CN105263955A - 具有通透酶活性的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及多肽，所述多肽在对应于SEQ？ID？NO:59的339或376位置的位置处具有一个或更多个替换，其中所述多肽为主要易化蛋白超家族(MFS)的成员。在一个实施方案中，所述替换在对应于376的位置处，并且其中该位置处的氨基酸被范德瓦尔斯体积为80至138A³并且侧链疏水性为10至100Δt_R的氨基酸置换。

Description

具有通透酶活性的多肽

技术领域

本发明涉及新颖的多肽和表达所述多肽的重组生物。在一个实施方案中，本发明涉及具有改变的糖特异性和/或糖转运活性的新颖的通透酶多肽。

背景技术

酵母细胞和其它真核生物的质膜为复杂生物膜，其由两个磷脂层组成，大量蛋白质嵌入其中。许多分子可通过扩散和渗透或借助于特定的转运系统来跨越质膜。

转运系统允许摄取营养物质和离子，输出代谢产物以及不希望的或有害的物质。存在不同的机制。初级主动转运蛋白通过利用例如ATP水解来驱使溶质积聚或挤出。次级载体属于主要易化蛋白超家族(MajorFacilitatorSuperfamily，MFS)转运蛋白，其促进一个或更多个分子种类响应于化学渗透梯度而跨膜转运。在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，已在菌株S288c中鉴定出186种MFS蛋白(Nelissen，1997)。

此类载体的一个实例为Hxt1蛋白，其参与酿酒酵母中的己糖转运。

通透酶是膜转运蛋白，这是一类多次跨膜蛋白，其促进特定分子(在本文中特别地为一种或多种糖)通过被动转运而扩散进入细胞或扩散出细胞。相比之下，主动转运蛋白将分子跨膜转运与能量源如ATP或有利的离子梯度偶联在一起。

术语通透酶、易化蛋白、转运蛋白或相关术语全部描述具有多个跨膜域的蛋白，其表现出跨膜转运分子的功能。此转运可由不同的机制引起：单转运(转运一个分子)、同向转运(沿同一方向同时共转运两个不同的分子)、反向转运(沿相反的方向同时转运两个分子)和易化扩散。

酵母中的糖转运蛋白家族由30-40个成员组成(菌株S288c中34个成员(Nelissen,1997))。糖转运蛋白可分为五个簇：己糖通透酶(HXT-基因，GAL2)、二糖通透酶、肌醇通透酶、糖受体和最后一个底物未知的转运蛋白簇。

木质纤维素生物质是一种生产液体运输燃料的有吸引力的替代原料，其由若干不同的糖组成。木质纤维素的己糖级分(主要是葡萄糖)原则上可易于通过酿酒酵母的非重组版本发酵。然而，此生物不能将戊糖类(例如木糖和阿拉伯糖)代谢成乙醇。

产生能够代谢戊糖糖类的微生物的方法是本领域中已知的。例如，WO/2009/109630中阐述了表达盒的构建以及通过表达木糖异构酶将酿酒酵母细胞转化成发酵戊糖的细胞。

存在天然的利用戊糖的生物，但其是缺乏充分开发的遗传学工具和/或低产物耐受性的，这限制了它们作为宿主用于木质纤维素转化方法的适用性。

因此，努力的焦点就在于在酿酒酵母中(其仍为乙醇工业中所选择的生物)引入戊糖转化途径以实现戊糖发酵。

尽管过去几年取得了大量的进展，但戊糖类的转运仍被认为是戊糖代谢的限速步骤(之一)。

酿酒酵母中的戊糖转运受到己糖转运蛋白(Hxt)家族的不同成员的介导。Hxt4、Hxt5、Hxt7和Gal2已被描述为酿酒酵母中的主要木糖转运蛋白(Hamacher等，2002)，并且已知Gal2也介导阿拉伯糖转运(Becker等，2003)。然而，对各戊糖类的亲和力比对各己糖类的亲和力低约10至100倍。重组酵母细胞中专用木糖或阿拉伯糖转运蛋白的缺乏因而限制了糖混合物中己糖和戊糖的共利用的能力，并且阻止了高戊糖分解代谢通量。因此，可认为生物质糖转化具有两个阶段：在第一阶段，发生己糖(葡萄糖)的较快转化，而在己糖已从培养基耗尽时开始的第二阶段，戊糖发酵开始，但相对于己糖转化速率是以低得多的速率进行。

因此，长久以来的期望是在其它方面不变的转运蛋白背景下表达戊糖特异性糖转运蛋白，即，无葡萄糖干扰(戊糖特异性)和对戊糖具有高亲和力，以便保持以大致相同的水平转化己糖的能力。

解决此问题的一种方法是筛选具有戊糖特异性并且对戊糖具有(适度)高亲和力的异源糖(戊糖)转运蛋白。然而，迄今为止，此类努力的成功有限。仅少数被证实能够在酿酒酵母中表达时促进戊糖转运，但相对于木糖而言全部优先葡萄糖(Young等，2011，以及其中的参考文献)，如同采用酿酒酵母Hxt-蛋白的情况一样，如上文所指出。

另一种方法是将己糖转运蛋白重新工程化为戊糖转运蛋白。例如，Kasahara等的工作(2000；2009；2010)表明若干糖转运蛋白的哪些残基在确定对天然底物的底物亲和力方面起着关键作用。

能够更有效地转运戊糖糖类的突变己糖转运蛋白是本领域中已知的。例如，在WO/2012/049173中，描述了从发酵戊糖的酿酒酵母细胞的培养物中分离突变己糖转运蛋白基因。

在酿酒酵母中，通透酶GAL2跨细胞膜转运半乳糖。还已知其为葡萄糖跨膜的转运蛋白。

发明概述

本发明的一个目的是提供具有改变的，特别是具有改善的糖特异性的新颖通透酶多肽。本发明的另一个目的是提供表达通透酶多肽的重组菌株，其对于被通透酶跨细胞膜转运的分子具有改善的摄取。另一个目的是提供与亲本多肽相比对C5糖，特别是木糖具有改善的转运能力的通透酶多肽。另一个目的是提供与亲本多肽相比对C6糖，特别是葡萄糖具有降低的转运活性的通透酶多肽。另一个目的是提供一种鉴定其它相关通透酶多肽中的突变的方法，其对改善木糖转运能力或降低葡萄糖转运活性具有有益效果。

根据本发明实现了这些目的中的一个或更多个。根据本发明，提供了多肽，其在对应于SEQIDNO:59的339或376位置的位置处具有一个或更多个替换，其中所述多肽为主要易化蛋白超家族(MFS)的成员。在一个实施方案中，所述替换在对应于376的位置处，并且其中该位置处的氨基酸被范德瓦尔斯体积(vanderWaalsvolume)为80至并且侧链疏水性为10至100Δt_R的氨基酸置换。在一个实施方案中，位置376处的氨基酸的范德瓦尔斯体积为85至并且侧链疏水性为10至100Δt_R。

本文中所用的氨基酸的范德瓦尔斯体积值如http://www. proteinsandproteomics.org/content/free/tables_1/table08.pdf中所述。相对应的文献为N.J.Darby,ThomasE.Creighton,ProteinStructure(1993)OxfordUniversityPress。本文中所用的氨基酸的侧链疏水性(Δt_R)值如http://onlinelibrary. wiley.com/doi/10.1002/psc.310010507/pdf中所述。与此相对应的参考文献为Monera,O.D.等，JournalofPeptidescience，第1卷，第319-329页(1995)。

根据本发明的具有这些突变中的一个或更多个的多肽具有有利的糖消耗和/或发酵产物生产。这将在下文进行更详细的描述并且将通过下文的实施例1-5进行阐释。

附图简述

图1示出己糖转运蛋白突变体在Verduyn-尿素+15gl^-1葡萄糖+20gl^-1木糖上进行有氧摇瓶培养的结果。培养期间的(A)600nm波长处的光密度测量；(B)葡萄糖浓度(gl^-1)；C)木糖浓度。

图2示出己糖转运蛋白突变体在Verduyn-尿素+20gl^-1木糖上进行有氧摇瓶培养的结果。(A)600nm波长处的光密度测量；(B)木糖浓度(gl^-1)。

图3示出菌株YD01227的菌株构建方案

图4示出四倍(quadruple)己糖激酶突变体(col2)和参照菌株RN1014在Verduyn-尿素+100gl^-1葡萄糖+20gl^-1木糖上进行有氧摇瓶培养的结果。培养期间的A)600nm波长处的光密度测量；(B)葡萄糖浓度(gl^-1)；(C)木糖浓度。

图5示出在葡萄糖-木糖混合物上进行微孔板培养的结果。参照菌株RN1014以及四倍己糖激酶突变体YD01227和具有相同基因型的菌落2(Col2)在补有葡萄糖和木糖混合物的Verduyn-尿素上的生长特性，其中葡萄糖和木糖分别具有下列浓度：(A)60+20、(B)100+20、(C)15+5和(D)25gl^-1+5gl^-1。每15分钟，通过BioscreenC装置自动测量OD600。数据点为一式三份测量的平均值。

图6示出pRN99质粒图谱3。

图7示出葡萄糖转运活性反向筛选(GTAC筛选)中残余木糖与葡萄糖浓度(A)或残余木糖浓度与生长(OD600；B)的关系，参见实施例。将在96小时残余木糖浓度(gl^-1)相对于残余(A)葡萄糖浓度(gl^-1)和(B)OD600绘图。(插图B)线性回归分析显示OD600和木糖的良好相关性。每个数据点表示每个筛选部分的1至3个重复的糖浓度的平均值或RN1001对照菌株或培养基样品的多次测量的平均值。

图8示出GTAC筛选中Gal2-N376-突变变体的生长和木糖消耗。GTAC筛选期间的(A)时间点24、72和96小时的OD600测量；和(B)针对Gal2-N376-突变变体、RN1001对照菌株和空样品(仅YD10培养基)测量的残余木糖浓度(gl^-1)。每个柱表示3个转化体的平均OD600或残余木糖浓度；误差条表示平均值的标准误差。星号表示包含具有明显效果的大疏水性侧链的氨基酸。

图9示出最佳15(TOP15)木糖转运活性(XTA)筛选(参见实施例)的生长曲线。来自XTA筛选的(A)A部分和(B)B部分的最佳15菌株/变体的三个采样点的OD600值。每柱表示3个转化体的平均OD600；误差条表示平均值的标准误差。

图10示出通透酶蛋白质序列的比对。

图11示出氨基酸范德瓦尔斯体积(Y轴)相对于氨基酸疏水性(Δt_R)(X轴)的图线。就对应于SEQIDNO:59的376的位置而言的有利氨基酸(降低的葡萄糖转运活性)在短条状线所界定的区域内，就位置339而言的在长条状线所界定的区域内。本文中所用的范德瓦尔斯体积值描述于http://www.proteinsandproteomics.org/content/free/tables_1/table08.pdf中。相对应的文献为N.J.Darby,ThomasE.Creighton,ProteinStructure(1993)OxfordUniversityPress。本文中所用的氨基酸的疏水性值(Δt_R)如http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/psc.310010507/pdf中所述。与此相对应的参考文献为Monera,O.D.等，JournalofPeptidescience第1卷，第319-329页(1995)。

图12示出(A)经进化菌株RN1053-X2和野生型菌株RN1053在补有2％木糖的Verduyn-尿素-his上的生长曲线。生长曲线表示为随时间(h)在600nm波长处测量的光密度(OD)(OD600)单位，(B)菌株RN1053-X2中的HXT8-HXT17的表达水平。每个样品中相对于ACT1水平的表达水平以归一化倍数表达水平(NormalisedFoldExpressionLevel)表示；表达水平相对于特定HXT基因的RN1053mRNA水平(RN1053表达水平设定为1)进行归一化。

图13(A-B)示出与RN1053-X2-空(1053-X2)和RN1053-空相比的HXT11敲除菌株(KO1至-6)的(A)HXT11表达水平和(B)生长。生长以600nm波长处测量的光密度(OD)(OD600)的单位表示。

图13(C-D)示出(C)pRS313-P7T7的质粒图谱；(D)用空载体对照(1053-X)转化的RN1053-X2和在引入pRS313-P7T7-反HXT11(iHXT1至-4)之后的四个转化体在补有2％木糖的Verduyn-尿素上的生长。生长以600nm波长处测量的光密度(OD)(OD600)的单位表示。

图14示出RN1053-HXT11(Hxt11，实心菱形)、RN1053-HXT12(Hxt12，空心三角形)、RN1053-空载体对照(1053；三角形)、RN1041-空载体对照(1041；空心正方形)在补有(A)葡萄糖和木糖(各2％)的混合物或(B)2％木糖的Verduyn-尿素上的生长曲线。生长曲线以随时间(h)在600nm波长处测量的光密度(OD)(OD600)的单位表示。

图15示出在存在或不存在逐渐增加的竞争葡萄糖浓度(0-500mM)的情况下对RN1053-HXT11(HXT11)、RN1053-HXT2(Hxt2)、RN1053-空(空)的木糖摄取研究。

图16示出(A)表达嵌合Hxt11p-GFP蛋白的RN1053在2％木糖上在16小时的生长(初始细胞密度为OD0.5)。(B)在补有葡萄糖或木糖的Verduyn-尿素上生长的RN1053-HXT11和RN1041-HXT11的荧光显微镜检查。

图17示出(A)RN1041-空质粒和(B)RN1053-HXT11在补有80gl^-1葡萄糖和40gl^-1木糖的Verduyn-尿素上的糖消耗和乙醇生产的发酵曲线。

图18示出在用YD01227-GAL2(n＝3)、YD01227-HXT2(n＝3)、YD01227-HXT11(n＝3)转化体进行96小时的GTAC筛选之后的生长曲线(OD600)(A)、残余木糖(B)和葡萄糖(C)浓度(gl^-1)。添加培养基和RN1001样品作为对照。

图19(A-B)示出(A)YD01227-空、YD01227-HXT11和YD01227-mHXT11(N366D)转化体(n＝2)在补有15％葡萄糖和1％木糖的Verduyn-尿素上的摇瓶培养物的生长曲线，和(B)RN1053-转化体在含有2％木糖的Verduyn-尿素(n＝3)上的摇瓶培养物的生长曲线。

图19(C-E)示出RN1053-HXT11和RN1053-mHXT11(N366D)的¹⁴C-放射性标记的糖摄取曲线。(A)在不存在(D)和存在(E)逐渐升高的未标记葡萄糖(0-500mM)浓度的情况下的¹⁴C-葡萄糖摄取和¹⁴C-木糖摄取。糖摄取以酵母nmolmg干重(DW)/分钟(min)表示。

图19(C-F)示出RN1041-空(实心菱形；1041+空)、RN1053-HXT11(实心三角形；1053+HXT11)、RN1053-mHXT11(N366D)(实心正方形；1053+epHXT11)在Verduyn-尿素+100gl^-1葡萄糖和60gl^-1木糖上的发酵曲线。(C)随时间(h)的生长曲线(以OD600测量表示)。随时间(h)测量的发酵液中的组分，例如(D)葡萄、(E)木糖和(F)乙醇。

图19(J-L)示出菌株RN1053-HXT11(J和L灰色虚线)和RN1053-mHXT11(N366D)(K和L黑线)在补有80gl-1葡萄糖和40gl-1木糖Verduyn-尿素上的发酵曲线。(L)(J)和(K)中所示两条发酵曲线的组合图。

图20示出在YD01227的恒化培养(天)期间Verduyn-尿素-his培养基中的葡萄糖/木糖比率方案；

图21示出YD01227-evo(A)和YD01227-ori(B)在补有1％木糖的Verduyn-尿素-his上的摇瓶培养物在不存在(实心三角形；1+0)或存在(3％葡萄糖，条状线，1+3；6％葡萄糖，实心圆，1+6；10％葡萄糖，实心菱形，1+10)逐渐增加的葡萄糖浓度的情况下的生长曲线。(C)在存在或不存在逐渐增加的葡萄糖浓度(0-500mM)的情况下的YD01227-ori(1227-ori，实心正方形)或YD01227-evo(1227-evo，实心菱形)的¹⁴C-木糖摄取研究。

图22示出(A)YD01227-ori(白色条)、YD01227-evoB在补有木糖:葡萄糖比率为1:3(灰色条)和1:10(黑色条)的糖混合物的Verduyn-尿素-his上的mRNA表达谱。数据以归一化表达表示(相对于ACT1和相对于YD01227-ori，其被设定为1)。

图22(B-D)：采用木糖(B)和葡萄糖(C)的摄取实验。测量RN1053-Hxt3-6(菱形)、RN1053-N367I(三角形)和1053-空(正方形)中的摄取(以nmol/mg.DW.min计)。(D)在0、50、100、200和500mM葡萄糖的存在下RN1053-Hxt3-6(菱形)和RN1053-N367I菌株(正方形)中的50mM¹⁴C木糖的摄取。

图23：表达Hxt36(A)和Hxt36-N367I(B)的GFP融合蛋白的菌株RN1053的荧光图像。采用NikonEclipse-Ti显微镜来分析图像。(C)两个菌株中的GFP荧光的总量(以AU/OD600计)。

图24：包含表达HXT36转运蛋白的载体的YD01227菌株的生长，所述HXT36转运蛋白在位置367处具有所有可能的氨基酸替换。细胞在1％木糖和10％木糖上生长，并且用空载体pRS313-P7T7转化的YD01227用作对照。

图25：用于测定葡萄糖(图块A)和木糖(图块B)的K_m和V_max的摄取实验。测量RN1053-HXT36菌株(菱形)、RN1053-HXT36-N367I菌株(正方形)和RN1053-HXT36-N367A菌株(三角形)中的摄取(以nmol/mg.DW.min计)。对于两种糖，将RN1053-空菌株的摄取水平从RN1053-HXT36、RN1053-HXT36-N367I和RN1053-HXT36-N367A菌株中减去。

图26：表达HXT36(A)、HXT36-N367I(B)和HXT36-N367A(C)的RN1053菌株在5gL^-1D-葡萄糖和5gL^-1D-木糖上的生长。测量残余D-葡萄糖(菱形)、D-木糖(正方形)和乙醇(圆)(以g/l计)。

图27：HXT11-N366X突变体的木糖特异性的表征。(A)菌株YD01227中HXT11-N366X突变体的最大指数生长速率(1/h)。葡萄糖(B)或木糖(C)上的RN1053中表达的N366X突变体的最大指数生长速率(1/h)。

图28：在2％麦芽糖上生长的表达HXT11N366X突变体的GFP融合蛋白的菌株RN1053的荧光图像。图片左上方中的字母示出在相应Hxt11变体的位置366处的氨基酸。

图29：(A)RN1053HXT11-N366M、(B)RN1053HXT11-N366T、(C)RN1001和(D)RN1053HXT11-N366N在补有木糖(40gL^-1)和葡萄糖(71,8gL^-1)的Verduyn-尿素上的发酵。符号：葡萄糖(◆)、木糖(■)、乙醇(▲)、细胞密度(●)。(A)、(B)、(C)和(D)为图29的图块。

序列表简述

SEQIDNO:1：引物5034-kanf

SEQIDNO:2：引物5035-kanr

SEQIDNO:3：引物5116-lf2

SEQIDNO:4：引物5118-lr2

SEQIDNO:5：引物5115-lf1

SEQIDNO:6：引物5117-lr1

SEQIDNO:7：pRN201；TOPO-BLUNT-loxP-kanMX-loxP

SEQIDNO:8：pRN251；TOPO-BLUNT-loxP-hphMX-loxP

SEQIDNO:9：pRN365；TOPO-BLUNT-loxP-natMX-loxP

SEQIDNO:10：引物115-natf

SEQIDNO:11：引物116-natr

SEQIDNO:12：pRN447；TOPO-BLUNT-loxP-zeoMX-loxP

SEQIDNO:13：引物28-H3f

SEQIDNO:14：引物29-H3r

SEQIDNO:15：pRN247(TOPO-BLUNT-HIS3:loxPkanMXloxP)

SEQIDNO:16：引物201-Hx2uf

SEQIDNO:17：引物202-Hx2ur

SEQIDNO:18：引物203-Hx2df

SEQIDNO:19：引物204-Hx2dr

SEQIDNO:20：引物205-Hx3uf

SEQIDNO:21：引物206-Hx3ur

SEQIDNO:22：引物210-Hx4df

SEQIDNO:23：引物211-Hx4dr

SEQIDNO:24：引物212-Hx5uf

SEQIDNO:25：引物213-Hx5ur

SEQIDNO:26：引物229-Hx7df

SEQIDNO:27：引物230-Hx7dr

SEQIDNO:28：引物243-Gal2ufn

SEQIDNO:29：引物244-Gal2urn

SEQIDNO:30：引物233-Ga2df

SEQIDNO:31：引物234-Ga2dr

SEQIDNO:32：pRN485；TOPO-BLUNT-GAL2:loxPzeoMXloxP

SEQIDNO:33：pRN566；TOPO-BLUNT-HXT367:loxP-hphMX-loxP

SEQIDNO:34：pRN569:TOPO-BLUNT-HXT514:loxP-natMX-loxP

SEQIDNO:35：pRN635；TOPO-BLUNT-HXT2:loxP-kanMX-loxP

SEQIDNO:36：引物281-Hx3inr2

SEQIDNO:37：引物323-Hx7inr1

SEQIDNO:38：引物Hx4inr2

SEQIDNO:39：引物Hx5inf

SEQIDNO:40：引物324-Ga2inf1

SEQIDNO:41：引物325-Ga2inr1SEQIDNO42：引物289-Hx2inf

SEQIDNO:43：引物290-Hx2inr

SEQIDNO:44：引物838-Glk1-psuc227f

SEQIDNO:45：引物834-Hxk2-psuc227f

SEQIDNO:46：引物645-pSUC227r

SEQIDNO:47：引物839-Glk1-psuc225r

SEQIDNO:48：引物835-Hxk2-psuc225r

SEQIDNO:49：引物646-pSUC225f

SEQIDNO:50：引物846-Hxk1_loxP_f

SEQIDNO:51：引物847-Hxk1_loxP_r

SEQIDNO:52：引物848-Gal1_loxP_f

SEQIDNO:53：引物849-Gal1_loxP_r

SEQIDNO:54：pRN774；TOPO-BLUNT-loxP-hphMX-loxP(相反取向的loxP位点)

SEQIDNO:55：pRN775；TOPO-BLUNT-loxP-natMX-loxP(相反取向的loxP位点)

SEQIDNO:56：WT-GAL2DNA序列SEQIDNO:57pRN993；XbaI位点(TCTAGA)和BssHII位点(GCGCGC)。

SEQIDNO:58：pDB1250；用于筛选的WT-GAL2表达载体；XbaI位点(TCTAGA)和BssHII位点(GCGCGC)。

SEQIDNO:59：WTGal2p氨基酸序列

SEQIDNO:60：pRN187(pSH65-衍生的CRE重组酶表达载体)

SEQIDNO:61：pRN486(TOPO-BLUNT-his3::loxP-natMX-loxP)

SEQIDNO:62：引物ActinF(实时PCR)

SEQIDNO:63：引物ActinR(实时PCR)

SEQIDNO:64：引物HXT1F(实时PCR)

SEQIDNO:65：引物HXT1R(实时PCR)

SEQIDNO:66：引物HXT2F(实时PCR)

SEQIDNO:67：引物HXT2R(实时PCR)

SEQIDNO:68：引物HXT3F(实时PCR)

SEQIDNO:69：引物HXT3R(实时PCR)

SEQIDNO:70：引物HXT4F(实时PCR)

SEQIDNO:71：引物HXT4R(实时PCR)

SEQIDNO:72：引物HXT5F(实时PCR)

SEQIDNO:73：引物HXT5R(实时PCR)

SEQIDNO:74：引物HXT7F(实时PCR)

SEQIDNO:75：引物HXT7R(实时PCR)

SEQIDNO:76：引物HXT8F((实时PCR)

SEQIDNO:77：引物HXT8R(实时PCR)

SEQIDNO:78：引物HXT9F(实时PCR)

SEQIDNO:79：引物HXT9R(实时PCR)

SEQIDNO:80：引物HXT10F(实时PCR)

SEQIDNO:81：引物HXT10R(实时PCR)

SEQIDNO:82：引物HXT11F(实时PCR)

SEQIDNO:83：引物HXT11R(实时PCR)

SEQIDNO:84：引物HXT12F(实时PCR)

SEQIDNO:85：引物HXT12R(实时PCR)

SEQIDNO:86：引物HXT13F(实时PCR)

SEQIDNO:87：引物HXT13R(实时PCR)

SEQIDNO:88：引物HXT14F(实时PCR)

SEQIDNO:89：引物HXT14R(实时PCR)

SEQIDNO:90：引物HXT15F(实时PCR)

SEQIDNO:91：引物HXT15R(实时PCR)

SEQIDNO:92：引物HXT16F(实时PCR)

SEQIDNO:93：引物HXT16R(实时PCR)

SEQIDNO:94：引物HXT17F(实时PCR)

SEQIDNO:95：引物HXT17R(实时PCR)

SEQIDNO:96：引物GAL2F(实时PCR)

SEQIDNO:97：引物GAL2R(实时PCR)

SEQIDNO:98：KOHXT11的引物KOP11*

SEQIDNO:99：KOHXT11的引物KOT11*

SEQIDNO:100：引物iHXT11F(反向HXT11)

SEQIDNO:101：引物iHXT11R(反向HXT11)

SEQIDNO:102：引物HXT11F(克隆)

SEQIDNO:103：引物HXT12F(克隆)

SEQIDNO:104：引物HXT11/12R(克隆)

SEQIDNO:105：引物HXT1Xbal(克隆)

SEQIDNO:106：引物RHXT1Cfr9i(克隆)

SEQIDNO:107：引物FHXT2Xbai(克隆)

SEQIDNO:108：引物RHXT2Cfr9i(克隆)

SEQIDNO:109：引物FHXT3Xbal(克隆)

SEQIDNO:110：引物RHXT6Cfr9i(克隆)

SEQIDNO:111：引物FHXT4Xbal(克隆)

SEQIDNO:112：引物RHXT4RNCfr9l(克隆)

SEQIDNO:113：引物FHXT5Xbal(克隆)

SEQIDNO:114：引物RHXT5Cfr9i(克隆)

SEQIDNO:115：引物FHXT7Xbal(克隆)

SEQIDNO:116：引物RHXT7Cfr9l(克隆)

