许多代中发生,并且是生物学的基本现象之一。
术语适应也可以表示对生物存活而言特别重要的特征。此类适应在可变种群中通过天然选择由更成功地进行繁殖的、更好地适应的形式生产。
环境条件的改变改变了天然选择的结果,影响所造成的适应的选择性益处(selective benefits),改善生物在新条件下的适合度(fitness)。在极端环境改变的情况下,有益适应的出现和固定对存活而言可以是至关重要的。大量不同的因素(例如养分可用度、温度、氧可用度等等)能够驱动适应性进化。
适合度(Fitness)
适应性(在给定栖息地集合中生物能够生活和繁殖的程度)和适合度之间存在清楚的联系。适合度是天然选择率的一种估计量和预测器。通过应用天然选择,替代性表型的相对频率可随着时间而变化,如果它们可以遗传的话。
遗传改变
当天然选择作用于种群的遗传变异性时,遗传改变是潜在的机制。通过这种方式,种群遗传适应于其环境。遗传改变可导致可见的结构,或者以适应改变的栖息地的方式调节生物的生理活性。
可出现栖息地的频繁变化。因此,接着适应的过程从不会最终结束。及时地,可能出现环境逐步变化并且物种越来越好地适应其环境。另一方面,可能出现环境变化相对迅速并且接着物种越来越不能良好适应。适应是遗传过程,其在某种程度上一直在进行,当种群不改变栖息地或环境时也在进行。
DNA序列中的单个核苷酸可改变(置换)、去除(缺失)或添加(插入)。插入或缺失SNP(InDel)可转变翻译框。
单核苷酸多态性可落入基因的编码序列(开放阅读框或ORF)内、基因的非编码区域(如启动子序列、终止子序列等等)或基因之间的基因间区域。由于遗传密码的兼并性,编码序列中的SNP未必改变在转录和翻译之后产生的相应的蛋白质的氨基酸序列。其中两种形式产生相同多肽序列的SNP称为同义的(同义突变)。如果产生不同的多肽序列,它们是非同义的。非同义的变化可以是错义的或无义的。错义变化在相应的多肽中产生不同的氨基酸,而无义变化产生过早的终止密码子,有时导致形成截短的蛋白质。
例如通过改变的转录因子结合或相应的mRNA稳定性,不在蛋白质-编码区域的SNP可仍具有基因表达的结果。
可在DNA中出现的变化不必限于单个核苷酸的变化(置换、缺失或插入),而是也可包含两个或多个核苷酸的变化(小细胞核变异)。
另外,可出现染色体易位。染色体易位是由非同源染色体之间的部分重排造成的染色体畸形。
尤其,根据本发明在下述阅读框中产生SNP:SSY1、CEP3和GAL80。
SSY1在这里是SPS质膜氨基酸传感器系统(Ssy1p-Ptr3p-Ssy5p)的组分,其感知外部的氨基酸浓度并传送导致调节氨基酸通透酶基因表达的细胞内信号。
CEP3在这里是必须的动粒蛋白质,CBF3复合物的组分,其结合着丝粒的CDEIII区域;包含N-末端Zn2Cys6类型锌指结构域、C-末端酸性结构域和推测的卷曲螺旋二聚化结构域。
GAL80在这里是参与在缺少半乳糖的情况下抑制GAL基因的转录调节子。通常其通过Gal4p抑制转录活性并通过Gal3p或Gal1p结合释放抑制。
根据本发明,已经显示基因SSY1、CEP3和GAL80中的SNP对于细胞能够发酵混合糖组合物而言是重要的。
进行BLAST搜索用于在这些基因中发现SNP。
经鉴定的SNP的概况在表1中给出:
表1:本发明的SNP的概况
*起始密码子ATG的A是第一核苷酸位置
包含SNP的基因的blast产生下述数据:
Ssy1p(AA_反式超家族成员)
SPS质膜氨基酸传感器系统(Ssy1p-Ptr3p-Ssy5p)的组分,其感知外部氨基酸浓度并传送导致调节氨基酸通透酶基因表达的细胞内信号[酿酒酵母]
在酿酒酵母BIE201中出现的更短蛋白质是独特特征。
YJR154w(PhyH超家族成员)
未知功能的假定的蛋白质;绿色荧光蛋白质(GFP)-融合蛋白质位于细胞质[酿酒酵母]中。
在所有这些蛋白质中,在位置171处(或基于BLAST结果的等价位置)的D-残基是保守。
CEP3(GAL4样Zn2Cys6 双核簇DNA-结合结构域;出现在转录调节子
样GAL4中)
着丝粒DNA-结合蛋白质复合物CBF3亚单位B
在所有这些蛋白质中,在位置396(或基于BLAST结果的等价位置)处的S-残基是保守的。
GAL80(NADB_Rossmann超家族成员)
半乳糖/乳糖代谢调节蛋白质GAL80
在所有这些蛋白质中,位置146处(或基于BLAST结果的等价位置)的T-残基是保守的。
糖组合物
根据本发明的糖组合物包含葡萄糖、阿拉伯糖和木糖。在本发明中可以使用满足这些标准的任何糖组合物。糖组合物中任选的糖是半乳糖和鼠李糖。在一个优选的实施方式中,糖组合物是一种或多种木质纤维素材料的水解产物。此处木质纤维素包括半纤维素和生物质的半纤维素部分。木质纤维素还包括生物质的木质纤维素级分。合适的木质纤维素材料可存在于以下列表中:果园底料,树丛,磨坊废弃物,城市木材废弃物,市政废弃物,伐木废弃物,森林疏伐废弃物,短期轮种木本作物,工业废弃物,小麦秸,燕麦秸,水稻秸,大麦秸,黑麦秸,亚麻秸,大豆壳,稻壳,水稻秸,玉米谷蛋白饲料,燕麦壳,甘蔗,玉米秸秆,玉米杆,玉米芯,玉米壳,柳枝稷,芒草,高粱,芸苔茎,大豆茎,牧场草,磨擦禾,狐尾草;甜菜浆,柑橘果实浆,种子壳,纤维素动物粪便,草坪修剪废弃物,棉花,海藻,树木,软木材,硬木材,白杨,松树,灌木丛,草,小麦,小麦秸,甘蔗渣,玉米,玉米壳,玉米棒,玉米粒,来自玉米粒的纤维,来自谷物湿磨或干磨的产物和副产物,市政固体废弃物,废纸,庭院废弃物,草本材料,农业残余物,林业残余物,市政固体废弃物,废纸,纸浆,造纸厂残余物,树枝,灌木,甘蔗,玉米,玉米壳,能源作物,森林,水果,鲜花,谷物,草,草本作物,树叶,树皮,针叶,原木,根,树苗,灌木丛,柳枝稷,树木,蔬菜,水果皮,藤蔓,甜菜浆,小麦麸皮,燕麦壳,硬木材或软木材,由农业加工产生的有机废弃物材料,林业木材废弃物,或其中任意两种或更多的组合。
表1中给出了源自木质纤维素的一些合适的糖组合物及其水解产物的糖组合物的概况。所列出的木质纤维素包括:玉米芯、玉米纤维、稻壳、瓜皮(melon shells)、甜菜浆、小麦秸、甘蔗渣、木材、草和橄榄压制物(olive pressings)。
表1:来自木质纤维素材料的糖组合物的概况。Gal=半乳糖,Xyl=木糖,Ara=阿拉伯糖,Man=甘露糖,Glu=谷氨酸盐/酯,Rham=鼠李糖。给出了半乳糖百分比(%Gal)和文献来源。
从表1中清楚地看出,在这些木质纤维素中,高含量的糖以葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖的衍生物形式存在。葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖转化成发酵产品因此具有巨大的经济重要性。鼠李糖也以比之前提到的糖较小的量存在于木质纤维素材料中。因此有利地鼠李糖也被混合糖细胞转化。
预处理和酶水解
可能需要预处理和酶水解以释放可根据本发明从木质纤维素(包括半纤维素)材料发酵的糖。这些步骤可用常规方法进行。
混合糖细胞
混合糖细胞如下文所定义,包含整合进入混合糖细胞基因组的基因araA、araB和araD。其能够发酵葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖和甘露糖。在本发明的一个实施方式中,混合糖细胞能够发酵一种或多种其他糖,优选地C5和/或C6糖。在本发明的一个实施方式中,混合糖细胞包含以下之一种或多种:xylA-基因和/或XKS1-基因,以允许混合糖细胞发酵木糖;醛糖还原酶(GRE3)基因的缺失;PPP-基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1的过表达,以允许提高细胞中通过戊糖磷酸途径的通量。
混合糖菌株的构建
可以通过向宿主细胞中引入:
a)处于强启动子控制下的由PPP-基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1构成的簇,
b)由二者均处于组成型启动子控制下的xylA-基因和XKS1-基因构成的簇,
c)由基因araA、araB和araD构成的簇和/或XKS1-基因和/或xylA-基因的簇;
和
d)缺失醛糖还原酶基因,
并进行适应性进化(adaptive evolution)以产生混合糖细胞。上面的细胞可使用重组表达技术构建。
重组表达
本发明的细胞是重组细胞。也就是说,本发明的细胞包含下述核苷酸序列,或用下述核苷酸序列转化,或用下述核苷酸序列遗传修饰,所述核苷酸序列并不天然地存在于所考虑的细胞中。
用于在细胞中重组表达酶以及用于对木发明的细胞进行其他遗传修饰的技术是本领域技术人员公知的。典型地,此类技术涉及用包含相关序列的核酸构建体转化细胞。此类方法可例如从标准手册中获知,例如Sambrook and Russel(2001)″Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rdedition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Pressor F.Ausubel et al,eds.,″Current protocols in molecular biology″,GreenPublishing and Wiley Interscience,New York (1987)。用于对真菌宿主细胞进行转化和遗传修饰的方法可从例如EP-A-0635574、WO 98/46772、WO99/60102、WO 00/37671、WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US 6,265,186中获知。
典型地,核酸构建体可以是质粒,例如低拷贝质粒或高拷贝质粒。根据本发明的细胞可例如通过多个拷贝的核苷酸构建体,或通过使用具有多个拷贝酶序列的构建体,而包含单个或多个拷贝的编码酶的核苷酸序列。
核酸构建体可保持为游离并因此包含用于自主复制的序列,例如常染色体复制序列。合适的游离核酸构建体可例如基于酵母2μ或pKD1质粒(Gleer et al,1991,Biotechnology 9:968-975)或AMA质粒(Fierro et al,1995,Curr Genet.29:482-489)。或者,每种核酸构建体可作为单个拷贝或多个拷贝被整合进细胞的基因组中。进入细胞基因组的整合可通过非同源重组随机地发生,但是优选地,核酸构建体可如本领域所公知的通过同源重组被整合进细胞的基因组中(见例如WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US 6,265,186)。
大部分游离或2μ质粒是相对不稳定的,在每一代后在约10-2或更多细胞中丢失。即使在选择性生长的条件下,只有60%到95%的细胞保留游离质粒。对cir+宿主而言,大部分游离质粒的拷贝数范围在每个细胞10-40个之间。然而,质粒在细胞之间并非均等分布的,种群中每个细胞中的拷贝数存在高度方差。用整合型质粒转化的菌株是极度稳定的,即使在不存在选择性压力时也是如此。然而,质粒丢失可通过串联重复DNA之间的同源重组而以约10-3到10-4的频率发生,导致载体序列的成环丢失(looping out)。因此,优选地,在稳定整合情况下的载体设计是,通过选择标记物基因的丢失(也通过分子内、同源重组发生),被整合的构建体的成环丢失不再可能。优选地,基因以这种方式被稳定整合。稳定整合在本文中被定义为整合进基因组中,其中被整合的构建体的成环丢失不再可能。优选地不存在选择标记物。典型地,酶编码序列应与一个或多个能够提供或帮助酶序列的转录和/或翻译的核酸序列可操作地连接。
术语“可操作地连接”是指下述并置(juxtaposition),其中所述组分处于允许它们以期望的方式发挥作用的关系中。例如,启动子或增强子与编码序列可操作地连接,所述启动子或增强子影响所述编码序列的转录。
在本文中使用时,“启动子”是指下述核酸片段,其发挥控制一个或多个基因转录的功能,相对于基因转录起点的转录方向而言位于上游,并且在结构上通过DNA-依赖性RNA聚合酶、转录起点和本领域技术人员已知的任何其它DNA序列的存在来识别。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。
能够用于实现编码本发明酶的核苷酸序列表达的启动子对编码要表达的酶的核苷酸序列而言可以不是天然的,即对与之可操作地连接的核苷酸序列(编码序列)而言异源的启动子。然而,启动子对宿主细胞而言可以是同源的,即内源的。
启动子是可广泛获得的,并是技术人员已知的。这类启动子的合适例子包括例如来自糖酵解基因的启动子,如来自酵母或丝状真菌的果糖磷酸激酶(PFK)、丙糖磷酸异构酶(TPI)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD、TDH3或GAPDH)、丙酮酸激酶(PYK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子;关于这类启动子的更多细节可在(WO 93/03159)中找到。其它有用的启动子是编码核糖体蛋白的基因启动子,乳糖酶基因启动子(LAC4)、醇脱氢酶启动子(ADHl、ADH4等等)和烯醇化酶启动子(ENO)。其它(组成型以及诱导型)启动子和增强子或上游活化序列应当是本领域技术人员已知的。本发明宿主细胞中使用的启动子可以在需要时被修饰,来影响它们的控制特征。本文上下文中合适的启动子包括组成型和诱导型两种天然启动子以及经改造的启动子,这是本领域技术人员公知的。真核宿主细胞中合适的启动子可以是GAL7、GAL10或GAL1、CYC1、HIS3、ADH1、PGL、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO1 TPI1和AOX1。其它合适的启动子包括PDC1、GPD1、PGK1、TEF1和TDH3。
在本发明的细胞中,编码酶的核苷酸序列的3’-端优选地与转录终止子序列可操作地连接。优选地,终止子序列在选择的宿主细胞、如例如选择的酵母物种中是可操作的。在任何情况下终止子的选择不是关键性的;其可以例如来自于任何酵母基因,尽管如果来自于非酵母、真核基因时终止子有时可能发挥功能。通常,编码酶的核苷酸序列包含终止子。优选地,这类终止子与预防本发明宿主细胞中无义介导的mRNA衰变的突变组合(参阅例如:Shirley等,2002,Genetics 161:1465-1482)。
