MX2012012171A - Proceso para la produccion de celulas que tienen la capacidad de convertir arabinosa. - Google Patents

Proceso para la produccion de celulas que tienen la capacidad de convertir arabinosa.

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MX2012012171A
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arabinose
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acid
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MX2012012171A
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Paul Klaassen
Bianca Elisabeth Maria Gielesen
Gijsberdina Pieternella Suylekom Van
Wilbert Herman Marie Heijne
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Dsm Ip Assets Bv
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Abstract

La presente invención se relaciona con un proceso para producir células capaces de convertir arabinosa que comprende las siguientes etapas: a) introducir los genes araA, araB y araD en una cepa hospedera que no puede convertir arabinosa, donde la célula resultante se conoce como una célula construida; b) someter la célula construida a una evolución adaptativa hasta obtener una célula capaz de convertir arabinosa; c) opcionalmente, someter la primera célula capaz de convertir arabinosa a una evolución adaptativa para mejorar la conversión de la arabinosa, donde la célula que se obtiene en el paso b) o c) se conoce como la primera célula capaz de convertir arabinosa; d) analizar la totalidad o una parte del genoma de la primera célula capaz de convertir arabinosa y de la célula construida; e) identificar los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en la primera célula capaz de convertir arabinosa; y f) usar la información de los SNP en el diseño racional de una célula capaz de convertir arabinosa; g) construir la célula capaz de convertir arabinosa diseñada en el paso f).

Description

PROCESO PARA LA PRODUCCIÓN DE CÉLULAS QUE TIENEN LA CAPACIDAD DE CONVERTIR ARABINOSA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con un proceso para la producción de células que tienen la capacidad de convertir arabinosa. La invención también se relaciona con células que se pueden producir por medio del proceso. La invención además se relaciona con un proceso en el cual dichas células se usan para la producción de un producto de fermentación, tal como etanol .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El consumo a gran escala de combustibles fósiles tradicionales (combustibles basados en petróleo) en las últimas décadas ha contribuido a altos niveles de contaminación. Esto, junto con la verificación de que la reserva mundial de combustibles fósiles no es ilimitada y una creciente conciencia ambiental, ha estimulado nuevas iniciativas para investigar la viabilidad de combustibles alternativos tal como etanol, que es una fuente de combustible inflamable libre de partículas que libera menos C02 que la gasolina sin plomo en base a un litro. A pesar de que el etanol derivado de biomasa se puede producir por la fermentación de azúcares de hexosa obtenidos de muchas fuentes diferentes, los sustratos típicamente usados para la producción a escala comercial de alcohol combustible, tales como caña de azúcar y almidón de maíz, son caros. El aumento en la producción de etanol combustible por lo tanto requerirá el uso de materias primas de menor costo. Actualmente, sólo materia prima lignocelulósica que se deriva de biomasa vegetal se encuentra disponible en cantidades suficientes para sustituir los cultivos actualmente usados para la producción de etanol. En la mayor parte del material lignocelulósico, el segundo azúcar más común, después del azúcar C6, son las cantidades considerables de azúcares C5, que incluyen arabinosa. Por lo tanto, para un proceso de producción de combustible económicamente posible, los azúcares hexosa y pentosa se deben fermentar para formar etanol. La levadura Saccharomyces cerevisiae es robusta y bien adaptada para la producción de etanol, pero no es capaz de convertir arabinosa. Además, se conocen organismos de origen no natural que pueden fermentar xilosa a etanol con un alto rendimiento de etanol y una alta productividad de etanol. Por lo tanto existe la necesidad de un organismo que posea estas propiedades a modo de permitir la producción comercialmente posible de etanol a partir de materia primas lignocelulósicas .
SUM&RIO DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la invención es proveer una célula, en particular una célula de levadura que tenga la capacidad de convertir arabinosa.
Este objetivo se logra de conformidad a la invención que provee un proceso para la producción de células que tienen la capacidad de convertir arabinosa, que comprende las siguientes etapas: a) Introducir en una cepa hospedera que no puede convertir arabinosa, los genes araA, araB y araD, esta célula se designa como célula construida; b) Someter a la célula construida a evolución adaptativa hasta que se obtenga una célula que convierta arabinosa, c) Opcionalmente, someter la primera célula que convierte arabinosa a evolución adaptativa para mejorar la conversión de arabinosa; la célula producida en el paso b) o c) se designa como primera célula convertidora de arabinosa; d) Analizar el genoma completo o parte del genoma de la primera célula convertidora de arabinosa y el de la célula construida; e) Identificar polimorfismos de nucleótidos simples (SNP) en la primera célula convertidora de arabinosa; y f) Usar la información de los SNP en el diseño racional de una célula con capacidad de convertir arabinosa; g) Construir la célula con capacidad de convertir arabinosa diseñada en el paso f ) .