SEQIDNO:117：质粒pRS313-P7T7

SEQIDNO:118：质粒pRS313-P7t7-HXT11+GFP

SEQIDNO:119：HXT11ORF酿酒酵母的DNA序列

SEQIDNO:120：HXT2ORF酿酒酵母的DNA序列

SEQIDNO:121：GAL2ORF酿酒酵母的DNA序列

SEQIDNO:122：HXT3-6ORF酿酒酵母的DNA序列

SEQIDNO:123：Hxt11p氨基酸序列酿酒酵母

SEQIDNO:124：Hxt2p氨基酸序列酿酒酵母

SEQIDNO:125:Gal2p氨基酸序列酿酒酵母

SEQIDNO:126：Hxt3-6氨基酸序列酿酒酵母

SEQIDNO:127：FHXT36Bcui

SEQIDNO:128：RHXT36367NNN

SEQIDNO:129：FHXT36367NNN

SEQIDNO:130：RHXT36BamHi

SEQIDNO:131：RHXT36BamHI-stop

SEQIDNO:132：FGFPBamHI

SEQIDNO:133：RGFPClaI

SEQIDNO:134：FHXT11XbaI

SEQIDNO:135：RHXT11BamHI

SEQIDNO:136：FHXT11366NNN

SEQIDNO:137：RHXT11366NNN

SEQIDNO:138：FHXT11N366F

SEQIDNO:139：RHXT11N366F

SEQIDNO:140：FHXT11N366E

SEQIDNO:141：RHXT11N366E

SEQIDNO:142：FHXT11N366K

SEQIDNO:143：RHXT11N366K

SEQIDNO:144：FHXT11N366M

SEQIDNO:145：RHXT11N366M

SEQIDNO:146：FHXT11N366W

SEQIDNO:147：RHXT11N366W

SEQIDNO:148：FHXT11N366Y

SEQIDNO:149：RHXT11N366Y

发明详述

在本说明书和所附权利要求书通篇中，词语“包含”和“包括”以及诸如“含有”的变型形式均以包含性的含义来解释。即，这些词语是为了表达在上下文允许时，可能包括没有具体指出的其它要素或整体。本文不使用数量词修饰时表示一个或多于一个(即一个或至少一个)的客体。以举例的方式，“要素”可指一个要素或多于一个要素。

本发明涉及一种鉴定来自酵母和真菌的通透酶多肽，优选己糖通透酶多肽，更优选己糖通透酶多肽，甚至更优选酿酒酵母Hxt或Gal2通透酶多肽中的氨基酸位置的方法，所述通透酶多肽可被突变以改变通透酶的糖特异性。

本发明涉及多肽，其在对应于SEQIDNO:59的位置339或376的位置处具有一个或更多个替换，其中所述多肽为主要易化蛋白超家族(MFS)的成员。在一个实施方案中，所述替换在对应于376的位置处，并且其中所述位置处的氨基酸被范德瓦尔斯体积为80至并且侧链疏水性为10至100Δt_R的氨基酸(T、C、V、M、L、I、F)置换。

在一个实施方案中，所述替换在对应于376的位置处，并且其中所述位置处的氨基酸被范德瓦尔斯体积为80至并且侧链疏水性为40至100Δt_R的氨基酸(C、V、M、L、I、F)置换。

在一个实施方案中，所述替换在对应于376的位置处，并且其中所述位置处的氨基酸被范德瓦尔斯体积为90至并且侧链疏水性为10至100Δt_R的氨基酸(T、V、M、L、I、F)置换。

在一个实施方案中，所述替换在对应于376的位置处，并且其中所述位置处的氨基酸被范德瓦尔斯体积为100至并且侧链疏水性为60至100Δt_R的氨基酸(V、M、L、I、F)置换。

在一个实施方案中，所述替换在对应于376的位置处，并且其中所述位置处的氨基酸被范德瓦尔斯体积为100至并且侧链疏水性为60至100Δt_R的氨基酸(V、M、L、I)置换。

在一个实施方案中，所述替换在对应于376的位置处，并且其中所述位置处的氨基酸被范德瓦尔斯体积为120至并且侧链疏水性为60至100Δt_R的氨基酸(M、L、I)置换。

在一个实施方案中，所述替换在对应于376的位置处，并且其中所述位置处的氨基酸被范德瓦尔斯体积为120至并且侧链疏水性为80至100Δt_R的氨基酸(L、I)置换。

在一个实施方案中，所述替换在对应于376的位置处，并且其中所述位置处的氨基酸被范德瓦尔斯体积为100至并且侧链疏水性为60至80Δt_R的氨基酸(V、M)置换。

在一个实施方案中，所述替换在对应于376的位置处，并且其中所述位置处的氨基酸被范德瓦尔斯体积为100至并且侧链疏水性为60至98Δt_R的氨基酸(V、M、L)置换。

在一个实施方案中，所述替换为N376T、N376C、N376V、N376M、N376L、N376I或N376F。

在一个实施方案中，多肽在对应于339的位置处具有替换，并且其中所述位置处的氨基酸被侧链疏水性为-30至10Δt_R的氨基酸(G、S、N、Q、H、K、R)置换。

在一个实施方案中，多肽在对应于339的位置处具有替换，并且其中所述位置处的氨基酸被侧链疏水性为-30至10Δt_R并且范德瓦尔斯体积为60至的氨基酸(S、N、Q、H、K、R)置换。

在一个实施方案中，多肽在对应于339的位置处具有替换，并且其中所述位置处的氨基酸被侧链疏水性为-30至10Δt_R并且范德瓦尔斯体积为80至的氨基酸(N、Q、H、K、R)置换。

在一个实施方案中，多肽在对应于339的位置处具有替换，并且其中所述位置处的氨基酸被侧链疏水性为-30至10Δ_tR并且范德瓦尔斯体积为100至的氨基酸(Q、H、K、R)置换。

在一个实施方案中，多肽在对应于339的位置处具有替换，并且其中所述位置处的氨基酸被侧链疏水性为-30至0Δt_R并且范德瓦尔斯体积为100至的氨基酸(Q、K、R)置换。

在一个实施方案中，多肽在对应于339的位置处具有替换，并且其中所述位置处的氨基酸被侧链疏水性为-30至0Δt_R并且范德瓦尔斯体积为120至的氨基酸(K、R)置换。

在一个实施方案中，多肽在对应于339的位置处具有替换，并且其中所述位置处的氨基酸被侧链疏水性为-30至10Δt_R并且范德瓦尔斯体积为80至的氨基酸(N、Q、H)置换。

在一个实施方案中，多肽在对应于339的位置处具有替换，并且其中所述位置处的氨基酸被侧链疏水性为-30至10Δt_R并且范德瓦尔斯体积为80至的氨基酸(N、Q)置换。

在一个实施方案中，所述替换为M339G、M339S、M339N、M339Q、M339H、M339K、M339R或M339V。

在一个实施方案中，所述多肽具有一个或更多个对应于339N/V和/或376I/M/V的氨基酸。

通透酶属于主要易化蛋白超家族(MFS)。在下文中对其进行定义。细胞转运系统允许摄取必需的营养物质和离子，并且排出代谢产物和有害物质。此外，转运系统在细胞与环境之间的通信中起作用。另外，它们是细胞系统产生或消耗能量供给分子例如ATP的必要部分。

初级主动转运蛋白对溶质的转运首先是能量驱动的，例如由ATP水解、光子吸收、电子流、底物脱羧或甲基转移提供的能量。如果带电分子由于初级细胞能源的消耗而被沿着一个方向泵送，则结果便是电化电势。所得化学渗透梯度于是可用于驱动另外的分子经由次级载体结构转运，所述次级载体结构恰好促进一个或更多个分子的跨膜转运。

在过去二十年间，基因组学策略的出现以及许多已进行的生物化学和分子遗传学研究的利用阐明了大量先前未知的初级和次级转运蛋白的蛋白家族。在所有活的生物中发现其蛋白质的两个主要转运蛋白家族属于ATP结合盒(ABC)超家族和主要易化蛋白超家族(MFS)，也被称为单转运体-同向转运体-反向转运体家族。ABC家族通透酶由多种组分组成并且为初级主动转运蛋白，其能够仅在通过ATP水解产生能量之后转运小分子和大分子二者，MFS转运蛋白由次级载体的单一多肽组成，其响应于化学渗透离子梯度而促进小的溶质的转运。ABC超家族和MFS蛋白占到微生物基因组内编码的溶质转运蛋白的几乎一半(由Pao等，1998,MicrobiolMolBiolRev.；62第1–34页，和Saier等，1999,JMolMicrobiolBiotechnol,1第257-279页所综述)。

合适的通透酶多肽序列可包含下列基序中的一个或更多个：

a)G-R-x(3)-G-x(3)-G-x(11)-E-x(5)-[LIVM]-R-G-x(12)-[GA]；

b)R-x(14)-G-x(2)-Y-x(2)-[YF]-[YF]-[GSAL]；

c)V-x(15)-[GNR]-[RH]-R-x(2)-[LM]-x(2)-[GA]。

基序(a)对应于Gal2中的残基179-221；基序(b)对应于Gal2中的残基330-353；基序(c)对应于Gal2中的残基375-399。

在一个实施方案中，所述多肽包含基序G-R-x(3)-G-x(3)-G-x(11)-E-x(5)-[LIVM]-R-G-x(12)-[GA]。

所述方法包括，在木糖或葡萄糖结合的大肠杆菌木糖通透酶XylE(在PDB数据库中分别为PDB代码4GBY和4GBZ，http://www.pdb.org)的公布晶体结构上对通透酶多肽序列进行建模，以鉴定通透酶通道中与结合糖直接相互作用的氨基酸位置(本领域中称为第一壳残基)，以及与第一壳残基相互作用的残基(本领域中称为第二壳残基)。构建此类模型的合适建模软件为YASARA,Prime(SchrodingerInc.)或MODELLER，采用默认设置。或者，通透酶多肽序列中改变糖特异性的第一和第二壳氨基酸位置可通过下述NEEDLE方案经由通透酶序列与Gal2序列SEQIDNO:59的全局配对比对来鉴定。对来自酿酒酵母的Gal2和Hxt’s的示例性比对在图10中给出，该图示出可如何使用比对来鉴定不同酵母Hxt’s中的对应氨基酸位置。本文中的氨基酸位置因此是指描述Gal2的SEQIDNO:59或其它多肽，特别是其它通透酶多肽中的对应氨基酸位置。例如，在Hxt1中，Gal2(SEQIDNO:59)中的位置N376的对应位置为N370、在Hxt2中为N361、在Hxt3中为N367、在Hxt4SC中为N376、在Hxt4RN中为N376、在Hxt5中为N391、在Hxt6/7中为N370、在Hxt8中为N372、在Hxt9中为N366、在Hxt10中为N354、在Hxt11中为N366、在Hxt12中为N256、在Hxt13中为N363、在Hxt14中为N387、在Hxt15中为N366、在Hxt16中为N366，以及在Hxt17中为N363。类似地，在Hxt1中，Gal2(SEQIDNO:9)中的N346的对应位置为D340、在Hxt2中为N331、在Hxt3中为D337、在Hxt4SC中为D346、在Hxt4RN中为D346、在Hxt5中为D361、在Hxt6/7中为D340、在Hxt8中为D342、在Hxt9中为D336、在Hxt10中为C324、在Hxt11中为D336、在Hxt12中为D226、在Hxt13中为E333、在Hxt14中为I357、在Hxt15中为E336、在Hxt16中为E336，以及在Hxt17中为E333。这可针对其它MFS超家族转运蛋白类似地进行，使得可获得这些多肽中对应于SEQIDNO:59中的位置的相应位置。这得到实施例6-20的数据支持。

本领域技术人员可随后使通透酶多肽中所鉴定的氨基酸位置突变为所有其它19种氨基酸，并且筛选突变通透酶的改善的C5糖摄取和/或降低的C6糖摄取，如实施例4和5中所述。

例如，对于在对应于SEQIDNO:59的N376的一个或更多个位置的位置处具有突变的多肽，对应于N376的位置处的突变可为用C、P、G、A、V、L、I、M、F、W、Y、H、S、T、N、Q、D、E、K、R，或缺失替换。X可为任何氨基酸，X(2)意指两个X。

在本文中，Gal2是高亲和力半乳糖激酶依赖性和低亲和力半乳糖激酶非依赖性半乳糖转运过程所需的易化扩散转运蛋白(facilitateddiffusiontransporter)。其属于主要易化蛋白超家族糖转运蛋白(TC2.A.1.1)家族。“通透酶多肽”在本文中也称作“多肽通透酶”或“多肽”。“通透酶多肽多核苷酸”在本文中为编码通透酶多肽的多核苷酸。

在本发明的一个实施方案中，通透酶多肽与SEQIDN0:59具有至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。

本文中，通过单字母氨基酸和这些氨基酸的位置来指示突变。例如，本文中的A6表示SEQIDNO:59中特定位置上的氨基酸(单字母代码)，此处为蛋白质6位上为A(丙氨酸)。A6(L/N/Q/G/V/I/Y/S/E/K)在本文中指示特定位置上的氨基酸突变，此处为蛋白质6位上的A(丙氨酸)被更换为下列中的任何：L(亮氨酸)、N(天冬酰胺)、Q(谷氨酰胺)、G(甘氨酸)、V(缬氨酸)、I(异亮氨酸)、Y(酪氨酸)、S(丝氨酸)、E(谷氨酸)或K(赖氨酸)。

在一个实施方案中，所述多肽具有木糖转运活性。

在一个实施方案中，所述多肽与SEQIDNO:59的多肽相比具有降低的葡萄糖亲和力。

本发明的通透酶多肽除了糖通透酶活性之外还可具有一种或多种替代的和/或额外的活性。

如上文所陈述的，本发明的通透酶多肽将通常具有糖通透酶活性。然而，除了所述活性以外或作为所述活性的替代，本发明的通透酶多肽可具有一种或多种上文所陈述的活性。

多核苷酸序列

使用本文公开的通透酶多肽及其氨基酸序列，技术人员可以确定编码所述通透酶多肽的合适的多核苷酸。

在一个实施方案中，所述多核苷酸为与SEQIDNO:56具有至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的变体多核苷酸，并且编码权利要求1至11中所述的多肽。

本发明因此提供了包含编码通透酶多肽的基因及其编码序列的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是经分离的或合成的。本文中的通透酶多肽和通透酶多肽多核苷酸可以分别是合成的多肽或合成的多核苷酸。合成的多核苷酸可以在密码子使用方面被优化，优选地根据WO2006/077258和/或PCT/EP2007/055943中描述的方法进行，所述参考文献通过引用并入本文。PCT/EP2007/055943致力于密码子对优化。

所述术语是指多核苷酸分子，其为核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)分子，单链或双链。多核苷酸可以经分离的形式存在，或者包含在重组的核酸分子或载体中，或包含在宿主细胞中。

术语“多肽”在本文中用于含有多于七个氨基酸残基的链。本文中的所有寡肽和多肽式以从左到右且从氨基端到羧基端的方向书写。本文中使用的氨基酸的单字母代码是本领域公知的。

“经分离的”多肽或蛋白质意指从其天然环境中取出的多肽或蛋白质，例如，就本发明的目的而言，在宿主细胞中表达的重组生产的多肽和蛋白质被认为是经分离的，就如同通过任何合适的技术被基本上纯化的天然或重组的多肽一样，所述合适的技术例如为SmithandJohnson,Gene67:31-40(1988)中公开的单步骤纯化方法。

可以使用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息合成或分离本发明的多核苷酸，例如编码通透酶多肽的多核苷酸。

可以使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板和适当的寡核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术，扩增编码本发明的通透酶多肽的多核苷酸。藉此扩增的核酸可以被克隆进适当的载体中，并通过DNA序列分析来表征。

转化

根据本发明的多核苷酸可在合适的宿主中表达。本发明因此涉及经转化的宿主细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞可用核酸构建体转化，所述核酸构建体包含前文定义的编码根据本发明的多肽的多核苷酸。因此可使用标准转化技术。

在一个实施方案中，所述经转化的宿主细胞包含异源核苷酸，所述异源核苷酸编码根据权利要1所述的多肽或编码序列IDNO:59的具有替换F85Q/V、T89V、V187A/F、I218S、T219A、Q341S/A、N346V、T380A、F444L/V、T448A、T449F、T451G或W455M的多肽，并且在其一个实施方案中，宿主细胞为酿酒酵母。

在一个实施方案中，所述经转化的宿主被编码多肽的多核苷酸转化，所述多肽为天然存在于未转化的宿主细胞中的多肽的突变体。

在一个实施方案中，天然存在于未转化的宿主细胞中的多肽为主要易化蛋白超家族(MFS)转运蛋白的成员，在一个实施方案中，其为己糖转运蛋白多肽。

在一个实施方案中，天然存在于未转化的宿主细胞中的多肽为选自以下的转运蛋白多肽：Gal2、Hxt1、Hxt2、Hxt3、Hxt4、Hxt5、Hxt6、Hxt7、Hxt8、Hxt9、Hxt10、Hxt11、Hxt12、Hxt13、Hxt14、Hxt15、Hxt16和Hxt17。

在一个实施方案中，当X天然存在于第二MFS家族多肽中与A对应的位置处时，本发明的多肽在给定位置A(A可为SEQIDNO:59的多肽中的任何特定位置)处不具有氨基酸残基X(X可为任何氨基酸)，其中X为SEQIDNO:59中的突变。

在一个实施方案中，所述多肽在在以下的对应位置处不具有与SEQIDNO:59中的M339S对应的氨基酸残基S：HXT1(即，在HXT1中不具有333S)、HXT2(即，在HXT2中不具有324S)、HXT3(即，在HXT3中不具有330S)、HXT4(即，在HXT4中不具有339S)、HXT5(即，在HXT5中不具有354S)、HXT6或HXT7(即，在HXT6或HXT7中不具有333S)、HXT8(即，在HXT8中不具有335S)、HXT9(即，在HXT9中不具有329S)、HXT10(即，在HXT10中不具有317S)或HXT11(即，在HXT11中不具有329S)。

在一个实施方案中，所述多肽为突变HXT3-6并且在HXT3-6中具有一个或更多个替换，在其一个实施方案中，所述多肽具有对应于SEQIDNO:126的N367A/C/D/F/G/I/L/M/S/T/V的替换。在一个实施方案中，所述多肽具有对应于SEQIDNO:126的N367A/I的替换。在一个实施方案中，所述多肽具有对应于SEQIDNO:126的N367A的替换。

在一个实施方案中，所述多肽为突变HXT11在HXT11中具有一个或更多个替换，在其一个实施方案中，所述多肽具有对应于SEQIDNO:123的N366A/C/D/F/G/I/L/M/S/T/V的替换。在一个实施方案中，所述多肽为突变HXT11。在一个实施方案中，所述多肽具有对应于SEQIDNO:123的N366/F/I/L/M/T/V的替换。在一个实施方案中，所述多肽具有对应于SEQIDNO:123的N366D/M/T的替换。在一个实施方案中，所述多肽具有对应于SEQIDNO:123的N366M/T的替换。在一个实施方案中，所述多肽具有对应于SEQIDNO:123的N366M/T或N366T的替换。

共同消耗(Co-consumption)

在一个实施方案中，所述经转化的宿主能够共同消耗葡萄糖和至少一种戊糖。此戊糖可为阿拉伯糖或木糖，在一个实施方案中，其为木糖。两种底物的共同消耗(或共同发酵)在本文中被定义为两种不同的碳源(例如，木糖和葡萄糖)以可评估的水平进行同时摄取和细胞内转化。所述碳源同时转化成诸如生物质、乙醇、甘油等的产物。

细胞的共同消耗在本文中被定量和表示为共同消耗指数。共同消耗指数在本文中为葡萄糖和木糖的共同消耗指数并且计算为葡萄糖摄取速率(Qg)和木糖摄取速率(Qx)(以每个时间单位消耗的糖的克数表示)的绝对差异历经0-24小时的时间间隔(在0、8、12、14、16、18、20、22和24小时测量)的总和，其中以1.0g/l干酵母投放进行厌氧分批培养发酵，温度为30℃，并且其中发酵培养基在发酵开始时包含71.8克葡萄糖/升和40.0克木糖/升。参见实施例16-18。

在一个实施方案中，经转化的宿主细胞的共同消耗指数为27g/h或更小、25g/h或更小、23g/h或更小、20g/h或更小、18g/h或更小、16g/h或更小、14g/h或更小或12g/h或更小。

本发明还涉及包含如上文所述的多核苷酸的核酸构建体，例如载体。

因此，本发明的另一方面涉及载体，包括克隆和表达载体，其包含编码通透酶多肽蛋白质或其功能等同物的本发明的多核苷酸，和例如在本发明的通透酶发生表达的条件下培养合适的宿主细胞、在合适的宿主细胞中转化或转染此类载体的方法。在本文中使用时，术语“载体”是指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。

本发明的多核苷酸可以被并入重组复制载体，例如克隆或表达载体中。载体可被用于在相容的宿主细胞中复制核酸。因此在另一个实施方式中，本发明提供了如下制造本发明多核苷酸的方法：将本发明的多核苷酸引入可复制载体中，将所述载体引入相容的宿主细胞中，并在导致载体复制的条件下培养所述宿主细胞。可从宿主细胞中回收载体。合适的宿主细胞如下文所述。

本领域技术人员应当明白，表达载体的设计可取决于此类因素：要转化的宿主细胞的选择、想要的蛋白质表达水平等等。本发明的载体(例如表达载体)可以被引入宿主细胞中，从而生产由本文所述的核酸编码的蛋白质或肽。本发明的载体(例如重组表达载体)可以被设计为在原核细胞或真核细胞中表达通透酶多肽蛋白质。

例如，通透酶多肽可以在以下中表达：细菌细胞例如大肠杆菌、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、丝状真菌、酵母细胞或哺乳动物细胞。合适的宿主细胞在Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中更进一步讨论。适当的宿主的代表性例子在下文描述。

针对上述宿主细胞的适当的培养基和条件是本领域已知的。

对大部分丝状真菌和酵母而言，载体或表达构建体优选地被整合进宿主细胞的基因组中，从而获得稳定的转化体。然而，对某些酵母而言还可获得合适的附加体载体，可以向其中并入表达构建体进行稳定和高水平的表达，其例子包括分别衍生自Saccharomyces和Kluyveromyces的2μ和pKD1质粒的载体，或含有AMA序列(例如来自Aspergillus的AMA1)的载体。将表达构建体整合进宿主细胞基因组中的情况下，所述构建体被整合进基因组中随机基因座处，或者使用同源重组整合进预定的目标基因座处，在这种情况下目标基因座优选地包含高度表达的基因。

因此，可用于本发明的表达载体包括来自染色体、附加体和病毒的载体，例如来自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒(如杆状病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反转录病毒)的载体和来自其组合的载体，如来自质粒和噬菌体遗传元件的载体(如粘粒和噬菌粒)。

当根据本发明的多肽要从宿主细胞中被分泌进培养基时，可以对多肽添加适当的信号序列，从而将重新合成的多肽导向宿主细胞的分泌途径。本领域技术人员知晓如何针对特定的宿主选择适当的信号序列。

载体可还包括产生RNA的多核苷酸侧翼的序列，所述侧翼的序列包含与真核基因组序列或病毒基因组序列同源的序列。这会允许将本发明的多核苷酸引入宿主细胞的基因组中。

整合型克隆载体可在整合了它的宿主细胞染色体中随机整合或在预定的靶基因座处整合。

载体系统可以是单个载体例如单个质粒，或两个或更多个载体，例如两个或更多个质粒，它们一起含有要被引入宿主细胞基因组中的总DNA。

载体可以反义方向含有本发明的多核苷酸，以提供反义RNA的生产。

可以通过常规的转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。本文使用的术语“转化”和“转染”旨在表示用于向宿主细胞中引入外源核酸(例如DNA)的多种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、转导、感染、脂质转染、阳离子脂质介导的转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook,等.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)，Davis等,BasicMethodsinMolecularBiology(1986)和其它实验室手册中。

如上文所述，本发明提供了具有根据SEQIDNO:59的氨基酸序列、并具有权利要求1中所示突变的经分离的多肽。

可以通过本领域已知的方法，将根据本发明的通透酶多肽从重组细胞培养物中回收和纯化。最优选地，使用高效液相色谱(“HPLC”)进行纯化。

本发明的多肽包括天然纯化的产物、化学合成步骤的产物，和通过重组技术从原核或真核宿主生产的产物，所述宿主包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。取决于重组生产步骤中使用的宿主，可以将本发明的多肽糖基化或不糖基化。另外，本发明的多肽也可以包含最初被修饰的甲硫氨酸残基(在一些情况下由宿主介导的过程产生)。

本发明还包括根据本发明的多肽的生物活性片段。

本发明还提供了包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。所述多核苷酸对宿主细胞的基因组可以是异源的。通常涉及宿主细胞的术语“异源的”表示多核苷酸不天然存在于宿主细胞的基因组中，或者多肽不由所述细胞天然地生产。

在另一实施方案中，本发明包括细胞，例如含有本发明所包括的核酸的经转化的宿主细胞或重组的宿主细胞。“经转化的细胞”或“重组细胞”是其中(或其祖先中)已经借助于重组DNA技术引入了本发明核酸的细胞。原核和真核细胞均包括在内，例如细菌、真菌、酵母等等，特别优选的是酵母细胞，包括例如Saccharomyces，例如Saccharomycescerevisiae。

可选择下述宿主细胞，其调控被插入的序列的表达，并以特异的、期望的方式加工基因产物。蛋白质产物的这类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)可促进蛋白质发挥最佳功能。

多种宿主细胞具有用于翻译后加工和修饰蛋白质和基因产物的特性和特异机制。可选择分子生物学和/或微生物学领域技术人员熟悉的适当细胞系或宿主系统，以确保对所表达的外源蛋白质的想要的和正确的修饰与加工。为此，可以使用具有下述细胞机制的真核宿主细胞，所述细胞机制用于基因产物的原始转录本、糖基化和磷酸化的正确加工。这类宿主细胞是本领域公知的。

如果期望，可以在根据本发明的多肽的制备中使用上述细胞。这样的方法典型地包含在提供编码多肽的编码序列(通过载体)表达的条件下培养(例如用上述表达载体转化或转染的)宿主细胞，并任选地回收被表达的多肽。可以将本发明的多核苷酸并入重组可复制载体例如表达载体中。可以使用载体在相容的宿主细胞中复制核酸。因此在又一个实施方案中，本发明提供了如下制造本发明多核苷酸的方法：将本发明的多核苷酸引入可复制载体中，将所述载体引入相容的宿主细胞中，并在使得所述载体复制的条件下培养所述宿主细胞。可以从所述宿主细胞中回收载体。

可如上文所述将载体转化或转染进合适的宿主细胞中，以提供本发明多肽的表达。该方法可包括在提供编码多肽的编码序列的载体表达的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞用如上所述的表达载体转化。

在本文中使用标准的分离、杂交、转化和克隆技术(例如如Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,和Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.第二版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中所述)。