转录终止序列还优选地包含多聚腺苷酸化信号。
任选地,适用于本发明的核酸构建体中可存在选择性标记物。在本文中使用时,术语“标记物”是指编码性状或表型的基因,所述性状或表型允许选择或筛选含有所述标记物的宿主细胞。标记物基因可以是抗生素抗性基因,从而可使用适当的抗生素从未经转化的细胞中选择经转化的细胞。合适的抗生素抗性标记物包括例如二氢叶酸还原酶、潮霉素B磷酸转移酶、3′-O-磷酸转移酶II(卡那霉素、新霉素和G418抗性)。对于多倍体宿主细胞的转化而言抗生素抗性标记物可以是最为便利的。也可以使用非抗生素抗性标记物,如营养缺陷型标记物(URA3、TRPl、LEU2)或S.pombe TPI基因(由Russell P R,1985,Gene 40:125-130描述)。在一个优选的实施方式中,用核酸构建体转化的宿主细胞是无标记物基因的。用于构建重组的无标记物基因的微生物宿主细胞的方法公开于EP-A-O 635 574中,并且基于双向标记物如A.nidulans amdS(乙酰胺酶)基因或酵母URA3和LYS2基因的使用。或者,可以将可筛选的标记物如绿色荧光蛋白、lacL、萤光素酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡萄糖苷酸酶并入本发明的核酸构建体中,允许筛选经转化的细胞。
可存在于适用于本发明的核酸构建体中任选的其它元件包括但不限于,一条或多条前导序列、增强子、整合因子、和/或报告基因、内含子序列、着丝点抗体(centromer)、调聚物和/或基质附着(MAR)序列。本发明的核酸构建体可还包含用于自主复制的序列,如ARS序列。
因此,重组方法可使用已知的重组技术进行。本领域技术人员已知用于在本发明的细胞中表达和过表达酶的多种手段。具体地,可以通过提高宿主细胞中编码酶的基因的拷贝数(例如通过在宿主细胞的基因组中整合额外的基因拷贝,通过表达来自游离多拷贝表达载体的基因,或通过引入包含多拷贝基因的游离表达载体)来过表达酶。
或者,可以通过使用对编码要过表达的酶的序列而言不是天然的启动子(即对与之可操作地连接的编码序列而言为异源的启动子)来实现本发明宿主细胞中酶的过表达。尽管启动子优选地对与之可操作地连接的编码序列而言是异源的,但是还优选启动子是同源的,即对宿主细胞而言是内源的。优选地,与对编码序列而言天然的启动子相比,异源启动子能够生产更高稳态水平的包含所述编码序列的转录本(或者每单位时间能够生产更多转录木分子,即mRNA分子)。在木文上下文中,合适的启动子包括组成型和诱导型启动子二者,以及经改造的启动子。
用于上述酶过表达的编码序列可优选地对本发明的宿主细胞而言是同源的。然而,可以使用对本发明宿主细胞而言异源的编码序列。
涉及经遗传修饰的细胞中酶的生产时,酶的过表达表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比,所述酶以更高水平的酶比活性被生产。通常,这表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比酶活性蛋白质(或在多亚基酶的情况下多种蛋白质)以更大量被生产,或者以更高的稳态水平被生产。类似地,这通常表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比,编码酶活性蛋白质的mRNA以更大量被生产,或者也以更高的稳态水平被生产。优选地,在本发明的宿主细胞中,与除了引起过表达的遗传修饰之外在遗传上相同的菌株相比时,要过表达的酶被过表达至至少约1.1、约1.2、约1.5、约2、约5、约10或约20的倍数。应当理解这些过表达水平可适用于酶活性的稳态水平,酶蛋白质的稳态水平以及编码酶的转录本的稳态水平。
适应性进化
混合糖细胞在其制备中被施加以适应性进化。可以针对在想要的糖上、优选地作为唯一碳源的想要的糖上,更优选地在厌氧条件下的生长来选择自发或(例如通过辐射或化学品)诱导的突变体,使本发明的细胞适应糖使用。突变体的选择可以通过包括例如Kuyper等(2004,FEMS YeastRes.4:655-664)所述的培养物连续转移在内的技术来进行,或者通过在恒化器培养中的选择压力下培养来进行。例如,在本发明的一种优选的宿主细胞中,至少一种上述遗传修饰(包括通过突变体选择获得的修饰)赋予宿主细胞在木糖作为碳源、优选地作为唯一碳源时、并且优选地在厌氧条件下生长的能力。优选地,细胞基本上不生产木糖醇,例如生产的木糖醇低于检出界限,或者例如以摩尔为基础少于消耗的碳的约5%、约2%、约1%、约0.5%或约0.3%。
适应性进化还描述于例如Wisselink H.W.et al,Applied andEnvironmental Microbiology Aug.2007,p.4881-4891中。
在适应性进化的一个实施方式中,使用由不同培养基(葡萄糖、木糖和阿拉伯糖;木糖和阿拉伯糖)中重复的连续生长循环与重复的分批培养所构成的方案。见Wisselink等(2009)Applied and EnvironmentalMicrobiology,Feb.2009,p.907-914。
宿主细胞
宿主细胞可以是适合生产有用产物的任何宿主细胞。本发明的细胞可以是任何合适的细胞,如原核细胞如细菌,或真核细胞。典型地,细胞会是真核细胞,例如酵母或丝状真菌。
酵母在本文中被定义为真核微生物,并且包括主要以单细胞形式生长的真菌亚门的所有物种(Alexopoulos,C.J.,1962,In:IntroductoryMycology,John Wiley & Sons,Inc.,New York)。
酵母可以通过单细胞原植体的出芽生长,或可通过生物的裂变生长。作为本发明细胞的一种优选的酵母可属于Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、Schizosaccharomyces、Hansenula、Kloeckera、Schwanniomyces或Yarrowia属。优选地,酵母是能够厌氧发酵的酵母,更优选地是能够厌氧醇发酵的酵母。
丝状真菌在本文中被定义为下述真核微生物,其包括真菌亚门的所有丝状形式。这些真菌的特征是由甲壳质、纤维素和其它复合多糖构成的营养菌丝体。适合用作本发明细胞的丝状真菌在形态学、生理和遗传上区别于酵母。可有利地使用丝状真菌细胞,因为大部分真菌不需要无菌条件来繁殖,并且对噬菌体感染敏感。丝状真菌的营养生长通过菌丝延长进行,并且大部分丝状真菌的碳代谢是专性需氧的。作为本发明宿主细胞的优选的丝状真菌可属于Aspergillus、Trichoderma、Humicola、Acremoniurra、Fusarium或Penicillium属。更优选地,丝状真菌细胞可以是Aspergillusniger、Aspergillus oryzae、Penicillium chrysogenum或Rhizopus oryzae细胞。
在一个实施方式中,宿主细胞可以是酵母。
优选地,宿主是工业宿主,更优选地是工业酵母。工业宿主和工业酵母细胞可以如下定义。工业方法中酵母细胞的生活环境与实验室中显著不同。工业酵母细胞必须能够在所述方法期间可能变化的多种环境条件下表现良好。此类改变包括养分来源、pH、乙醇浓度、温度、氧浓度等等的改变,它们一起对Saccharomyces cerevisiae的细胞生长和乙醇生产具有潜在的影响。在不利的工业条件下,环境耐受菌株会允许强健的生长和生产。对使用工业酵母菌株的应用(例如烘焙工业、酿造工业、造酒和乙醇工业)中可能发生的环境条件中的这些改变而言,工业酵母菌株通常更加强健。工业酵母(S.cerevisiae)的例子是Ethanol(Fermentis)、(DSM)和(Lallemand)。
在一个实施方式中,宿主是抑制剂耐受的。可以通过针对在含抑制剂的材料上的生长筛选菌株,来选择抑制剂耐受的宿主细胞,如Kadar et al,Appl.Biochem.Biotechnol.(2007),Vol.136-140,847-858中所述,其中选择了抑制剂耐受的S.cerevisiae菌株ATCC 26602。
优选地,宿主细胞是工业的和抑制剂耐受的。
AraA、AraB和AraD基因
本发明的细胞能够使用阿拉伯糖。因此,本发明的细胞能够将L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或需要的发酵产物,例如本文提到的发酵产物之一。
能够从L-阿拉伯糖生产乙醇的生物例如S.cerevisiae菌株可以通过修饰细胞,引入来自合适来源的araA(L-阿拉伯糖异构酶)、araB(L-核酮糖激酶)和araD(L-核酮糖-5-P4-差向异构酶)基因来产生。这类基因可被引入本发明的细胞中,使其能够使用阿拉伯糖。这样的通路描述于WO2003/095627中。来自Lactobacillus plantanum的araA、araB和araD基因可以使用,并公开于WO2008/041840中。来自Bacillus subtilis的araA基因和来自Escherichia coli的araB和araD基因可以使用,并公开于EP1499708中。
PPP-基因
本发明的细胞可包含一种或多种提高戊糖磷酸通路通量的遗传修饰。具体地,遗传修饰可导致通过戊糖磷酸通路非氧化性部分的通量提高。引起戊糖磷酸通路非氧化性部分通量提高的遗传修饰在本文中被理解为表示下述修饰,与除了引起通量提高的遗传修饰之外遗传上相同的菌株中的通量相比,所述修饰将所述通量提高至约1.1、约1.2、约1.5、约2、约5、约10或约20的倍数。戊糖磷酸通路非氧化部分的通量可以如下测量:在木糖作为唯一碳源时培养经修饰的宿主,测定木糖消耗的比速率,并在产生任何木糖醇时从木糖消耗的比速率中减去木糖醇生产的比速率。然而,戊糖磷酸通路非氧化部分的通量与木糖作为唯一碳源时的生长速率成比例,优选地与木糖作为唯一碳源时的厌氧生长速率成比例。木糖作为唯一碳源时的生长速率(μmax)和戊糖磷酸通路非氧化部分的通量之间存在线性相关。木糖消耗的比速率(Qs)等于生长速率(μ)除以在糖上的生物量产率(Yxs),因为在糖上的生物量产率是恒定的(在给定的一组条件下:厌氧、生长培养基、pH、菌株的遗传背景等;即Qs=μ/Yxs)。因此,戊糖磷酸通路非氧化部分通量的提高可能演绎自这些条件下最大生产速率的提高,除非转运(摄取收到限制)。
可以通过多种方式在宿主细胞中引入提高戊糖磷酸通路通量的一种或多种遗传修饰。这些方式包括例如,实现木酮糖激酶和/或非还原性部分戊糖磷酸通路的一种或多种酶更高的稳态活性水平,和/或非特异性醛糖还原酶活性的降低的稳态水平。稳态活性水平的这些改变可以通过(自发或化学或辐射诱导的)突变体的选择和/或编码酶的基因或调节这些基因的因子的重组DNA技术(例如过表达或失活)来实现。
在一种优选的宿主细胞中,遗传修饰包括(非氧化部分)戊糖磷酸通路的至少一种酶的过表达。优选地,所述酶选自由编码核酮糖-5-磷酸异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶的酶构成的组。可以过表达(非氧化性部分)戊糖磷酸通路的酶的多种组合。例如可以被过表达的酶可以至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和5-磷酸核酮糖差向异构酶;或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和转酮酶;或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和转醛酶;或至少是酶5-磷酸核酮糖差向异构酶和转酮酶;或至少是酶核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转醛酶;或至少是酶转酮酶和转醛酶;或至少是酶5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶;或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶、转酮酶和转醛酶;或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶和转醛酶;或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶和转酮酶。在本发明的一个实施方式中,酶5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶的每一种都在宿主细胞中被过表达。更优选的是下述宿主细胞,其中遗传修饰至少包含酶转酮酶和转醛酶二者的过表达,因为这样的宿主细胞已经能够在木糖上厌氧生长。实际上,在一些条件下,仅过表达转酮酶和转醛酶的宿主细胞在木糖上已经具有与下述宿主细胞相同的厌氧生长速率,所述宿主细胞过表达所有四种酶,即5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶。另外,过表达酶5-磷酸核酮糖异构酶和核酮糖-5-磷酸差向异构酶二者的宿主细胞是超过下述宿主细胞而被优选的,所述宿主细胞仅过表达异构酶或仅过表达差向异构酶,因为这些酶中仅一种的过表达可产生代谢失衡。
酶“核酮糖-5-磷酸差向异构酶”(EC 5.1.3.1)在本文中被定义为催化D-木酮糖5-磷酸差向异构化为D-核酮糖5-磷酸并且反之亦然的酶。所述酶也已知为磷酸核酮糖(phosphoribulose)异构酶;赤藓糖-4-磷酸异构酶;磷酸酮戊糖3-差向异构酶;木酮糖磷酸3-差向异构酶;磷酸酮戊糖向异构酶;核酮糖5-磷酸3-差向异构酶;D-核酮糖磷酸-3-差向异构酶;D-核酮糖5-磷酸差向异构酶;D-核酮糖-5-P 3-差向异构酶;D-木酮糖-5-磷酸3-差向异构酶;戊糖-5-磷酸3-差向异构酶;或D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶。核酮糖5-磷酸差向异构酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地,核酮糖5-磷酸差向异构酶可以通过编码酶的核苷酸序列或者通过与编码核酮糖5-磷酸差向异构酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码核酮糖5-磷酸差向异构酶的核苷酸序列在本文中称作RPE1。