La invención además provee una célula de levadura que tiene los genes araA, araB y araD en donde el cromosoma VII tiene un tamaño de entre 1300 y 1600 Kb como se determina por electroforesis, con la exclusión de célula de levadura BIE201.
La invención además se relaciona con un polipéptido que pertenece al grupo que consiste en los polipéptidos: a. Un polipéptido que tiene una secuencia codificada por el polinucleótido de SEQ ID NO: 14 que tiene una sustitución E455detención en SSY1 y polipéptidos variantes de los mismos, en donde una o más de las otras posiciones tienen una mutación de un aminoácido por otro aminoácido que es un aminoácido existente en la superfamilia de AA trans; b. Un polipéptido que tiene la secuencia codificada por el polinucleótido de SEQ ID NO: 16 que tiene una sustitución D171G en YJR154w y polipéptidos variantes de los mismos, en donde una o más de las otras posiciones tienen mutación de aminoácido por otro aminoácido que es un aminoácido conservado existente en la superfamilia PhyH; c. Un polipéptido que tiene la secuencia codificada por el polinucleótido de SEQ ID NO: 18 que tiene una sustitución S396G en CEP3. ; d. Un polipéptido que tiene la secuencia codificada por SEQ ID NO: 20 que tiene una sustitución T146P en GAL80 y polipéptidos variantes de los mismos, en donde una o más de las otras posiciones pueden tener mutación del aminoácido por un aminoácido que es un aminoácido conservado existente en la superfamilia NADB Rossmann.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra un mapa físico del vector pP T006.
La Figura 2 muestra un mapa físico del plásmido pPWT018, la secuencia del cual se da en SEQ ID NO: 1.
La Figura 3 muestra un autorradiograma que muestra los resultados de un experimento de hibridización que muestra la integración correcta de una copia del plásmido pP T080 en CEN . PK113-7D; La Figura 4 muestra un mapa físico del plásmido pPWT080, la secuencia del cual se da en SEQ ID NO: 8.
La Figura 5 muestra una curva de crecimiento aeróbico de la cepa de referencia BIE104A2P1 sobre arabinosa al 2% como única fuente de carbono, La Figura 6 muestra una curva de crecimiento anaeróbico de BIE104A2Plc sobre arabinosa al 2% como única fuente de carbono, La Figura 7 muestra una curva de crecimiento (concentraciones de azúcar-, etanol- y glicerol OD600 y C02 producido; ml/hora, segundo eje) para BIE104 precultivado sobre glucosa al 2%, y crecido en medio Verduyn con glucosa al 5%, xilosa al 5%, arabinosa al 3.5% y galactosa al 1%, todos los % en p/p.
La Figura 8 muestra una curva de crecimiento (concentraciones de azúcar-, etanol- y glicerol, OD600 y C02 producido; ml/hora, segundo eje) para BIE104A2Plc precultivado sobre glucosa al 2%, y crecido sobre medio Verduyn con glucosa al 5%, xilosa al 5%, arabinosa al 3.5% y galactosa al 1%.
La Figura 9 muestra una curva de crecimiento (concentraciones de azúcar-, etanol- y glicerol, OD600 y C02 producido; ml/hora, segundo eje) para BIE201 precultivado sobre glucosa al 2%, y crecido sobre medio Verduyn con glucosa al 5%, xilosa al 5%, arabinosa al 3.5% y galactosa al 1%, todos los % en p/p.
La Figura 10 muestra una vista esquemática de cruzamiento .
La Figura 11 muestra un ejemplo de "Curvas de Fusión Normalizadas" (curvas de fusión; panel superior) y una curva de "Picos de Fusión Normalizados" (panel inferior) . El último es el que deriva del primer gráfico y se muestra el cambio de señal de fluorescencia como función de la temperatura. Se muestran las cepas BIE104A2P1 y BIE201. El gen ensayado en esta figura es YJR154w. La diferencia de temperatura de fusión de la sonda es clara entre las dos cepas que se ensayaron, BIE201 y BIE104A2P1.