同源性和同一性

当氨基酸序列或核苷酸序列展示某些相似性水平时，其被称为是同源的。两个序列同源表示共同的进化来源。两个同源序列是密切相关还是更远相关，这由“百分比同一性”或“百分比相似性”(分别为高或低)来表示。虽然是有争论的，但为了表示“百分比同一性”或“百分比相似性”，“同源性水平”或“百分比同源性”通常互换使用。

可以使用数学算法完成两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定。技术人员应当明白下述事实：可获得若干种不同的计算机程序来比对两条序列并测定两条序列之间的同源性(Kruskal,J.B.(1983)AnoverviewofsequencecomparisonInD.SankoffandJ.B.Kruskal,(ed.),Timewarps,stringeditsandmacromolecules:thetheoryandpracticeofsequencecomparison,pp.1-44AddisonWesley)。可使用用于比对两条序列的Needleman和Wunsch算法测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性(Needleman,S.B.andWunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。所述算法比对氨基酸序列以及核苷酸序列。Needleman-Wunsch算法已在计算机程序NEEDLE中实施。就本发明目的而言，使用了来自EMBOSS包的NEEDLE程序(版本2.8.0或更高，EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite(2000)Rice,P.Longden,I.andBleasby,A.TrendsinGenetics16,(6)pp276—277,http://emboss.bioinformatics.nl/)。对蛋白质序列而言，使用EBLOSUM62用于替换矩阵。就核苷酸序列而言，使用EDNAFULL。可指定其他矩阵。用于比对氨基酸序列的任选的参数是缺口开放惩罚为10和缺口延伸惩罚为0.5。技术人员会意识到所有这些不同的参数会产生些微不同的结果，但是当使用不同的算法时两条序列的总百分比同一性不显著改变。

总体同源性定义

同源性或同一性是在包括任何缺口或延伸的总比对区域上的两条全序列之间的相同匹配的百分比。两条比对序列之间的同源性或同一性如下计算：在两条序列中都显示相同氨基酸的比对中的对应位置的数目除以包括缺口在内的比对的总长度。本文中定义的同一性可从NEEDLE中获得并在程序输出中被标记为“同一”(“IDENTITY”)。

最长同一性定义

两条比对序列之间的同源性或同一性如下计算：在两条序列中都显示相同氨基酸的比对中的对应位置的数目除以减去比对中的总缺口数目后的比对的总长度。本文定义的同一性可通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE中获得，并在程序输出中被标记为“最长同一性”(“longest-identity”)。

本文所述的本发明的多个实施方式可以交叉组合。

糖组合物

根据本发明的糖组合物包括葡萄糖、阿拉伯糖和木糖。满足这些标准的任何糖组合物可在本发明中使用。糖组合物中的任选的糖是半乳糖和甘露糖。在一个优选的实施方式中，糖组合物是一种或多种木质纤维素材料的水解产物。木质纤维素在本文中包括半纤维素和生物质的半纤维素部分。木质纤维素还包括生物质的木质纤维素级分。合适的木质纤维素材料可见以下列表：底料，树丛，磨坊废弃物，城市木材废弃物，市政废弃物，伐木废弃物，森林疏伐废弃物，短期轮种木本作物，工业废弃物，小麦秸，燕麦秸，水稻秸，大麦秸，黑麦秸，亚麻秸，大豆壳，稻壳，水稻秸，玉米谷蛋白饲料，燕麦壳，甘蔗，玉米秸秆，玉米杆，玉米芯，玉米壳，柳枝稷，芒草，高粱，芸苔茎，大豆茎，牧场草，磨擦禾，狐尾草；甜菜浆，柑橘果实浆，种子壳，纤维素动物粪便，草坪修剪废弃物，棉花，海藻，树木，软木材，硬木材，白杨，松树，灌木丛，草，小麦，小麦秸，甘蔗渣，玉米，玉米壳，玉米棒，玉米粒，来自玉米粒的纤维，来自谷物湿磨或干磨的产物和副产物，市政固体废弃物，废纸，庭院废弃物，草本材料，农业残余物，林业残余物，市政固体废弃物，废纸，纸浆，造纸厂残余物，树枝，灌木，甘蔗，玉米，玉米壳，能源作物，森林，水果，鲜花，谷物，草，草本作物，树叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，藤蔓，甜菜浆，小麦麸皮，燕麦壳，硬木材或软木材，由农业加工产生的有机废弃物材料，林业木材废弃物，或其中任意两种或更多的组合。

表1中给出了源自木质纤维素的一些合适的糖组合物和它们的水解产物的糖组合物的概述。列出的木质纤维素包括：玉米芯、玉米纤维、稻壳、瓜壳、甜菜浆、小麦秸、甘蔗渣、木料、草和橄榄压榨物(olivepressings)。

表1：来自木质纤维素材料的糖组合物的概述。Gal＝半乳糖、Xyl＝木糖、Ara＝阿拉伯糖、Man＝甘露糖、Glu＝葡萄糖、Rham＝鼠李糖。给出了半乳糖百分比(％Gal)和文献来源。

表1表明在这些木质纤维素中，大量糖以葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖的形式存在。因此将葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖转化成为发酵产物具有巨大的经济重要性。一些木质纤维素材料中还存在甘露糖，但数量通常低于先前提到的糖。因此，有利的是甘露糖也被经转化的宿主细胞转化。

经转化的宿主细胞

在一个实施方式中，经转化的宿主细胞可包含一个或多个拷贝的木糖异构酶基因和/或一个或多个拷贝的木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶，和二到十个拷贝的araA、araB和araD基因，其中这些基因被整合进细胞基因组中。

在一个实施方式中，经转化的宿主细胞包含基因，例如上述木糖异构酶基因和/或一个或多个拷贝的木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶，和二到十个拷贝的araA、araB和araD基因被整合进经转化的细胞基因组中。

拷贝数可由技术人员通过任何已知的方法确定。在实施例中描述了合适的方法。

在一个实施方式中，经转化的宿主细胞能够发酵葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖。

在一个实施方式中，细胞能够将90％或更多的能用的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖转化成发酵产物。在一个实施方式中，细胞能够将91％或更多、92％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或100％的所有能用的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖转化成发酵产物。

在本发明的一个实施方式中，经转化的宿主细胞能够发酵一种或多种其他糖，优选地C5和/或C6糖，例如甘露糖。在本发明的一个实施方案中，经转化的宿主细胞包含以下之一种或多种：xylA-基因，XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1-基因，以允许经转化的宿主细胞发酵木糖；醛糖还原酶(GRE3)基因的缺失；PPP-基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1的过表达，以允许提高细胞中通过戊糖磷酸途径的通量。

在一个实施方式中，经转化的宿主细胞是工业细胞，更优选地是工业酵母。工业细胞和工业酵母细胞可如下定义。工业方法中(酵母)细胞的生存环境与实验室中显著不同。工业酵母细胞必须能够在所述方法期间可能变化的多种环境条件下表现良好。此类改变包括养分来源、pH、乙醇浓度、温度、氧浓度等等的改变，它们一起对酿酒酵母的细胞生长和乙醇生产具有潜在的影响。在不利的工业条件下，环境耐受菌株会允许强健的生长和生产。对使用工业酵母菌株的应用(例如烘焙工业、酿造工业、造酒和乙醇工业)中可能发生的环境条件中的这些改变而言，工业酵母菌株通常更加强健。在一个实施方式中，以工业宿主细胞为基础构建工业的经转化的宿主细胞，其中所述构建如下文所述进行。工业酵母(酿酒酵母)的例子是Ethanol(Fermentis)、(DSM)和(Lallemand)。

在一个实施方式中，经转化的宿主细胞是抑制剂耐受的。抑制剂耐受是对抑制性化合物的抗性。木质纤维素中抑制性化合物的存在和水平可随着原料、预处理方法、水解过程的变化而广泛变化。抑制剂范畴的例子是羧酸、呋喃和/或酚类化合物。羧酸的例子是乳酸、乙酸或甲酸。呋喃的例子是糠醛和羟基-甲基糠醛。酚类化合物的例子是香草醛(vannilin)、丁香酸、阿魏酸和香豆酸。对于羧酸而言，抑制剂的典型用量是每升若干克到每升20克或更多，取决于原料、预处理和水解条件。对呋喃而言是每升数百毫克到每升数克，取决于原料、预处理和水解条件。

对酚类而言是每升数十毫克到每升一克，取决于原料、预处理和水解条件。

根据本发明的经转化的宿主细胞可以是抑制剂耐受的，即它们能经得起下述水平的常见抑制剂，所述水平是使用常见的预处理和水解条件时它们典型地具有的水平，从而使得经转化的宿主细胞能够具有广泛的应用，即其具有针对不同原料、不同预处理方法和不同水解条件的高度可应用性。

在一个实施方式中，以抑制剂耐性宿主细胞为基础构建工业经转化的宿主细胞，其中如下文所述进行所述构建。可以针对在含有抑制剂的材料上的生长，通过筛选菌株来选择抑制剂耐性的宿主细胞，如Kadar等,Appl.Biochem.Biotechnol.(2007),Vol.136-140,847-858中所述，其中选择了抑制剂耐受性S.cerevisiae菌株ATCC26602。

在一个实施方式中，经转化的宿主细胞是无标记物的。在本文中使用时，术语“标记物”是指编码性状或表型的基因，所述性状或表型允许选择或筛选含有所述标记物的宿主细胞。无标记物表示经转化的宿主细胞中基本不存在标记物。在经转化的宿主细胞的构建中使用、并在之后去除抗生素标记物时，无标记物是尤其有利的。可以使用任何合适的现有技术(例如分子内重组)进行标记物的去除。标记物去除的合适方法在实施例中阐述。

经转化的宿主细胞可以能够将植物生物质、纤维素、半纤维素酶、果胶、淀粉、淀粉衍生物例如转化成可发酵的糖。因此，经转化的宿主细胞可表达一种或多种酶，例如将纤维素转化成葡萄糖单体或将半纤维素转化成木糖和阿拉伯糖单体所需要的纤维素酶(内切纤维素酶或外切纤维素酶)、半纤维素酶(内切木聚糖酶或外切木聚糖酶或阿拉伯糖酶)，能够将果胶转化成葡糖醛酸和半乳糖醛酸的果胶酶，或将淀粉转化成葡萄糖单体的淀粉酶。

经转化的宿主细胞还可包含将丙酮酸转化成想要的发酵产物例如乙醇、丁醇、乳酸、二萜、糖基化二萜、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸、衣康酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素或头孢菌素所需的这些酶活性。

在一个实施方式中，经转化的宿主细胞是天然能够进行醇发酵、优选地能够进行厌氧醇发酵的细胞。经转化的宿主细胞优选地具有对乙醇的高度耐受，对低pH的高度耐受(即能够在低于约5、约4、约3、或约2.5的pH下生长)和对有机酸的高度耐受，和/或对提高的温度的高度耐受。

经转化的宿主细胞的任何上述特征或活性可天然存在于细胞中，或可通过遗传修饰被引入或修饰。

经转化的宿主细胞的构建

根据一个实施方式，可以通过向宿主细胞中引入：

a)处于强组成型启动子控制下的基因araA、araB和araD构成的簇，

b)由PPP-基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1构成的簇，其可选地处于强组成型启动子的控制下；和醛糖还原酶基因的缺失；

c)由处于强组成型启动子控制下的xylA-基因和XKS1-基因构成的簇，

d)包含处于强组成型启动子控制下的xylA-基因的构建体，所述构建体能够在多个基因座上整合进基因组，

并进行适应进化(adaptiveevolution)以生产经转化的宿主细胞。上述细胞可以使用重组表达技术构建。

重组表达

经转化的宿主细胞是重组细胞。也就是说，经转化的宿主细胞包含下述核苷酸序列，或用下述核苷酸序列转化，或用下述核苷酸序列遗传修饰，所述核苷酸序列并不天然地存在于所考虑的细胞中。

用于在细胞中重组表达酶以及用于对本发明的细胞进行其他遗传修饰的技术是本领域技术人员公知的。典型地，此类技术涉及用包含相关序列的核酸构建体转化细胞。此类方法可例如从标准手册中获知，例如Sambrook和Russel(2001)"MolecularCloning:ALaboratoryManual(第三版),ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress或F.Ausubeletal.,编,"Currentprotocolsinmolecularbiology",GreenPublishingandWileyInterscience,NewYork(1987)。用于对真菌宿主细胞进行转化和遗传修饰的方法可从例如EP-A-0635574、WO98/46772、WO99/60102、WO00/37671、WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US6,265,186中获知。

典型地，核酸构建体可以是质粒，例如低拷贝质粒或高拷贝质粒。根据本发明的细胞可例如通过多个拷贝的核苷酸构建体，或通过使用具有多个拷贝酶序列的构建体，而包含单个或多个拷贝的编码酶的核苷酸序列。

核酸构建体可保持为附加体并因此包含用于自主复制的序列，例如常染色体复制序列。合适的附加体核酸构建体可例如基于酵母2μ或pKD1质粒(Gleeretal.,1991,Biotechnology9:968-975)或AMA质粒(Fierroetal.,1995,CurrGenet.29:482-489)。或者，每种核酸构建体可作为单个拷贝或多个拷贝被整合进细胞的基因组中。进入细胞基因组的整合可通过非同源重组随机地发生，但是优选地，核酸构建体可如本领域所公知的通过同源重组被整合进细胞的基因组中(见例如WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US6,265,186)。

大部分附加体或2μ质粒在酵母中是相对不稳定的，在每一代后在约10^-2或更多细胞中丢失。即使在选择性生长的条件下，只有60％到95％的细胞保留附加体质粒。对cir⁺宿主而言，大部分附加体质粒的拷贝数范围在每个细胞20-100个之间。然而，质粒在细胞之间并非均等分布的，种群中每个细胞中的拷贝数存在高度方差。用整合型质粒转化的菌株是极度稳定的，即使在不存在选择性压力时也是如此。然而，质粒丢失可通过串联重复DNA之间的同源重组而以约10^-3到10^-4的频率发生，导致载体序列的成环丢失(loopingout)。因此，优选地，在稳定整合情况下的载体设计是，通过选择标记物基因的丢失(也通过分子内、同源重组发生)，被整合的构建体的成环丢失不再可能。优选地，基因以这种方式被稳定整合。稳定整合在本文中被定义为整合进基因组中，其中被整合的构建体的成环丢失不再可能。优选地不存在选择标记物。典型地，酶编码序列应与一个或多个能够提供或帮助酶序列转录和/或翻译的核酸序列可操作地连接。

术语“可操作地连接”是指下述并置(juxtaposition)，其中所述组分处于允许它们以期望的方式发挥作用的关系中。例如，启动子或增强子与编码序列可操作地连接，所述启动子或增强子影响所述编码序列的转录。

在本文中使用时，术语“启动子”是指下述核酸片段，其发挥控制一个或多个基因转录的功能，相对于基因转录起点的转录方向而言位于上游，并且在结构上通过DNA-依赖性RNA聚合酶、转录起点和本领域技术人员已知的任何其它DNA序列的存在来识别。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境调节或发育调节下有活性的启动子。

能够用于实现编码本发明酶的核苷酸序列表达的启动子对编码要表达的酶的核苷酸序列而言可以不是天然的，即对与之可操作地连接的核苷酸序列(编码序列)而言异源的启动子。然而，启动子对宿主细胞而言可以是同源的，即内源的。

启动子是可广泛获得的，并是技术人员已知的。这类启动子的合适例子包括例如来自糖酵解基因的启动子，如来自酵母或丝状真菌的果糖磷酸激酶(PFK)、丙糖磷酸异构酶(TPI)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD、TDH3或GAPDH)、丙酮酸激酶(PYK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子；关于这类启动子的更多细节可在(WO93/03159)中找到。其它有用的启动子是编码核糖体蛋白的基因的启动子，乳糖酶基因启动子(LAC4)、醇脱氢酶启动子(ADHl、ADH4等等)和烯醇化酶启动子(ENO)。其它(组成型以及诱导型)启动子和增强子或上游活化序列应当是本领域技术人员已知的。本发明宿主细胞中使用的启动子可以在需要时被修饰，来影响它们的控制特征。本文上下文中合适的启动子包括组成型和诱导型两种天然启动子以及经改造的启动子，这是本领域技术人员公知的。真核宿主细胞中合适的启动子可以是GAL7、GAL10或GAL1、CYC1、HIS3、ADH1、PGL、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO1、TPI1和AOX1。其它合适的启动子包括PDC1、GPD1、PGK1、TEF1和TDH3。

在经转化的细胞中，编码酶的核苷酸序列的3’-端优选地与转录终止子序列可操作地连接。优选地，终止子序列在选择的宿主细胞、如例如选择的酵母物种中是可操作的。在任何情况下终止子的选择不是关键性的；其可以例如来自于任何酵母基因，尽管如果来自于非酵母、真核基因时终止子有时可能发挥功能。通常，编码酶的核苷酸序列包含终止子。优选地，这类终止子与预防经转化的宿主细胞中无义介导的mRNA衰变的突变组合(参阅例如：Shirleyetal.,2002,Genetics161:1465-1482)。

转录终止序列还优选地包含多聚腺苷酸化信号。

任选地，适用于本发明的核酸构建体中可存在可选择标记物。在本文中使用时，术语“标记物”是指编码性状或表型的基因，所述性状或表型允许选择或筛选含有所述标记物的宿主细胞。标记物基因可以是抗生素抗性基因，从而可使用适当的抗生素从未经转化的细胞中选择经转化的细胞。合适的抗生素抗性标记物包括例如二氢叶酸还原酶、潮霉素B磷酸转移酶、3'-O-磷酸转移酶II(卡那霉素、新霉素和G418抗性)。对于多倍体宿主细胞的转化而言抗生素抗性标记物可以是最为便利的。也可以使用非抗生素抗性标记物，如营养缺陷型标记物(URA3、TRPl、LEU2)或S.pombeTPI基因(由RussellPR,1985,Gene40:125-130描述)。在一个优选的实施方式中，用核酸构建体转化的宿主细胞是无标记物基因的。用于构建重组的无标记物基因的微生物宿主细胞的方法公开于EP-A-O635574中，并且基于双向标记物如A.nidulansamdS(乙酰胺酶)基因或酵母URA3和LYS2基因的使用。或者，可以将可筛选的标记物如绿色荧光蛋白、lacL、萤光素酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡萄糖苷酸酶并入本发明的核酸构建体中，允许筛选经转化的细胞。

可存在于适用于本发明的核酸构建体中任选的其它元件包括但不限于，一条或多条前导序列、增强子、整合因子、和/或报告基因、内含子序列、着丝点抗体(centromer)、调聚物和/或基质附着(MAR)序列。本发明的核酸构建体可还包含用于自主复制的序列，如ARS序列。

因此，重组方法可使用已知的重组技术进行。本领域技术人员已知用于在经转化的宿主细胞中表达和过表达酶的多种手段。具体地，可以通过提高宿主细胞中编码酶的基因的拷贝数(例如通过在宿主细胞的基因组中整合额外的基因拷贝，通过表达来自附加体多拷贝表达载体的基因，或通过引入包含多拷贝基因的附加体表达载体)来过表达酶。

或者，可以通过使用对编码要过表达的酶的序列而言不是天然的启动子(即对与之可操作地连接的编码序列而言为异源的启动子)来实现酶在本发明宿主细胞中的过表达。尽管启动子优选地对与之可操作地连接的编码序列而言是异源的，但是还优选启动子是同源的，即对宿主细胞而言是内源的。优选地，与对编码序列而言天然的启动子相比，异源启动子能够生产更高稳态水平的包含所述编码序列的转录本(或者每单位时间能够生产更多转录本分子，即mRNA分子)。在本文上下文中，合适的启动子包括组成型和诱导型启动子二者，以及经改造的启动子。

在一个实施方式中，经转化的宿主细胞是无标记物的，这表示基因组或染色体外不存在营养缺陷或显性标记物，尤其是抗生素抗性标记物。

用于上述酶过表达的编码序列可优选地对宿主细胞而言是同源的。然而，可以使用对宿主细胞而言异源的编码序列。

涉及经遗传修饰的细胞中酶的生产时，酶的过表达表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比，所述酶以更高水平的特异性酶活性被生产。通常，这表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比酶活性蛋白质(或在多亚基酶的情况下多种蛋白质)以更大量被生产，或者以更高的稳态水平被生产。类似地，这通常表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比，编码酶活性蛋白质的mRNA以更大量被生产，或者也以更高的稳态水平被生产。优选地，在宿主细胞中，与除了引起过表达的遗传修饰之外在遗传上相同的菌株相比时，要过表达的酶被过表达至至少约1.1、约1.2、约1.5、约2、约5、约10或约20的倍数。应当理解这些过表达水平可适用于酶活性的稳态水平，酶蛋白质的稳态水平以及编码酶的转录本的稳态水平。

适应(adaption)

适应是一种进化过程，藉此种群变得更加适合(适应)其一种或多种栖息地(habitat)。该过程在若干到许多世代中发生，并且是生物学的基本现象之一。

术语适应也可以表示对生物存活而言特别重要的特征。此类适应在可变种群中通过天然选择由更成功地进行繁殖的、更好地适应的形式生产。

环境条件的改变改变了天然选择的结果，影响所造成的适应的选择性益处(selectivebenefits)，改善生物在新条件下的适合度(fitness)。在极端环境改变的情况下，有益适应的出现和固定对存活而言可以是至关重要的。大量不同的因素(例如养分可用度、温度、氧可用度等等)能够驱动适应性进化。

适合度(Fitness)

适应性(在给定栖息地集合中生物能够生活和繁殖的程度)和适合度之间存在清楚的联系。适合度是天然选择率的一种估计量和预测器。通过应用天然选择，替代性表型的相对频率可随着时间而变化，如果它们可以遗传的话。

遗传改变

当天然选择作用于种群的遗传变异性时，遗传改变是潜在的机制。通过这种方式，种群在遗传上适应其环境。遗传改变可导致可见的结构，或者以适应改变的栖息地的方式调节生物的生理活动。

可发生栖息地的频繁改变。因此，由此可见适应的过程永远不会终结。最后，可能发生环境逐渐改变，而物种变得越来越适应其环境的情况。另一方面，可能发生环境中的改变相对迅速发生，而物种变得越来越不适应的情况。适应是一种遗传过程，其在一定程度上是随时发生的，种群不改变其栖息地或环境时也是如此。

适应性进化

经转化的宿主细胞可在其制备中被施加以适应性进化。可以针对在想要的糖上、优选地作为唯一碳源的想要的糖上，更优选地在厌氧条件下的生长，来选择自发或(例如通过辐射或化学品)诱导的突变体，使经转化的宿主细胞适应糖使用。突变体的选择可以通过包括例如Kuyperetal.(2004,FEMSYeastRes.4:655-664)所述的培养物连续转移在内的技术来进行，或者通过在恒化器培养中的选择压力下培养来进行。例如，在一种优选的宿主细胞中，至少一种上述遗传修饰(包括通过突变体选择获得的修饰)赋予宿主细胞在木糖作为碳源、优选地作为唯一碳源时、并且优选地在厌氧条件下生长的能力。使用XI作为基因转化木糖时，优选地细胞基本上不生产木糖醇，例如生产的木糖醇低于检出界限，或者例如以摩尔为基础少于消耗的碳的约5％、约2％、约1％、约0.5％或约0.3％。

适应性进化还描述于例如WisselinkH.W.etal,AppliedandEnvironmentalMicrobiologyAug.2007,p.4881–4891中。

在适应性进化的一个实施方式中，使用由不同培养基中重复循环的连续生长的重复分批培养组成的方案，所述培养基例如为具有不同组成的三种培养基(葡萄糖、木糖和阿拉伯糖；木糖和阿拉伯糖)。见Wisselinketal.(2009)AppliedandEnvironmentalMicrobiology,Feb.2009,p.907–914。

酵母转化和遗传稳定性

遗传工程(即用重组DNA转化酵母细胞)在1978年首次成为可行[Beggs,1978；Hinnenetal.,1978]。从那时起，建立了酵母中的重组DNA技术。可以获得多种不同的载体构建体。通常，这些被称作穿梭载体的质粒载体含有由复制起点和可选择标记物(通常是β-内酰胺酶基因，ampR)构成的、源自E.coli载体的遗传材料，这使得它们在被转化进酵母细胞中之前能够在E.coli中繁殖。另外，穿梭载体含有用于在酵母中选择的可选择标记物。标记物可以是下述基因，所述基因编码用于合成具体氨基酸或核苷酸的酶，使得带有相应基因组缺失(或突变)的细胞针对营养缺陷或自养而被回补(complemented)。或者，这些载体含有异源显性抗性标记物，它们对重组的酵母细胞(即吸收了DNA并且表达标记物基因的细胞)赋予针对某些抗生素如g418(遗传霉素)、潮霉素B或腐草霉素的抗性。另外，这些载体可含有(组合的)限制性位点序列(多克隆位点或MCS)，所述序列会允许将外源DNA克隆进这些位点内，尽管同时存在替代性的方法。

传统上，可以通过额外的遗传元件的不存在或存在区别四种类型的穿梭载体：

·整合性质粒(YIp)，当宿主基因组中标记物或另一基因的基因座通过限制性消化被打开并使用经线性化的DNA转化酵母细胞时，所述整合性质粒通过同源重组被整合进宿主基因组中标记物或另一基因的基因座处。

·附加体质粒(Yep)，其带有在酵母细胞中自主复制所需的2μ质粒DNA序列部分。多拷贝的被转化的质粒在酵母细胞中繁殖，并作为附加体保持。

·自主复制质粒(YRp)，其带有允许被转化的质粒被繁殖数百倍的酵母复制起点(ARS，自主复制序列)。

·CEN质粒(YCp)，其除了ARS序列外还带有中心粒序列(源自核染色体之一)，所述中心粒序列通常保证稳定的有丝分裂分离，并且通常将自我复制的质粒的拷贝数减少至仅有一个。

这些质粒通过转化被引入酵母细胞中。酵母细胞的转化可以通过若干不同的技术实现，例如用醋酸锂(Itoetal,1983)和电穿孔方法使细胞通透化。

在重组微生物的商业应用中，质粒不稳定性是最重要的问题。不稳定性是经转化的细胞由于质粒的改变或丢失而失去它们被改造的特性的趋势。这一问题由Zhangetal(PlasmidstabilityinrecombinantSaccharomycescerevisiae.BiotechnologyAdvances,Vol.14,No.4,pp.401-435,1996)详细讨论。用整合型质粒转化的菌株是极度稳定的，即使在缺失选择性压力时也是如此(Sherman,F.http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/yeast/9.html及其中的参考文献)。