酶“核酮糖5-磷酸异构酶”(EC 5.3.1.6)在本文中被定义为催化D-核糖5-磷酸直接异构化为D-核酮糖5-磷酸并且反之亦然的酶。所述酶也已知为磷酸戊糖异构酶;磷酸核糖异构酶;核糖磷酸异构酶;5-磷酸核糖异构酶;D-核糖5-磷酸异构酶;D-核糖-5-磷酸酮醇-异构酶;或D-核糖-5-磷酸醛糖-酮糖-异构酶。核酮糖5-磷酸异构酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地,核酮糖5-磷酸异构酶可以通过编码所述酶的核苷酸序列以及与编码核酮糖5-磷酸异构酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码核酮糖5-磷酸异构酶的核苷酸序列在本文中称作RPI1。
酶“转酮酶”(EC 2.2.1.1)在本文中被定义为催化下述反应的酶:D-核糖5-磷酸+D-木酮糖5-磷酸<->景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸且反之亦然。所述酶也已知为羟乙醛转移酶或景天庚酮糖-7-磷酸:D-甘油醛-3-磷酸羟乙醛转移酶。转酮酶还可通过其氨基酸定义。类似地,转酮酶可以通过编码酶的核苷酸序列以及与编码转酮酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码转酮酶的核苷酸序列在本文中称作TKL1。
酶“转醛酶”(EC 2.2.1.2)在本文中被定义为催化下述反应的酶:景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸<->D-赤藓糖4-磷酸+D-岩藻糖6-磷酸且反之亦然。所述酶还已知为二羟基丙酮转移酶;二羟基丙酮合酶;甲醛转酮酶;或景天庚酮糖-7-磷酸:D-甘油醛-3-磷酸甘油酮转移酶。转醛酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地,转醛酶可以通过编码酶的核苷酸序列以及与编码转醛酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码转醛酶的核苷酸序列在本文中称作TAL1。
木糖异构酶基因
编码木糖异构酶的核苷酸序列的存在赋予细胞将木糖异构化成木酮糖的能力。根据木发明,2至15拷贝的一种或多种木糖异构酶基因引入宿主细胞。
在一个实施方式中,一个、两个或更多个拷贝的一种或多种木糖异构酶基因被引入宿主细胞的基因组中。
“木糖异构酶”(EC 5.3.1.5)在本文中被定义为催化D-木糖直接异构化为D-木酮糖和/或反过来的酶。所述酶还已知为D-木糖酮异构酶。本文的木糖异构酶也可以能够催化D-葡萄糖和D-果糖之间的转化(并因此可以被称作葡萄糖异构酶)。本文的木糖异构酶可需要二价阳离子如镁、锰或钴作为辅因子。
因此,这样的混合糖细胞能够将木糖异构化为木酮糖。通过用下述核酸构建体转化宿主细胞对所述宿主细胞赋予将木糖异构化为木酮糖的能力,所述核酸构建体包含编码确定的木糖异构酶的核苷酸序列。混合糖细胞通过木糖到木酮糖的直接异构化将木糖异构化为木酮糖。这理解为木糖在由木糖异构酶催化的单个反应中被异构化成木酮糖,与木糖分别由还原酶和木糖醇脱氢酶催化的经木糖醇中间产物的两步转化成木酮糖不同。
木糖异构酶活性单位(U)在本文中可以被定义为:在Kuyper等(2003,FEMS Yeast Res.4:69-78)所述条件下,每分钟生产1nmol木酮糖的酶的量。木糖异构酶基因可具有多种来源,例如WO2006/009434中公开的Pyromyces sp.。其他合适的来源是如PCT/EP2009/52623中所述的Bacteroides,特别是Bacteroides uniformis,如PCT/EP2009/052625中所述的Bacillus,特别是Bacillus stearothermophilus,Thermotoga,特别是如PCT/EP2009/052621中所描述的Thermotoga maritima,和Clostridium,特别是如PCT/EP2009/052620中所描述的Clostridium cellulolyticum。
XKS1基因
本发明的细胞可包含提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰。优选地,所述一种或多种遗传修饰引起木酮糖激酶的过表达,例如通过编码木酮糖激酶的核苷酸序列的过表达来实现。编码木酮糖激酶的基因对宿主细胞而言可以是内源的,或者可以是对宿主细胞异源的木酮糖激酶。用于本发明宿主细胞中木酮糖激酶过表达的核苷酸序列是编码具有木酮糖激酶活性的多肽的核苷酸序列。
酶“木酮糖激酶”(EC 2.7.1.17)在本文中被定义为催化反应ATP+D-木酮糖=ADP+D-木酮糖5-磷酸的酶。所述酶还已知为磷酸化木酮糖激酶、D-木酮糖激酶或ATP:D-木酮糖5-磷酸转移酶。本发明的木酮糖激酶还可以通过其氨基酸序列定义。类似地,木酮糖激酶可以通过编码所述酶的核苷酸序列以及与编码木酮糖激酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。
在本发明的细胞中,提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰可以与上文所述提高戊糖磷酸通路通量的任何修饰组合。然而,这不是必需的。
因此,本发明的宿主细胞可仅包含提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰。用于实现和分析本发明宿主细胞中木酮糖激酶过表达的木领域可获得的多种手段与上文针对戊糖磷酸通路酶所述相同。优选地,在本发明的宿主细胞中,与除了引起过表达的遗传修饰之外在遗传上相同的菌株相比,要过表达的木酮糖激酶被过表达至少约1.1、约1.2、约1.5、约2、约5、约10或约20的倍数。还应当理解这些过表达水平可适用于酶活性的稳态水平,酶蛋白质的稳态水平以及编码酶的转录本的稳态水平。
醛糖还原酶(GRE3)基因缺失
在使用XI作为转化木糖的基因的实施方式中,其可有利地降低醛糖还原酶活性。因此,本发明的细胞可包含降低宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性的一种或多种遗传修饰。优选地,通过一种或多种下述遗传修饰降低宿主细胞中的非特异性醛糖还原酶活性,所述遗传修饰降低编码非特异性醛糖还原酶的基因的表达或使其失活。优选地,所述遗传修饰降低宿主细胞中编码非特异性醛糖还原酶的基因的每种内源拷贝或使其表达失活(本文中称作GRE3缺失)。宿主细胞可由于二倍性、多倍性或非整倍性而包含多拷贝的编码非特异性醛糖还原酶的基因,和/或宿主细胞可含有具有醛糖还原酶活性的若干不同的(同工)酶,所述酶氨基酸序列不同并且鸽子由不同基因编码。还在这类情况下,优选地编码非特异性醛糖还原酶的每种基因的表达被降低或失活。优选地,通过缺失基因的至少一部分或者通过破坏基因使基因失活,其中在该语境中,术语基因还包括编码序列上游或下游的任何非编码序列,其(部分)缺失或失活导致宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性表达的降低。
编码要在本发明宿主细胞中降低其活性的醛糖还原酶的核苷酸序列是编码具有醛糖还原酶活性的多肽的核苷酸序列。
因此,仅包含下述一种或多种遗传修饰的本发明的宿主细胞明确地包括在本发明中,所述修饰降低宿主细胞中的非特异性醛糖还原酶活性。
酶“醛糖还原酶”(EC1.1.1.21)在本文中被定义为能够将木糖或木酮糖还原为木糖醇的任何酶。在本发明的语境中,醛糖还原酶可以是对本发明宿主细胞而言天然(内源)的并且能够将木糖或木酮糖还原为木糖醇的任何非特异性醛糖还原酶。非特异性醛糖还原酶催化反应:
所述酶具有广泛特异性并且也已知为醛糖还原酶;多元醇脱氢酶(NADP+);糖醇:NADP氧化还原酶;糖醇:NADP+1-氧化还原酶;NADPH-戊醛糖还原酶;或NADPH-醛糖还原酶。
这类非特异性醛糖还原酶的一个具体的例子是对S.cerevisiae内源并且由GRE3基因编码的醛糖还原酶(Traff等,2001,Appl.Environ.Microbiol.67:5668-74)。因此,本发明的醛糖还原酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地,醛糖还原酶可以通过编码酶的核苷酸序列以及与编码醛糖还原酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。
生物制品生产
许多年来,建议引入多种生物用于从作物糖生产生物乙醇。然而在实践中,所有主要的生物乙醇生产方法继续使用Saccharomyces属的酵母作为乙醇生产者。这归因于Saccharomyces物种对工业方法而言的许多有吸引力的特征,即高度酸-、乙醇-和渗透-耐性,厌氧生长的能力,当然及其高的醇发酵能力。作为宿主细胞的优选的酵母物种包括S.cerevisiae、S.bulderi、S.barnetti、S.exiguus、S.uvarum、S.diastaticus、K.lactis、K.marxianus或Kfragilis。
木发明的细胞可以能够将植物生物量、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油转化成例如可发酵的糖。因此,本发明的细胞可表达将纤维素转化为葡萄糖单体或将半纤维素转化为木糖和阿拉伯糖单体所需的一种或多种酶,如纤维素酶(内切纤维素酶和外切纤维素酶)、半纤维素酶(内切或外切木聚糖酶或阿拉伯糖酶),能够将果胶转化成葡糖醛酸和半乳糖醛酸的果胶酶,或能够将淀粉转化成葡萄糖单体的淀粉酶。
所述细胞还优选地包含将丙酮酸转化成期望的发酵产物如乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、反丁烯二酸、苹果酸、衣康酸(itaconic acid)、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素或头孢菌素所需的这些酶活性。
木发明的一种优选的细胞是天然能够进行醇发酵、优选地进行厌氧醇发酵的细胞。本发明的细胞优选地具有对乙醇的高度耐性、对低pH的高度耐性(即能够在低于约5、约4、约3或约2.5的pH下生长)和对有机酸如乳酸、乙酸或甲酸和/或糖降解产物如糠醛和羟基-甲基糠醛的的高度耐性,和/或对提高的温度的高度耐性。
本发明细胞的任何上述特征或活性可以天然存在于细胞中,或者可以通过遗传修饰引入或修饰。
本发明的细胞可以是适合生产乙醇的细胞。然而,本发明的细胞可适用于生产除乙醇以外的发酵产物。这类非乙醇发酵产物原则上包括可由真核微生物如酵母或丝状真菌生产的任何大宗化学品(bulk chemical)或精细化学品。
这类发酵产物可以是例如丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、丙三醇、β-内酰胺抗生素或头孢菌素。用于生产非乙醇发酵产物的一种优选的本发明的细胞是下述宿主细胞,所述宿主细胞含有导致降低的醇脱氢酶活性的遗传修饰。
在又一个方面中,本发明涉及多种发酵方法,其中使用本发明的细胞来发酵包含木糖来源的碳源,如木糖。除了木糖来源以外,发酵培养基中的碳源还可包含葡萄糖来源。木糖或葡萄糖来源可以是原样的木糖或葡萄糖,或者可以是包含木糖或葡萄糖单元的任何碳水化合物寡聚体或多聚体,如例如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉等等。为了从这类碳水化合物释放木糖或葡萄糖单元,可以向发酵培养基中添加或者由细胞生产适当的糖酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等等)。在后一情况下,细胞可以被遗传改造为生产和分泌这类碳水化合物。使用葡萄糖的寡聚体或多聚体来源的一种额外的优点是其例如通过使用限速量的碳水化合物,使得能够在发酵期间维持(更)低的游离葡萄糖浓度。这随即会预防阻抑非葡萄糖的糖(如木糖)代谢和转运所需的系统。
在一种优选的方法中,细胞发酵木糖以及葡萄糖,优选地同时发酵,在这种情况下优选地使用下述细胞,所述细胞对葡萄糖阻抑不敏感从而防止两阶段生长。除了作为碳源的木糖(和葡萄糖)来源以外,发酵培养基还会包含细胞生长所需的适当成分。用于微生物(如酵母)生长的发酵培养基的组成是本领域公知的。发酵方法是用于生产以下发酵产物的方法,如例如乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、丙三醇、β-内酰胺抗生素如青霉素G或青霉素V及其发酵衍生物,和头孢菌素。
生物制品生产
许多年来,建议引入多种生物用于从作物糖生产生物乙醇。然而在实践中,所有主要的生物乙醇生产方法继续使用Saccharomyces属的酵母作为乙醇生产者。这归因于Saccharomyces物种对工业方法而言的许多有吸引力的特征,即高度酸-、乙醇-和渗透-耐性,厌氧生长的能力,当然及其高的醇发酵能力。作为宿主细胞的优选的酵母物种包括S.cerevisiae、S.bulderi、S.barnetti、S.exiguus、S.uvarum、S.diastaticus、K.lactis、K.marxianus或K fragilis。
混合糖细胞可以是合适生产乙醇的细胞。但是混合糖细胞可以合适生产不是乙醇的发酵制品。原则上这种非乙醇发酵制品包括被真核微生物比如酵母或丝状真菌生产的任何块或精细化学制品。
可用于生产非乙醇发酵制品的混合糖细胞是下述宿主细胞,其包含导致降低乙醇脱氢酶活性的遗传修饰。
在一种实施方式中,混合糖细胞可用于其中源于木质纤维素的糖转化成乙醇的过程。
木质纤维素
可以被认为是潜在的可再生原料的木质纤维素通常包含多糖纤维素(葡聚糖)和半纤维素(木聚糖、杂木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外,一些半纤维素可以作为葡甘露聚糖(glucomannans)存在于例如木材衍生的原料中。这些多糖成为可溶糖(包括单体和多体,例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和其他己糖和戊糖)的酶促水解发生于共同作用(acting in concert)的不同酶的作用下。
另外,果胶和其他果胶物质如阿拉伯聚糖(arabinans)可占来自非木本植物组织典型的细胞壁干物质的可观的比例(约四分之一到一半的干物质可以是果胶)。
预处理