La Figura 12 muestra una representación esquemática (gráfico de cobertura) del cromosoma VII en la cepa BIE201. La profundidad de lectura se configuró como una función de la posición a lo largo del cromosoma. Algunas partes del cromosoma VII están presentes en múltiples copias, o sea sobrerepresentadas entre dos y tres veces.
La Figura 13 muestra un gel CHEF, teñido con bromuro de etidio. Se separaron los cromosomas por tamaño usando la técnica de CHEF. Las cepas que se analizaron son BIE104 (célula de levadura sin transformar) , BIE104A2Pla (transformante primario incapaz de consumir arabinosa, sinónimo de BIE104A2P1) , BIE104A2Plc, una cepa que deriva de BIE104A2P1 mediante evolución adaptativa, que es capaz de crecer en arabinosa, y cepa BIE201, que deriva de BIEl04A2Plc mediante evolución adaptativa, que puede crecer sobre arabinosa bajo condiciones anaeróbicas. Se observan desplazamientos de los cromosomas (véase el texto) . La cepa YNN295 es una cepa marcadora (Bio-Rad) .
La Figura 14 muestra un gel CHEF, transferido e hibridizado con la sonda araA. Se separaron los cromosomas por tamaño usando la técnica de CHEF. Las cepas que se analizaron son BIE104 (célula de levadura sin transformar), BIE104A2Pla (transformante primario incapaz de consumir arabinosa, sinónimo de BIE104A2P1) , BIE104A2Plc, una cepa que deriva de BIE104A2P1 mediante evolución adaptativa, que es capaz de crecer en arabinosa, y la cepa BIE201, que deriva de BIE104A2Plc mediante evolución adaptativa, que puede crecer sobre arabinosa bajo condiciones anaeróbicas. Se observan desplazamientos de los cromosomas (véase el texto) . La cepa YNN295 es una cepa marcadora (Bio-Rad) , que se usa como referencia para el tamaño de los cromosomas.
La Figura 15 muestra un gel CHEF, transferido e hibridizado con la sonda ACT1. Se separaron los cromosomas por tamaño usando la técnica de CHEF. Las cepas que se analizaron son BIE104 (célula de levadura sin transformar) , BIE104A2Pla (transformante primario incapaz de consumir arabinosa, sinónimo de BIE104A2P1), BIE104A2Plc, una cepa que deriva de BIE104A2P1 mediante evolución adaptativa, que es capaz de crecer en arabinosa, y la cepa BIE201, que deriva de BIE104A2Plc mediante evolución adaptativa, que puede crecer sobre arabinosa bajo condiciones anaeróbicas. Se observan desplazamientos de los cromosomas (véase el texto) . La cepa YNN295 es una cepa marcadora (Bio-Rad) , que se usa como referencia para el tamaño de los cromosomas.
La Figura 16 muestra un gel CHEF, transferido e hibridizado con la sonda PNC1. Se separaron los cromosomas por tamaño usando la técnica de CHEF. Las cepas que se analizaron son BIE104 (célula de levadura sin transformar), BIE104A2Pla (transformante primario incapaz de consumir arabinosa, sinónimo de BIE104A2P1), BIE104A2Plc, una cepa que deriva de BIE104A2P1 mediante evolución adaptativa, que es capaz de crecer en arabinosa, y la cepa BIE201, que deriva de BIE104A2Plc mediante evolución adaptativa, que puede crecer sobre arabinosa bajo condiciones anaeróbicas. Se observan desplazamientos de los cromosomas (véase el texto) . La cepa YNN295 es una cepa marcadora (Bio-Rad) , que se usa como referencia para el tamaño de los cromosomas.
La Figura 17 muestra un gel CHEF, transferido e hibridizado con la sonda HSF1. Se separaron los cromosomas por tamaño usando la técnica de CHEF. Las cepas que se analizaron son BIE104 (célula de levadura sin transformar) , BIE104A2Pla (transformante primario incapaz de consumir arabinosa, sinónimo de BIE104A2P1), BIE104A2Plc, una cepa que deriva de BIE104A2P1 mediante evolución adaptativa, que es capaz de crecer en arabinosa, y la cepa BIE201, que deriva de BIE104A2Plc mediante evolución adaptativa, que puede crecer sobre arabinosa bajo condiciones anaeróbicas. Se observan desplazamientos de los cromosomas (véase el texto) . La cepa YNN295 es una cepa marcadora (Bio-Rad) , que se usa como referencia para el tamaño de los cromosomas.