异源DNA通常以染色体外质粒(Yep、YCp和YRp)的形式被引入生物中。不幸的是，已经用细菌和酵母发现新的特征可能不被保持，特别是不持续应用选择压力时。这归因于重组细胞长时间生长时杂种质粒的分离不稳定性(segregationalinstability)。这导致种群异质性和克隆变异性，并最终得到下述细胞种群，其中大部分细胞丢失了通过转化被引入的特性。如果使用具有营养缺陷型标记物的载体，则在丰富培养基中的培养通常导致载体的迅速丢失，因为载体仅在最小培养基中被保持。或者，显性抗生素抗性标记物的使用通常不与生产方法相容。从注册的观点来看(痕量抗生素存在于终产物中的可能性)或出于经济原因(以工业规模使用抗生素的成本)，抗生素的使用可能不是期望的。

载体的丢失在大规模生产的情况下导致多种问题。对酵母而言，存在用于引入DNA的替代性方法，例如使用整合性质粒(YIp)。DNA通过重组被整合进宿主基因组中，导致高稳定性。(Caunt,P.Stabilityofrecombinantplasmidsinyeast.JournalofBiotechnology9(1988)173–192)。我们发现，使用宿主转座子的整合方法是一种好的选择。在一个实施方式中，可以将基因整合进经转化的宿主细胞的基因组中。多拷贝的初始引入(即在适应性进化之前)可以通过本领域已知的导致基因引入的任何方式进行。在一个优选的实施方式中，这可以通过使用下述载体来进行，所述载体具有与宿主细胞的重复序列同源的部分(转座子)。当宿主细胞是酵母细胞时，合适的重复序列是Ty元件的长末端重复(LTR)，这已知被称为δ序列。Ty元件落入称作Ty1和Ty2的两个相当相似的亚家族中。这些元件长度约为6000个碱基(kb)，并且通过长末端重复(LTR)结合，所述场末端重复是约335个碱基对的序列(BoekeJDetal,TheSaccharomycescerevisiaeGenomeContainsFunctionalandNonfunctionalCopiesofTransposonTy1.MolecularandCellularBiology,Apr.1988,p.1432-1442Vol.8,No.4)。在经完全测序的S.cerevisiae菌株S288c中，最丰富的转座子是Ty1(31个拷贝)和Ty2(13个拷贝)(GabrielA,DapprichJ,KunkelM,GreshamD,PrattSC,etal.(2006)Globalmappingoftransposonlocation.PLoSGenet2(12):e212.doi:10.1371/journal.pgen.0020212)。这些转座子由两个重叠的开放读码框(ORF)构成，每个开放读码框编码若干种蛋白质。编码区侧翼是前述接近相同的LTR。S.cereviaise中的其他(但是较不丰富并且更不同的)Ty元件包括Ty3、Ty4和Ty5。对全长Ty元件的每个家族而言，存在多出一个数量级的单独的LTR元件分散于基因组中。它们被认为通过全长元件的LTR–LTR重组产生，同时内部蛋白质编码区成环丢失。

Ty反转录转座子的反转录机制已被用于在基因组中整合多个拷贝(Boekeetal.,1988；Jacobsetal.,1988)。已知被称为δ序列的Ty元件的长末端重复(LTR)也是通过同源重组进行整合的良好靶标，因为它们存在于约150-200个拷贝的与Ty结合的或单独的位点中(Boeke,1989；KingsmanandKingsman,1988)。(ParekhR.N.(1996).AnIntegratingVectorforTunable,HighCopy,StableIntegrationintotheDispersedTyDELTASitesofSaccharomycescerevisiae.Biotechnol.Prog.1996,12,16-21)。通过适应性进化，拷贝数可以改变。

宿主细胞

宿主细胞可以是适合生产有用产物的任何宿主细胞。宿主细胞可以是任何合适的细胞，如原核细胞如细菌，或真核细胞。典型地，细胞会是真核细胞，例如酵母或丝状真菌。

酵母在本文中被定义为真核微生物，并且包括主要以单细胞形式生长的真菌亚门的所有物种(Alexopoulos,C.J.,1962,In:IntroductoryMycology,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork)。

酵母可以通过单细胞原植体的出芽生长，或可通过生物的裂变生长。作为经转化的宿主细胞的一种优选的酵母可属于Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、Schizosaccharomyces、Hansenula、Kloeckera、Schwanniomyces或Yarrowia属。优选地，酵母是能够厌氧发酵的酵母，更优选地是能够厌氧醇发酵的酵母。

丝状真菌在本文中被定义为下述真核微生物，其包括真菌亚门的所有丝状形式。这些真菌的特征是由甲壳质、纤维素和其它复合多糖构成的植物菌丝体。适合用作本发明细胞的丝状真菌在形态学、生理和遗传上区别于酵母。可有利地使用丝状真菌细胞，因为大部分真菌不需要无菌条件来繁殖，并且对噬菌体感染敏感。丝状真菌的营养生长通过菌丝延长进行，并且大部分丝状真菌的碳代谢是专性需氧的。作为宿主细胞的优选的丝状真菌可属于Aspergillus、Trichoderma、Humicola、Acremoniurra、Fusarium或Penicillium属。更优选地，丝状真菌细胞可以是Aspergillusniger、Aspergillusoryzae、Penicilliumchrysogenum或Rhizopusoryzae细胞。

在一个实施方式中，宿主细胞可以是酵母。

优选地，宿主是工业宿主，更优选地是工业酵母。工业宿主和工业酵母细胞可以如下定义。工业方法中酵母细胞的生活环境与实验室中显著不同。工业酵母细胞必须能够在所述方法期间可能变化的多种环境条件下表现良好。此类改变包括养分来源、pH、乙醇浓度、温度、氧浓度等等的改变，它们一起对酿酒酵母的细胞生长和乙醇生产具有潜在的影响。在不利的工业条件下，环境耐受菌株会允许强健的生长和生产。对使用工业酵母菌株的应用(例如烘焙工业、酿造工业、造酒和乙醇工业)中可能发生的环境条件中的这些改变而言，工业酵母菌株通常更加强健。工业酵母(酿酒酵母)的例子是Ethanol(Fermentis)、(DSM)和(Lallemand)。

在一个实施方式中，宿主是抑制剂耐受的。可以通过针对在含抑制剂的材料上的生长筛选菌株，来选择抑制剂耐受的宿主细胞，如Kadaretal,Appl.Biochem.Biotechnol.(2007),Vol.136-140,847-858中所述，其中选择了抑制剂耐受的酿酒酵母菌株ATCC26602。

araA、araB和araD基因

经转化的宿主细胞能够使用阿拉伯糖。因此，经转化的宿主细胞能够将L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或需要的发酵产物，例如本文提到的发酵产物之一。

能够从L-阿拉伯糖生产乙醇的生物例如S.cerevisiae菌株可以通过修饰细胞，引入来自合适来源的araA(L-阿拉伯糖异构酶)、araB(L-核酮糖激酶)和araD(L-核酮糖-5-P4-差向异构酶)基因来产生。这类基因可被引入经转化的宿主细胞中，使其能够使用阿拉伯糖。这样的通路描述于WO2003/095627中。来自Lactobacillusplantanum的araA、araB和araD基因可以使用，并公开于WO2008/041840中。来自Bacillussubtilis的araA基因和来自Escherichiacoli的araB和araD基因可以使用，并公开于EP1499708中。在另一实施方式中，araA、araB和araD基因可源自Clavibacter、Arthrobacter和/或Gramella中至少一种属，特别是Clavibactermichiganensis、Arthrobacteraurescens和/或Gramellaforsetii之一，如WO2009011591中所公开。

PPP-基因

经转化的宿主细胞可包含一种或多种提高戊糖磷酸通路通量的遗传修饰。具体地，遗传修饰可导致通过戊糖磷酸通路非氧化性部分的通量提高。引起戊糖磷酸通路非氧化性部分通量提高的遗传修饰在本文中被理解为表示下述修饰，与除了引起通量提高的遗传修饰之外遗传上相同的菌株中的通量相比，所述修饰将所述通量提高至约1.1、约1.2、约1.5、约2、约5、约10或约20的倍数。戊糖磷酸通路非氧化部分的通量可以如下测量：在木糖作为唯一碳源时培养经修饰的宿主，测定木糖消耗的比速率，并在产生任何木糖醇时从木糖消耗的比速率中减去木糖醇生产的比速率。然而，戊糖磷酸通路非氧化部分的通量与木糖作为唯一碳源时的生长速率成比例，优选地与木糖作为唯一碳源时的厌氧生长速率成比例。木糖作为唯一碳源时的生长速率(μ_max)和戊糖磷酸通路非氧化部分的通量之间存在线性相关。木糖消耗的比速率(Q_s)等于生长速率(μ)除以在糖上的生物质产率(Y_xs)，因为在糖上的生物质产率是恒定的(在给定的一组条件下：厌氧、生长培养基、pH、菌株的遗传背景等；即Q_s＝μ/Y_xs)。因此，戊糖磷酸通路非氧化部分通量的提高可能演绎自这些条件下最大生产速率的提高，除非转运(摄取收到限制)。

可以通过多种方式在宿主细胞中引入提高戊糖磷酸通路通量的一种或多种遗传修饰。这些方式包括例如，实现木酮糖激酶和/或非还原性部分戊糖磷酸通路的一种或多种酶的更高的稳态活性水平，和/或非特异性醛糖还原酶活性的降低的稳态水平。稳态活性水平的这些改变可以通过(自发或化学或辐射诱导的)突变体的选择和/或通过重组DNA技术(例如编码酶的基因或调节这些基因的因子的过表达或失活)来实现。

在一种优选的宿主细胞中，遗传修饰包括(非氧化部分)戊糖磷酸通路的至少一种酶的过表达。优选地，所述酶选自由编码5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶的酶构成的组。可以过表达(非氧化性部分)戊糖磷酸通路的酶的多种组合。例如，过表达的酶可以至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和5-磷酸核酮糖差向异构酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和转酮酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖差向异构酶和转酮酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转醛酶；或至少是酶转酮酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶、转酮酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶和转酮酶。在本发明的一个实施方式中，酶5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶的每一种都在宿主细胞中被过表达。更优选的是下述宿主细胞，其中遗传修饰至少包含酶转酮酶和转醛酶二者的过表达，因为这样的宿主细胞已经能够在木糖上厌氧生长。实际上，在一些条件下，仅过表达转酮酶和转醛酶的宿主细胞在木糖上已经具有与下述宿主细胞相同的厌氧生长速率，所述宿主细胞过表达所有四种酶，即5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶。另外，过表达酶5-磷酸核酮糖异构酶和核酮糖-5-磷酸差向异构酶二者的宿主细胞是超过下述宿主细胞而被优选的，所述宿主细胞仅过表达异构酶或仅过表达差向异构酶，因为这些酶中仅一种的过表达可产生代谢失衡。

酶“核酮糖-5-磷酸差向异构酶”(EC5.1.3.1)在本文中被定义为催化D-木酮糖5-磷酸差向异构化为D-核酮糖5-磷酸或其逆反应的酶。所述酶也已知被称为磷酸核酮糖(phosphoribulose)异构酶；赤藓糖-4-磷酸异构酶；磷酸酮戊糖3-差向异构酶；木酮糖磷酸3-差向异构酶；磷酸酮戊糖向异构酶；核酮糖5-磷酸3-差向异构酶；D-核酮糖磷酸-3-差向异构酶；D-核酮糖5-磷酸差向异构酶；D-核酮糖-5-P3-差向异构酶；D-木酮糖-5-磷酸3-差向异构酶；戊糖-5-磷酸3-差向异构酶；或D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶。核酮糖5-磷酸差向异构酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，核酮糖5-磷酸差向异构酶可以通过编码酶的核苷酸序列或者通过与编码核酮糖5-磷酸差向异构酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码核酮糖5-磷酸差向异构酶的核苷酸序列在本文中称作RPE1。

酶“核酮糖5-磷酸异构酶”(EC5.3.1.6)在本文中被定义为催化D-核糖5-磷酸直接异构化为D-核酮糖5-磷酸或其逆反应的酶。所述酶也已知被称为磷酸戊糖异构酶；磷酸核糖异构酶；核糖磷酸异构酶；5-磷酸核糖异构酶；D-核糖5-磷酸异构酶；D-核糖-5-磷酸酮醇-异构酶；或D-核糖-5-磷酸醛糖-酮糖-异构酶。核酮糖5-磷酸异构酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，核酮糖5-磷酸异构酶可以通过编码所述酶的核苷酸序列以及与编码核酮糖5-磷酸异构酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码核酮糖5-磷酸异构酶的核苷酸序列在本文中称作RKI1。

酶“转酮酶”(EC2.2.1.1)在本文中被定义为催化下述反应的酶：D-核糖5-磷酸+D-木酮糖5-磷酸<->景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸或其逆反应。所述酶也已知被称为羟乙醛转移酶或景天庚酮糖-7-磷酸:D-甘油醛-3-磷酸羟乙醛转移酶。转酮酶还可通过其氨基酸定义。类似地，转酮酶可以通过编码酶的核苷酸序列以及与编码转酮酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码转酮酶的核苷酸序列在本文中称作TKL1。

酶“转醛酶”(EC2.2.1.2)在本文中被定义为催化下述反应的酶：景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸<->D-赤藓糖4-磷酸+D-岩藻糖6-磷酸或其逆反应。所述酶还已知被称为二羟基丙酮转移酶；二羟基丙酮合酶；甲醛转酮酶；或景天庚酮糖-7-磷酸:D-甘油醛-3-磷酸甘油酮转移酶。转醛酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，转醛酶可以通过编码酶的核苷酸序列以及与编码转醛酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码转醛酶的核苷酸序列在本文中称作TAL1。

木糖异构酶或木糖还原酶基因

根据本发明，一个或多个一种或多种木糖异构酶基因和/或一种或多种木糖还原酶和木糖醇脱氢酶被引入宿主细胞的基因组中。这些遗传元件的存在赋予细胞通过异构化或还原来转化木糖的能力。

在一个实施方式中，一个或多个拷贝的一种或多种木糖异构酶基因被引入宿主细胞的基因组中。

“木糖异构酶”(EC5.3.1.5)在本文中被定义为催化D-木糖直接异构化为D-木酮糖和/或反过来的酶。所述酶还已知被称为D-木糖酮异构酶。本文的木糖异构酶也可以能够催化D-葡萄糖和D-果糖之间的转化(并因此可以被称作葡萄糖异构酶)。本文的木糖异构酶可能需要二价阳离子如镁、锰或钴作为辅因子。

因此，这样的经转化的宿主细胞能够将木糖异构化为木酮糖。通过用下述核酸构建体转化宿主细胞对所述宿主细胞赋予将木糖异构化为木酮糖的能力，所述核酸构建体包含编码确定的木糖异构酶的核苷酸序列。经转化的宿主细胞通过木糖到木酮糖的直接异构化将木糖异构化为木酮糖。

木糖异构酶活性单位(U)在本文中可以被定义为：在Kuyperetal.(2003,FEMSYeastRes.4:69-78)所述条件下，每分钟生产1nmol木酮糖的酶的量。

木糖异构酶基因可具有多种来源，例如如WO2006/009434中公开的Piromycessp.。其他合适的来源是如PCT/EP2009/52623中所述的Bacteroides，特别是Bacteroidesuniformis，如PCT/EP2009/052625中所述的Bacillus，特别是Bacillusstearothermophilus。

在另一实施方式中，一个或多个拷贝的一种或多种木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因被引入宿主细胞的基因组中。在所述实施方式中，木糖的转化在两个步骤中进行：分别由木糖还原酶和木糖醇脱氢酶催化的，木糖通过木糖醇中间产物转化成木酮糖。在一个实施方式中，木糖还原酶(XR)，木糖醇脱氢酶(XDR)和木酮糖激酶(xylokinase，XK)可以被过表达，任选地一个或多个编码NADPH生产酶的基因被上调，并且一个或多个编码NADH消耗酶的基因被上调，如WO2004085627中所述。

XKS1基因

经转化的宿主细胞可包含提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰。优选地，所述一种或多种遗传修饰引起木酮糖激酶的过表达，例如通过编码木酮糖激酶的核苷酸序列的过表达来实现。编码木酮糖激酶的基因对宿主细胞而言可以是内源的，或者可以是对宿主细胞异源的木酮糖激酶。用于在宿主细胞中过表达木酮糖激酶的核苷酸序列是编码具有木酮糖激酶活性的多肽的核苷酸序列。

酶“木酮糖激酶”(EC2.7.1.17)在本文中被定义为催化反应ATP+D-木酮糖＝ADP+D-木酮糖5-磷酸的酶。所述酶还已知被称为磷酸化木酮糖激酶、D-木酮糖激酶或ATP:D-木酮糖5-磷酸转移酶。本发明的木酮糖激酶还可以通过其氨基酸序列定义。类似地，木酮糖激酶可以通过编码所述酶的核苷酸序列以及与编码木酮糖激酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。

在经转化的宿主细胞中，提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰可以与上文所述提高戊糖磷酸通路通量的任何修饰组合。然而，这不是必需的。

因此，宿主细胞可仅包含提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰。用于实现和分析本发明宿主细胞中木酮糖激酶过表达的本领域可获得的多种手段与上文针对戊糖磷酸通路酶所述相同。优选地，在本发明的宿主细胞中，与除了引起过表达的遗传修饰之外在遗传上相同的菌株相比，要过表达的木酮糖激酶被过表达至少约1.1、约1.2、约1.5、约2、约5、约10或约20的倍数。还应当理解这些过表达水平可适用于酶活性的稳态水平，酶蛋白质的稳态水平以及编码酶的转录本的稳态水平。

醛糖还原酶(GRE3)基因缺失

在使用XI作为转化木糖的基因的实施方式中，其可有利地降低醛糖还原酶活性。因此，经转化的宿主细胞可包含降低宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性的一种或多种遗传修饰。优选地，通过一种或多种下述遗传修饰降低宿主细胞中的非特异性醛糖还原酶活性，所述遗传修饰降低编码非特异性醛糖还原酶的基因的表达或使其失活。优选地，所述遗传修饰降低宿主细胞中编码非特异性醛糖还原酶的基因的每种内源拷贝或使其表达失活(本文中称作GRE3缺失)。经转化的宿主细胞可由于二倍性、多倍性或非整倍性而包含多拷贝的编码非特异性醛糖还原酶的基因，和/或宿主细胞可含有具有醛糖还原酶活性的若干不同的(同工)酶，所述酶氨基酸序列不同并且鸽子由不同基因编码。还在这类情况下，优选地编码非特异性醛糖还原酶的每种基因的表达被降低或失活。优选地，通过缺失基因的至少一部分或者通过破坏基因使基因失活，其中在该语境中，术语基因还包括编码序列上游或下游的任何非编码序列，其(部分)缺失或失活导致宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性表达的降低。

编码要在宿主细胞中降低其活性的醛糖还原酶的核苷酸序列是编码具有醛糖还原酶活性的多肽的核苷酸序列。

因此，仅包含下述一种或多种遗传修饰的宿主细胞明确地包括在本发明中，所述修饰降低宿主细胞中的非特异性醛糖还原酶活性。

酶“醛糖还原酶”(EC1.1.1.21)在本文中被定义为能够将木糖或木酮糖还原为木糖醇的任何酶。在本发明的语境中，醛糖还原酶可以是对本发明宿主细胞而言天然(内源)的并且能够将木糖或木酮糖还原为木糖醇的任何非特异性醛糖还原酶。非特异性醛糖还原酶催化反应：

所述酶具有广泛特异性并且也已知被称为醛糖还原酶；多元醇脱氢酶(NADP⁺)；糖醇:NADP氧化还原酶；糖醇:NADP⁺1-氧化还原酶；NADPH-戊醛糖还原酶；或NADPH-醛糖还原酶。

这类非特异性醛糖还原酶的一个具体的例子是对S.cerevisiae内源并且由GRE3基因编码的醛糖还原酶(Traffetal.,2001,Appl.Environ.Microbiol.67:5668-74)。因此，本发明的醛糖还原酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，醛糖还原酶可以通过编码酶的核苷酸序列以及与编码醛糖还原酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。

生物制品生产

许多年来，建议引入多种生物用于从作物糖生产生物乙醇。然而在实践中，所有主要的生物乙醇生产方法继续使用酵母菌属(Saccharomyces)的酵母作为乙醇生产者。这归因于Saccharomyces物种对工业方法而言的许多有吸引力的特征，即高度的酸-、乙醇-和渗透-耐性，厌氧生长的能力，当然以及其高的醇发酵能力。作为宿主细胞的优选的酵母物种包括酿酒酵母、S.bulderi、S.barnetti、S.exiguus、S.uvarum、S.diastaticus、K.lactis、K.marxianus或Kfragilis。

经转化的宿主细胞可以是适用于生产乙醇的细胞。然而，经转化的宿主细胞可适用于生产除乙醇以外的发酵产物。

这类非乙醇发酵产物原则上包括可由真核微生物如酵母或丝状真菌生产的任何大宗化学品(bulkchemical)或精细化学品。

可用于生产非乙醇发酵产物的经转化的宿主细胞是含有下述遗传修饰的宿主细胞，所述遗传修饰导致降低的醇脱氢酶活性。

在一个实施方式中，可在方法中使用经转化的宿主细胞，其中源自木质纤维素的糖被转化成乙醇。

木质纤维素

可以被认为是潜在的可再生原料的木质纤维素通常包括多糖纤维素(葡聚糖)和半纤维素(木聚糖、杂木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外，一些半纤维素可以作为葡甘露聚糖(glucomannans)存在于例如木材衍生的原料中。这些多糖成为可溶糖(包括单体和多体，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和其他己糖和戊糖)的酶促水解发生于共同作用(actinginconcert)的不同酶的作用下。

另外，果胶和其他果胶物质如阿拉伯聚糖(arabinans)可占来自非木本植物组织典型的细胞壁干物质的可观的比例(约四分之一到一半的干物质可以是果胶)。

预处理

在酶处理之前，可以对木质纤维素材料进行预处理。预处理可包括将木质纤维素材料暴露于酸、碱、溶剂、热、过氧化物、臭氧、机械粉碎、碾磨、研磨或快速释压，或其中任何两种或更多种的组合。所述化学预处理通常与热预处理(例如150-220℃之间1到30分钟)组合。

酶促水解

通过对经预处理的材料进行酶促水解，以释放可根据本发明被发酵的糖。这可通过常规方法进行，例如与纤维素酶(例如纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶)和任选地其他酶接触。使用纤维素酶的转化可以在室温下或更高的温度下进行足以释放足量糖的反应时间。酶促水解的结果是包含C5/C6糖的水解产物，在本文中称作糖组合物。

发酵

发酵方法可以是需氧或厌氧的发酵方法。厌氧发酵方法在本文中被定义为在不存在氧时运行的发酵方法，或者其中基本不消耗氧，优选地消耗少于约5、约2.5或约1mmol/L/h，更优选地消耗0mmol/L/h(即氧消耗不可检出)，并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种用途。在不存在氧时，糖酵解和生物质形成中产生的NADH不能够被氧化性磷酸化反应氧化。为了解决这一问题，许多微生物使用丙酮酸或其衍生物之一作为电子和氢受体，从而再生NAD⁺。

因此，在一种优选的厌氧发酵方法中，丙酮酸被用作电子(和氢受体)，并且被还原成发酵产物如乙醇、丁醇、乳酸、二萜、糖基化二萜、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、丙三醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。

发酵方法优选地在对细胞而言最适的温度下进行。因此，对大部分酵母或真菌宿主细胞而言，发酵方法在低于约42℃、优选地低于约38℃的温度下进行。对酵母或丝状真菌宿主细胞而言，发酵方法优选地在低于约35、约33、约30或约28℃的温度且高于约20、约22或约25℃的温度下进行。

在所述方法中，在木糖和/或葡萄糖上的乙醇产率优选地为至少约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，约95％或约98％。乙醇产率在本文中被定义为理论最大产率的百分比。

本发明还涉及用于生产发酵产物的方法。

根据本发明的方法可以在需氧和厌氧条件下进行。在一个实施方式中，所述方法在微需气(aerophilic)或氧受限的条件下进行。

厌氧发酵方法在本文中被定义为在不存在氧时进行的发酵方法，或其中基本不消耗氧，优选地消耗少于约5、约2.5或约1mmol/L/h，并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种作用。

氧受限的发酵方法是下述方法，其中氧消耗受到从气体到液体的氧转移的限制。氧受限的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际混合/物量转移特性决定。优选地，在氧受限条件下的方法中，氧消耗速率为至少约5.5、更优选地至少约6、如至少7mmol/L/h。本发明的方法可包括发酵产物的回收。

在一个优选的方法中，细胞发酵木糖以及葡萄糖，优选地同时发酵，在这种情况下优选地使用下述细胞，所述细胞对葡萄糖阻抑不敏感从而防止两阶段生长(diauxicgrowth)。除了作为碳源的木糖(和葡萄糖)来源以外，发酵培养基还会包含细胞生长所需的适当成分。用于微生物(如酵母)生长的发酵培养基的组成是本领域公知的。

发酵方法可以以分批、补料分批或连续的方式进行。也可以使用分离水解和发酵(SHF)方法或同时糖化和发酵(SSF)方法。也可以针对最适生产力使用这些方法模式的组合。这些方法在下文更详细地描述。

SSF模式

对同时糖化和发酵(SSF)的模式而言，液化/水解或预糖化步骤的反应时间取决于实现期望产率(即纤维素成为葡萄糖的转化产率)的时间。这类产率优选地尽可能高，优选地为60％或更多，65％或更多，70％或更多，75％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多，99％或更多，甚至99.5％或更多或99.9％或更多。

根据本发明，在SHF模式下实现了非常高的糖浓度，在SSF模式下实现了非常高的产物浓度(例如乙醇)。在SHF操作中，葡萄糖浓度是25g/L或更高，30g/L或更高，35g/L或更高，40g/L或更高，45g/L或更高，50g/L或更高，55g/L或更高，60g/L或更高，65g/L或更高，70g/L或更高，75g/L或更高，80g/L或更高，85g/L或更高，90g/L或更高，95g/L或更高，100g/L或更高，110g/L或更高，120g/L或更高，或者可以例如是25g/L-250g/L，30gl/L-200g/L，40g/L-200g/L，50g/L-200g/L，60g/L-200g/L，70g/L-200g/L，80g/L-200g/L，90g/L，80g/L-200g/L。

SSF模式中的产物浓度

在SSF操作中，产物浓度(g/L)取决于生产的葡萄糖量，但因为在SSF中糖被转化成产物，所以这是不可见的，并且糖浓度可以通过与理论最大产率(以gr产物/克葡萄糖计的Ypsmax)相乘而与潜在的葡萄糖浓度相关。