在酶处理之前,木质纤维素材料可被预处理。预处理可包含将纤维素材料暴露至酸、碱、溶剂、热、过氧化物、臭氧、机械剪切、研磨、制粉或快速减压或其两种或多种的组合。该化学预处理通常结合热-预处理,例如在150-220℃之间1至30分钟。
酶水解
预处理的材料通常进行酶水解以释放可根据本发明发酵的糖。这可用常规方法执行,例如与纤维素酶,例如纤维二塘水解酶(一种或多种)、内切葡聚糖酶(一种或多种)、β-葡萄糖苷酶(一种或多种)和任选地其他酶接触。用纤维素酶的转化可在环境温度或在更高的温度下,以反应时间以释放足够量的糖(一种或多种)进行。酶水解的结果是包含本文命名为糖组合物的C5/C6糖的水解产品。
发酵
发酵方法可以是需氧或厌氧的发酵方法。厌氧发酵方法在木文中被定义为在不存在氧时运行的发酵方法,或者其中基本不消耗氧,优选地消耗少于约5、约2.5或约1mmol/L/h,更优选地消耗0mmol/L/h(即氧消耗不可检出),并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种用途。在不存在氧时,糖酵解和生物量形成中产生的NADH不能够被氧化磷酸化氧化。为了解决这一问题,许多微生物使用丙酮酸或其衍生物之一作为电子和氢受体,从而再生NAD+。
因此,在一种优选的厌氧发酵方法中,丙酮酸被用作电子(和氢受体),并且被还原成发酵产物如乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、丙三醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。
发酵方法优选地在对细胞而言最适的温度下进行。因此,对大部分酵母或真菌宿主细胞而言,发酵方法在低于约42℃、优选地低于约38℃的温度下进行。对酵母或丝状真菌宿主细胞而言,发酵方法优选地在低于约35、约33、约30或约28℃的温度且高于约20、约22或约25℃的温度下进行。
在所述方法中,在木糖和/或葡萄糖上的乙醇产率优选地为至少约50%,约60%,约70%,约80%,约90%,约95%或约98%。乙醇产率在本文中被定义为理论最大产率的百分比。
本发明还涉及用于生产发酵产物的方法。
发酵方法可以以分批、补料分批或连续的方式进行。也可以使用分离水解和发酵(SHF)方法或同时糖化和发酵(SSF)方法。也可以针对最适生产力使用这些方法模式的组合。
根据本发明的方法可以在需氧和厌氧条件下进行。优选地,所述方法在微需气(aerophilic)或氧受限的条件下进行。
厌氧发酵方法在本文中被定义为在不存在氧时进行的发酵方法,或其中基本不消耗氧,优选地消耗少于约5、约2.5或约1mmol/L/h,并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种作用。
氧受限的发酵方法是下述方法,其中氧消耗受到从气体到液体的氧转移的限制。氧受限的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际混合/物量转移特性决定。优选地,在氧受限条件下的方法中,氧消耗速率为至少约5.5、更优选地至少约6、如至少7mmol/L/h。本发明的方法包括发酵产物的回收。
发酵产物
本发明的发酵产品可以是任何有用的产品。在一种实施方式中,其为选自下组的产物,所述组由以下构成:乙醇;正丁醇;异丁醇;乳酸;3-羟基-丙酸;丙烯酸;乙酸;琥珀酸;延胡索酸;苹果酸;衣康酸;马来酸;柠檬酸;己二酸;氨基酸,比如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸;1,3-丙二醇;乙烯;甘油;β-内酰胺抗生素和头孢菌素;维生素;药物制剂;动物饲料添加剂;专用化学品;化学原料;塑料;溶剂;燃料,包括生物燃料和生物气或有机聚合物和工业酶,比如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。例如,遵从现有技术的细胞制备方法和发酵方法,发酵产物可通过根据本发明的细胞生产,但所述制备方法和发酵方法的例子在本文中不应构成限制。例如,正丁醇可由WO2008121701或WO2008086124中描述的细胞生产;乳酸如US2011053231或US2010137551中描述;3-羟基-丙酸如WO2010010291中描述;丙烯酸如WO2009153047中描述。下面给出了发酵产品和它们如何在酵母中制备的综述:Romanos,MA等,“Foreign Gene Expression in Yeast::a Review”,yeast vol.8:423-488(1992),见例如表7。产物甘油、1,3丙二醇、有机酸和维生素C(表2)描述在Negvoigt,E.,Microbiol.Mol.Biol.Rev.72(3)379-412(2008)中。Giddijala,L.等,BMC Bio技术8(29)(2008)描述酵母中的产品β-内酰胺。
发酵产物的回收
对发酵产物的回收而言,使用现有的技术。对不同的发酵产物而言,适用不同的回收方法。现有的从水性混合物中回收乙醇的方法通常使用分级(fractionation)和吸附技术。例如,可以使用发酵醪蒸馏器(beerstill)加工在水性混合物中含有乙醇的发酵产物,以生产富集的含有乙醇的混合物,所述富集的含有乙醇的混合物随后进行分级(例如分馏(fractional distillation)或其他类似的技术)。接着,含有最高浓度乙醇的级分可以经过吸附剂,从乙醇中去除大部分(如果不是所有的话)剩余的水。
以下的实施例阐述本发明:
实施例
除非另有说明,本文描述的方法是标准生物化学方法。合适的一般方法教科书的例子包括Sambrook等,Molecular Cloning,a Laboratory Manual(1989)和Ausubel等,Current方案s in Molecular Biology(1995),John Wiley& Sons,Inc。
培养基组合物
生长实验:在具有以下组成的培养基上培养Saccharomyces cerevisiae菌株:0.67%(w/v)酵母氮基或合成培养基(Verduyn等,Yeast 8:501-517,1992),和葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖或木糖,或这些底物的组合(见下文)。对于琼脂平板而言,对培养基补充2%(w/v)细菌学琼脂。
乙醇生产
通过在100ml摇瓶中用冰冻培养物或来自琼脂平板的单菌落对25ml补充2%葡萄糖的Verduyn-培养基(Verduyn等,Yeast 8:501-517,1992)接种,来制备预培养物。在30℃下定轨摇床(280rpm)中孵育约24小时之后,收获该培养物并用于测定CO2进展和乙醇生产实验。
在BAM(生物活性监测器,Halotec,荷兰)中,在100ml合成模型培养基(含5%葡萄糖、5%木糖、3.5%阿拉伯糖和1%半乳糖的Verduyn-培养基(Verduyn et al.,Yeast 8:501-517,1992))中于30℃下进行乙醇产物培养。在灭菌前用2M NaOH/H2SO4将培养基的pH调节至4.2。对厌氧培养的合成培养基补充溶于乙醇中的0.42g 1-1 Tween 80和0.01g l-1麦角固醇(Andreasen和Stier.J.Cell Physiol.41:23-36,1953;和Andreasen and Stier.J.Cell Physiol.43:271-281,1954)。以大约2的初始OD600接种培养基。用磁力搅拌器搅拌培养物。因为不对培养物充气,所以发酵期间厌氧条件迅速发展。持续监测CO2生产。通过NMR分析糖转化和产物形成(乙醇、甘油)。通过在LKB Ultrospec K分光光度计上于600nm下跟踪培养物的光密度来监测生长。
酿酒酵母的转化
如Gietz和Woods(2002;Transformation of the yeast by the LiAc/SScarrier DNA/PEG method。Methods in Enzymology 350:87-96)描述的进行酿酒酵母的转化。
菌落PCR
用塑料牙签挑取单个菌落隔离群,并重悬于50μl milliQ水中。将样品在99℃下孵育10分钟。使用5μl经孵育的样品作为PCR反应的模板,所述PCR反应使用DNA聚合酶(Finnzymes)根据供应商提供的说明书进行。
PCR反应条件:
染色体DNA分离
酵母细胞于旋转摇瓶中(过夜,30℃和280rpm)中在包含2%葡萄糖的YEP-培养基中生长。将1.5ml这些培养物转移至Eppendorf管并在最大速度下离心1分钟。倒出上清液并且将球团再悬浮在200μl的YCPS(10mMTris.HCl pH 7.5中的0.1%SB3-14(Sigma Aldrich,荷兰);1mM EDTA)和1μl RNase(20mg/ml RNase A from bovine pancreas,Sigma,荷兰)中。细胞悬液在65℃下孵育10分钟。在Eppendorf离心机中以7000rpm悬液离心1分钟。丢弃上清液。球团小心地溶解在200μl CLS(25mM EDTA,2%SDS)和1μl RNase A中。在65℃下孵育10分钟之后,悬液在冰上冷却。添加70μlPPS(10M醋酸铵)之后,在Vortex混合器中充分混合溶液。离心(在Eppendorf离心机中以最大速度,5分钟)之后,将上清液与200μl冰冷的异丙醇混合。DNA容易沉淀并通过离心(5分钟,最大速度)成为球团。用400μl冰冷的70%乙醇下洗涤球团。在室温下干燥球团并溶解在50μl TE(10mM Tris.HCl pH7.5,1mM EDTA)中。
实施例1
构建菌株BIE104A2P1
1.1构建包含用于阿拉伯糖通路基因的表达载体
如下构建如图2中所展示的质粒pPWT018:用限制性酶BsiWI和MluI消化载体pPWT006(图1,由SIT2-基因座(Gottlin-Ninfa and Kaback(1986)Molecular and Cell Biology vol.6,no.6,2185-2197)和允许基于抗生素G418和在乙酰胺上生长的能力来选择转化体的标记物组成)。从p427TEF(Dualsystems Biotech)分离赋予G418抗性的kanMX-标记物,含有amdS-标记物的片段已在文献中描述(Swinkels,B.W.,Noordermeer,A.C.M.andRenniers,A.C.H.M(1995)The use of the amdS cDNA of Aspergillus nidulansas a dominant,bidirectional selectable marker for yeast transformation.YeastVolume 11,Issue 1995A,page S579;and US 6051431)。如专利申请WO2008/041840中公开的来自Lactobacillus plantarum的编码阿拉伯糖异构酶(araA)、L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(araD)的基因由BaseClear(Leiden,荷兰)合成。合成一个大的片段,其带有位于来自S.cerevisiae的强启动子控制下(或与之可操作地连接)的上文提到的三个阿拉伯糖基因,即TDH3-启动子控制araA-基因的表达,ENO1-启动子控制araB-基因的表达,PGIl-启动子控制araD-基因的表达。该片段被特有的限制性酶Acc65I和MluI包围。将该片段克隆进用MluI和BsiWI消化的pPWT006中,得到质粒pPWT018(图2)。质粒pPWT018的序列在SEQ ID1中公开。
1.2酵母转化
用质粒pPWT018转化CEN.PK113-7D(MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1MAL2-8SUC2),所述质粒之前已根据供应商的说明用SfiI(New EnglandBiolabs)线性化。在SIT2-基因的5’-侧翼设计合成的SfiI-位点(见图2)。将转化混合物涂布在每ml含100μg G418(Sigma Aldrich)的YPD-琼脂(每升:10克酵母提取物,每升20克蛋白胨,每升20克葡萄糖,每升20克琼脂)上。两到四天后,平板上出现菌落,而阴性对照(即转化实验中不添加DNA)得到空白的YPD/G418-平板。质粒pPWT018的整合指向SIT2-基因座。使用PCR和Southern印迹技术表征转化体。
用SEQ ID 2和3,和3和4所示引物进行指示单拷贝质粒pPWT018的正确整合的PCR反应。使用引物对SEQ ID 2和3检查了SIT2-基因座上的正确整合。如果质粒pPWT018以多个拷贝被整合(头尾整合(head-to-tail integration)),则SEQ ID 3和4的引物对会给出PCR产物。如果不存在后一PCR产物,则表示pPWT018的单拷贝整合。其中一个拷贝的质粒pPWT018被整合在SIT2-基因座中的菌株被命名为BIE104R2。
1.3标记物补救(Marker rescue)
为了能够使用相同的选择标记物,用其他构建体转化酵母菌株,必须去除选择性标记物。质粒pPWT018的设计如下:将pPWT018整合在染色体中后,同源序列彼此密切接近。这种设计允许选择性标记物通过这些同源区域的自发性分子内重组而丢失。
在营养性生长时分子内重组会发生,尽管以较低的频率发生。这种重组的频率取决于同源性的长度和基因组中的基因座(未公开的结果)。将培养物的亚级分相继转移至新鲜培养基后,分子内重组体会及时累积。
为此,从单个菌落隔离群开始在YPD-培养基(每升:10克酵母提取物,每升20克蛋白胨,每升20克右旋糖)中培养菌株BIE104R2。使用25μl过夜培养物接种新鲜的YPD培养基。在至少五次这样的连续转移后,测定培养物的光密度,并将细胞稀释至每ml约5000个的浓度。将100μl细胞悬浮液涂布在含30mM KPi(pH 6.8)、0.1%(NH4)2SO4、40mM氟乙酰胺(Amersham)和1.8%琼脂(Difco)的酵母碳基培养基(Difco)上。与菌株BIE104R2的细胞相同(即无细胞内重组)的细胞仍然含有amdS-基因。对这些细胞而言,氟乙酰胺是有毒的。在含有氟乙酰胺的培养基上,这些细胞将不能生长,并且不会形成菌落。然而,如果发生了分子内重组,则丢失了选择性标记物的BIE104R2-变体将能够在氟乙酰胺培养基上生长,因为它们不能将氟乙酰胺转化成抑制生长的化合物。这些细胞会在该琼脂培养基上形成菌落。