La Figura 18 muestra un gel CHEF, transferido e hibridizado con la sonda YGR031w. Se separaron los cromosomas por tamaño usando la técnica de CHEF. Las cepas que se analizaron son BIE104 (célula de levadura sin transformar) , BIE104A2Pla (transformante primario incapaz de consumir arabinosa, sinónimo de BIE104A2P1), BIE104A2Plc, una cepa que deriva de BIE104A2P1 mediante evolución adaptativa, que es capaz de crecer en arabinosa, y la cepa BIE201, que deriva de BIE104A2Plc mediante evolución adaptativa, que puede crecer sobre arabinosa bajo condiciones anaeróbicas. Se observan desplazamientos de los cromosomas (véase el texto) . La cepa YNN295 es una cepa marcadora (Bio-Rad) , que se usa como referencia para el tamaño de los cromosomas.
La Figura 19 muestra un ejemplo de diez asci disectados del cruce BIE104A2P1 x BIE201. Los asci se disectaron con un micro-manipulador Singer Micromanipulator . Cada ascus consiste en cuatro ascoesporas. Estas ascoesporas se separan entre si y se ponen en una placa de agar a distancias distintivas. En teoría, cuatro aislados de esporas haploides pueden dar origen a cuatro colonias individuales. Las cuatro colonias en una "columna" se originan de un ascus.
La Figura 20 ilustra el desempeño de la cepa BIE252 en el BAM (Biological Activity Monitor, Halotec, Países Bajos) . La cepa se precultivó en medio Verduyn con glucosa al 2%. La aplicación en el BAM se hizo sobre medio Verduyn suplementado con glucosa al 5%, xilosa al 5%, arabinosa al 3-5%, galactosa al 1% y mañosa al 0.5%, pH 4.2, bajo condiciones anaeróbicas.
La Figura 21 ilustra el desempeño de la cepa BIE252AGAL80 en el BAM. La cepa se precultivó en medio Verduyn con glucosa al 2%. La aplicación en el BAM se hizo en medio Verduyn suplementado con glucosa al 5%, xilosa al 5%, arabinosa al 3.5%, galactosa al 1% y mañosa al 0.5%, pH 4.2, bajo condiciones anaeróbicas.
La Figura 22 muestra una vista esguemática de la integración por doble entrecruzamiento de la vía completa del ácido adípico en el genoma .
La Figura 23 muestra un cromatograma resultante de un estándar de ácido adípico y una muestra medidos con el método de análisis.
La Figura 24 muestra un mapa físico del plásmido pGBS416ARABD.
BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de pPWT018; SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de un cebador para la verificación de la integración de pPWT018; SEQ ID NO: 3 muestra un cebador para la verificación de la integración de pPWT018 (con SEQ ID NO: 2) y para la verificación del número de copias de pPWT018 (con SEQ ID NO: 4) ; SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de un cebador para la verificación del número de copias de pPWT018; SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de un cebador para la verificación de la presencia de pPWT018 en el genoma en combinación con SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de un cebador directo para la generación de la sonda SIT2; SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de un cebador reverso para la generación de la sonda SIT2; SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia para el plásmido pP T080; SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de un cebador directo para la verificación de la integración correcta de pPWT080 en el extremo 3' del locus GRE3 (con SEQ ID NO: 10) y para la verificación del número de copias del plásmido pPWT080 (con SEQ ID NO: 11) ; SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de un cebador reverso para la verificación de la integración correcta de pPWT080 en el extremo 3' del locus GRE3; SEQ ID NO: 11 muestra la secuencia de un cebador reverso para la verificación del número de copias del plásmido pPWT080 (con SEQ ID NO: 10); SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia de un cebador directo para la generación de una sonda RKIl; SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de