发酵产物的理论最大产率(以gr产物/克葡萄糖计的Ypsmax)可源自生物化学教科书。对乙醇而言，1摩尔葡萄糖(180gr)根据酵母中正常的糖酵解发酵通路产生2摩尔乙醇(＝2x46＝92gr乙醇)。因此，基于葡萄糖的乙醇的理论最大产率为92/180＝0.511gr乙醇/gr葡萄糖。

对丁醇(MW74gr/摩尔)或异丁醇而言，理论最大产率是每摩尔葡萄糖1摩尔丁醇。因此，(异)丁醇的Ypsmax＝74/180＝0.411gr(异)丁醇/gr葡萄糖。

对乳酸而言，纯乳酸发酵(homolacticfermentatio)的发酵产率是每摩尔葡萄糖2摩尔乳酸(MW＝90gr/摩尔)。根据所述化学计量法，Ypsmax＝1gr乳酸/gr葡萄糖。

对其他发酵产物而言，可以进行类似的计算。

SSF模式

在SSF操作中，产物浓度为25g*Ypsg/L/L或更高，30*Ypsg/L或更高，35g*Yps/L或更高，40*Ypsg/L或更高，45*Ypsg/L或更高，50*Ypsg/L或更高，55*Ypsg/L或更高，60*Ypsg/L或更高，65*Ypsg/L或更高，70*Ypsg/L或更高，75*Ypsg/L或更高，80*Ypsg/L或更高，85*Ypsg/L或更高，90*Ypsg/L或更高，95*Ypsg/L或更高，100*Ypsg/L或更高，110*Ypsg/L或更高，120g/L*Yps或更高，或者可以例如是25*Ypsg/L-250*Ypsg/L，30*Ypsgl/L-200*Ypsg/L，40*Ypsg/L-200*Ypsg/L，50*Ypsg/L-200*Ypsg/L，60*Ypsg/L-200*Ypsg/L，70*Ypsg/L-200*Ypsg/L，80*Ypsg/L-200*Ypsg/L，90*Ypsg/L，80*Ypsg/L-200*Ypsg/L。

因此，本发明提供了用于制备发酵产物的方法，所述方法包括：

a.使用本文所述的方法降解木质纤维素；和

b.发酵所得到的材料，

从而制备发酵产物。

发酵产物

本发明的发酵产物可以是任何有用的产物。在一个实施方式中，其为选自下组的产物，所述组由以下物质构成：乙醇，正丁醇，异丁醇，乳酸，二萜、糖基化二萜、3-羟基-丙酸，丙烯酸，乙酸，琥珀酸，富马酸，苹果酸，衣康酸，马来酸，柠檬酸，己二酸，氨基酸例如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸，1,3-丙二醇，乙烯，甘油，β-内酰胺抗生素和头孢菌素，维生素，药物，动物饲料补充剂，特种化学品，化学原料，塑料，溶剂，燃料包括生物燃料和沼气或有机聚合物，和工业酶例如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂合酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。例如，可根据现有技术细胞制备方法和发酵方法，由根据本发明的细胞生产发酵产物，然而所述方法的例子在本文中不应被解释为限制。正丁醇可由WO2008121701或WO2008086124中所述细胞生产；乳酸如US2011053231或US2010137551中所述；3-羟基丙酸如WO2010010291中所述；丙烯酸如WO2009153047中所述。

发酵产物的回收

对发酵产物的回收而言，使用现有的技术。对不同的发酵产物而言，适用不同的回收方法。现有的从水性混合物中回收乙醇的方法通常使用分级(fractionation)和吸附技术。例如，可以使用发酵醪蒸馏器(beerstill)加工在水性混合物中含有乙醇的发酵产物，以生产富集的含有乙醇的混合物，所述富集的含有乙醇的混合物随后进行分级(例如分馏或其他类似的技术)。接着，含有最高浓度乙醇的级分可以经过吸附剂，从乙醇中去除大部分(如果不是所有的话)剩余的水。

以下实施例阐述本发明：

实施例

方法

分子生物学技术和化学品。限制性内切酶和T4DNA连接酶均获自Fermentas。抗生素潮霉素(HG)、腐草霉素(phleo)和遗传霉素(G418)获自Invivogen。pYL16和诺尔丝菌素(nour)获自WernerBioagents。氨苄青霉素和卡那霉素获自Sigma-Aldrich。

对于PCR扩增，使用高保真DNA聚合酶(Finnzymes)。使用TA试剂盒或ZeroPCR克隆试剂盒(均来自LifeTechnologies)对PCR片段进行亚克隆。用于菌株构建的寡核苷酸购自Sigma-Aldrich。

按照制造商的说明在化学感受态TOP10细胞(TA试剂盒,LifeTechonologies)中扩增和维持质粒。使用GeneJET^TM质粒小提试剂盒(Fermentas)从大肠杆菌微培养物中分离质粒。使用YeaStar^TM基因组DNA试剂盒(ZymoResearch)按照制造商的说明从酵母中分离基因组DNA。

标准分子生物学和酵母遗传学技术根据教科书进行，包括Sambrook等，(1989)和Ausubel等，(1995)。

菌株和维持。为了储存本研究中使用的菌株(表2)，在加富培养基(YP)中进行摇瓶培养，所述培养基由10gl^-1酵母提取物(Oxoid)和20gl-¹蛋白胨(BDDifco)组成，补有2％葡萄糖(YPD)、2％麦芽糖(YPM)或3％木糖(YPX)。将培养物在定轨摇床中于30℃下维持直至培养物达到静止生长期。添加甘油至30％(v/v)后，将来自摇瓶培养物的样品以2ml等分试样储存于-80℃下。

表2：本文中使用或制备的菌株

摇瓶培养物的OD600和HPLC分析。在培养期间对摇瓶培养物进行定期采样。对于OD600测量，对培养物进行适度稀释以便准确测量并且在PerkinElmer分光光度计λ2仪器中测量600nm波长处的光密度。过滤剩余样品以将培养基与酵母分离。

将滤液注入适当的小瓶中以供HPLC分析。使用ShimadzuHPLC系统测量培养基中葡萄糖、木糖、甘油、乙酸和乙醇的浓度。所述系统配备有柱箱CTO-10A-vp和带有保护柱(Bio-RadH筒,Bio-Rad)和AminexHPX-87H柱(300×7.8mm；Bio-Rad)的AutoinjectorSIL-10AD-vp。采用5mMH2SO4在80℃下以0.6mL/min进行洗脱。使用折射率检测器RID-10A(Shimadzu)监测洗出液。

用于生长曲线谱的微孔板培养。对于菌株的微孔培养，使用BioscreenC(GrowthCurvesLtd.)。将过夜的预培养物沉淀，用脱矿质水洗涤，在脱矿质水中稀释至两倍于接种所需的OD600。以所需浓度的两倍制备培养基。在蜂窝结构孔板的一个孔中，将150μl培养基与150μl细胞悬液混合。一式三份地进行测量。BioscreenC的设定为维持在30℃孵育温度，每15分钟进行测量，连续式摇动，振幅最大，速度正常。摇动被设定为在测量之前中止5秒。

自动化转化和菌落挑取。为了产生饱和诱变文库向模型菌株的转化，在YPM中(针对RN1053)或YPX中(针对YD01227)中进行摇瓶培养(参见下文)。使酵母细胞沉淀，随后用于基于Schiestl和Gietz(1989)的自动化转化规程中。将转化混合物涂布在选择培养基上，所述选择培养基由酵母氮源(Sigma-Aldrich；6.7gl^-1)、琼脂(BDBiosciences；15gl^-1)、补充的2％麦芽糖(RN1053转化)或3％木糖(YD01227转化)组成。将转化板在30℃下孵育，菌落形成后使用自动化方法对菌落进行再涂布，将菌落转移到包含上述选择培养基的96微量滴定板(MTP)中。将含有转化体的MTP在30℃下孵育，直至观察到明显的生长。

NMR分析。为了量化样品中的葡萄糖、木糖、甘油、乙酸和乙醇，将100μl样品准确转移到合适的小瓶中。随后添加100μl内标溶液，其包含D₂O中的马来酸(20g/l)、EDTA(40g/l)和痕量的DSS(4,4-二甲基-4-硅杂戊烷-1-磺酸)以及450μLD₂O。

1D¹HNMR光谱通过配备冷冻探针的BrukerAvanceIII700MHz，使用水峰压制脉冲程序(功率对应于3Hz)在27℃下记录。

分析物浓度基于下列信号计算(相对于DSS的δ)：

·5.22ppm处的α-葡萄糖峰(d,0.38H,J＝4Hz),

·5.18ppm处的α-木糖峰(d,0.37H,J＝4Hz),

·3.55ppm处的甘油峰(dd,2H,J1,2＝6Hz,J1a,1b＝12Hz)

·1.91ppm处的乙酸峰(s,3H)

·1.17ppm处的乙醇峰(t,3H,J＝7Hz)

·针对标准品的信号使用：

·6.05ppm处的马来酸峰(s,2H)

实施例1-己糖转运蛋白基因缺失

缺失盒构建。质粒构建中使用的引物在表3中示出；产生的质粒在表4中示出。采用用于克隆的限制性位点和用于将缺失构建体从质粒骨架释放的位点的方案在表5中示出。

表3：实施例中使用的引物(寡核苷酸)

表4：菌株构建中使用的质粒

表5：克隆方案

使用引物SEQIDNO1和2由质粒pFA6-kanMX4扩增kanMX标记物(http://www-sequence.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/kanmx4.txt)。随后，通过用引物SEQIDNO3和4进行PCR扩增添加loxP侧翼，从而在kanMX标记物的序列两侧加上loxP位点(floxed)。再扩增用引物SEQIDNO5和6进行。将所得loxP-kanMX-loxP片段在pCR-BLUNT中克隆，产生pRN201(SEQIDNO:7)。

对于pRN251(SEQIDNO:8)的构建，将hphMX从pGRE3:hphMX中分离(Kuyper等，2005)。为了适当地使MluI位点缺失，将hphMX附近的限制性位点pGRE3:hphMX用Eco32I切割并重新连接。随后，hphMX作为XhoI-MluI片段克隆到被SalI和MluI消化的pRN201中以代替kanMX。

对于pRN365(SEQIDNO:9)的构建，使用SEQIDNO:10和-11的引物由pYL16(WernerBioagents)对诺尔斯氏链霉菌(Streptomycesnoursei)nat1基因进行PCR扩增。将PscI-ScaInat1片段连同Acc65I-NcoIpRN201-片段克隆到已经用Acc65I和ScaI线性化的pRN201中，以将kanR代替为nat1。

对于pRN447(SEQIDNO:12)的构建，将pRN201用PmlI消化。这有两个目的。首先，使印度施坦链异壁菌(Streptoalloteichushindustanus)ble(博莱霉素或腐草霉素抗性基因)ORF分离；其次，在PmlI-消化的pRN201再连接后使NcoI位点缺失。随后，将作为NcoI-PmlI片段的ble和作为BamHI-NcoI载体片段的pRN201的一部分克隆到再连接的pRN201(缺失ble)中，用BamHI和ScaI消化，从而产生pRN447。

对于HIS3缺失构建体，使用引物SEQID13和-14由酵母基因组DNA扩增HIS3基因座。用于切除HIS3侧翼并将这些连接至序列两侧加上loxP位点的kanMX标记物的位点在表5中示出。将连接产物用SacI和ApaI消化并克隆到用SacI和ApaI消化的pCR-BLUNT中。所得质粒为pRN247(SEQIDNO:15)。

对于酿酒酵母中八种主要的己糖转运蛋白(HXT1-7和GAL2)的缺失，产生四种缺失构建体(参见表4)。每种缺失构建体包含不同的序列两侧加上loxP位点的显性抗性标记物。对于每种HXT基因，使用表3中列出的引物(SEQIDNO:16-31)以RN1001基因组DNA作为模板对400-700bp侧翼进行扩增。使用表5列出的片段和克隆位点来连接上游侧翼、显性抗性标记物和下游标记物。使用上游侧翼的正向引物和下游侧翼的反向引物(引物组合SEQIDNO:16+19、SEQIDNO:20+27、SEQIDNO:24+23和SEQIDNO:28+31)对连接进行扩增。将融合的PCR片段克隆到pCR-BLUNT中以获得pRN485、pRN566、pRN569、pRN635(分别为SEQIDNO:32-35)。为获得高质粒DNA产率，使用XtraMidi试剂盒(Bioké,Leiden,theNetherlands)从50mL大肠杆菌培养物中分离质粒。在转化至酵母之前，通过用表5中列出的释放限制性位点进行消化来将缺失构建体从质粒骨架中释放。

菌株构建。通过在HIS3基因座处插入loxP-kanMX-loxP(从pRN247释放；SEQNOID15)来使木糖发酵菌株RN1001成为组氨酸营养缺陷型。随后，通过质粒pRN187(衍生自pSH65，表达半乳糖可诱导的cre重组酶；SEQIDNO60)的瞬时表达来移除标记物。针对腐草霉素(phleo)选择pRN187的引入，并且在补有半乳糖的YP-培养基上诱导CRE重组酶表达。所得his3:loxP菌株被命名为RN1041。己糖转运蛋白以下列顺序缺失：1)HXT3-HXT6-HXT7簇、2)HXT5-HXT1-HXT4簇、3)GAL2、4)HXT2。通过表5中列出的酶组合进行切割来使缺失构建体线性化或从质粒骨架释放并且将这些整合在RN1041的基因组中。将所有转化物均涂布在补有20g/L麦芽糖的酵母提取物(10g/L)、蛋白胨(20g/L)琼脂(15g/L)培养基上。将麦芽糖加入培养基中，因为此二糖的摄取经由葡萄糖转运系统的替代转运系统进行(Wieczorke等，1999)。随着HXT基因(簇)的每个缺失，将额外标记物以下列顺序插入：1)hphMX、2)natMX、3)zeoMX、4)kanMX。随着每种插入的额外标记物，将相应的抗生素以下列顺序额外地补充到培养基中：1)HG、2)HG和nour、3)HG、nour和phleo,4)HG、nour、phleo和G418。在整合所有四个缺失构建体后，在所有四种抗生素的选择下来分离单菌落。通过对基因组DNA分离物进行PCR分析来检验正确的整合。使用整合位点外的引物(组合SEQIDNO:36+37、SEQIDNO:38+39、SEQIDNO:40+41、SEQIDNO:42+43；表3中列出的序列)。

菌株表征。为表征(中间)己糖转运蛋白菌株，进行摇瓶培养。培养物以OD600＝0.1接种。所得菌株RN1053(Δhxt1-7；gal2-突变RN1041；精确基因型参见表2)在补有0.2gl^-1组氨酸(Sigma-Aldrich；Verduyn-尿素-his；用于补充组氨酸营养缺陷型)和15gl^-1葡萄糖和20gl^-1木糖的Verduyn-尿素(根据将尿素用作氮源的Verduyn矿物培养基；Luttik等，2001)上显示出生长迟缓模式，仅在60小时之后在葡萄糖上开始缓慢生长；有趣的是，当葡萄糖存在于培养基中时，木糖也在150小时之后完结(图1)，这表明隐匿(cryptic)己糖转运蛋白基因(HXT8-17)中的一个或更多个在葡萄糖上诱导并促进木糖转运(图1)。然而，在作为唯一碳源的木糖上，RN1053在培养期间未在Verduyn-尿素(+20gl-1％木糖)上生长(图2)，这表明菌株可用作测试推定木糖转运蛋白的模型菌株。将RN10153进一步在YPM上维持。

实施例2–己糖激酶基因缺失

缺失盒构建。对于己糖激酶基因的缺失，设计寡核苷酸(表3中的SEQIDNO)，其由60个与己糖激酶基因基因座同源的核苷酸侧翼序列和20个与序列两侧加上loxP位点的显性抗性标记物盒同源的核苷酸构成。使用寡核苷酸来扩增缺失构建体。后续的PCR产物被柱过滤器纯化(FermentasGeneJet试剂盒)并且用于转化实验。使用三种类型的缺失盒：首先，对于GLK1和HXK2缺失，使用二分系统。一个片段由lox66位点、KanMX、CRE的GAL1启动子上游和CRE的5’-部分(CRE1)组成，其采用一个基因特异性引物(对于GLK1为SEQIDNO:44，对于HXK2为SEQIDNO:45)和一个pSUC227特异性引物(SEQIDNO:46)由pSUC227扩增；第二片段由与CRE1重叠的CRE3’-部分(CRE2)和lox71位点组成，其同样采用一个基因特异性引物(对于GLK1为SEQIDNO:47，对于HXK2为SEQID48)和一个pSUC225特异性引物SEQIDNO:49由pSUC225扩增。通过同源重组，两个片段在己糖激酶基因座处整合为lox66-kanMX-CRE-lox71(PCT/EP2013/055047中提供的pSUC225和pSUC227序列和方法)。其次，对于HXK1(引物SEQIDNO:50-51)和GAL1(引物SEQIDNO:52-53)缺失，将序列两侧加上loxP位点显性抗性标记物(DRM)用与相应己糖激酶同源的侧翼序列扩增以代替基因座处的编码区域；作为用于DRM盒的PCR扩增模板，分别使用pRN774(loxP-hphMX-loxP；SEQIDNO:54)和pRN775(loxP-natMx-loxP；SEQIDNO:55)。第三，对于允许通过转运蛋白附加体质粒补充营养缺陷型表型的HIS3缺失，整合具有HIS3-同源侧翼的相似构建体，如同用于产生RN1041的(RN1001-his3:loxP，在菌株家族RN1053中；参见上述实施例1)。在这种情况下，构建体携带作为显性抗性标记物的natMX而非kanMX(SEQIDNO61)。

菌株构建。对于不能进行己糖代谢但能进行己糖转运的菌株的产生，在木糖发酵菌株RN1014中进行己糖激酶基因缺失(缺失方案见表2；图3)。

如所提及的，就GLK1和HXK2而言，破坏盒是二分的。通过同源重组，两个片段在己糖激酶基因座处整合为lox66-kanMX-CRE-lox71。针对补有G418的YPD选择整合。用于HXK1和GAL1的破坏盒分别由一个片段：loxP-natMX-loxP或loxP-hphMX-loxP组成。用纯化的PCR产物转化RN1014并且针对适当的抗生素选择整合。另外，用用于产生RN1053的类似构建体(SEQIDNO:61)破坏HIS3。在这种情况下，natMX代替kanMX为选择标记物。

基因以下列顺序缺失：1)GLK1、2)HXK1、3)GAL1、4)HXK2和5)HIS3。在GLK1和HXK1缺失后，两种标记物均通过半乳糖诱导的Cre-介导重组来进行再循环。在HXK2缺失后，将中间菌株维持在含有木糖的加富培养基(YPX)上。在HIS3缺失后，通过半乳糖诱导的CRE重组来移除整合的hphMX和kanMX标记物。为了确保菌株的生长，将2％木糖加入YP2％半乳糖+诺尔丝菌素(YPGX)中。根据诺尔丝菌素的选择确保了natMX标记物维持在HIS3基因座处，从而保留了后来可能使用的选择性状。单菌落分离后，通过菌落PCR检验菌株的缺失和δ序列谱，命名为YD01227。

菌株表征。在使用Verduyn-尿素-his的需氧摇瓶培养实验中，在预筛选中表征具有与YD01227相同的四倍(quadruple)己糖激酶敲除(KO)基因型(col2)的另一菌落在不存在和存在过量葡萄糖(10％)时其消耗木糖的能力及其消耗葡萄糖的能力(图4)。培养物以OD600＝0.1接种。RN1014和四倍己糖激酶KO两者均能在木糖上生长并且消耗木糖(数据未示出)。意料的是，四倍己糖激酶KO既不在葡萄糖上生长也不消耗葡萄糖，而RN1014可以(数据未示出)。此外，过量的葡萄糖(10％)阻止在木糖上的生长以及对木糖的消耗达至少96小时，而RN1014利用木糖(图4)。

在BioscreenC实验中，对YD01227和上述col2在补有不同糖和糖混合物的Verduyn-尿素-his上的生长进行筛选。培养物以OD600＝0.05接种。YD01227在木糖上生长，但不能在葡萄糖、麦芽糖或半乳糖上生长(数据未示出)。对葡萄糖-木糖混合物进行筛选以支持适于筛选戊糖特异性转运蛋白的培养基组成的选择。从图5中看出，采用5:1的葡萄糖:木糖比率显示出对菌株YD01227在木糖上的最佳生长抑制。对于高糖负载(10:2)和低糖负载(2.5:0.5)均是如此。将YD01227进一步维持在YPX上以供储存和处理。

实施例3GAL2饱和诱变文库和其它构建体。

用于野生型(WT)GAL2的合成DNA构建体购自GeneArt(SEQIDNO:56；Invitrogen)并且用作定点诱变的模板。将合成WTGAL2DNA构建体克隆到pRN993(SEQIDNO:57)中作为XbaI-BssHII片段，从而用合成的WTGAL2构建体交换另一ORF，以产生pDB1250(SEQIDNO:58)。pDB1250为基于pRS313的酵母穿梭载体，其具有除合成制备的GAL2ORF之外的最突出的特征：1)HIS3表达盒，其补充组氨酸营养缺陷型；2)CEN.ARSH，其维持酵母细胞中表达载体的1-2个拷贝(低拷贝数)；3)截短的HXT7启动子(-491bp)，其导致下游ORF的中等表达水平；4)ADH1终止子；和5)氨苄青霉素抗性基因(amp^r)，其用于在大肠杆菌TOP10细胞(参见上文)进行选择以用于克隆目的(图6)。用于Gal2p中30个氨基酸位置上至少13个非野生型氨基酸变化的饱和诱变库购自InvitrogenLifeTechnologies.(http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/ Cloning/gene-synthesis/directed-evolution/GeneArt-Site-Saturation-Mutagenesis.ht ml)；关于野生型Gal2p氨基酸序列(SEQIDNO:59)的位置和氨基酸变化参见表6。

表6：GAL2单位点饱和诱变文库

通过GeneArt(Invitrogen,Regensburg,Germany)的定制克隆将所得构建体插入pDB1250(SEQIDNO:ID58)中。

实施例4：葡萄糖转运活性反向筛选

目的。使用葡萄糖转运活性反向(GTAC)筛选，即转化己糖激酶-突变菌株YD01227作为宿主来引入GAL2变体并且筛选培养基上的所得转化体在存在葡萄糖的情况下的木糖上的生长和木糖消耗(葡萄糖的量为木糖的5倍)，可鉴定出在存在过量葡萄糖的情况下优先木糖的Gal2p变体中的突变(即，对木糖的亲和力高于对葡萄糖的亲和力，降低或更优选地完全消除葡萄糖转运能力，而将木糖转运能力保持为几乎不受损)。

转化和菌落挑取。将YD01227用总共497个构建体转化，每个构建体具有GAL2突变体。包括一个具有野生型GAL2序列(pDB1250；SEQIDNO:58)的构建体作为对照。对于每种转化，当可用时，将3个菌落再涂布于总计1450个转化体的琼脂培养基MTP上。这1450个转化体分三部分筛选。对于每个筛选部分，包括野生型GAL2作为对照。

预培养和筛选。对于预培养，通过自动化方法将转化体从选择琼脂培养基MTP转移到96孔半深孔板(96HDWP)，所述96孔半深孔板包含由补有3％木糖的矿物培养基组成的液体选择培养基(根据Verduyn，尿素作为氮源)。将96HDWP在定轨摇床中以30℃和750rpm进行3天的预培养。随后，对于每个孔，通过自动化方法将20μl培养物转移至包含2.5mlVerduyn-尿素的24深孔板(24DWP)，Verduyn-尿素补有比率为5:1的葡萄糖：木糖的糖混合物，浓度为：10gl^-1葡萄糖和2gl^-1木糖(YD10-培养基)。对于三个采样点中的每一个，对一系列的24DWP进行接种。在每个24DWP上，接种一个RN1001生长对照以具有板变动效应的指示。在24小时、72小时和96小时的自动采样后，进行向96HDWP的转移以用于600nm波长处的自动OD测量。

在96小时后的最后OD测量之后，细胞在离心后沉淀并通过自动化方法收集100μl上清液，以便对培养后培养基中的残余组分进行流动-NMR分析(关于方法描述参见上文)。对于每个构建体和每个时间点，对不同重复所测量的残余葡萄糖和木糖浓度进行平均。为了将不同的筛选部分进行比较，根据下式，基于与特定GTAC筛选部分中所测量的野生型残余木糖浓度的差异来计算相对值：

结果。尽管RN1001显示出葡萄糖和木糖的完全消耗，野生型和诱变文库GAL2构建体的YD01227转化体未消耗葡萄糖并且显示出代表其各自在存在葡萄糖的情况下消耗木糖的能力的残余木糖浓度谱(图7A)。如图7B中所示，木糖消耗显示出与生长测量(OD600)的高相关性(R²＝0.93)。由于筛选在需氧条件下进行，并且显示出极少乙醇形成(数据未示出)并且生长显示与木糖消耗的高相关性，因此将残余木糖浓度用作对GAL2变体与野生型进行比较的主要参数。所有测试的突变GAL2变体相对于野生型GAL2在96小时关于木糖消耗(平均RelXyl)的比较在表7中列出。所有影响对木糖转运有利的葡萄糖转运的突变均具有>0的RelXyl(表7)。用作靶标进行第二轮诱变的最佳(TOP)位置基于其每突变的平均RelXyl得分进行分选；还根据优选性基于RelXyl得分分选特定的突变(表8)。

表7.GTAC筛选的相对OD600(RelOD600)和木糖消耗(RelXyl)。野生型GAL2构建体pDB1250设定为0。RelOD600值为1-3次重复的平均值并且为相比于野生型的相对值。

位置	wtAA	MutAA	Relxyl
				85	F	A	1.45
		C	0.66
						D	-1.89
		E	-13.09
						G	-1.06
		H	1.76
						K	-20.81
		M	7.03
						N	1.96
		P	2.83
						Q	37.68
		R	-1.93
						S	19.81

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						T	50.51
		V	32.76
				89	T	A	11.68
		C	13.22
						D	19.68
		F	-9.97
						H	25.59
		I	-17.32
						K	-24.84
		L	12.38
						M	-8.38
		N	9.88
						Q	-16.03
		R	-16.11
						S	-11.44
		V	41.06
						Y	-2.89
187	V	A	26.84
						C	9.98
		D	3.76
						E	6.21
		F	14.53
						G	10.01
		H	8.32
						I	6.69
		K	4.09