使用引物SEQ ID 2和3,和4和5,对由此获得的氟乙酰胺抗性菌落进行PCR分析。如果如所预期地发生选择性标记物的重组,则SEQ ID 2和3的引物会得到条带。因此,带有处于强酵母启动子控制下的基因araA、araB和araD的盒已被整合进宿主菌株基因座的SIT2-基因座中。在这种情况下,使用引物SEQ ID 4和5的PCR反应应当不能得到PCR产物,因为引物4在应当由于重组而丢失的区域中发挥引物作用。如果使用后一对引物获得了条带,这表明基因组中存在完整的质粒pPWT018,因此未发生重组。
如果SEQ ID 2和3的引物不得到PCR产物,则发生了重组,但是重组方式是整个质粒pPWT018被重组出基因组之外。不仅选择性标记物丢失,而且阿拉伯糖基因也丢失。事实上恢复了野生型酵母。
对显示与pPWT018的单拷贝整合一致的PCR结果的隔离群进行Southern印迹分析。用EcoRI和HindIII消化菌株CEN.PK113-7D的染色体DNA和正确的重组体(双重消化)。使用pPW018作为模板,用引物SEQ ID 6和7制备SIT2-探针。杂交实验的结果展示于图3中。
在野生型菌株中观察到2.35kb的条带,其与野生型基因的预期大小一致。质粒pPWT018的整合和通过重组部分丢失后,预期有1.06kb的条带。事实上观察到了这一条带,如图3中所示(第2道)。
(如从图3中可推出的)在Southern印迹上显示正确条带模式的菌株之一是被命名为BIE104A2的菌株。
1.4引入4个组成型非氧化性戊糖磷酸路径表达的基因
用质粒pPWT080转化组成型表达基因araA、araB和araD的Saccharomyces cerevisiae BIE104A2(图4)。质粒pPWT080的序列在SEQ ID 8中展示。在选择单拷贝整合转化体之后,用于转化和选择的程序与上文第1.1、1.2和1.3部分中所述相同。简言之,用经SfiI-消化的pPWT080转化BIE104A2。将转化混合物涂布在每ml含有100μg G418(Sigma Aldrich)的YPD-琼脂(每升:10克酵母提取物,每升20克蛋白胨,每升20克右旋糖,每升20克琼脂)上。
两到四天后,平板上出现菌落,而阴性对照(即转化实验中未添加DNA)得到空白的YPD/G418-平板。
质粒pPWT018的整合指向GRE3-基因座。使用PCR和Southern印迹技术表征转化体。通过PCR使用引物对SEQ ID 9和SEQ ID10检查质粒pPWT080在GRE3-基因座上的正确整合,并且引物对SEQ ID 9和SEQ ID11用于检测单个或多拷贝整合的质粒pPWT080。对于Southern分析,通过PCR使用SEQ ID 12和SEQ ID 13制备探针,扩增酿酒酵母的部分RKI1基因。靠近天然RKI1基因,获得由质粒pPWT080的整合而产生的额外信号(数据未显示)。
显示与预期的杂交模式一致的单拷贝质粒pPWT080正确整合的转化体被命名为BIE104A2F1。
为了去除通过质粒pPWT080的整合引入的选择标记物。从单个菌落隔离群开始在YPD-培养基中培养菌株BIE104A2F1。使用25μl过夜培养物接种新鲜的YPD培养基。五次连续转移后,测定培养物的光密度,并将细胞稀释至每ml约5000个的浓度。将100μl细胞悬浮液涂布在含30mM KPi(pH6.8)、0.1%(NH4)2SO4、40mM氟乙酰胺(Amersham)和1.8%琼脂(Difco)的酵母碳基培养基(Difco)上。对氟乙酰胺抗性菌落使用引物SEQ ID 9和SEQID 10进行PCR分析。在正确的PCR谱的情况下,进行Southern印迹分析以便确认正确的整合,使用RKl1-基因的探针。在Southern印迹上显示正确条带模式的菌株之一是被命名为BIE104A2P1的菌株。
实施例2
摇瓶中适应性进化产生BIE104A2P1c和BIE201。
2.1适应性进化(需氧)
使用菌株BIE104A2P1的单菌落隔离群对补充有2%半乳糖的YNB-培养基(Difco)接种。将预培养物在30℃和280rpm下孵育约24小时。收获细胞并以0.2的起始OD 600接种于含1%半乳糖和1%阿拉伯糖的YNB培养基中(图5)。细胞在30℃和280rpm下培养。有规律地监测600nm下的光密度。
当光密度达到5的数值时,将培养物的一小份转移至含有相同培养基的新鲜YNB培养基中。添加的细胞量使得培养物的初始OD 600为0.2。再次达到5的OD 600后,将培养物的一小份转移至含2%阿拉伯糖作为惟一碳源的YNB培养基上(如图5中(1)所示事件)。
转移至含2%阿拉伯糖作为惟一碳源的YNB上后,可以在约两周后观察生长。当600nm处的光密度达到至少1的数值后,将细胞以0.2的起始OD 600转移至含有补充有2%阿拉伯糖的新鲜YNB培养基的摇瓶中(图5,28天)。
将连续转移重复三次,如图5中所示。得到的能够在阿拉伯糖上快速生长的菌株被命名为BIE104A2P1c。
2.2适应性进化(厌氧)
在需氧条件下在阿拉伯糖上适应生长后,将来自菌株BIE104A2P1c的单个菌落接种进补充有2%葡萄糖的YNB培养基中。将预培养物在30℃和280rpm下孵育约24小时。收获细胞,并以0.2的初始OD600接种于含2%阿拉伯糖的YNB培养基中。用水封(waterlocks)闭合摇瓶,确保从培养基和液面上空间(head space)耗尽氧后厌氧的生长条件。达到3的OD600最小值后,每次在0.2的初始OD600值下,将培养物的一小份转移至含2%阿拉伯糖的新鲜YNB培养基上(图9)。若干次转移后,将得到的菌株命名为BIE104A2P1d(=BIE201)。
实施例3
菌株在BAM中的性能测试显示适应性进化已经产生(改进的)阿拉伯糖转
化。与半乳糖共发酵。
使用菌株BIE104、BIE104A2P1c和BIE201的单菌落隔离群接种补充有2%葡萄糖的YNB-培养基(Difco)。将预培养物在30℃和280rpm下孵育约24小时。收获细胞并以约2的起始OD600接种于BAM中的合成模型培养基(Verduyn et al.,Yeast 8:501-517,1992;5%葡萄糖,5%木糖,3.5%阿拉伯糖,1%半乳糖)中。持续监测CO2生产。通过NMR分析糖转化和产物形成。数据表示所指示处的残余糖量(以克/升为单位的葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和木糖)和(副)产物(乙醇、甘油)的形成。通过跟踪600nm处培养物的光密度(图7、8、9)监测生长。实验进行约140小时。
实验清楚地显示参照菌株BIE104迅速转化葡萄糖,但是在140小时内不能够转化阿拉伯糖、木糖和/或半乳糖(图7)。然而,菌株BIE104A2P1c和BIE201能够转化阿拉伯糖和半乳糖(分别见图8和9)。半乳糖和阿拉伯糖利用在葡萄糖耗尽之后在少于20小时后立即开始。两种糖同时被转化。然而,针对厌氧条件下阿拉伯糖生长被改进的菌株BIE201更迅速地消耗两种糖(图9)。在所有发酵中,仅产生甘油作为副产物。
实施例4
重新测序菌株并鉴定参与阿拉伯糖发酵的SNP
如可从实施例1、2和3中总结的,仅仅引入编码利用阿拉伯糖需要的或增强阿拉伯糖利用的酶的基因不足以使得在作为唯一碳源的阿拉伯糖上生长。如在实施例2中所示的,需要称为适应性进化的方法以选择利用阿拉伯糖作为单一C源的细胞。
据推测,在基因组中自发突变(SNP,对于单核苷酸多态性)是该表型变化的原因。可选地,在基因组中可发生更大的变异(不限于单个核苷酸的置换、插入或缺失)。
为此,从来自YEP 2%葡萄糖过夜培养物的菌株BIE104、初次转化体BIE104A2P1、进化的转化体BIE104A2P1c和进一步进化的转化体BIE201中分离染色体DNA。DNA送至ServiceXS(Leiden,荷兰),用于使用基因组分析仪重新测序(50bp读数,配对末端测序)。
对于每个菌株,获得约1800Mb的序列,所述序列对应于140的平均基因组覆盖,意思是平均每个碱基已经被读数140次。
使用NextGene软件(SoftGenetictics LLC,State College,PA 16803,USA),使用S288c作为模板比对测序读数。使用NextGene软件检测突变(单核苷酸多态性和插入/缺失达30bp)并总结在突变报告。不同菌株的比对被彼此比较,以鉴定菌株间的独特变异。手动检查每条突变报告,以便在测序覆盖太低而不能支持其的区域中排除读数错排、测序错误或突变调用(mutation calls)的可能性。假阳性突变从突变报告中去除。
除了被引入的序列以及被质粒整合并随后通过重组去除标记物而被删除的序列之外,初次转化体(BIE104A2P1)的序列与野生型菌株BIE104的序列相同。
在进化的转化体菌株BIE104A2P1c中,引入了限制数目的SNP:
在进一步进化的转化体菌株BIE201中,观察到靠近上面提到的4个SNP的一种另外的SNP:
GAL80 YML051w A→C T→P
在野生型菌株BIE104和进化的菌株BIE104A2P1c和BIE201二者中包含SNP的基因的5个开放阅读框的序列在下述中给出:SEQ ID 14、SEQ ID 15(SSY1)、SEQ ID 16、SEQ ID 17(YJR154w)、SEQ ID 18、SEQ ID19(CEP3)、SEQ ID 20、SEQ ID 21(YPL277c)、SEQ ID 22和SEQ ID 23(GAL80)。
实施例5
SNP的确认
为了(再次)确认在上述实施例中检测的SNP,采用了两种方法。第一种方法包括扩增包含SNP的区域随后在ABI3730XL测序仪(outsourced toBaseclear BV,Leiden,荷兰)上对单端(single read)(Sanger)测序。第二种方法由高分辨率熔融分析(Hi-Res)组成。
5.1对单端Sanger测序
分离自菌株BIE104A2P1和BIE201的培养物的基因组DNA用作使用使用High-Fidelity DNA聚合酶(Finnzymes,Vantaa,芬兰)的PCR反应的模板。根据提供商的建议进行PCR反应。下述引物用于扩增期望具有SNP的下述基因。
表2 用于扩增PCR产物的引物
将PCR产物克隆进入pTOPO Blunt II载体(Invitrogen,Carlsbad,USA)中。基于限制酶分析选择正确的克隆。正确的克隆送至BaseClear BV(Leiden,荷兰),用于对单端Sanger测序。
CEP3片段的TOPO克隆没有成功。该基因未获得Sanger测序数据。
YPL277c的序列好像与野生型菌株BIE104的序列相同。
Sanger测序结果确认了基因SSY1、YJR154w和GAL80中的SNP,即SNP与实施例4中的描述相同。
5.2Hi-Res分析
Hi-Res技术被Idaho Technologies(Salt Lake City,Utah 84108,USA)商业化。简而言之,由最佳被染料检测的异源双链核酸分子的存在来检测PCR产物突变。通过与参考样品的熔融图比较,熔融图的形状变化来鉴定变异。在上的Hi-Res(HR)在许多研究和临床应用中用于突变发现。
对于每个SNP,设计两条引物以扩增包含SNP或野生型序列的约100至200bp的区域。另外,设计第三条引物以在检测熔融图形的实验中起到探针的作用。设计后者引物以便其覆盖SNP区域并与野生型序列精确互补。与SNP序列的匹配不是完美的,即探针的几乎所有但是一个核苷酸与感兴趣的区域互补。错配的DNA链将比匹配的DNA链更早熔融,其导致使用(Idaho Technologies,Salt Lake City,Utah,USA)检测的野生型和SNP扩增子的熔融曲线不同。
下表总结了用于扩增感兴趣的基因或ORF的引物序列,所述感兴趣的基因或ORF的SNP应当在菌株BIE201中确认。
表3 扩增PCR产物的引物
下表总结已经用于确认菌株BIE201中SNP的SEQ ID NO(探针)。
表4 Hi-Res分析中用作探针的引物
根据Idaho Technologies提供的说明书,但没有探针的情况下,使用菌株BIE104(野生型酵母菌株)和菌株BIE201(能够在阿拉伯糖上厌氧生长的酵母菌株)的染色体DNA,使用引物对SEQ ID NO 24和25(SSY1)、26和27(YJR154w)、28和29(CEP3)、30和31(YPL277c)和32和33(GAL80),进行PCR反应。针对产率和完整性,在2%琼脂糖凝胶上检查扩增的片段。
与Idaho Technologies提供的方案类似的如下进行HiRes分析:将2μl的探针(5μM)添加至在PCR微板(4titude Framestart 96,黑框,白孔(Bioké,Leiden,荷兰))中的10μl PCR产物。混合后,旋转微板。使板在99℃下孵育30秒并冷却至室温(~20℃)。随后,在Lightscanner上进行熔融方案,起始温度为55℃、结束温度为94℃并且曝光设置为“自动”。测量完成后,进行数据分析。手动将在温度范围之间分析荧光变化的温度范围设定在这样的温度间隔下,在所述时间间隔中期望探针从PCR产物中熔融。
熔融曲线的例子示在图11中。图11展示了“标准化的熔融曲线”(熔融曲线;上图)和“标准化的熔融峰”曲线(下图)二者的例子。后者源于第一图并显示作为温度的函数的荧光信号的变化。展示了菌株BIE104A2P1和BIE201。在该图中测试的基因是YJR154w。在两个测试菌株BIE201和BIE104A2P1之间的探针的熔融温度差异是明显的。
除了YPL277c中的一个SNP,确认了所有期望的SNP。BIE201中该ORF(YPL277c)的序列好像与野生型菌株BIE104的序列相同。
总之,在实施例5中确认了SSY1(YDR160w)、YJR154w、CEP3(YMR168c)和GAL80(YML051w)的ORF中的SNP。使用两个独立的方法证明YPL277c的ORF中的之前(实施例4)鉴定的SNP搞错了。
实施例6
扩增染色体VII的部分
6.1扩增染色体VII的一部分
如在实施例4中所描述,对野生型菌株BIE104、初次转化体BIE104A2P1、进化的转化体BIE104A2P1c和进一步进化的菌株BIE201再测序测序产生若干有趣的SNP。
使用指示基因组的每个单个核苷酸的读取深度的覆盖图,我们搜索基因组中过度或过低表示的区域。的确,我们已经鉴定了过度表示的染色体VII上的区域(见图12)。