un cebador reverso para la generación de una sonda RKIl; SEQ ID NO: 14 muestra la secuencia de la secuencia del gen SSYl en la cepa de tipo nativa BIE104; SEQ ID NO: 15 muestra la secuencia del gen SSYl en las cepas BIE104A2P1C y BIE201; SEQ ID NO: 16 muestra la secuencia del gen YJR154w en la cepa de tipo nativa BIE104; SEQ ID NO: 17 muestra la secuencia del gen YJR154w en las cepas BIE104A2Plc y BIE201; SEQ ID NO: 18 muestra la secuencia del gen CEP3 en la cepa de tipo nativa BIE104; SEQ ID NO: 19 muestra la secuencia del gen CEP3 en las cepas BIE104A2Plc y BIE201; SEQ ID NO: 20 muestra la secuencia del gen YPL277c en la cepa de tipo nativa BIE104; SEQ ID NO: 21 muestra la secuencia del gen YPL277c en las cepas BIE104A2Plc y BIE201; SEQ ID NO: 22 muestra la secuencia del gen GAL80 en la cepa de tipo nativa BIE104; SEQ ID NO: 23 muestra la secuencia del gen GAL80 en la cepa BIE201; SEQ ID NO 24 muestra la secuencia del cebador directo SSY1; SEQ ID NO 25 muestra la secuencia del cebador reverso SSY1; SEQ ID NO 26 muestra la secuencia del cebador directo YJR154w; SEQ ID NO 27 muestra la secuencia del cebador reverso YJR15 w; SEQ ID NO 28 muestra la secuencia del cebador directo CEP3; SEQ ID NO 29 muestra la secuencia del cebador reverso CEP3; SEQ ID NO 30 muestra la secuencia del cebador directo YPL277c; SEQ ID NO 31 muestra la secuencia del cebador reverso YPL277c; SEQ ID NO 32 muestra la secuencia del cebador directo GAL80; SEQ ID NO 33 muestra la secuencia del cebador reverso GAL80; SEQ ID NO 34 muestra la secuencia de la sonda de alta resolución SSY1; SEQ ID NO 35 muestra la secuencia de la sonda de alta resolución YJR154w; SEQ ID NO 36 muestra la secuencia de la sonda de alta resolución CEP3; SEQ ID NO 37 muestra la secuencia de la sonda de alta resolución YPL277c; SEQ ID NO 38 muestra la secuencia de la sonda de alta resolución GAL80 ; SEQ ID NO 39 muestra la secuencia del cebador directo YGL057c; SEQ ID NO 40 muestra la secuencia del cebador reverso YGL057c; SEQ ID NO 41 muestra la secuencia del cebador directo SDS23; SEQ ID NO 42 muestra la secuencia del cebador reverso SDS23; SEQ ID NO 43 muestra la secuencia del cebador directo ACT1; SEQ ID NO 44 muestra la secuencia del cebador reverso ACT1; SEQ ID NO 45 muestra la secuencia del cebador directo araA; SEQ ID NO 46 muestra la secuencia del cebador reverso araA; SEQ ID NO 47 muestra la secuencia del cebador directo ACT1; SEQ ID NO 48 muestra la secuencia del cebador reverso ACT1; SEQ ID NO 49 muestra la secuencia del cebador directo PNC1; SEQ ID NO 50 muestra la secuencia del cebador reverso PNC1 SEQ ID NO 51 muestra la secuencia del cebador directo HSF1; SEQ ID NO 52 muestra la secuencia del cebador reverso HSF1; SEQ ID NO 53 muestra la secuencia del cebador directo YGR031w; SEQ ID NO 54 muestra la secuencia del cebador reverso YGR031w; SEQ ID NO 55 muestra la secuencia del cebador directo (matA, mata) ; SEQ ID NO 56 muestra la secuencia del cebador reverso matA; SEQ ID NO 57 muestra la secuencia del cebador reverso mata (alpha) ; SEQ ID NO 58 muestra la secuencia del cebador directo GAL80: : kan X; SEQ ID NO 59 muestra la secuencia del cebador reverso GAL80: : kanMX; SEQ ID NO 60 muestra la secuencia del cebador Directo para la amplificación de INT1LF; SEQ ID NO 61 muestra la secuencia del cebador Reverso para la amplificación de INT1LF con un flanco de 50 pb que solapa al cásete de expresión de Adi21; SEQ ID NO 62 muestra la secuencia del cebador Directo para la amplificación del cásete de expresión de Adi21 con flanco de 50 pb INT1LF; SEQ ID NO 63 muestra la secuencia del cebador Reverso para la amplificación del cásete de expresión de Adi21 SEQ ID NO 64 muestra la secuencia del cebador Directo para la amplificación del cásete de expresión de Adi22; SEQ ID NO 65 muestra la secuencia del cebador Reverso para la amplificación del cásete de expresión