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						L	4.12
		M	1.85
						Q	10.17
		R	3.05
						S	7.54
		T	10.41
						W	1.81
		Y	1.22
				191	A	C	4.70
		D	12.43
						E	-2.61
		F	5.49
						G	15.83
		H	2.83
						I	11.93
		K	1.94
						L	-8.25
		M	-14.37
						N	20.35
		P	14.89
						Q	2.94
		R	-1.09
						S	3.09
		T	10.61
						V	4.52
		W	2.49

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						Y	1.93
214	Y	A	-12.81
						C	-5.85
		G	18.41
						I	-12.07
		K	-4.66
						L	35.33
		M	23.92
						N	32.71
		P	18.44
						Q	39.94
		R	25.50
						S	14.91
		V	55.48
						W	47.35
215	Q	A	2.01
						C	9.90
		D	13.62
						F	10.12
		G	-9.62
						H	-18.18
		I	17.72
						L	24.63
		M	21.59
						N	-11.47
		S	2.14

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						V	-8.22
		W	-20.47
						Y	-8.07
218	I	A	17.98
						C	5.52
		D	4.64
						E	8.44
		G	4.62
						H	9.88
		K	27.86
						L	9.73
		M	5.80
						N	24.31
		R	-0.73
						S	24.96
		T	-2.65
						V	7.69
		W	-2.10
				219	T	A	52.55
		C	25.05
						D	18.04
		E	-14.58
						F	43.86
		G	46.45
						I	-11.07
		K	-4.44

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						M	-18.28
		N	7.85
						Q	-22.81
		R	-24.62
						S	4.90
		W	-16.77
				222	I	A	11.37
		C	13.45
						D	20.91
		E	3.35
						G	3.75
		H	9.73
						K	-4.92
		M	4.39
						P	0.97
		S	1.85
						T	-1.59
		V	8.42
						W	-8.04
		Y	7.87
				226	Y	A	63.63
		C	62.07
						D	81.68
		E	70.43
						G	39.06
		H	5.10

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						I	32.79
		K	-1.86
						L	42.48
		M	74.04
						N	62.81
		P	49.78
						Q	56.23
		R	65.53
						S	14.97
		T	7.27
						V	-11.15
		W	44.48
				338	Q	A	38.18
		C	52.66
						D	33.17
		E	46.93
						F	46.65
		G	13.80
						H	26.28
		I	28.32
						L	33.08
		M	-2.53
						N	22.26
		P	3.96
						R	39.83
		S	3.96

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						T	11.84
		V	24.84
						W	35.55
		Y	19.90
				339	M	A	50.56
		C	30.36
						D	46.71
		E	10.48
						F	63.75
		G	73.03
						H	67.99
		I	40.96
						K	71.92
		L	67.43
						N	83.73
		P	12.77
						Q	77.74
		R	70.25
						S	81.65
		T	57.02
						V	82.35
		W	-23.02
						Y	37.43
341	Q	D	-20.08
						E	-3.38
		H	-22.19

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						L	46.71
		M	23.17
						N	11.77
		R	-5.18
						S	15.78
		T	28.67
						Y	19.78
342	Q	A	61.47
						C	64.63
		D	48.62
						E	34.90
		F	45.61
						G	14.10
		H	46.28
						I	16.81
		K	41.75
						L	37.38
		M	27.70
						N	32.30
		P	44.88
						R	23.95
		S	68.48
						T	50.54
		V	24.39
						W	59.43
		Y	76.45

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
				343	L	A	9.67
		C	8.74
						D	9.41
		E	2.39
						F	15.49
		G	11.87
						H	16.96
		I	10.67
						K	40.15
		M	16.94
						N	14.03
		P	26.08
						Q	8.73
		R	29.11
						S	20.28
		T	14.38
						V	-6.06
		W	7.76
						Y	20.43
346	N	A	21.99
						C	17.11
		D	8.88
						E	-8.32
		F	9.91
						G	8.42
		H	26.01

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						I	17.12
		K	17.48
						L	6.48
		M	13.19
						Q	19.93
		R	7.94
						S	23.37
		T	23.19
						V	47.09
		W	45.58
						Y	41.70
347	N	A	44.64
						D	26.67
		E	25.36
						G	-22.71
		H	11.18
						I	27.33
		K	-22.05
						L	7.79
		Q	-14.96
						R	-15.36
		S	-15.56
						T	-19.33
		V	-28.12
				350	Y	D	2.93
		E	-13.15

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						H	-19.99
		I	-10.76
						K	3.00
		L	40.49
						M	5.01
		N	13.57
						Q	0.66
		R	57.58
						S	15.25
		T	21.64
						V	13.39
		Y	-7.36
				373	G	A	25.90
		C	36.56
						D	36.22
		E	41.01
						F	15.15
		H	6.96
						I	9.10
		K	20.72
						L	51.94
		M	35.03
						N	38.49
		P	35.75
						Q	5.50
		R	8.35

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						S	11.62
		T	10.67
						V	21.91
		W	22.96
						Y	31.04
376	N	A	36.70
						C	78.63
		D	19.23
						E	20.15
		F	92.62
						H	39.30
		I	99.46
						K	7.53
		L	93.69
						M	97.33
		P	51.70
						Q	24.24
		R	27.86
						S	59.39
		T	99.01
						V	96.57
		W	13.51
						Y	43.95
380	T	A	53.06
						C	42.34
		D	37.28

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						E	-29.92
		F	54.67
						G	34.22
		I	47.40
						K	42.12
		L	39.25
						M	74.78
		N	49.79
						P	43.28
		Q	43.31
						R	42.31
		S	42.03
						V	42.53
		W	51.16
						Y	25.09
383	S	A	57.21
						C	67.78
		D	29.42
						E	54.55
		F	52.71
						G	39.71
		I	25.88
						K	49.19
		L	37.72
						M	52.64
		N	58.14

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						Q	83.94
		R	61.78
						T	71.85
		V	19.38
						W	65.32
		Y	62.76
				444	F	A	32.41
		C	14.64
						D	13.21
		E	16.38
						G	12.78
		H	25.62
						I	31.95
		K	28.79
						L	39.43
		M	17.30
						N	5.43
		P	15.65
						Q	19.63
		R	0.06
						S	10.94
		T	7.44
						V	37.29
		W	2.94
						Y	32.56
446	F	D	10.80

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						E	10.63
		H	16.93
						I	8.65
		K	-3.40
						L	22.78
		M	18.62
						N	14.99
		Q	34.25
						R	-8.44
		S	-20.59
						T	-16.07
		V	-9.48
				448	T	A	76.95
		C	58.53
						D	66.10
		E	53.25
						F	61.94
		G	65.05
						H	67.00
		I	58.01
						K	54.82
		L	63.49
						M	77.64
		P	64.39
						Q	58.15
		R	33.80

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						S	59.40
		V	53.50
						W	56.69
		Y	47.73
				449	T	A	57.64
		C	50.44
						D	55.89
		E	37.14
						F	92.65
		G	61.00
						H	82.47
		I	71.71
						K	79.30
		L	81.03
						M	89.29
		N	84.60
						P	37.06
		Q	81.19
						R	82.14
		S	83.15
						V	74.98
		W	80.75
						Y	79.80
451	T	C	10.57
						D	9.68
		E	15.39

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						F	13.38
		G	43.34
						H	7.65
		I	17.96
						K	8.59
		L	11.00
						M	5.68
		N	14.56
						P	11.89
		Q	8.63
						R	4.46
		S	13.08
						T	2.10
		V	4.99
						W	15.25
		Y	1.62
				455	W	A	1.31
		C	1.19
						D	-6.13
		E	19.68
						F	-1.57
		G	0.73
						I	-2.70
		K	6.91
						L	19.08
		M	19.92

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						N	19.10
		P	14.76
						Q	3.03
		R	-14.86
						S	8.05
		T	19.75
						V	10.66
		Y	7.30
				478	N	A	-11.71
		C	-1.14
						D	-3.08
		F	30.35
						G	8.29
		H	-15.02
						I	10.06
		K	9.95
						L	-3.27
		P	30.98
						Q	4.37
		R	11.41
						V	21.91
		W	3.25
						Y	4.98
479	W	C	13.20
						D	6.12
		E	11.20

位置	wtAA	MutAA	RelXyl
						F	1.41
		G	1.34
						H	6.90
		I	1.50
						K	5.54
		L	7.80
						M	5.47
		N	2.20
						P	7.07
		Q	15.50
						R	1.63
		S	18.50
						T	21.51
		V	5.89
						Y	8.63

表8.GTAC筛选中鉴定的Gal2p位置和突变根据优选性进行排序。评分最佳命中(SCORETOPHIT)为位置中与野生型Gal2p相比得到最明显改善的氨基酸替换的RelXyl得分。这允许对在Gal2p中靶向的最有影响力的突变和相关位置靶标进行分选以消除葡萄糖亲和力。

当野生型氨基酸Asn交换成具有大疏水性侧链的氨基酸(例如Phe、Ile、Leu、Met、Thr或Val)时，在位置376处发现最突出的突变；这些变体促进明显的生长和几乎完全的木糖消耗并且在GTAC筛选中几乎没有针对葡萄糖的转运活性(图8)。我们发现位置376处的有利氨基酸的范德瓦尔斯体积为85至并且疏水性为10至100Δt_R，或在一个实施方案中，范德瓦尔斯体积为100至并且疏水性为10至100Δt_R。另一个重要的实施方案为位置339处的特定氨基酸，在所述位置处，我们已发现疏水性为-30至10Δt_R的氨基酸导致葡萄糖转运活性降低的突变体。这由图11示出。

本文中所用的氨基酸的范德瓦尔斯体积值如http://www.proteinsandproteomics.org/content/free/tables_1/table08.pdf中所述。相对应的文献为N.J.Darby,ThomasE.Creighton,ProteinStructure(1993)OxfordUniversityPress。本文中所用的氨基酸的疏水性值(Δt_R)如http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/psc.310010507/pdf中所述。与此相对应的参考文献为Monera,O.D.等，JournalofPeptidescience，第1卷，第319-329页(1995)。

实施例5:木糖转运活性筛选

目的。使用木糖转运活性(XTA)筛选，即使用己糖转运蛋白-突变菌株RN1053作为宿主来引入GAL2变体并且筛选在低木糖(1gl^-1)浓度下生长的培养基上的所得转化体，可鉴定出提高Gal2p变体中木糖转运活性的突变。转运活性可由多于一个的参数定义，例如，转运蛋白的亲和力(由Michaelis常数，即K_m表示)或转运蛋白速率(以V_max表示)。突变还可增加转运蛋白的表达，并因此改善宿主细胞的木糖转运活性。

转化和菌落挑取。将RN1053用总共468个构建体转化，每个构建体具有GAL2突变体。包括一个具有野生型GAL2序列(SEQ.ID58)的构建体作为对照。对于每种转化，将1-3个菌落再涂布于总计1229个转化体的琼脂培养基MTP上。将1229转化体分两部分筛选。对于每个筛选部分，包括野生型GAL2作为对照。

预培养和筛选。对于预培养，通过自动化方法将自动化转化和菌落挑取获得的转化体从选择琼脂培养基MTP转移到96HDWP，所述96HDWP的每个孔包含250μl补有2％麦芽糖的Verduyn-尿素。在定轨摇床中以30℃和750rpm进行3天的预培养后，将5μl培养物转移至包含250μl补有1gl^-1木糖的Verduyn-尿素(RN01-培养基)的三个不同的96HDWP，每个96HDWP表示一个采样点。在每个板(24DWP或96HDWP)上，接种至少一个RN1001生长对照以具有板间效应的指示。24小时、72小时和96小时后，收获一系列96HDWP以进行600nm波长处的自动OD测量。对于每个构建体和每个时间点，对不同重复的OD600值进行平均。为了将不同的筛选部分进行比较，根据下式，基于与特定XTA筛选部分中所测量的野生型OD600值的差异来计算相对值：

结果。在XTA筛选的两个部分中，RN1001为基于与野生型Gal2p相比的生长曲线的最佳15位置的一部分；RN1001具有完全互补的己糖转运蛋白，并且在XTA筛选的两个部分中最佳15中存在RN1001(图9)表明酵母中的一种或多种内源己糖转运蛋白促进高亲和力木糖摄取，这与显示出较不良生长曲线的野生型Gal2RN1053-转化体形成对比。在最佳15中存在单一氨基酸变化的突变变体与野生型Gal2p相比显示出提高的对木糖的亲和力，并且朝向RN1001生长曲线发展，或甚至在低木糖浓度下显示出类似或改善的生长特性。有趣的是，当对酿酒酵母己糖转运蛋白家族的氨基酸序列进行比对时，最佳15中发现的一些Gal2p突变(例如N346D和M339S)将分别存在于Hxt2(S324)和Hxt11(D336和S329)的野生型序列中。所有测试的突变GAL2变体相对于野生型GAL2在96小时关于生长(平均RelOD600)的比较在表8中列出。提出RelOD600>0的所有突变对木糖亲和力具有正面效应。

表9.XTA筛选中筛选的Gal2p突变体的平均RelOD600值。

野生型GAL2构建体pDB1250设定为0。RelOD600值为1-3次重复的平均值并且为相比于野生型的相对值。

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
				85	F	A	-2.50
		C	-1.81
						D	-32.03
		E	-37.55
						G	-51.06
		H	-35.08
						K	-27.75
		N	-6.14
						P	-23.27
		Q	-0.27
						R	-18.30
		S	7.30
						T	-6.07
		V	2.40
				89	T	A	-1.12
		C	19.39
						E	-13.89
		I	-20.86

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						K	-13.89
		L	1.12
						M	-9.48
		N	-8.70
						Q	-4.57
		R	-10.12
						V	3.11
		W	-43.47
						Y	0.01
187	V	A	-10.62
						C	14.34
		D	-5.07
						E	-2.94
		F	-6.14
						G	14.77
		H	-2.79
						I	15.55
		L	10.08
						M	36.83
		Q	26.77
						R	-11.36
		S	-28.01
						T	-10.54
		W	-17.20
						Y	11.95
191	A	C	5.10

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						D	7.05
		E	0.58
						F	-1.81
		G	-4.01
						H	-12.93
		I	10.13
						K	7.11
		M	-4.82
						N	4.60
		P	1.90
						Q	-8.47
		R	3.34
						S	-19.15
		T	-2.00
						V	-9.91
		W	4.10
						Y	-15.24
214	Y	A	-3.04
						C	-12.04
		G	-6.92
						I	-6.92
		K	-4.15
						L	6.02
		M	-26.59
						N	-9.60
		P	5.35

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						Q	-26.44
		R	-29.77
						S	-37.90
		W	-21.91
				215	Q	A	1.54
		C	5.92
						D	25.93
		E	20.81
						F	3.28
		I	-5.50
						L	8.24
		M	11.19
						R	-48.74
		S	16.66
						V	-21.07
		W	-39.22
						Y	-24.30
218	I	A	-15.52
						C	-13.03
		D	-19.50
						E	-15.31
		G	-9.12
						H	-9.12
		K	-10.19
						L	-15.45
		M	-24.27

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						N	-23.20
		R	-13.39
						S	-13.60
		T	-15.95
						V	-4.00
		W	40.30
				219	T	A	-6.71
		C	-20.53
						D	-21.69
		E	3.47
						F	-17.01
		G	-35.80
						I	-47.23
		L	3.78
						M	-20.00
		N	-13.93
						P	-18.27
		Q	-14.25
						R	7.17
		S	-18.08
						V	11.19
		W	-15.13
				222	I	A	-7.91
		C	-6.92
						D	-12.54
		E	-16.80

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						G	28.78
		H	-13.50
						K	-48.17
		M	20.18
						P	11.01
		R	-0.62
						S	3.03
		T	10.25
						V	-12.55
		W	11.38
						Y	23.82
226	Y	A	23.92
						C	-6.78
		D	-12.89
						E	5.10
		F	-28.04
						G	-4.64
		H	-11.26
						I	-12.46
		K	-10.55
						M	24.16
		N	-4.86
						P	20.39
		Q	0.33
						R	-9.19
		S	-5.78

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						T	23.80
		W	-5.71
				338	Q	A	4.10
		C	10.88
						D	7.99
		E	3.59
						F	0.45
		G	5.29
						H	11.63
		I	12.95
						L	0.58
		M	4.79
						N	14.12
		P	2.21
						R	15.03
		S	-17.02
						T	-26.76
		V	-11.33
						W	-6.92
		Y	-17.30
				339	M	A	28.42
		C	20.32
						D	-0.09
		E	18.97
						F	4.17
		G	-20.00

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						H	-14.46
		I	-17.55
						K	-11.75
		L	21.03
						N	4.25
		P	-4.64
						Q	-3.65
		R	-7.91
						S	54.52
		T	10.79
						V	-11.90
		W	6.56
						Y	38.66
341	Q	D	-10.62
						E	-8.13
		H	2.89
						K	-21.66
		L	-22.79
						M	-11.30
		N	-13.31
						R	-10.76
		S	7.16
						T	-3.08
		V	18.89
						Y	9.37
342	Q	A	-15.66

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						C	2.04
		D	-12.54
						E	-9.23
		F	33.22
						G	42.01
		H	45.21
						I	34.38
		K	12.92
						L	28.91
		M	7.99
						N	45.31
		P	-7.15
						R	44.36
		S	22.25
						T	20.62
		V	-16.07
						W	32.62
		Y	-21.41
				343	L	A	15.98
		C	7.16
						D	-12.82
		E	9.65
						F	-6.07
		G	-6.63
						H	-9.83
		I	19.04

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						K	2.40
		M	-0.73
						N	0.97
		P	4.53
						Q	19.53
		R	-10.62
						S	10.72
		T	-6.46
						W	0.69
		Y	29.99
				346	N	A	26.36
		C	15.73
						D	69.10
		F	10.15
						G	24.01
		H	-4.93
						I	0.76
		K	-1.66
						P	-0.80
		Q	-5.28
						R	-7.84
		V	-44.97
						Y	-3.51
347	N	D	5.29
						E	-24.11
		G	7.59

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						H	-4.57
		I	-3.08
						K	9.65
		L	14.52
						Q	6.55
		R	-1.93
						S	18.92
		T	2.61
						V	6.09
350	Y	D	-2.08
						E	39.52
		I	-28.19
						L	33.56
		M	7.09
						Q	6.95
		R	-40.48
						S	7.93
		T	-6.33
						V	-15.81
		Y	-9.27
				373	G	A	-51.50
		E	-50.72
						F	-47.17
		H	-37.99
						I	2.84
		K	15.40

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						L	18.36
		M	14.21
						N	21.06
		Q	14.02
						R	32.18
		S	18.92
						T	-11.04
		V	-6.71
						W	-5.20
		Y	1.21
				376	N	A	10.19
		C	24.67
						D	8.93
		E	10.19
						F	-13.02
		H	-13.78
						I	14.59
		K	47.76
						L	-9.63
		M	6.29
						P	29.04
		Q	35.51
						R	-23.42
		S	44.42
						V	-42.40
		W	-15.74

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						Y	-21.28
380	T	A	3.56
						C	8.37
		D	24.95
						E	14.21
		F	-17.33
						G	29.22
		I	20.81
						K	14.34
		L	23.45
						M	29.16
		N	-50.25
						P	-7.46
		Q	-15.32
						R	-0.55
		S	-6.02
						V	-6.21
		W	14.78
						Y	29.48
383	S	A	16.05
						C	3.32
		D	-2.94
						E	1.97
		F	-15.10
						G	-4.50
		I	2.40

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						K	-47.86
		L	3.59
						M	-2.56
		N	-44.72
						Q	14.40
		R	21.37
						T	-28.26
		V	24.58
						W	26.71
		Y	27.84
				444	F	C	-6.49
		D	-2.08
						E	-16.16
		G	1.54
						H	-16.38
		I	-20.29
						K	-24.06
		L	-10.19
						M	-7.20
		N	-9.76
						P	-18.79
		Q	-27.18
						S	-14.45602
		W	-16.94
						Y	-18.08
446	F	D	19.61

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						E	-36.17
		H	30.98
						I	0.83
		L	-40.55
						M	-2.58
		N	-10.90
						Q	-35.54
		R	-37.62
						S	-2.94
		T	-39.41
						V	-47.79
448	T	A	10.57
						C	0.08
		D	15.78
						E	19.55
		F	-6.65
						G	16.91
		H	25.64
						I	-0.18
		K	26.65
						L	22.31
		M	0.77
						P	12.58
		Q	14.08
						R	29.22
		S	11.19

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						V
		W	8.09
						Y	-2.01
449	T	A	4.67
						C	6.59
		D	-2.58
						E	-2.08
		F	16.48
						G	11.00
		H	16.26
						I	9.51
		K	-3.51
						L	11.29
		M	-15.59
						N	-7.13
		P	8.73
						Q	13.21
		R	-10.33
						S	15.48
		V	14.41
						W	-5.78
		Y	-5.57
				451	T	C	-33.23
		D	-23.20
						F	-4.75
		G	-16.94

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						H	-41.76
		I	-40.26
						K	-8.91
		L	-23.73
						N	-6.07
		P	-6.14
						Q	-8.22
		R	-6.21
						S	2.90
		T	-11.42
						V	-5.89
		W	4.10
						Y	3.91
455	W	C	-14.75
						D	8.18
		E	4.22
						F	-2.31
		G	-10.67
						I	5.45
		K	8.12
						L	-5.96
		M	6.39
						N	-9.22
		P	0.83
						Q	0.95
		R	-48.55

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						S	-4.82
		T	-9.44
						V	-2.06
		Y	-19.81
				478	N	A	-25.74
		C	-14.75
						D	-9.91
		F	6.86
						G	0.01
		H	-13.12
						I	8.81
		K	-24.30
						P	-20.47
		Q	14.40
						R	-27.44
		W	-13.40
						Y	6.77
479	W	C	-12.96
						D	15.20
		E	18.40
						F	24.87
		H	1.83
						I	48.83
		K	8.58
						L	-3.79
		M	7.87

位置	wtAA	MutAA	RelOD600
						N	8.05
		P	-42.40
						Q	-33.73
		R	13.42
						S	57.22
		T	15.48
						V	-12.54
		Y	12.07

表10.XTA筛选中鉴定的Gal2p位置和突变根据优选性进行排序。评分最佳命中为与位置中野生型Gal2p相比得到最明显改善的氨基酸替换的RelXyl得分。这允许对在Gal2p中靶向的最有影响力的突变和相关位置进行分选以提高木糖转运活性。

实施例6至15

方法

分子生物学技术和化学品。限制性酶和T4DNA连接酶获自Fermentas(FisherScientific,Landsmeer,theNetherlands)。研究中所用的引物(SEQIDNO:1-55)在表11中示出。标准分子生物学和酵母遗传学技术根据教科书进行，包括Sambrook等，(2001；Molecularcloning:alaboratorymanual，第3版，ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NewYork,NY,USA)和Ausubel等，(1995；CurrentProtocolsinMolecularBiology)。

PCR扩增和克隆。对于PCR扩增，使用含有HF缓冲液的高保真PCR主混合物(Finnzymes；FisherScientific,Landsmeer,theNetherlands)。用于克隆和测序的引物在表11中示出(SEQIDNO:37-55)。将HXT2、HXT3-6和HXT11PCR片段克隆到基于穿梭载体pRS313酵母表达载体pRS313-P7T7(SEQIDNO56)中(Sikorski&Hieter,1989,AsystemofshuttlevectorsandyeasthoststrainsdesignedforefficientmanipulationofDNAinSaccharomycescerevisiae。Genetics,122,第19-27页)。构建体pRS313-P7T7具有截短的HXT7启动子(Hauf等，2000,SimultaneousgenomicoverexpressionofsevenglycolyticenzymesintheyeastSaccharomycescerevisiae.EnzymeMicrobTechnol,26:688-698)和HXT7终止子。在启动子与终止子之间，存在多克隆位点(MCS)。所得PCR片段由限制性酶组合消化(如下文实施例进一步描述)并且通过标准分子生物学技术克隆到酵母表达载体中。将HXT11也克隆到pRS313-P7T7-GFP中(导致SEQIDNO:57)中以用于采用荧光显微镜检查的GFP-标记Hxt11蛋白的定位研究(实施例5)。pDB1250包含截短的HXT7启动子与ADH1终止子之间的GAL2ORF(SEQIDNO:60)(序列pDB1250的引用参见SEQIDNO:58)。按照制造商的说明将质粒在DH5α细胞扩增并维持。使用GeneElute质粒小提试剂盒(Sigma-Aldrich,Zwijndrecht,theNetherlands)将质粒从大肠杆菌微培养物中分离。这些研究中使用和产生的基因/蛋白质序列和构建体在表12中列出。

表11：实施例中使用的寡核苷酸

*斜体的为HXT11侧翼序列，加下划线的为HIS3序列

RNA提取和cDNA合成。在指数期通过玻璃珠破坏/Trizol提取工序将总RNA从酵母细胞中分离。将来自2ml细胞培养物的酵母沉淀与0.2ml玻璃珠(直径0.45mm)和0.9mlTrizol混合并加入125μl氯仿，并在FastprepFP120(Bio-101,ThermoSavant,California,USA)中通过以速度6进行45秒的破裂来破坏。使用iScript试剂盒(Bio-Rad,Veenendaal,theNetherlands)用1μg总RNA来合成cDNA。

实时PCR。使用SensiMixSYBR&Fluorescein试剂盒(GCBiotech,AlphenaandenRijn,theNetherlands)和MyiQiCYCLER实时PCR仪(BIO-Rad,Veenendaal,theNetherlands)分别进行HXT1-HXT17和GAL2特异性实时PCR。各25μl反应物包含12.5μlSYBR绿主混合物、4μlcDNA、0.5μl各引物(10nM)和7.5μl无菌去离子水。PCR条件为95℃下10分钟，之后是39个扩增循环(95℃下15秒、60℃下30秒、72℃下30秒)。利用表11中示出的引物来通过PCR扩增对cDNA片段进行扩增(SEQIDNO1-36)。

易错PCR。易错PCR实验按照DNATaq聚合酶(ThermoFischer)提供的指示使用10ng模板在100μl包含5.5mMMgCl2和0.15mMMnCl2的PCR混合物中进行。

菌株维持、培养和进化工程。这些研究中产生的菌株在表13中列出。为了储存本研究中使用的菌株(表2)，在加富培养基(YP)中进行摇瓶培养，所述培养基由10gl^-1酵母提取物(Oxoid)和20gl^-1蛋白胨(BDDifco)组成，补有2％葡萄糖(YPD)、2％麦芽糖(YPM；在RN1053-衍生物的情况下)，或3％木糖(YPX；在YD01227-衍生物的情况下)。将培养物在定轨摇床中于30℃下维持直至培养物达到稳定生长期。添加甘油至30％(v/v)后，将来自摇瓶培养物的样品以2ml等分试样储存于-80℃下。