从读取深度中,得出结论:扩增了着丝粒周围的染色体VII的部分。染色体VII的左臂上区域扩增了3次。染色体VII右臂的一部分扩增了两次并且邻近部分扩增了3次(见图12)。
被扩增3次的染色体VII右臂的部分包含在强组成型启动子控制下的阿拉伯糖表达盒,即基因araA、araB和araD。
首先,通过Q-PCR确认若干基因的拷贝数。第二,调查扩增是否发生在相同的染色体上(两倍cq.三倍)或扩增的区域是否整合进入另一染色体(易位)。
6.2通过O-PCR测定拷贝数
为了验证如图12的覆盖图所指示的染色体VII部分的扩增,进行Q-PCR实验。具体而言,该方法通过将感兴趣的基因与已知拷贝数的另一种基因比较,来测定感兴趣基因的拷贝数。
为此,使用来自Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)的Bio-Rad iCycler iQ系统。使用iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)。如在提供商的手册中建议的设置实验。
从覆盖图(读取深度)中,推出基因SDS23和YGL057c期望是染色体VII左臂上的扩增区域的一部分。选择ACT1基因作为参考单拷贝基因。
用于检测基因YGL057c、SDS23和ACT1的引物总结在下表中。
表5 用于O-PCR实验中扩增的引物
Q-PCR条件如下:
1)95℃ 3分钟
步骤2-4,40个循环
2)95℃ 10秒
3)58℃ 45秒
4)72℃ 45秒
5)65℃ 10秒
6)每10秒增加温度0.5℃,至95℃
通过在65℃下开始测量荧光10秒,测定熔融曲线。每10秒温度增加0.5℃,直到达到95℃的温度。从读数中,计算和/或估计感兴趣基因的拷贝数。结果在下表中列出。
表6 在菌株BIE104A2P1和BIE201中所选择基因的相对拷贝数
如从实施例6(6.1节)中的读取深度分析中显而易见的,结果确证了扩增。观测值比期望的3.0的拷贝数更高。如之前Klein(Klein,D.(2002)TRENDS in Molecular Medicine Vol.8No.6,257-260)所公开的,差异可能由许多因素造成。
6.3分析复制本的性质
为了确定扩增的区域是否位于和该基因起初所处的相同染色体,即染色体VII上,或已经易位至另一染色体上,采用CHEF电泳(钳位均匀电场电泳;III Variable Angle System;Bio-Rad,Hercules,CA 94547,USA)。根据提供商的说明书,使用CHEF酵母基因组DNA填料试剂盒(BioRad)制备酵母菌株的琼脂糖填料(见下)。根提供商的说明书在0.5x TBE(Tris-Borate-EDTA)中制备1%琼脂糖凝胶(脉冲场琼脂糖,Bio-Rad)。根据下述设置进行跑胶:
块1 起始时间60秒
结束时间80秒
比率1
运行时间15小时
块2 起始时间90秒
结束时间120秒
比率1
运行时间9小时
作为染色体大小测定的标记物,菌株YNN295(Bio-Rad)的琼脂糖填料包括在实验中。
电泳之后,使用以终浓度为70μg每升的溴化乙锭对凝胶染色30分钟。在图13中,显示了染色的凝胶的例子。
染色之后,将凝胶印迹到Amersham Hybond N+薄膜上(GE HealthcareLife Sciences,Diegem,比利时)。
为了能够确定扩增的基因是否定位于一个染色体上或易位至其他染色体上,制造与印迹的薄膜杂交的探针。根据提供商的说明书使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche,Almere,荷兰)制备探针(见下表)。
制备下述探针。
表7用于扩增指示的探针的引物
期望araA基因在BIE104A2P1c和BIE201中扩增3次。
ACT1基因位于染色体VI上并且不期望被扩增。因此,该探针作为对照。
PNC1位于染色体VII的左臂上并期望在BIE104A2P1c和BIE201中扩增3次。
HSF1位于染色体VII的左臂上并位于扩增区域的上游。因此,期望该基因在测试的菌株中作为单个基因出现在基因组中。
YGR031w位于染色体VII的右臂上。期望该基因以双份出现在菌株BIE104A2P1c和BIE201的基因组中。
根据提供商的说明书,将薄膜在DIG Easy Hyb Buffer(Roche)中预杂交。探针在99℃下变性5分钟,在冰上冰冻5分钟并添加至预杂交的薄膜上。在42℃下过夜进行杂交。
根据提供商的说明书使用DIG Wash和Block Buffer Set(Roche)进行洗涤薄膜并封闭薄膜,然后检测杂交的探针。使用CDP-Star即开即用试剂盒,(Roche)通过用抗-地高辛-AP Fab片段(Roche)孵育随后添加检测试剂,来进行检测。使用Chemidoc装置提供的适当设置,使用Bio-Rad ChemidocXRS+系统进行化学发光信号检测。
结果显示在图13、14、15、16、17和18中。
从图13中,可已经推断,从BIE104至BIE201的菌株系的染色体大小不同。就染色体的大小而言,当与BIE104比较时,在初次转化体菌株BIE104A2P1(a)中未观察到大的不同。但是,在菌株BIE104A2P1c和BIE201中,染色体VII的大小已增加。在菌株BIE104中,染色体VII接近于染色体XV;但是,在BIE104A2P1c和BIE201中,染色体的大小已增加并几乎与染色体IV一样大。
与基因araA(图14)、PNC1(图16)和HSF1(图17)的探针杂交产生相同的图像。这提示扩增已经在相同的染色体中发生,即所有扩增的区域仍然在染色体VII上。如果已经发生易位,可预料到多重信号,而其不是该情况。在菌株BIE104A2P1(a)中,用所有的3个探针在染色体VII带的下面观察到一条较小的带。这提示存在第二个、更小版本的染色体VII。因为强度比更大的带低,其可能仅仅在小部分细胞中存在。其也可能解释为推测的电泳假象。
如所预料的,在所有菌株中与ACT1探针(图15)杂交产生表示染色体VI的单条带。
与YGR031w(图18)探针的杂交最后产生许多条带。显然,发生了交叉杂交,在每个菌株中产生多重信号。因此,该结果不能用于该实验的目的。
尽管在菌株之间观察到强度的一些不同,但是难以从这些数据中得出结论是否可显示扩增。尽管信号强度的增加可提示某些基因拷贝数的增加,但是其他因素也可影响信号强度,比如应用用凝胶上的DNA的量、印迹效率、检测饱和度等等。
综合考虑,实施例6的结果清楚地指示已经在染色体VII中发生了扩增。没有证据表明基因araA、araB和araD(包括周围的序列)的遗传背景易位至另一染色体上。
实施例7
SNP和扩增的表型验证
为了验证发现的SNP和扩增——并如果对于某些情况是的话——是否有利于通过酵母细胞将阿拉伯糖转化成乙醇的能力(除了引入的同源和异源路径之外),进行杂交育种实验。为此,进行下述实验:菌株BIE201的交配型转换,交配型转换的BIE201与非进化亲本菌株BIE104A2P1的杂交育种,二倍体菌株的孢子形成随后4个子囊孢子的剥离,在单倍体后代中测定利用能源和作为唯一碳源的阿拉伯糖的能力,使用Hi-Res在单倍体后代中的SNP检测,并分析这些数据组。
通过将进化的、交配型转换的BIE201与非进化的初次转化体BIE104A2P1杂交,构建二倍体细胞,所述细胞除了经鉴定的基因改变(SNP和扩增)外是完成纯合子的。通过随后的孢子形成,该二倍体细胞接着进行子囊孢子的剥离,将获得单倍体细胞,其可没有、有一些或所有的在适应性进化中引入的基因改变。在一个二倍体细胞的4个单倍体衍生物上的基因改变分布是随机的,尽管对于每个SNP、DIP或扩增,在4个单倍体衍生物中期望是2∶2的分离(segregation)。对于更理论性的背景知识,见例如Mortimer R.K.和Hawthorne D.C.(1975)Genetic Mapping in Yeast。Mehods Cell Biol.11:221-33。
7.1菌株BIE201的交配型转换
质粒pGal-HO(KAN)是质粒pGAL-HO衍生物(Herskowitz,I.和Jensen,R.E.(1991)Methods in Enzymology,194:132-146)。通过用EcoRV切割pGAL-HO随后通过连接来自pUG6的kanMX片段,pGAL-HO中的URA3-标记物已经被kanMX标记物替换(Güldener,U.等(1996)Nucleic AcidsResearch 24:2519-2524)。用限制酶XbaI和XhoI从pUG6中切割允许在酿酒酵母中G418选择的kanMX标记物,随后用Klenow聚合酶补平悬垂末端。所得质粒是pGal-HO (KAN)。
根据Gietz和Woods的方法(2002)用质粒pGal-HO (KAN)转化菌株BIE201(与该实验有关的相关基因型:matA)。在包含葡萄糖(2%)和G418(100μg/ml)的YEP/琼脂平板上选择转化体。在30℃下孵育2天后出现菌落。将8个菌落在具有葡萄糖和G418的新鲜的YEP/琼脂平板上再划线。每次转化的2个菌落用于对包含1%半乳糖和0.1%葡萄糖的20ml YEP-培养基接种。在30℃和280rpm下孵育2天之后,将细胞在YEPD平板上再划线。平板在30℃下孵育2天并且菌落是可见的。使用引物SEQ ID NO 55和56(用于鉴定matA细胞)和引物SEQ ID NO 55和57(用于鉴定matα(alpha)细胞),进行PCR反应用于确定交配型。
获得了BIE201的若干matα(alpha)变体。为了测试这些衍生物是否已经的确转换了它们的交配型,将它们在YEPD平板上再划线。还将菌株BIE104A2P1(该实验中初次转化体、相关基因型:matA)在各自的新鲜YEPD-平板上再划线。
随后,通过在新鲜YEPD-琼脂平板上混合一菌环的每种菌株使两个菌株交配。在30℃下孵育6小时后,在显微镜下对交配记分。一些分离的确显示形成接合体,即其中相反交配型的两个细胞已经融合形成一个二倍体菌株的结构。这些BIE201衍生物的确将交配型转换成matα(alpha)。
7.2交配型转换的BIE201与非进化的母本菌株BIE104A2P1的杂交 育种
将其中通过显微检查观察到的形成杂种(结合体)(7.1节)的制剂在YEPD-琼脂平板上涂布。平板在30℃下孵育2天。挑取较大的菌落并在新鲜YEPD平板上再划线。随后,使用引物SEQ ID NO 55和56和SEQ ID NO55和57进行菌落PCR。用两种引物对,二倍体将形成PCR产物。获得这些菌落中的若干个并用于对具有2%葡萄糖的YEP-培养基接种(30℃、280rpm)。
7.3二倍体菌株的孢子形成和子囊孢子的剥离
在30℃和280rpm下过夜生长之后,将2.5ml转移至25ml的于自来水(灭菌的)中1.5%KAc中。在30℃和280rpm下继续孵育。每天,显微检测孢子形成的程度。当子囊对营养性细胞的比例大于2时,使用提供商的说明书和方案,使用Singer MSM系列300(Somerset,UK)装置对60个子囊剥离。在YEPD平板上进行剥离。将平板在30℃下孵育2天。结果的例子在图19中示出。
图19显示了被剥离的10个子囊。来自子囊的子囊孢子彼此分开并以不同的距离放在琼脂平板上。“圆柱体”(显示了10个圆柱体)中的菌落源自一个子囊。
如从图19中显而易见的,并不是所有的4个孢子在所有的情况下都可见。在少数情况下,仅仅3个并且有时甚至仅仅2个子囊孢子生长成可育的菌落。
还,观察到来自一个子囊孢子的菌落之间菌落大小的一些不同。
7.4测定单倍体后代中利用能源和作为唯一碳源的阿拉伯糖的能力
在4个可育的孢子获得自一个子囊的情况下,将所有完整组的单倍体衍生物在96孔微平板的YEPD-琼脂中接种。以至少两份包括对照BIE104A2P1和BIE201作为每个微板上的对照。在30℃下孵育平板2天。这些平板称为“总平板(masterplate)”。
在允许在一个动作中将微板中的所有96个菌株的细胞材料转移的一次性针状工具的帮助下,用来自总平板的菌落材料对含200μl Verduyn-培养基和2%葡萄糖的96孔微平板接种。
含具有2%葡萄糖的液体Verduyn培养基的微板在30℃和550rpm下,于80%的湿度下的Infors微板摇床中,生长2天。
随后,将10μl的葡萄糖生长的微板培养物转移至微平板,所述微平板含200μl的含有2%阿拉伯糖作为碳源的Verduyn培养基。在Infors摇床中30℃下、550rpm和80%湿度下孵育持续4天。每天,通过使用BMG FLUOstar微板读数器(BMG,Offenburg,德国)测量620nm处的光密度来监测生长。利用阿拉伯糖的能力表达为,用在相同微平板上的初始光密度除以在作为唯一碳源的阿拉伯糖上孵育4天之后的最终光密度。结果的例子总结在表8中。
表8 测定了来自剥离的子囊和对照BIE104A2P1和BIE201的每个单倍体衍生物的生长(定义为用620nm处的初始光密度除以620nm处的最终光密度)。
如可预料的,从表8清楚地看出,在两个对照菌株BIE104A2P1和BIE201之间有大的不同。BIE104A2P1达到5的水平,其实际上表示没有获得生长。尽管5倍提示已经出现了一些生长,但是这很可能是由于携带来自预培养物的过量营养素(残留的葡萄糖、乙醇)引起的。菌株BIE201达到25的生长比例,其明显地比菌株BIE104A2P1高。
单倍体衍生物展示宽的生长表型范围,范围从低生长(与BIE104A2P1类似)至高水平的生长(与BIE201的水平类似并超过它)。而且,获得了具有中间生长水平的菌株。例如,在产生4个单倍体菌株A1、A2、A3和A4的第一子囊,子囊A中,获得了阿拉伯糖生长表型的2∶2分离。在一些其他子囊中,获得的低生长水平和高生长水平之间的分离不是按照2∶2模式。例如,在子囊B中,获得一个高水平生长表型菌株,一个具有中间水平(值为9)和具有低生长表型的两个单倍体。类似的观察可从源自其他子囊的单倍体菌株中进行。
7.5使用Hi-Res检测单倍体后代中的SNP
对包含补充2%葡萄糖的YEP-培养基的96孔微平板接种来自总平板的菌落材料(7.4节)。使得细胞在Infors摇床中30℃下、550rpm和80%湿度下生长2天。作为对照,包括菌株BIE104A2P1和BIE201。
以缩小规模的方式,使用上面的方案分离染色体DNA。如在5.2节中描述的,染色体DNA作为用于Hi-Res分析的模板。Hi-Res分析使得鉴定来自杂交BIE201(matα)×BIE104A2P1(matA)的每个单倍体分离子的SNP。同样地,根据6.2节中描述的方法测定染色体VII上的扩增区域。测定每个单倍体分离子的关于SNP和扩增的基因型。结果在表9中列出。