de Adi22; SEQ ID NO 66 muestra la secuencia del cebador Directo para la amplificación del cásete de expresión de Adi23; SEQ ID NO 67 muestra la secuencia del cebador Reverso para la amplificación del cásete de expresión de Adi23; SEQ ID NO 68 muestra la secuencia del cebador Directo para la amplificación del marcador KanMX de pUG7 con flanco de 50 pb que solapa con Adi23; SEQ ID NO 69 muestra la secuencia del cebador Reverso para la amplificación del marcador KanMX de pUG7 con flanco de 50 pb que solapa con Adi8; SEQ ID NO 70 muestra la secuencia del cebador Directo para la amplificación del cásete de expresión de Adi8 con flanco de 25 bp que solapa con kanMX de pUG7; SEQ ID NO 71 muestra la secuencia del cebador Reverso del cásete de expresión Adi8; SEQ ID NO 72 muestra la secuencia del cebador Directo para la amplificación del cásete de expresión de Adi24; SEQ ID NO 73 muestra la secuencia del cebador Reverso para la amplificación del cásete de expresión de Adi24; SEQ ID NO 74 muestra la secuencia del cebador Directo para la amplificación del cásete de expresión de Adi25; SEQ ID NO 75 muestra la secuencia del cebador Reverso para la amplificación del cásete de expresión de Adi25 con 50 pb que solapan con SucC; SEQ ID NO 76 muestra la secuencia del cebador Directo para la amplificación del SucC con 50 pb que solapan con Adi25; SEQ ID NO 77 muestra la secuencia del cebador Reverso para la amplificación del cásete de expresión de SucC; SEQ ID NO 78 muestra la secuencia del cebador Directo para la amplificación del cásete de expresión de SucD; SEQ ID NO 79 muestra la secuencia del cebador Reverso para la amplificación del cásete de expresión de SucD; SEQ ID NO 80 muestra la secuencia del cebador Directo para la amplificación del cásete de expresión de acdh67; SEQ ID NO 81 muestra la secuencia del cebador Reverso para la amplificación de la construcción acdh67 con flanco de 50 pb que solapa con INTRF; SEQ ID NO 82 muestra la secuencia del cebador Directo para la amplificación del sitio INT1LF en el genoma de levadura ; SEQ ID NO 83 muestra la secuencia del cebador Reverso para la amplificación del sitio INT1LF en el genoma de levadura; SEQ ID NO 84 muestra la secuencia del fragmento de PCR de ADI21; SEQ ID NO 85 muestra la secuencia del fragmento de PCR de ADI22; SEQ ID NO 86 muestra la secuencia del fragmento de PCR de ADI23; SEQ ID NO 87 muestra la secuencia del fragmento de PCR de ADI18; SEQ ID NO 88 muestra la secuencia del fragmento de PCR de ADI2 ; SEQ ID NO 89 muestra la secuencia del fragmento de PCR de ADI25; SEQ ID NO 90 muestra la secuencia del fragmento de PCR de SUCC; SEQ ID NO 91 muestra la secuencia del fragmento de PCR de SUCD; SEQ ID NO 92 muestra la secuencia del fragmento de PCR de ACDH67; SEQ ID NO 93 muestra la secuencia del fragmento del marcador KANMX; SEQ ID NO 94 muestra la secuencia del fragmento de PCR de INT1LF; SEQ ID NO 95 muestra la secuencia del fragmento de PCR de INT1RF; SEQ ID NO 96 muestra la secuencia del cebador directo del cásete araABD; SEQ ID NO 97 muestra la secuencia del cebador reverso del cásete araABD SEQ ID NO 98 muestra la secuencia del cebador directo Tyl: : araABD; SEQ ID NO 99 muestra la secuencia del cebador reverso TY1 : : araABD; SEQ ID NO 100 muestra la secuencia del cebador directo Tyl : : kanMX; SEQ ID NO 101 muestra la secuencia del cebador reverso Tyl : : kanMX.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprende" e "incluye" y las variaciones tales como "comprende", "que comprende", "que incluye" son de interpretación en forma inclusiva. 0 sea que estas palabras intentan cubrir la posible inclusión de otros elementos o números enteros no mencionados específicamente, en donde el contexto lo permite.
Los artículos "un" y "uno" se usan en la presente para referirse a uno o más de uno (o sea a uno o al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento.