对于菌株表征和进化工程，使用根据将尿素用作氮源的Verduyn矿物培养基(Verduyn-尿素Luttik等，2001,JBacteriol,182:501-517)进行培养，所述培养基的pH为4.5，补有所需糖(混合物)。在模型菌株RN1053或YD01227的培养物中，Verduyn-尿素补有0.2gl-1组氨酸(Sigma-Aldrich；Verduyn-尿素-his)以补充组氨酸营养缺陷型。

在摇瓶中进行表征生长和糖消耗曲线的菌株的培养，BioscreenC阅读器，使用蜂窝结构孔板(GrowthCurvesLtd，由ThermoFisherScientificBV(Breda,theNetherlands)代表)。将培养物维持在30℃的温度。特别地就进化工程的目的而言，在30℃下的温度下，在用500ml补有所需碳源的Verduyn-尿素-his填充的3L搅拌槽生物反应器(Applikon,Schiedam,theNetherlands)中使恒化培养物生长。起始溶解氧(DO)设定值为5％，搅动以400rpm进行搅动，起始OD600为0.2。

表12：质粒和基因/蛋白质序列

表13：本文中使用和制备的菌株

分析方法。使用紫外可见分光光度计(NovaspecPLUS)通过600nm处的光密度(OD)来监测细胞生长。通过高效液相色谱法(Shimadzu,Kyoto,日本)使用AminexHPX-87H柱(Bio-Rad)和折射率检测器(Shimadzu,Kyoto,日本)测量(以4000rpm离心5分钟后与细胞沉淀分离的)培养物的上清液中的葡萄糖、木糖、乙醇的浓度。将柱和检测器的温度维持在65℃。流动相为流速0.55ml/min的0.005NH2SO4。

糖摄取测量。放射性标记的木糖的摄取按如下测量：使细胞在摇瓶中于补有2％木糖和0.05％麦芽糖的Verduyn-尿素中生长24小时并通过离心(3,000rpm,3min,20℃)收集，洗涤并在Verduyn-尿素重悬。将[14C]木糖或[14C]葡萄糖(CAMPROscientific,Veenendaal,theNetherlands)原液加入细胞悬液中。通过加入5ml0.1M氯化锂使反应停止(对于木糖是在1分钟后，对于葡萄糖是在15秒后)，并过滤细胞悬液(0.45μmHV膜过滤器,Millipore,France)。将过滤器用另外5ml氯化锂洗涤，并在加强乳化闪烁剂(emulsifierscintillatorplus)中用液体闪烁计数仪(Perkin-Elmer,USA)计数。用0.5、2、6、20、40mM木糖或0.1、0.4、1.5、6、20、80mM葡萄糖进行YD01227-ori和YD01227-evo的摄取实验。RN1053-HXT3-6与RN1053-mHXT3-6(N367I)、RN1053-HXT11与RN1053-mHXT11(N366D)的葡萄糖竞争研究用[14C]木糖原液和未标记的葡萄糖进行。最终木糖和葡萄糖浓度分别为50mM和50-500mM。

荧光显微镜检查。质粒pRS313-P7T7-HXT11-GFP(SEQIDNO57)转化入菌株RN1053和RN1041。将新鲜菌落接种到含有木糖或葡萄糖的基本培养基中。使取自指数生长期的新鲜液体细胞培养物(600nm的光密度为10)在NikonEclipse-Ti显微镜下经受荧光显微镜检查，所述显微镜配备100×油浸物镜、针对GFP的滤光片组和NikonDS-5Mc冷却相机。我们按常规对每个样品检查至少100个细胞，每个实验重复进行至少三次。

自动化转化和菌落挑取。为了产生饱和诱变文库向YD01227的转化，在YPM中(针对RN1053)或YPX中(针对YD01227)中进行摇瓶培养(参见下文)。使酵母细胞沉淀，随后用于基于Gietz,R.D.和Woods,R.A的自动化转化规程中。(Gietz,R.D.和Woods,R.A.2006,YeasttransformationbytheLiAc/SSCarrierDNA/PEGmethod.MethodsMol.Biol.,313:107-120)。将转化混合物涂布在选择培养基上，所述选择培养基由酵母氮源(Sigma-Aldrich；6.7gl-¹)、琼脂(BDBiosciences；15gl^-1)、补充的2％麦芽糖(RN1053转化)或3％木糖(YD01227转化)组成。将转化板在30℃下接种，菌落形成后使用自动化方法对菌落进行再涂布，将菌落转移到包含上述选择培养基的96微量滴定板(MTP)中。将含有转化体的MTP在30℃下孵育，直至观察到明显的生长。

NMR分析。为了量化样品中的葡萄糖、木糖、甘油、乙酸和乙醇，将100μl样品准确转移到合适的小瓶中。随后添加100μl内标溶液，其包含D₂O中的马来酸(20g/l)、EDTA(40g/l)和痕量的DSS(4,4-二甲基-4-硅杂戊烷-1-磺酸)以及450μLD₂O。

1D¹HNMR光谱通过配备冷冻探针的BrukerAvanceIII700MHz，使用水峰压制脉冲程序(功率对应于3Hz)在27℃下记录。

分析物浓度基于下列信号计算(相对于DSS的δ)：

·5.22ppm处的α-葡萄糖峰(d,0.38H,J＝4Hz),

·5.18ppm处的α-木糖峰(d,0.37H,J＝4Hz),

·3.55ppm处的甘油峰(dd,2H,J1,2＝6Hz,J1a,1b＝12Hz)

·1.91ppm处的乙酸峰(s,3H)

·1.17ppm处的乙醇峰(t,3H,J＝7Hz)

·针对标准品的信号使用：

·6.05ppm处的马来酸峰(s,2H)

实施例6

酿酒酵母HXT11在木糖上的生长能力得到恢复的进化的木糖转运阴性菌 株中的升高的表达

RN1053恒化培养。酿酒酵母中的木糖摄取通过不同的己糖转运蛋白亚组来促进(Hamacher等，2002,Characterizationofthexylose-transportingpropertiesofyeasthexosetransportersandtheirinfluenceonxyloseutilization.Microbiology,148:2783-2788)。我们已构建了具有木糖发酵能力的缺失突变体(RN1053)，其缺乏主要己糖转运蛋白HXT1-HXT7和GAL2。由于缺失，RN1053不能利用木糖(如实施例1中所述)。酿酒酵母拥有比八个主要HXT基因(HXT8-17)多的HXT基因，对于它们的了解不是很多，除了已知它们的表达低或可忽略不计(Sedlak&Ho,2004,Characterizationoftheeffectivenessofhexosetransportersfortransportingxyloseduringglucoseandxyloseco-fermentationbyarecombinantSaccharomycesyeast.Yeast,21,第671-684页)或它们与除糖转运之外的生理作用有关(Nourani等1997Multiple-drug-resistancephenomenonintheyeastSaccharomycescerevisiae:involvementoftwohexosetransporters.MolCellBiol,17:5453-5460)。因此，我们称之为隐匿HXT基因。尝试选择在隐匿HXT基因座中导致表达改善或对木糖亲和力可能改善的可能自发突变。为了这样做，使菌株RN1053在稀释率为0.05h-1的厌氧木糖受限恒化培养物中生长。将恒化培养得到的进化的菌株RN1053-X2在2％木糖板上分离。选择单菌落在需氧摇瓶中于补有2％木糖的Verduyn-尿素-his中培养96小时，以与初始RN1053菌株进行比较。RN1053-X2和RN1053菌株的生长曲线在图12A中示出。进化的菌株RN1053-X2能够在2％木糖上生长，而初始菌株RN1053不在木糖培养基上生长。原因可能是隐匿HXT-基因(HXT8-HXT17)中的一个或更多个在恒化培养期间在木糖培养基上上调，从而促进了木糖的摄取。

表达表达谱进化的RN1053-X2。在2％木糖培养基上进行分批培养期间对进化的菌株RN1053-X2和初始菌株RN1053中的HXT8-HXT17的表达模式进行比较。与初始菌株RN1053相比，在进化的菌株RN1053-X2中，HXT11和HXT12的转录水平从指数期开始急剧提高多达8倍(图12B)并且在第3天达到最高水平。对于通过表达菌株RN1053中的HXT11和/或HXT12转运蛋白基因使突变体进化以提高木糖消耗而言，恒化是有效的。然而，与RN1053的野生型相比，其它HXT-基因(即HXT8-HXT10和HXT13-HXT17)的表达水平在木糖培养基上受到抑制。

木糖代谢的第一限制步骤是其跨质膜转运(KaharP,TakuK,TanakaS,2011.Enhancementofxyloseuptakein2-deoxyglucosetolerantmutantofSaccharomycescerevisiae.J.Biosci.Bioeng.111:557-63)。据报道，酿酒酵母的HXT转运蛋白基因的表达响应于不同的细胞外葡萄糖水平而调节(Ozcan&Johnston,1999.Functionandregulationofyeasthexosetransporters.Microbiol.Mol.Biol.Rev.63:554-569)。可能的是，启动子或调节基因中的突变是木糖恒化培养中进化的RN1053-X2菌株的隐匿HXT基因的增强表达的基础。

实施例7

进化的RN1053中的敲除/低HXT11消除了新获得的在木糖上生长的能力

菌株RN1053-X2中HXT11的敲除和沉默。对于HXT11的缺失构建体，使用由用于在HXT11基因座处整合的HXT11侧翼序列和用于扩增表达盒的HIS3序列组成的寡核苷酸KOP11(SEQIDNO98)和KOT11(SEQIDNO99)由质粒模板pRS313-P7T7(SEQIDNO117)来扩增P_HIS3-HIS3-T_HIS3表达盒。

为了确定Hxt11p是否负责在木糖上的自发生长，我们通过连续进行一步基因缺失来使得进化的菌株RN1053-X2中的HXT11缺失，所述一步基因缺失用于在HXT11缺失时补充HIS3标记物。HXT11mRNA水平在引入敲除构建体后显著降低(图13a)。当HXT11在菌株RN1053-X2中破坏时，菌株失去其新获得的在木糖培养基上生长的能力(图13b)。此外，敲除菌株的HXT11表达水平降至60％。最可能的是，仍测量到HXT11水平是因为在RN1053-X2菌株中另外表达的HXT12转录物与HXT11是约98％同源的(图13a)。

反义RNA技术对于通过清除微生物中的靶mRNA来抑制靶蛋白的翻译而言是非常有用的。翻译抑制可通过与信使RNA杂交的反义序列来促进。反义机制涉及核糖体干扰，其中核糖体不能与mRNA的核苷酸结合(Park等，2001.Antisense-mediatedinhibitionofarginase[CAR1]geneexpressioninSaccharomycescerevisiae.J.Biosci.Bioeng.92:481-484)。此方法与基因破坏方法相比对于抑制基因表达而言更加方便。对于反向HXT11(iHXT11)的表达，将iHXT11使用引物iHXT11F(SEQIDNO:100)和iHXT11R(SEQIDNO:101)进行扩增，并反向地克隆为BamHI-XbaI片段，介于pRS313-P7T7载体的截短的HXT7启动子与HXT7终止子之间(图13c；SEQIDNO:117)。将构建体引入RN1053-X2中来表达反义HXT11RNA，反义HXT11RNA妨碍HXT11mRNA翻译成蛋白质。iHXT11在菌株RN1053-X2中过表达，并且菌株失去其在木糖培养基上生长的能力(图13d)。

这些敲除/敲低实验清楚地表明，由于HXT11表达的增加和Hxt11p在酵母膜上的可能的功能性表达，进化的菌株RN1053-X2开始消耗木糖。

实施例8

在RN1053中过表达HXT11使木糖上的生长恢复

在RN1053中过表达HXT11和HXT12。为了确定表达HXT11或HXT12的菌株是否能够在木糖上生长，使这两种HXT-基因单独地在由于缺失八个主要己糖转运蛋白(HXT1-HXT7和GAL2)而不能在木糖上生长的初始RN1053菌株中表达。

对于这些实验，使用RN1041-空、RN1053-空、RN1053-HXT11和RN1053-HXT12(参见表13)。将RN1053-HXT11和RN1053HXT12以下列方式构建：使用引物HXT11F(SEQIDNO:102)、Hxt12F(SEQIDNO:103)和HXT11/12R(SEQIDNO:104)由野生型RN1053的cDNA对用于HXT11和HXT12基因的开放读码框进行PCR扩增；对PCR片段进行测序，发现其与相应的CEN.PK113-7D基因序列100％同源(酵母菌属基因组数据库,www.yeastgenome.org；HXT11序列SEQIDNO；119)；将PCR片段用限制性酶XbaI和BamHI切割并在酵母表达载体pRS313-P7T7(SEQIDNO:117；图13C；表12)中克隆。使用根据Gietz方法的标准酵母基因技术(GietzandWoods2006,YeasttransformationbytheLiAc/SSCarrierDNA/PEGmethod.MethodsMol.Biol313，第107-120页)来将转运蛋白的HXT11和HXT12表达构建体转化入RN1053。从单菌落分离的转化体导致菌株RN1053-HXT11和RN1053-HXT12。将两个菌株接种到麦芽糖培养基中，然后在包含2％木糖和/或2％葡萄糖的液体培养基上进行摇瓶培养。仅RN1053-HXT11和RN1041在48小时内显示出明显的生长，而RN1053-空和RN1053-HXT12在此时段几乎不显示任何生长(图14a)。与参照菌株RN1041-空(具有野生型HXT背景)相比，RN1053-HXT11在木糖培养基的生长开始的较早并且显示出较快的生长(图14b)。然而，将HXT12序列引入RN1053中并未允许在木糖培养基上生长。在酵母属基因组数据库的参照菌株S288C中，Hxt12由于移码突变而被认为是假基因(www.yeastgenome.org；ORFsYIL170W和YIL171W)。

此实验清楚地表明，RN1053-X2在木糖上的自发生长由HXT11的较高表达引起并且HXT11是有效的木糖转运蛋白(如果表达的话)。

实施例9

Hxt11p通过本身比Hxt2p更高的木糖特异性水平来促进木糖转运

Hxt11p的木糖摄取。为了确定HXT11是否能够在存在或不存在葡萄糖的情况下进行木糖转运，进行使用放射性标记的14C-木糖的摄取研究。对于这些实验，使用菌株RN1053-空、RN1053-HXT11和RN1053-HXT2(参见表13)。HXT2因其木糖转运能力而为人所知(Saloheimo等，2007,Xylosetransportstudieswithxylose-utilizingSaccharomycescerevisiaestrainsexpressingheterologousandhomologouspermeases.ApplMicrobiolBiotechnol.74:1041-1052；Sedlak和Ho,2004,Characterizationoftheeffectivenessofhexosetransportersfortransportingxyloseduringglucoseandxyloseco-fermentationbyarecombinantSaccharomycesyeast.Yeast,21:671-684)。RN1053-HXT11的构建在之前实施例中已做描述。将RN1053-HXT2以下列方式构建：使用引物FHXT2XbaI(SEQIDNO:107)和RHXT2Cfr9I(SEQIDNO:108)由RN1001基因组(表12)对HXT2(SEQIDNO:120)进行PCR扩增。将所得PCR片段进行序列检验并且克隆到pRS313-P7-T7(SEQIDNO:117)中作为XbaI-Cfr9I片段。将RN1053用所得构建体pRS313-P7T7-HXT2(；参见表12)转化，产生源自单菌落的命名菌株RN1053-HXT2的转化体(表13)。为了确定Hxt11p是否提高了菌株RN1053中的木糖摄取，使用表达转运蛋白的细胞中的¹⁴C来测量木糖摄取。与在存在葡萄糖的情况下表达HXT2的菌株相比，表达HXT11的菌株在存在葡萄糖的情况下累积多50％的木糖(图15)。此外，与RN1053-HXT2相比，RN1053-HXT11的木糖摄取提高多达4.5倍(图15)。这些实验表明，Hxt11p能够跨酵母质膜转运木糖。另外，与先前在酵母基因组内鉴定的木糖转运蛋白例如Hxt2p相比，Hxt11p具备本身较高的不会被葡萄糖轻易竞争的木糖特异性。

实施例10

Hxt11p在酵母质膜中功能性表达

HXT11在RN1053中的功能性表达。通过免疫印迹分析检测Hxt11p无法充分证实蛋白的功能性表达。对于己糖转运蛋白的功能性表达，其必须驻留在质膜中。为了监测Hxt11p的表达和靶向，将嵌合Hxt11p-GFP蛋白工程化并通过荧光测定法和荧光显微镜检查进行检查。对于这些研究，使用RN1053-HXT11-GFP、RN1041-HXT11-GFP、RN1053-HXT11和RN1053-空(表13)。对于HXT11-GFP表达菌株的构建，用具有此嵌合Hxt11-GFP蛋白的表达载体(pRS313-P7T7-HXT11-GFP；SEQIDNO:118；表12)对RN1053和RN1041进行转化。Hxt11p+GFP融合蛋白为功能性己糖转运蛋白：其恢复菌株RN1053在2％木糖上的生长(图16a)。此外，RN1053-HXT11-GFP和RN1041-HXT11-GFP的Hxt11p+GFP荧光定位到木糖或葡萄糖培养基上质膜(图16b)。

这些实验表明Hxt11p-GFP可用作木糖转运蛋白并且Hxt11p在质膜中功能性表达。

实施例11

RN1053中的HXT11表达促进工业相关浓度的葡萄糖和木糖的较快的共 同发酵

葡萄糖-木糖混合物中的RN1053-HXT11的发酵曲线。为确定在HXT缺失背景(hxt1-7,gal2)下功能性表达HXT11的菌株在葡萄糖-木糖混合物上与表达野生型HXT情况的菌株相比较的发酵特征，发酵在补有工业相关葡萄糖-木糖浓度(分别为80和40gl^-1)的Verduyn-尿素中进行。对于这些发酵，使用RN1053-HXT11和RN1041-空(参见表13)。

如图17a中所示，RN1041的木糖未与葡萄糖共同发酵；而葡萄糖-木糖共同发酵的程度在菌株RN1053-HXT11中增强，如图17b中所示。此外，木糖发酵在HXT11-RN1053中完全耗尽，而10g/L木糖仍在40小时时保留在RN1041中；此外，RN1053-HXT11的木糖消耗在2％残余葡萄糖下显著增加，并且乙醇浓度在发酵结束时从63.92g/L升至72.33g/L(图17ab)。

本实施例表明，主要己糖转运蛋白缺失但表达HXT11的菌株与具有不含HXT11的野生型己糖转运蛋白背景的菌株相比显示出更快的木糖利用。

实施例12

在葡萄糖转运反向活性筛选中，野生型HXT11表达支持在木糖上的生长

目的。使用葡萄糖转运活性反向(GTAC)筛选，即转化己糖激酶-突变菌株YD01227作为宿主来引入转运蛋白并且筛选培养基上的所得转化体在存在葡萄糖的情况下的木糖上的生长和木糖消耗(葡萄糖的量为木糖的5倍)，可鉴定出在存在过量葡萄糖的情况下表现出改善的木糖转运能力的木糖转运蛋白(即，对木糖的亲和力高于对葡萄糖的亲和力，降低或更优选地完全消除葡萄糖转运能力，而将木糖转运能力保持在至少相同的水平)。

转化和菌落挑取。用具有野生型GAL2(pDB1250,EPA-29355)的构建体、HXT2(pDB1162；关于构建质粒参见实施例9)构建体和HXT11(pRS313-P7T7-HXT11，关于构建参见实施例8)构建体转化YD01227。对于每种转化，使用自动化菌落挑取将3个菌落(可用时)再涂布于YNB+3％木糖琼脂培养基MTP上并在30℃下生长，直至琼脂穿刺中可观察到可见的菌落生长。

预培养和筛选。对于预培养，通过自动化方法将转化体从选择琼脂培养基MTP转移到96孔半深孔板(96HDWP)，所述96孔半深孔板包含由补有3％木糖的矿物培养基组成的液体选择培养基(根据Verduyn，尿素作为氮源)。将96HDWP在定轨摇床中以30℃和750rpm进行3天的孵育(预培养)。随后，对于每个样品，将20μl培养物转移至包含2.5mlVerduyn-尿素的24深孔板(24DWP)，Verduyn-尿素补有比率为5:1的葡萄糖和木糖的糖混合物，浓度为：10gl^-1葡萄糖和2gl-¹木糖(YD10-培养基)。对于三个采样点中的每一个，对一系列的24孔DWP进行接种。在每个24DWP上，接种一个RN1001生长对照以具有不同24DWP之间板变动效应的指示。在24小时、72小时和96小时的自动采样后，进行向96HDWP的转移以用于600nm波长处的自动OD测量。在96小时后的最后OD测量之后，细胞在离心后沉淀并收集100μl上清液，以便对孵育后培养基中的残余糖和乙醇形成进行流动-NMR分析(关于方法描述参见上文)。

结果。RN1001显示出自24小时起的生长(图18a)以及葡萄糖和木糖的完全消耗(图18b、18c)，表达GAL2、HXT2和HXT11构建体的YD01227转化体由于缺失己糖激酶和葡糖激酶活性而不消耗葡萄糖(图18c)。后述菌株还显示出随时间的不同生长曲线(图18a)和表示其各自在存在葡萄糖的情况下消耗木糖的能力的不同残余木糖浓度(图18b)。表达HXT11构建体的YD01227(YD01227-HXT11)在72小时显示出明显的生长(图18a)和相当大的木糖消耗，从实验开始时存在于培养基中的22,7±0.12gl^-1(n＝43)到96小时后残留于培养基中的4.83±1.26gl^-1(n＝3)木糖；YD01227-GAL2和YD01227-HXT2与YD01227-HXT11相比几乎未显示出任何生长并且未消耗太多的木糖，在96小时孵育后分别有18.34±0.39和21.29±0.32gl^-1木糖残留于培养基中(图18b)。

本实施例表明HXT11在存在葡萄糖的情况下支持相当多的生物质形成和木糖消耗，这表明与GAL2或HXT2(两者均为酿酒酵母转运组中已证实的木糖转运蛋白)表达所施加的相比，己糖激酶突变体YD01227中的HXT11表达允许糖转运中更具木糖特异性的组分(Saloheimo等，2007,Xylosetransportstudieswithxylose-utilizingSaccharomycescerevisiaestrainsexpressingheterologousandhomologouspermeases.ApplMicrobiolBiotechnol.,74:1041-1052；Sedlak和Ho,2004,Characterizationoftheeffectivenessofhexosetransportersfortransportingxyloseduringglucoseandxyloseco-fermentationbyarecombinantSaccharomycesyeast.Yeast21:671-684；Hamacher等，2002,Characterizationofthexylose-transportingpropertiesofyeasthexosetransportersandtheirinfluenceonxyloseutilization.Microbiology,148:2783-2788)。

实施例13

从在YD01227中筛选的HXT11易错文库获得的改进的HXT11突变体

为了改善在存在葡萄糖的情况下的木糖摄取，进行了易错PCR以生成编码Hxt11p的变体的HXT11突变体文库，在存在葡萄糖的情况下在YD01227菌株中对这些变体的竞争性木糖转运进行了筛选(参见本文的表3)。PCR反应混合物中的Mn2+浓度为0.15mM，并且其根据使用引物HXT11F(SEQIDNO:41)和HXT11/12R(SEQIDNO:43)的标准易错PCR方案(Cirino,P.C等2003.Generatingmutantlibrariesusingerror-pronePCR.MethodsMol.Biol.,231,第3-9页)添加。将文库作为XbaI-BamHI片段克隆进pRS313-P7T7。将菌株YD01227用HXT11文库转化，并使用SynergyMX(BioTekInstruments,Inc,USA)以96孔板形式在补有1:15的木糖(1％)和葡萄糖(15％)的Verduyn-尿素培养基上筛选了三千个转化体。从这3000个突变体中，在筛选培养基上获得了八个胜过野生型Hxt11p的突变体。代表性克隆在图19a中示出。通过使用根据Chowdhury(Chowdhury,K.1991.Onestep'miniprep'methodfortheisolationofplasmidDNA.Nucl.AcidsRes19,第2792页)的方案从YD01227分离了质粒，并再次测序。据发现，所有八个突变体均携带具有以下突变序列的质粒，该突变序列翻译成的蛋白含有Hxt11(野生型氨基酸序列Hxt11pSEQIDNO:62)中的相同突变，该突变导致第366位的氨基酸天冬酰胺(N)变成天冬氨酸(D)。在摇瓶实验中，N366D突变体(YD01227-mHXT11[N366D]；参见表13)还展示出在筛选培养基中与YD01227-HXT11相比更快的生长，如在图19a中所示。将pRS313-P7T7-mHXT11(N366D)构建体再次转化入RN1053，产生RN1053-mHXT11(N366D)。表达HXT11-N366D突变体的RN1053与表达野生型HXT11基因的RN1053相比在2％木糖培养基上的木糖利用率方面不受影响，因为观察到了类似的生长曲线(图19b)。

具有Hxt11和N366D突变体的菌株RN1053的糖摄取。利用表达转运蛋白Hxt11和mHxt11p-(N366D)的酿酒酵母菌株RN1053在木糖中测定了木糖和葡萄糖转运动力学。将测得的木糖转运速率相对于葡萄糖或木糖浓度作图。RN1053-mHXT11(N366D)的葡萄糖亲和力与RN1053-HXT11相比显著降低达2倍，而RN1053-mHXT11(N366D)的木糖亲和力与RN1053-HXT11相比也略微降低达1.2倍(图19c、图19d)。此外，在存在渐增浓度的葡萄糖的情况下，表达N366D突变体的菌株与表达Hxt11的菌株相比蓄积的木糖多出高达75％(图19e)。

在存在葡萄糖的情况下的木糖发酵。进行了比较RN1053-mHXT11(N366D)与RN1053-HXT11和RN1041-空的糖混合物发酵实验。

在补有100g/L葡萄糖和60g/L木糖的Verduyn-尿素上进行的第一项实验中，如图19f、图19g、图19h和图19i中所示，RN1053-mHXT11(N366D)的葡萄糖利用、生物质形成(OD600)和乙醇生产与RN1041和RN1053-HXT11相比在发酵期间延迟。看起来，RN1053-mHXT11(N366D)的葡萄糖消耗与RN1053-HXT11相比在指数早期显著降低(图19g)。此外，RN1053-mHXT11(N366D)的木糖消耗未降低(图19h)，但RN1053-mHXT11(N366D)的细胞密度低于RN1041和RN1053-HXT11的细胞密度(图19f)。