表9杂交BIE104A2P1×BIE201的单倍体衍生物中SNP和扩增出现的概述。作为对照,包括BIE104A2P1和BIE201。
在大部分子囊中,观察到SNP和扩增的2∶2分离。这也有一些例外,其可能是由例如减数分裂基因转化造成的。
7.6这些数据组的分析
结合7.4和7.5节的数据组(分别是表8和9),产生下表,表10。但是在表Z中,结果已经按照在阿拉伯糖上的从高生长至低生长排序。
表10杂交BIE104A2P1×BIE201和各自母本菌株的单倍体衍生物的SNP、扩增和生长表型的概述。
表10的结果强烈提示扩增是决定在阿拉伯糖上以相对高的生长速度生长的关键事件。有扩增的绝大部分菌株位于表10的前9位。这些菌株的2/3也在GAL80基因中具有SNP,提示了GAL80基因中SNP的存在和扩增的存在之间的相互作用。
为了统计学上确定哪些因素与高生长相关并且是否有协同效应,采用ANOVA分析。尽管设计不是平衡的,基于数据的统计学测试,清楚地看出扩增的存在对生长具有积极的效果(p<<0.01)。结果也揭示GAL80 SNP和扩增的存在之间具有强烈的相互作用(p<<0.01),而其他SNP没有显著效果(p>0.01)。
在不存在扩增的情况下评估的中值生长为8.4,而在扩增存在时,中值生长为17.6。在不存在GAL80 SNP和扩增二者的情况下评估的中值生长为8.7,而在存在二者的情况时,中值生长为26.8。
而且,尽管比GAL80 SNP和扩增的存在之间的相互作用较弱的程度,但CEP3 SNP的存在和扩增的存在之间的相互作用好像具有协同效应。
总之,由于SNP和/或扩增的存在,可测定对生长作用的效果和显著性。扩增对生长具有显著的作用。该作用通过扩增和GAL80 SNP的组合而增加。针对扩增和CEP3 SNP的组合以及扩增、GAL80 SNP和CEP3SNP的组合,检测到较小的相互作用效果。
实施例8
GAL80的缺失导致甚至更好的阿拉伯糖转化
在实施例7中,其显示GAL80基因中的鉴定的SNP对在阿拉伯糖上的生长具有正面的加性作用,如果也存在染色体VII的一部分扩增的话。
GAL80编码参与响应半乳糖转录抑制物转录调节的转录抑制物(Timson DJ等.(2002)Biochem J 363(Pt 3):515-20)。结合Gal4p和Gal3p,Gal80p协作调节在它们的启动子(UAS-GAL)中包含GAL上游活性位点的基因的表达,其包括GAL代谢基因GAL1、GAL10、GAL2和GAL7(LohrD等.(1995)FASEB J 9(9):777-87综述)。就gal80而言无表面标记的细胞组成型表达GAL基因,即使在非诱导培养基中(Torchia TE等.(1984)MolCell Biol 4(8):1521-7)。
假设在GAL80基因中鉴定的SNP影响Gal80p、Gal3p和Gal4p之间的相互作用。因此,与具有野生型GAL80等位基因的酵母细胞相比较,半乳糖代谢基因,包括编码半乳糖通透酶的GAL2的表达也将改变。Gal2p(半乳糖通透酶)是用于阿拉伯糖的主要糖运输蛋白(Kou等(1970)J Bacteriol.103(3):671-678;Becker和Boles(2003)Appl Environ Microbiol.69(7):4144-4150)。
显而易见,GAL80基因中的SNP对转化L-阿拉伯糖的能力具有正面作用。为了调查是否可进一步改进阿拉伯糖生长表型,使用PCR-介导的基因置换策略整体删除GAL80基因的编码序列。
8.1 GAL80基因的打断
使用引物SEQ ID NO 58和59(分别是正向和反向引物)用于扩增来自质粒p427-TEF(Dualsystems Biotech,Schlieren,瑞士)的kanMX-标记物。引物的侧翼与GAL80基因的5’-区域和3’-区域同源。与Wach(Wach等(1994)Yeast 10,1793-1808)描述的类似,一旦同源重组,GAL80基因的ORF将被kanMX标记物置换。获得片段被命名为GAL80::kanMX片段。
根据Gietz和Woods(2002,Methods in Enzymology 350:87-96)描述的方案用纯化的GAL80::kanMX片段,进行菌株BIE252的酵母转化。菌株BIE252的构建已经描述在EP10160622.6中。菌株BIE252是S cerevisiae的木糖和阿拉伯糖发酵菌株,其是BIE201的衍生物。菌株BIE252也包含GAL80SNP。
将转化的细胞在包含用于选择的100μg/ml G418的YEPD-琼脂上涂布。在30℃下孵育平板直到菌落可见。包括作为阳性对照的质粒p427-TEF并产生许多菌落。包括作为阴性对照的MilliQ(即没有DNA)并且不产生菌落。GAL80::kanMX片段产生许多菌落。通过Southern印迹验证两个独立的菌落,以便验证正确的整合(数据未显示)。具有正确缺失GAL80基因的菌落被命名为BIE252ΔGAL80。
8.2 GAL80基因置换对BAM性能的作用
进行BAM (Biological Activity Monitor;Halotec BV,Veenendaal,荷兰)实验。菌株BIE252和菌株BIE252ΔGAL80(其中GAL80基因的ORF被kanMX标记物正确置换的转化体)的单菌落隔离群用来接种补充2%葡萄糖的Verduyn培养基(Verduyn等,Yeast 8:501-517,1992)。预培养物在30℃和280rpm下孵育约24小时。收获细胞并在合成模拟培养基(补充5%葡萄糖、5%木糖、3.5%阿拉伯糖、1%半乳糖和0.5%甘露糖的Verduyn培养基,pH 4.2)中以每kg培养基1g干重的细胞密度接种。持续监测CO2产生。通过NMR分析糖转化和产物形成。数据表示在指示的时间点下糖的残留量(葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和木糖,以g/L表示),以及副产物的形成(乙醇、甘油等等)。通过在600nm下跟踪培养物的光密度来监测生长。实验进行约72小时。
数字在图20(BIE252)和21(BIE252ΔGAL80)中展示。
实验清楚地显示参照菌株BIE252快速转化葡萄糖和甘露糖。在葡萄糖耗尽后(10小时左右),开始木糖和阿拉伯糖的转化。一些半乳糖已经在约10小时左右的时间点发酵,其可能是由于在该菌株中的GAL80 SNP,所述GAL80 SNP可允许(部分)同时利用葡萄糖和半乳糖。在实验结束时,72小时左右,几乎所有的糖被转化。获得了每克糖0.37克乙醇的乙醇产量。
菌株BIE252ΔGAL80比菌株BIE252展示更快的糖转化能力。而且在该菌株的情况下,甘露糖和葡萄糖在发酵的第一小时中被转化。但是,与菌株BIE252相反,在该转化体中,有葡萄糖、半乳糖和甘露糖与阿拉伯糖和尤其是木糖的一些共同消耗。一般而言,糖消耗更快,导致更充分地使用所有可利用的糖。这也可从随着时间的CO2进展中显而易见。在BIE252的情况下,观察到第一个峰,其基本上是由葡萄糖和甘露糖形成的CO2。在到达仅仅高于10ml/hr的最低点(图20)时,观察到第二个更平的峰。但是,如从NMR的糖分析中显而易见的,在BIE252ΔGAL80的情况下(图21),第二个峰作为第一个峰的尾部出现,这归因于加强的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖的共同使用。在亲本菌株BIE252中,不同的糖的使用是更加持续的。因此,菌株BIE252ΔGAL80的产量在实验结束时(72h)更高:每克糖0.40克的乙醇。
总之,如在菌株BIE252中验证的,GAL80基因ORF的缺失导致性能进一步改进。
实施例9
菌株BIE201中的己二酸生产
9.1在DNA2.0定制的合成DNA片段
在DNA2.0(Menlo Park,CA 94025,USA)定制合成包含参与己二酸路径的9个开放阅读框(见于2011年3月28日提交的欧洲专利申请EP11160000.3)和用于有效表达的酿酒酵母启动子和终止子的9个DNA片段。在一些情况下向合成片段添加己二酸路径邻近部分的同源体,用于在转化至BIE201之后体内路径的重组。DNA2.0产生作为标准克隆载体中的克隆插入物的合成片段。这产生下述质粒(括号之间是简称),pADI141(Adi21)、pADI142(Adi22)、pADI143(Adi23)、pADI199(Adi8)、pADI145(Adi24)、pADI146(Adi25)、pADI149(SucC)、pADI150(SucD)和pADI200(Acdh67)。表11显示参与该路径的基因、使用的简称、来源、Uniprot码和参与的路径。
表11转化至BIE201菌株的己二酸路径中的基因的概述
9.2制备用于转化至BIE201的PCR片段
体内同源重组用于将完整己二酸路径安装并整合进BIE201中。在合成片段的合成期间或通过将序列添加至用于扩增片段的引物中,来添加用于完整路径的重组的必要同源体(50-250bp)。引物序列列在表12中。
表12在PCR-反应中使用的以产生用于转化至BIE201菌株的片段的所有引物疗列的列表。
总共需要12个片段(见图22)以将完整的己二酸路径整合进入BIE201的基因组,9个PCR片段(SEQ ID NO 84-92)含有属于己二酸路径的基因表达盒,1个PCR片段(SEQ ID 93)含有赋予G418抗性的kanMX-标记物和最后的INT1LF(整合左侧翼)和INT1RF(整合右侧翼)整合侧翼(分别为SED ID NO 94和SEQ ID NO 95)。所有的片段用在路径中与每个相邻片段的重叠同源和在路径外面与INT1LF和INT1RF的重叠同源产生,用于经双交换将路径整合进入基因组。同源重组事件、路径的完整的组装和整合显示在图22的图中。在转化中使用的产生的PCR片段列在表13中。本文包括的序列如SEQ ID NO 84到SEQ ID NO 95并包括SEQ ID NO 95。表13显示了针对在PCR扩增反应中使用的基因和引物的关于使用的启动子和终止子的信息,以产生用于转化的片段。
表13用于体内己二酸路径重组/整合的DNA元件的概述。启动子-ORF-终止子片段称为ORF的名字。5’和3’同源栏指示与哪种其他片段(一种或多种)共有同源(见图22)。“质粒名字”栏显示含有合成片段的DNA2.0质粒的名字。
用聚合酶(Finnzymes)根据手册进行所有的PCR反应。在DNA2.0定制的质粒用作扩增9个己二酸路径基因的模板。KanMX-标记物从携带标记物序列的质粒pUG7扩增。pUG7的构建如下:在两个步骤中通过克隆含有修饰的loxP-位点lox 66和lox71(Araki等(1997)Nucleic AcidsResearch,1997,Vol.25,No.4,pp 868-872)的连接子置换质粒pUG6的loxP-位点(Güldener,U.等(1996)Nucleic Acids Research 24:2519-2524)。进行限制分析并测序以确认正确的置换。
使用分离自BIE104的染色体DNA作为模板,扩增用于在“INT1基因座”整合的INT1LF和INT1RF(分别为左侧翼和右侧翼)。
用标准琼脂糖电泳技术检查PCR片段的大小。根据手册,用来自Qiagen的PCR纯化试剂盒,纯化并浓缩PCR扩增的DNA片段。使用来自Thermo scientific的Nanodrop(A260/A280吸收)测量DNA浓度。
9.3.酵母转化
如Gietz和Woods的描述(2002,Methods in Enzymology 350:87-96)进行酿酒酵母的转化。用lμg的12个扩增的并纯化的PCR片段的每一个转化BIE201。转化混合物在含100μg G418/ml(Sigma Aldrich)的YPD-琼脂(每升:10克的酵母提取物、20克每升的蛋白胨、20克每升的葡萄糖、20克的琼脂)上涂布。2天至4天之后,菌落出现在平板上,而阴性对照(即在转化实验中未添加DNA)产生空白YPD/G418平板。从转化平板,将单菌落转移至新的含有100μg G418/ml的YPD-琼脂平板上。平板在30℃下孵育2天。
9.4阿拉伯糖上的己二酸生产
将4个转化体(菌株1、2、3和4)的单菌落和作为对照菌株的BIE201在duplo中的在每孔包含具有2%阿拉伯糖和0.05%葡萄糖的200μlVerduyn培养基的半孔深度MTP(微平板)中接种。MTP在30℃、550rpm下和80%湿度下在微平板的Infors摇床中孵育48小时。48小时孵育之后,40μl的每种培养物转移至2个每孔包含具有2%阿拉伯糖的2.5mlVerduyn培养基的24孔平板中。用标准MTP盖子覆盖24孔平板并在30℃、550rpm和80%湿度下孵育24小时。24小时孵育之后,在Heraeus离心机中,以2750g对24孔平板离心10分钟。去除上清液并向包含细胞球团的每个孔添加4.5ml具有2%阿拉伯糖的新鲜的Verduyn培养基。用吸液管使细胞球团再悬浮。对于一个平板,用透气孔板(Qiagen)替换标准MTP盖子以改善通风。对于第二个24孔平板,它用BugStopperTM Capmat(Whatman)替换,这产生微氧环境。24孔平板在Infors Microtron孵育箱中在30℃、350rpm和80%湿度下孵育72小时。孵育之后,在Heraeus离心机中以2750g对平板离心10分钟。用LC-MS测量上清液中的己二酸浓度。结果显示在表14中。
表14 通过BIE201在阿拉伯糖上生长之后在上清液中产生的所得己二酸浓度。
菌株2、3和4在具有作为唯一碳源的阿拉伯糖的Verduyn培养基上生产己二酸。在氧受限条件下,即用bugstopper盖子,相对于用透气孔板获得更好的水平。
参照菌株BIE201在阿拉伯糖上生长但是不产生己二酸。
9.5 UPLC-MS/MS分析(ESI阴性模式)
用具有下述规格的柱子分析样品:“Waters Acquity UPLC HSS T3,1.8μm,100mm*2.1mm I.D”。使用全充满定量环,注入体积为5μl,通过柱子的流量是0.250ml/min并且柱子温度是40℃。表15显示用于流动相A和B的梯度。流动相A包含水中0.1%的甲酸并且流动相B包含乙腈中0.1%的甲酸。
表15在UPLC-MS/MS分析上清液中己二酸浓度期间使用的梯度.