Las diferentes formas de realización de la invención que se describen en la presente se pueden combinar entre sí.
La invención provee un proceso para la producción de células que tienen la capacidad de convertir arabinosa, que comprende los pasos a) a g) los cuales se describirán a continuación con más detalle: Paso a) Introducir en una cepa hospedera que no puede convertir arabinosa , los genes araA, araB y araD, esta célula se designa como célula construida El paso a) se describirá más adelante en detalle en la descripción así como también se ilustrará con los ejemplos.
Los pasos b) y c) Someter la célula construida a evolución adaptativa hasta que se obtenga una célula que convierte arabinosa. Opcionalmente someter la primera célula convertidora de arabinosa a evolución adaptativa para mejorar la conversión de arabinosa; la célula producida en el paso b) o c) se designa como primera célula convertidora de arabinosa; Los pasos b) y c) se describirán más adelante en detalle en la descripción bajo evolución adaptativa asi como también se ilustrará con los ejemplos.
Paso d) Analizar el genoma completo o parte del genoma de la primera célula convertidora de arabinosa y el de la célula construida; Este paso d) se puede ejecutar usando técnicas comunes de resecuenciamiento de genoma Paso e) Identificar polimorfismos de nucleotidos simples (SNP) en la primera célula convertidora de arabinosa ; Mirando las diferencias entre la primera célula convertidora de arabinosa y la de la célula construida Paso f) Usar la información de los SNP en el diseño racional de una célula con capacidad de convertir arabinosa ; En el paso f) una persona con experiencia sabrá a cuál SNP se atribuye la conversión de arabinosa, y con experiencia ordinaria tendrá la capacidad de diseñar una cepa mejorada en base a esa información.
En los pasos e) , f) y/o g) una persona con experiencia preferentemente usa técnicas de fenotipificación, es decir la identificación de células con características deseadas y en combinación con técnicas de genotipificación, es decir la identificación de genes candidatos asociados con las características elegidas.
Los ejemplos de técnicas para fenotipificación son experimentos de crecimiento, en matraces de agitación o termentadores, en presencia de azúcares únicos o mezcla de azúcares. También se pueden aplicar ensayos de crecimiento en medio de agar sólido. Sin embargo, se pueden usar otros métodos conocidos adecuados.
Los ejemplos de técnicas para genotipificación son técnicas de resecuenciamiento, tal como Solexa y similares, PCR cuantitativa (Q-PCR) , transferencia Southern. Sin embargo se pueden usar otros métodos adecuados.
Paso g) Construcción de la célula con capacidad de convertir arabinosa diseñada en el paso f) .
En el paso g) se pueden usar todas las técnicas comunes de construcción de nuevas cepas. En una forma de realización, se combinan diferentes cepas (parentales) con el objetivo de combinar propiedades ventajosas de los parentales. Por ejemplo se puede usar una técnica de apareamiento que involucra la cepa del paso b) o c) que se aparea con una cepa que no tienen todos los SNP presentes en las cepas del paso b) o c) .
Por ejemplo, una cepa de levadura haploide, transformada con genes necesarios para o que potencian la capacidad para fermentar arabinosa (diseñado todo junto como ARA) se mejoró por un proceso llamado evolución adaptiva. Durante el proceso de evolución adaptativa, se habían introducido tres mutaciones en el genoma, designadas mutl, mut2 y mut3. El genotipo de dicha cepa de levadura puede ser escrito como mutl mut2 mut3 ARA.
Dicha cepa de levadura puede ser apareada con otra cepa de levadura haploide, que también consiste en los genes que se necesitan para la transformación de arabinosa, pero que aún no puede hacerlo, debido a que carece de mutaciones extra para hacerlo. Sin embargo, esta cepa puede tener otra propiedad beneficiosa, tal como tolerancia a inhibidores. Esta propiedad se designa como ABC. Dicho proceso se ilustra en la figura 10.
En una forma de realización, en el proceso anterior, la célula de levadura con capacidad para convertir arabinosa tiene un cromosoma que está amplificado en comparación con la cepa hospedera, en donde el cromosoma amplificado tiene el mismo número que el cromosoma en el cual se introdujeron los genes araA, araB y araD genes en la cepa hospedera. En una forma de realización el cromosoma amplificado es el cromosoma VII. En una forma de realización, en la célula de levadura, partes del cromosoma VII, que rodean el centrómero, están amplificados (en comparación con la cepa hospedera) . En una forma de realización, se amplificó tres veces una región en el brazo izquierdo del cromosoma VII. En una forma de realización, parte del brazo derecho del cromosoma VII se amplificó dos veces, y una parte adyacente se amplificó tres veces (véase la figura 12) .