在补有较低糖浓度(80gl^-1葡萄糖和40gl^-1木糖)的Verduyn-尿素上进行的比较RN1053-mHXT11(N366D)与RN1053-HXT11的第二项发酵实验中，观察到了糖消耗曲线的明显差异(图19j、图19k、图19l)。葡萄糖消耗曲线展示出在葡萄糖快速下降阶段更快的葡萄糖消耗速率(在0与35小时之间；q_{gluc(RN1053-HXT11}2.22g/l/h对比q_{gluc(RN1053-mHXT11[N366D])})2.04g/l/h/，q_gluc下降8.5％)，而木糖消耗速率在同一时间窗口中大大增加(0.23g/l/h的q_{xyl(RN1053-HXT11)}对比0.38g/l/h的q_{xyl(RN1053-mHXT11[N366D]}，q_xyl倾斜65％)。在主要为木糖发酵的阶段(35-73小时)，木糖消耗速率几乎相同(0.36g/l/h的q_{xyl(RN1053-HXT11)}对比0.37g/l/h的q_{xyl(RN1053-mHXT11[N366D])})。在RN1053-mHXT11(N366D)的发酵中，最大木糖消耗速率比RN1053-HXT11更高且到达的时间更早，分别为23小时的0.65g/l/h和35小时的0.50g/l/h。在发酵过程结束时(工业发酵的典型周期为72小时)，RN1053-HXT11消耗了51％的木糖，而RN1053-mHXT11(N366D)消耗了63％。表达N366D突变体的RN1053在发酵结束时测得的乙醇滴度比表达野生型HXT11的RN1053高4.4％。考虑到发酵中的糖输入几乎相同，可以想象，从具有工业相关分批发酵的典型糖浓度的该葡萄糖-木糖混合物得到了更高的产率，更特别地，从木糖部分得到了更高的产率。

这些发酵实验表明与其野生型参考序列相比，在膜上存在从酿酒酵母己糖转运蛋白HXT11工程改造的木糖特异性转运蛋白变体增加葡萄糖阶段的木糖消耗速率，其中葡萄糖消耗速率略微下降，并且表明在结束时，在工业相关水解产物的典型葡萄糖-木糖混合物上获得了更高的乙醇产率。

实施例14

进化的己糖激酶突变体在存在葡萄糖的情况下消耗木糖

菌株YD01227的进化工程。对于进化工程，将菌株YD01227用于在葡萄糖-木糖混合物上进行的进化工程以进化成在存在葡萄糖的情况下的木糖同化，目的在于分离己糖转运中或调控己糖转运的表达和/或活性的自发突变体。

将YD01227在具有补充了2％木糖的Verduyn-尿素-his的摇瓶中接种16小时。在进化工程开始时，在含有1％木糖、3％葡萄糖的Verduyn-尿素-his中将YD01227稀释到0.2的OD600和5％的DO设定值。监测二氧化碳流出。在各个时间点，采样以进行葡萄糖和木糖浓度分析。确定了菌株YD01227是仅在木糖上生长还是在葡萄糖和木糖两者上生长。将进化工程开始时的葡萄糖与木糖比率保持为低比率(葡萄糖3％、木糖1％)，这仍允许实验开始时的YD01227生长。然而，与在仅1％木糖上的生长相比，生长速率明显更低。在该设置中，菌株消耗木糖导致更高的葡萄糖:木糖比率，并因此导致生长速率的下降。当CO₂的产生下降时，添加另外的木糖(向500ml发酵罐体积添加5ml50％的木糖)以维持生长。在20的OD600(其平均在5-6天后达到)下，如果生长速率在前一循环中显著改善，则将培养物稀释到处于较高葡萄糖与木糖比率的新鲜Verduyn-尿素-his中。总计，在27天的时间范围内，将菌株分别在1％Xyl/3％Glc(1:3)、1.5％Xyl/9％Glc(1:6)、1％Xyl/8％Glc(1:8)、1％Xyl/10％Glc(1:10)和0.57％Xyl/10％Glc(1:15)中系列稀释5次。在1％木糖和8％葡萄糖中接种前，将DO的设定值降低到0％(厌氧生长)以便维持较低的生长速率。在图20中，给出了在YD01227的恒化培养(天)期间Verduyn-尿素-his培养基中的葡萄糖/木糖比率方案。在27天后，从进化的YD01227菌株中采样，并涂布到1％木糖和10％葡萄糖中，以原始YD01227作为阴性对照。原始YD01227仅显示出小的菌落，而进化的YD01227菌株的菌落大10-15倍。

在有/无葡萄糖竞争的情况下的木糖生长和木糖摄取。将进化的YD01227菌株再次划线到1％木糖和10％葡萄糖板上后，在摇瓶中在1％木糖上在分别存在0％、3％、6％和10％葡萄糖的情况下分析了三个菌落(EvoA、EvoB和EvoC)的生长。YD01227EvoB在木糖上在6％和10％葡萄糖下具有最高的生长速率，并与原始YD01227菌株进行了比较(图21a、图21b)。在原始YD01227菌株中(图21b中的YD01227ORI)，生长速率已在3％葡萄糖下受到部分抑制，并在6％和10％葡萄糖下受到完全抑制，然而，YD01227EvoB菌株在所有葡萄糖浓度下均仅显示出小的生长速率抑制，并且这似乎与添加的葡萄糖的量无关(图21a)。将相同的两个菌株用于¹⁴C木糖(50mM)摄取实验，其中木糖摄取被葡萄糖抑制(图21c)。在两个菌株中在不添加葡萄糖的情况下木糖的摄取相同，然而，一旦将葡萄糖加到两个菌株中后，YD01227EvoB菌株中的木糖摄取受到的抑制不如原始YD01227菌株中受到的摄取抑制。在1:10的比率下，原始YD01227菌株中的木糖摄取完全消除，而在YD01227EvoB菌株中，仍有5nmol/mgDW.min的摄取。

实施例15

HXT3-6嵌合体中的单核苷酸多态性允许在进化的己糖激酶突变体中在 存在葡萄糖的情况下消耗木糖

在进化的YD01227菌株中表达HXTs。在含有1％木糖和3％葡萄糖的Verduyn-尿素-his上进行的分批培养期间，比较了HXT1-17和GAL2在进化的YD01227EvoB和原始YD01227菌株中的表达水平(图22a)。将引物(SEQIDNO:2-37)用于YD01227和进化衍生物中的HXT表达的实时PCR表征。此外，还在含有1％木糖和10％葡萄糖的Verduyn-尿素-his上分析了YD01227EvoB菌株中的表达水平。绝对C(t)值(数据未示出)表明HXT1-7基因是中表达或高表达的仅有HXT基因，其中HXT3-6嵌合体(在菌株谱系基因内和基因间HXT3和HXT6序列中的特异性缺失产生一个HXT36嵌合序列)具有最高的表达水平。所分析的糖转运蛋白在YD01227EvoB菌株中与原始YD01227菌株相比均未上调。在YD01227EvoB1％木糖和10％葡萄糖中在HXT1基因中所见的上调因该样品中的高葡萄糖浓度导致，这是众所周知的(Ozcan&Johnston,1995,Threedifferentregulatorymechanismsenableyeasthexosetransporter(HXT)genestobeinducedbydifferentlevelsofglucose.MolCellBiol15,第1564-1572页)。该高葡萄糖浓度还导致了YD01227EvoB中的HXT2和HXT7下调。HXT1的上调与HXT2和HXT7的下调均在文献中进行了描述(Boles&Hollenberger1997,KineticcharacterizationofindividualhexosetransportersofSaccharomycescerevisiaeandtheirrelationtothetriggeringmechanismsofglucoserepression,FEMSMicrobiolRev21,第85-111页)。

高表达的HXT基因的测序。使用引物SEQIDNO:49-60从cDNA扩增了HXT1-7，该cDNA从1％木糖和3％葡萄糖上的YD01227EvoB培养物分离而得。对得自这些基因的PCR产物测序。在HXT1、HXT2和HXT4中未发现突变，在HXT5和HXT7中发现一个沉默突变，以及在嵌合体HXT3-6中发现一个导致第367位的氨基酸变化(Asn变成Ile；N367I)的突变。在YD01227菌株谱系中的某处，在HXT3与HXT6的相邻基因座之间出现了缺失，其中基因内和基因间序列发生缺失(HXT3ORF的3’部分、HXT3终止子、Hxt6启动子、Hxt6ORF的部分)，从而产生一个HXT36嵌合序列，该序列处于框内并可作为mRNA进行表达且翻译成功能蛋白。在所翻译的嵌合蛋白Hxt3-6p中，前438个氨基酸与CEN.PKHxt3p氨基酸序列相同，而朝向C端的130个氨基酸与CEN.PK中的Hxt6p相同。HXT3-6-7基因座中的基因组重排在过去已有记述，例如由低葡萄糖浓度的恒化培养产生的HXT6/7嵌合序列，并且提出是因该己糖转运蛋白簇中高度同源的序列段而发生的同源重组所导致(Brown等1998。Multipleduplicationsofyeasthexosetransportgenesinresponsetoselectioninaglucose-limitedenvironment.MolBiolEvol15:931-942)。N367I点突变位于跨膜结构域(TMD)8中，已知该结构域含有负责葡萄糖亲和力的残基(Kasahara&Kasahara,2003.Transmembranesegments1,5,7and8arerequiredforhigh-affinityglucosetransportbyS.cerevisiaeHxt2transporter.BiochemJ.372:247-252，通过本专利申请得到再次确认)。

实施例16-18

方法

在实施例16和17的章节中未提及的方法已在实施例6-15章节中进行了描述。用于实施例16和17中所述的研究的寡核苷酸在表14中示出。使用引物对FHXT36BcuI(SEQIDNO127)/RHXT36367NNN(SEQIDNO128)和FHXT36367NNN(SEQIDNO129)/RHXT36BamHI(SEQIDNO130)，通过具有HF缓冲液的高保真PCR主混合物用PCR进行了HXT36中位置N367的饱和诱变。随后将1119和623个碱基对的片段用于使用外引物FHXT36BcuI和RHXT36BamHI进行的重叠PCR，并使用BcuI和BamH克隆进pRS313P7T7。对48个大肠杆菌克隆的测序得到了N367S(tcc)、N367P(ccc)、N367G(ggg)、N367Y(tac)、N367A(gcc)、N367H(cac)、N367R(agg)、N367F(ttt)、N367E(gag)和N367V(gtg)。对第367位的其余8个氨基酸进行了扩增，并通过采用特异性引物的重叠PCR进行了克隆，其中NNN被tta(L)、tgt(C)、tgg(W)、atg(M)、act(T)、aag(K)、gat(D)和cag(Q)置换。

通过使用引物FHXT36BcuI(SEQIDNO127)和RHXT36BamHI-终止(SEQIDNO131)通过高保真PCR预混液(HF缓冲液)对相应的基因进行扩增，制备了与HXT36和HXT36-N367I突变体的羧基端GFP融合体。将GFP基因本身用FGFPBamHI(SEQIDNO132)和RGFPClaI(SEQIDNO133)扩增。将HXT36和HXT36-N367I用限制性内切酶BcuI和BamHI消化，并将GFP用BamHI和ClaI消化。将HXT36基因单独地在双片段连接中与GFP一起连接到通过BcuI和ClaI切割的pRS313-P7T7中。

对于实施例18的发酵，使菌株一式两份地在50mlSchott瓶中生长，该瓶用68m含有0.5％D-葡萄糖和0.5％D-木糖的发酵培养基灌装到瓶口边，并在水浴中在30℃保持完全密闭。采用磁力搅拌器实现的搅拌速度为200rpm，并将菌株以大约8.0的起始OD600接种。以定期的间隔采样以进行OD600测量和HPLC分析。

表14.用于克隆和测序的寡核苷酸。

实施例16

如通过GFP标签研究所示，HXT3-6N367I的V _MAX 的降低不是突变体表 达降低的结果

为了确保该较低的V_max不是由于表达的降低所致，制备了嵌合体，其中将GFP融合到HXT36和HXT36-N367I突变体的C端。将两个融合体均转化到RN1053菌株，并且荧光成像揭露出蛋白均匀分布在质膜上(图23A和图23B)。由于记录到相同的GFP水平，所以Hxt36p和Hxt36p-N367I的表达程度相似(图23C)。

实施例17

用于探索序列空间的对HXT3-6嵌合体中第367位天冬酰胺的饱和诱变 揭露出丙氨酸是具有增强的木糖转运能力的增强转运蛋白中的强效残基

为了探索位置N367(对应于SEQIDNO:59中的位置N376)的序列空间，将所有氨基酸替换单独地引入HXT36基因。将各个HXT36-N367X突变体转化到YD01227己糖激酶缺失菌株，并在含有1％D-木糖和10％D-葡萄糖的基本培养基上测试了生长。具有原始HXT36-N367I突变体的转化体在24小时后显示出0.56的OD₆₀₀，而HXT36野生型不能在这些条件下生长(图24)。生长最快的转化体具有Hxt36pN367A突变体，其达到几乎为2的OD₆₀₀。另外，表达具有其它非极性脂族氨基酸替换(甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸)的HXT36突变体的转化体能够在D-木糖上在存在10％D-葡萄糖的情况下生长。另一方面，苯丙氨酸和组氨酸突变体显示出降低的生长速率，而强极性和带电氨基酸替换不支持生长(图24)。这些数据表明N367(对应于Gal2p中的N376和Hxt11p中的N366)是决定Hxt36p对葡萄糖相对于木糖的特异性的关键残基。

对Hxt36pN367A和N367I突变体进行了进一步分析以确定其转运蛋白动力学。在这里，转运蛋白在具有低背景葡萄糖转运活性的菌株RN1053中表达。HXT36对D-葡萄糖的摄取的K_m和V_max分别为约6mM和32nmol/mgDW.min(表15和图25)。值得注意的是，Hxt36pN367I突变体完全不能摄取D-葡萄糖，而D-木糖摄取的亲和力与Hxt36p相比提高2.7倍(即，从108到40mM)(表15)。然而，该突变还导致了D-木糖摄取的V_max近3倍的降低。

另外，研究了Hxt36p-N367A突变体的转运活性，其显示出在D-木糖上的最快生长。该转运蛋白仍显示出一定的葡萄糖摄取，但K_m极差(171mM对比6mM)。与N367I突变体相比，N367A突变导致了D-木糖摄取的K_m和V_max值分别提高到25mM和15.3nmol/mgDW.min。

实施例18

通过具有改变的转运特性的工程化酿酒酵母对D-葡萄糖和D-木糖进行共同发酵

为了研究D-葡萄糖和D-木糖的共同发酵，使具有野生型Hxt36、Hxt36-N367I和Hxt36p-N367A的RN1053菌株在5gL^-1D-葡萄糖/5gL^-1D-木糖上以大约8.0的较高的工业相关起始OD₆₀₀生长。随着时间监测糖消耗和乙醇浓度(图26)。含有Hxt36-N367I转运蛋白的菌株在D-木糖上生长，但由于严重的D-葡萄糖摄取缺陷(图26B)，其仅显示出一些背景水平的D-葡萄糖消耗，该水平类似于无任何重新引入的转运蛋白的原始RN1053菌株的水平(数据未示出)。具有Hxt36-N367A突变体的菌株显示出与含有Hxt36野生型转运蛋白的菌株(图26A)相比改善的D-葡萄糖和D-木糖共同消耗(图26C)。此外，由于表达Hxt36p-N367A的RN1053对葡萄糖和木糖的共同消耗，总的糖消耗也增加，从而在9小时的发酵后比表达野生型Hxt36p的RN1053(2.67gL^-1)产生更高的乙醇浓度(2.83gL^-1)。

表15.在菌株RN1053中表达的Hxt36p转运蛋白对D-葡萄糖和D-木糖摄取的K_m和V_max值。

^a不能测定

实施例19和20

材料和方法

在实施例19和20的章节中未提及的方法已在实施例6-18的章节中进行了描述。用于实施例19和20中所述的研究的寡核苷酸在表16中示出。

N366X的诱变。使用引物对FHXT11XbaI/RHXT11366NNN和FHXT11366NNN/RHXT11BamHI(参见表16)，通过具有HF缓冲液的高保真PCR预混液用PCR进行了HXT11中位置N366的饱和诱变。随后将1113和591个碱基对的片段用于使用外引物FHXT11XbaI和RHXT11BamHI进行的重叠PCR，并使用XbaI和BamHI克隆进pRS313P7T7。对48个大肠杆菌克隆的测序得到了N367S(tct)、N367P(cca)、N367G(ggt)、N367A(gcc)、N367H(cac)、N367R(cgc)、N367L(ttg)、N367C(tgt)、N367T(acg)、N367D(gat)、N367Q(caa)和N367V(gtg)。对第366位的其余6个氨基酸进行了扩增，并如上所述使用特异性引物通过重叠PCR进行克隆，其中NNN被ttt(F)、gag(E)、tgg(W)、atg(M)、aaa(K)和N367Y(tat)置换。

使用通过饱和诱变PCR生成的HXT11变体序列，如实施例10的方法(第96页中所述类似地制备了用于研究HXT11变体的细胞定位的HXT11-N366x-GFP-融合构建体。

发酵实验。将酵母培养物在含有2％麦芽糖的矿质培养基中预培养。收获指数中期的细胞，在用无菌水洗涤两次后接种。使用100ml含有7％葡萄糖和4％木糖的矿质培养基在120ml瓶种在30℃以5的初始OD600在氧限制性条件下进行了发酵实验。通过磁力搅拌器实现的搅拌速度为200rpm。独立地重复所有瓶发酵实验。

表16.用于酿酒酵母HXT11的饱和诱变的引物。

n为任何核苷酸

实施例19

Hxt11中的N366突变改善在存在葡萄糖的情况下的木糖利用率。

Hxt11中的N366D突变因葡萄糖转运亲和力的降低而改善了在存在葡萄糖的情况下的木糖摄取。为了评估该位置的重要性，将N366用其它19个氨基酸中的每一个置换以生成一系列N366X突变体。使相应的基因在菌株YD01227中表达，并使用96孔板评价了其在存在10％葡萄糖的情况下利用1％木糖的能力。这里，使用10％葡萄糖而不是15％以提高测定的敏感性，以便区分各种突变体的性能。在存在10倍过量的葡萄糖的情况下在木糖上的生长速率在N366被甲硫氨酸(M)或苏氨酸(T)残基替换时得到改善(图27A)，并且高达N366D替换的3倍。具有带正电的或大疏水性侧链的氨基酸不支持在木糖上在筛选条件下生长。还测试了突变体在葡萄糖上的生长，并在菌株RN1053中表达。N366M和N366THxt11突变体显示出与野生型Hxt11相比在葡萄糖上类似的生长(图27B和图27C)。此外，使用GFP标签化的Hxt11蛋白测定了所有各个突变体的表达水平(图28)。除了GFP标签化的N366W和N366YHxt11蛋白外(胞质定位并可能空泡定位看起来明显)，所有Hxt11-GFP蛋白均在膜上高表达。这表明这些突变体的蛋白错误折叠以及错误膜靶向，从而解释了在木糖和葡萄糖生长实验中的低活性。然而，野生型和N366M及N366THxt11突变蛋白定位到质膜。总之，这些数据表明N366是决定Hxt11对木糖相比葡萄糖的特异性的关键残基。

利用酿酒酵母菌株RN1053测定了在木糖中表达的基因经由Hxt11和N366T及N366MHxt11突变体的木糖和葡萄糖转运动力学。与野生型Hxt11相比，N366T和N366MHxt11对葡萄糖的转运的亲和力分别降低高达5倍和4倍。相比之下，这些突变体对木糖的亲和力相对于Hxt11增加高达2倍(表17)。N366THxt11突变体对葡萄糖的摄取的V_max与野生型Hxt11相比增加约40％，而N366MHxt11蛋白的V_max不变。重要的是，突变体的木糖的V_max与Hxt11相比一直没有大的变化。

表17.在菌株RN1053中表达的Hxt11转运蛋白对D-葡萄糖和D-木糖的摄取的K_m和V_max值。

n.d.，未测定

实施例20

表达HXT11变体的工程化酿酒酵母菌株对D-葡萄糖和D-木糖的共同发 酵

由于Hxt11中的N366突变对葡萄糖转运的明显作用而不干扰木糖转运，进一步研究了突变体在工业条件下(即，分别为7％的葡萄糖和4％的木糖)共同代谢木糖和葡萄糖的能力。在这里，使突变体在菌株RN1053中表达，并将生长与Hxt11野生型和含有内源性转运蛋白的完全补充的菌株RN1001进行了比较。两个突变体与RN1001菌株(图29C)和RN1053野生型Hxt11(图29D)相比之下支持近乎完美的葡萄糖和木糖共同消耗(图29A和图29B)，并且显示出延迟的木糖消耗。这些数据证实了Hxt11的N366位置的诱变产生的突变体介导葡萄糖和木糖的平衡摄取，从而支持对己糖和戊糖类的共同消耗。突变N366THXT11得到了最佳的结果。

共同消耗

细胞的共同消耗在本文中被定量和表示为共同消耗指数。共同消耗指数在本文中为葡萄糖和木糖的共同消耗指数并且计算为葡萄糖摄取速率(Qg)和木糖摄取速率(Qx)(以每个时间单位消耗的糖的克数表示)的绝对差异历经0-24小时的时间间隔(在0、8、12、14、16、18、20、22和24小时测量)的总和。发酵是以1.0g/l干酵母投放进行的厌氧分批培养发酵，温度为30℃，并且其中发酵培养基在发酵开始时包含71.8克葡萄糖/升和40.0克木糖/升。低共同消耗指数值表示高共同消耗，高值则表示较少共同消耗。

菌株RN1001、RN1053HXT11、RN1053HXT11(N366M)和RN1053HXT11(N366T)的这些发酵数据和计算在表18中给出。

表18：菌株RN1001、RN1053HXT11、RN1053HXT11(N366M)和RN1053HXT11(N366T)的发酵数据和共同消耗指数计算

菌株RN1001、RN1053HXT11、RN1053HXT11(N366M)和RN1053HXT11(N366T)的共同消耗指数如表18中加以确定。对共同消耗指数的结果汇总在表19中给出。

表19：菌株的共同消耗指数

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Claims (30)

1.多肽，其在对应于SEQIDNO:59的位置339或376的位置处具有一个或更多个替换，其中所述多肽为主要易化蛋白超家族(MFS)的成员。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述替换在对应于376的位置处并且其中所述位置处的氨基酸被范德瓦尔斯体积为80至并且侧链疏水性为10至100Δt_R的氨基酸置换。

3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述替换在对应于339的位置处并且其中所述位置处的氨基酸被侧链疏水性为-30至10Δt_R的氨基酸置换。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其具有对应于339N/V或376I/M/V的一个或更多个氨基酸。

5.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽与SEQIDNO:59的多肽相比具有降低的葡萄糖转运活性。

6.根据权利要求2所述的多肽，其中所述多肽与SEDIDNO:59的多肽相比具有改善的木糖转运活性。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽与具有SEDIDNO:59的多肽相比具有增加的降低的葡萄糖转运活性和改善的木糖转运活性。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其包含含有一个或更多个下列氨基酸基序的序列：

a)G-R-x(3)-G-x(3)-G-x(11)-E-x(5)-[LIVM]-R-G-x(12)-[GA]；

b)R-x(14)-G-x(2)-Y-x(2)-[YF]-[YF]-[GSAL]和/或

c)V-x(15)-[GNR]-[RH]-R-x(2)-[LM]-x(2)-[GA]，

其中所述多肽(a)至(c)中的片段对应于SEQIDNO:59中的位置。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的多肽，其包含基序G-R-x(3)-G-x(3)-G-x(11)-E-x(5)-[LIVM]-R-G-x(12)-[GA]。

10.与SEQIDNO:56具有至少50％同一性的多核苷酸，其编码根据权利要求1至9中任一项所述的多肽。

11.核酸构建体，其包含权利要求10所述的多核苷酸。

12.宿主细胞，其被权利要求11所述的核酸构建体转化。

13.根据权利要求12的转化的宿主细胞，其为真核的。

14.根据权利要求13的转化的宿主细胞，其为酵母。

15.根据权利要求14所述的转化的宿主细胞，其属于酵母菌(Saccharomyces)属，特别是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)物种。

16.转化的宿主细胞，其包含异源核苷酸，所述异源核苷酸编码根据权利要求1至9中任一项所述的多肽或编码具有序列IDNO:59的M339S或N376C替换的多肽。

17.根据权利要求16所述的转化的宿主，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽为天然存在于未转化的宿主细胞中的多肽的突变体。

18.根据权利要求16或17所述的转化的宿主细胞，其中天然存在于未转化的宿主细胞中的所述多肽是主要易化蛋白超家族(MFS)的成员。

19.根据权利要求17或18所述的转化的宿主细胞，其中天然存在于未转化的宿主细胞中的所述多肽为己糖转运蛋白多肽。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的转化的宿主细胞，其中天然存在于未转化的宿主细胞中的所述多肽为己糖转运蛋白多肽。

21.根据权利要求20所述的转化的宿主细胞，其中天然存在于未转化的宿主细胞中的所述多肽为选自以下的转运蛋白多肽：Gal2、Hxt1、Hxt2、Hxt3、Hxt4、Hxt5、Hxt6、Hxt7、Hxt8、Hxt9、Hxt10、Hxt11、Hxt12、Hxt13、Hxt14、Hxt15、Hxt16和Hxt17。

22.转化的宿主细胞，其在经受GATC方案时消耗来自包含木糖和葡萄糖的培养基中的木糖，而葡萄糖仍存在于所述培养基中。

23.根据权利要求22所述的转化的宿主细胞，其在经受GATC方案时消耗木糖比其消耗葡萄糖更快。

24.具有对应于SEQIDNO:59的N376T的替换的多肽作为木糖转运蛋白的用途，其中所述多肽是主要易化蛋白超家族(MFS)的成员。

25.根据权利要求22所述的用途，其中所述多肽在真核细胞中表达并且所述真核细胞用于在葡萄糖的存在下发酵木糖。

26.一种用于降解木质纤维素或半纤维素材料的方法，其中使木质纤维素或半纤维素材料与酶组合物接触，其中产生一种或更多种糖，并且其中所产生的糖被发酵以产生发酵产物，其中所述发酵是利用根据权利要求12至23中任一项所述的转化的宿主细胞进行的。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所产生的糖包含木糖和葡萄糖，并且其中所述细胞共同发酵木糖和葡萄糖。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述发酵产物为以下的一种或更多种：乙醇、丁醇、乳酸、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料。

29.一种用于降解木质纤维素或半纤维素材料的方法，其中使木质纤维素或半纤维素材料与酶组合物接触，其中产生一种或多种糖，并且其中所产生的糖被发酵以产生发酵产物，其中所述发酵是利用根据权利要求12至23中任一项所述的转化的宿主细胞进行的。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述发酵产物为以下的一种或更多种：乙醇、丁醇、乳酸、二萜、糖基化二萜、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料。