图23描绘含有10.5mg/L己二酸的标准物和由菌株3产生的含有菌株3在具有Bugstopper的阿拉伯糖上生产的3mg/l己二酸的样品的MRM色谱图。
实施例10
琥珀酸生产
10.1表达构建体
按照之前在WO2009/065778的19-20和22-30页中描述的制造包含来自Actinobacillus succinogenes的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶PCKa (E.C.4.1.1.49)和来自Trypanosoma brucei的糖酶体(glycosomal)延胡索酸还原酶FRDg(E.C.1.3.1.6)的表达构建体pGBS414PPK-3和包含来自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶(E.C.4.2.1.2.)和过氧化物酶体苹果酸脱氢酶MDH3(E.C.1.1.1.37)的表达构建体pGBS415FUM3,所述WO2009/065778(包括图和序列表)通过参考附在本文中。
通过将包含来自质粒pPWT018的araABD表达盒的PCR产物克隆进入质粒pRS416,构建包含源自Lactobacillus plantarum的基因araA、araB和araD的表达构建体pGBS416ARAABD。使用DNA聚合酶(Finnzymes)和本文定义的如SEQ ID 96和SEQ ID 97的PCR引物产生PCR片段。如对质粒pRS416所进行的,用限制酶SalI和NotI切割PCR产物。在E.coli TOP10的连接和转化之后,基于限制酶分析选择正确的重组体。质粒pGBS416ARAABD的物理图谱在图24中示出。
10.2酿酒酵母菌株
质粒pGBS414PPK-3、pGBS415-FUM-3被转化进入酿酒酵母菌株CEN.PK113-6B(MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289)。另外,质粒pGBS416ARAABD被转化进入该酵母以产生原养型酵母菌株。通过电穿孔将表达载体转化进入酵母。将转化混合物涂布在Yeast Nitrogen Base(YNB)w/o AA(Difco)+2%葡萄糖上。一种这样的转化体被称为SUC595。
作为对照,仅仅用质粒pGBS416ARAABD转化菌株CEN.PK113-6B。一种这样的转化体被称为SUC600。
在作为唯一碳源的阿拉伯糖上生长,使菌株进行适应性进化(见实施例2,2.1节)。在实施例2中,使用了含有阿拉伯糖的YNB-培养基,而在该实施例中,使用具有2%阿拉伯糖的Verduyn培养基。
针对在其作为唯一碳源的阿拉伯糖上生长的能力,对来自适应性进化摇瓶中的经分离的单菌落表征。经历适应性进化的SUC595的衍生物,SUC689在作为唯一碳源的阿拉伯糖上的生长速度为0.1h-1。经过适应性进化的SUC600的衍生物——SUC694在作为唯一碳源的阿拉伯糖上的生长速度为0.09h-1。
10.3 生长实验和琥珀酸生产
在包含YNB(Difco)、4%半乳糖和2%琼脂的96孔微平板中接种转化体SUC689和SUC694的单菌落隔离群。每种菌株接种4个独立的菌落。在30℃下生长2天之后,在针工具的帮助下,将菌落材料转移至含200μl预培养物培养基的96孔微板,所述预培养物培养基由包含4%半乳糖(w/v)的Verduyn培养基(Verduyn等,1992,Yeast.Jul;8(7):501-17)组成,并在有氧条件下在Infors振荡孵育器中在30℃、550rpm和80%湿度下生长。在约48小时之后,将细胞一式两份转移至含有补充4%半乳糖的2.5ml新鲜Verduyn培养基的24孔微平板中。在30℃下孵育72小时之后,将平板在微平板离心机中旋转,以便从培养基中分离细胞。丢弃上清液。将细胞再悬浮在包含8%阿拉伯糖的4ml Verduyn培养基中。在2个时间间隔处,48小时(微平板1)和72小时(微平板2)时,通过使细胞旋转来停止孵育。如10.4节中描述的,通过NMR使用上清液来测量琥珀酸水平。
10.4 NMR分析
进行NMR用于测定发酵液样品中有机酸和糖。
结果在16和17中列出。
表16在时间点48小时下NMR分析的结果。所有的值表示为克每升。N.D.意思是未检测到。
表17 在时间点72小时下的NMR分析的结果。所有的值表示为克每升。N.D.意思是未检测到。
从表16和17中清楚地看出,与菌株SUC694相比,菌株SUC689的情况下琥珀酸的量更高。菌株SUC694几乎转化了所有的阿拉伯糖并且作为主要生物质的产物,形成了乙醇。在菌株SUC689的情况下,形成较少的乙醇,但形成了比菌株SUC694高3至4倍的显著更高量的琥珀酸,比。计算琥珀酸的产量并显示在下表中。
表18在作为碳源的阿拉伯糖上的琥珀酸产量。
总之,在菌株SUC689中从阿拉伯糖生产了琥珀酸,所述琥珀酸在不表达琥珀酸路径的菌株——菌株SUC694中显著更低。
实施例11
引入另外拷贝的araA、araB和araD基因
11.1扩增araABD-盒
为了将另外拷贝的araA、araB和araD基因引入基因组,使用DNA聚合酶(Finnzymes),使用质粒pPWT018作为模板和具有SEQ ID 98和SEQ ID 99的寡核苷酸作为引物,进行PCR反应。利用这些引物,扩增araABD-盒。这样设计引物,以便PCR片段的侧翼与酵母转位子Ty-1的δ-序列的连续序列同源。这些序列可从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得并使用允许比对的软件包进行比对,例如Clone Manager 9 Professional Edition (Scientific & Educational Software,Cary,USA)。
araABD-盒不含有利用其可选择整合进入基因组的选择性标记物。为了评估转化频率,用kanMX-标记物进行第二对照转化。为此,使用对应SEQ ID NO 100和SEQ ID NO 101的引物,在PCR反应中扩增来自质粒p427TEF的kanMX-盒(Dualsystems Biotech)。
11..2 BIE104A2P1的转化
根据电穿孔方案(如上述),用包含30μg araABD-盒(命名为Ty1::araABD)或10μg kanMX-盒的片段转化BIE104A2P1。KanMX-转化混合物在包含每ml为100μg G418(Sigma Aldrich)的YPD-琼脂(每升:10克的酵母提取物、20克每升蛋白胨、20克每升葡萄糖、20克的琼脂)上涂布。在2到4天之后,在平板上出现菌落,而阴性对照(即在转化实验中未添加DNA)产生空白YPD/G418平板。转化频率为高于600个菌落/μg的kanMX-盒。
Ty1::araABD转化混合物用于对包含100ml的补充2%阿拉伯糖的Verduyn培养基的摇瓶接种。作为对照,使用阴性对照的转化(即在转化实验中未添加DNA)。在30℃和280rpm下定轨摇床中孵育摇瓶。定期测量600nm处的光密度来跟踪生长。
约25天之后,Ty1::araABD摇瓶的光密度增加,而阴性对照中仍然没有生长。在25天时,从Ty1::araABD培养物对含有补充2%阿拉伯糖的新鲜Verduyn培养基的摇瓶接种,至在600nm处的起始光密度为0.15。培养物立即并快速地在阿拉伯糖上开始生长。因为可能培养物由亚培养物的混合物组成,因此由具有不同拷贝数的Ty1::araABD盒和在阿拉伯糖上不同生长速度的细胞组成,所以细胞在milliQ水中稀释并在YPD-琼脂平板上涂布,以便获得单菌落隔离群。测试单菌落隔离群使用不同碳源的能力。
11.3选择更好的阿拉伯糖转化菌株
为了选择在作为唯一碳源的阿拉伯糖上获得改进的生长而不丢失其利用其他重要的糖(葡萄糖和半乳糖)的能力的菌株,将适应性进化培养物的10个单菌落隔离群在YPD-琼脂上再划线。随后,在补充2%葡萄糖的YPD-培养基上进行预培养。将10个培养物在30℃和280℃下孵育过夜。每个培养物的一小份用来以0.15的初始光密度对补充2%葡萄糖或2%阿拉伯糖或2%半乳糖的新鲜Verduyn培养基中接种。作为对照,在实验中包括菌株BIE201、BIE104A2P1和混合的种群(从其恢复10个单菌落隔离群)。细胞在30℃和280rpm下于定轨摇床中生长。基于在600nm处的光密度测量值评估生长。
结果显示混合的培养物和10个单菌落隔离群在600nm处展示了更高的最终光密度。
基于其在作为唯一碳源的阿拉伯糖上的生长选择一个菌落(菌落T)。如果在补充2%阿拉伯糖的Verduyn培养基中接种,该菌落显示比亲本菌株BIE104A2P1更高的生长速度。其生长速度比得上菌株BIE201的生长速度。
在菌株BIE201、BIE104A2P1和菌落T的染色体DNA上进行Q-PCR。在BIE104A2P1的情况下,araABD盒的拷贝数确定为1并且在菌落T和BIE201二者的情况下大于2。
Claims (14)
1.生产能够转化阿拉伯糖的细胞的方法,其包括下述步骤:
a)将基因araA、araB和araD引入不能够转化阿拉伯糖的宿主菌株,该细胞被命名为构建细胞;
b)使所述构建细胞进行适应性进化,直到获得转化阿拉伯糖的细胞,
c)任选地,使第一阿拉伯糖转化细胞进行适应性进化,以改善阿拉伯糖转化;在步骤b)或c)中生产的所述细胞被命名为第一阿拉伯糖转化细胞;
d)分析所述第一阿拉伯糖转化细胞和所述构建细胞的全基因组或部分基因组;
e)鉴定所述第一阿拉伯糖转化细胞中的单核苷酸多态性(SNP);和
f)在能够转化阿拉伯糖的细胞的合理设计中使用SNP的信息;
g)构建在步骤f)中设计的能够转化阿拉伯糖的所述细胞。
2.根据权利要求1的方法,其中在步骤e)、f)和/或g)中一种或多种分表型技术与一种或多种分表型技术组合使用。
3.根据权利要求1方法或2的方法,其中,在所述方法中,所述能够转化阿拉伯糖的酵母细胞具有与所述宿主菌株相比扩增的染色体,其中所述扩增的染色体具有与所述宿主菌株中的araA、araB和araD基因被引入其中的所述染色体相同的数目。
4.根据权利要求3的方法,其中所述扩增的染色体是染色体VII。
5.除了酵母细胞BIE201之外,具有araA、araB和araD基因的酵母细胞,所述酵母细胞中染色体VII具有如通过电泳测定的从1300至1600Kb的大小。
6.根据权利要求5的酵母细胞,其中所述araA、araB和araD基因的拷贝数是每种3至5个。
7.根据权利要求6的酵母细胞,其具有选自由下述突变组成的组的一种或多种所述单核苷酸多态性:SSY1基因中的G1363T、YJR154w基因中的A512T、CEP3基因中的A1186G和GAL80基因中的A436C。
8.根据权利要求7的酵母细胞,其具有GAL80基因中的A436C的单核苷酸多态性。
9.根据权利要求8的酵母细胞,其还具有CEP3基因中的A1186G的单核苷酸多态性。
10.属于由下述多肽组成的组的多肽:
a.多肽,其具有由在SSY1中具有置换E455终止子的多核苷酸SEQID NO:14编码的序列,以及其变体多肽,其中一个或多个其他位置具有用作为AA反式超家族中已有的氨基酸的另一种氨基酸对氨基酸的突变;
b.多肽,其具有由在YJR154w中具有置换D171G的多核苷酸SEQID NO:16编码的序列,以及其变体多肽,其中一个或多个其他位置具有用作为PhyH超家族中已有的保守氨基酸的另一种氨基酸对氨基酸的突变;
c.多肽,其具有由在CEP3中具有置换S396G的多核苷酸SEQ IDNO:18编码的序列;
d.多肽,其具有由在GAL80中具有置换T146P的SEQ ID NO:20编码的序列;
和其变体多肽,其中一个或多个其他位置可具有用作为NADBRossmann超家族中已有的保守氨基酸的氨基酸对氨基酸的突变。
11.由包含葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖的糖组合物生产一种或多种发酵产品的方法,其中用根据权利要求5-9任一项的酵母细胞发酵所述糖组合物。
12.根据权利要求11的方法,其中所述糖组合物通过下述由木质纤维素材料生产:
a)预处理一种或多种木质纤维素材料以生产经预处理的木质纤维素材料;
b)酶处理所述经预处理的木质纤维素材料以生产所述糖组合物。
13.根据权利要求11或12的方法,其中所述发酵是厌氧进行的。
14.根据权利要求11-13任一项的方法,其中所述发酵产品选自由下述组成的组:乙醇;正丁醇;异丁醇;乳酸;3-羟基-丙酸;丙烯酸;乙酸;琥珀酸;延胡索酸;苹果酸;衣康酸;马来酸;柠檬酸;己二酸;氨基酸,比如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸;1,3-丙二醇;乙烯;甘油;β-内酰胺抗生素和头孢菌素;维生素;药物制剂;动物饲料添加剂;专用化学品;化学原料;塑料;溶剂;燃料,包括生物燃料和生物气或有机聚合物和工业酶,诸如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。
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