La parte del brazo derecho del cromosoma VII que se amplificó tres veces contiene el cásete de expresión de arabinosa, o sea los genes araA, araB y araD bajo el control de un promotor constitutivo fuerte.
La invención además se relaciona con una célula de levadura que tiene los genes araA, araB y araD en donde el cromosoma VII tiene un tamaño entre 1300 y 1600 Kb determinado por electroforesis, con la exclusión de una célula de levadura BIE201. La cepa BIE201 ha sido descrita en WO2011003893.
BIE201 tiene todos los polimorfismos de nucleótidos simples G1363T en el gen SSY1, A512T en el gen YJR154w, A1186G en el gen CEP3, y A436C en el gen GAL80.
En una forma de realización, en la célula de levadura, el número de copias de los genes araA, araB y araD genes es entre dos y diez, en una forma de realización entre dos y ocho o entre tres y cinco cada uno. El número de copias de los genes araA, araB y araD puede ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10. El número de copias se puede determinar con métodos conocidos por una persona con experiencia. En los ejemplos se ilustran métodos adecuados, y los resultados se muestran por ejemplo en la figura 12 En una forma de realización, la célula de levadura tiene uno o más, pero no todos, de los polimorfismos de nucleótidos simples elegidos del grupo que consiste en mutaciones G1363T en el gen SSY1, A512T en el gen YJR154w, A1186G en el gen CEP3, y A436C en el gen GAL80. En una forma de realización, la célula de levadura tiene un polimorfismo simple A436C en el gen GAL80. En una forma de realización, la célula de levadura tiene un polimorfismo simple A1186G en el gen CEP3.
Conjugación sexual El apareamiento en levaduras que es mediado por moléculas difusibles, feromonas, puede ser fácilmente demostrado (Manney, Duntze & Betz 1981) . Cuando se mezclan células de tipo de apareamiento opuesto en la superficie de medio de crecimiento con agar en una cápsula de petri, en dos o tres horas los cambios resultan evidentes. A medida que cada tipo de célula secreta su feromona hacia el medio, responde a la otra producida por el tipo opuesto (MacKay & Manney 1974). Cada una responde diferenciándose en una forma funcional especializada, una gameta. Las células detienen su división y cambian su forma. Se elongan y se cambian a forma de pera. Estas células distintivas han sido denominadas " shmoos" . Las células de tipos diferentes de apareamiento que están en contacto o muy cercanas se unen en la superficie y se fusionan entre si tomando una forma característica de "maní" con una constricción central, o sea se fusionan dos shmoos en sus extremos pequeños. Los dos núcleos haploides en cada una par unido se fusionan en un núcleo diploide, formando un cigoto verdadero. El diploide rápidamente brota en la constricción, formando una figura característica de "hoja de trébol". Uno puede observar todas estas etapas bajo el microscopio.
Las feromonas de apareamiento que se secretan por las células haploides son pequeñas moléculas peptídicas que difunden a través del agar (Betz, Manney & Duntze 1981) . Consecuentemente, su existencia y sus efectos sobre las células de los tipos opuestos de apareamiento son fáciles de demostrar. Si las células del tipo de apareamiento (alfa) se hacen crecer durante la noche en medio de agar, se acumula una alta concentración de la feromona en el agar que rodea el crecimiento. Si las células del tipo de apareamiento a (matA o mata) se colocan en este agar, ellas comienzan a transformarse a "shmoo" en un par de horas. El mismo efecto se puede demostrar en un medio liquido en el cual se han hecho crecer células de tipo de apareamiento OÍ (alfa) .
Meiosis Los shmoos son las gametas de las levaduras. Se diferencian a partir de células haploides vegetativas normales sólo cuando está presente una célula del tipo de apareamiento opuesto. De un modo similar, cualquier célula diploide puede realizar meiosis formando haploides que tienen el potencial de volverse gametas (Esposito & Klapholz 1981; Fowell 1969) . La meiosis es parte del proceso de esporulacion que es iniciado cuando se transfieren células diploides a un medio nutricionalmente desbalanceado, pero los cambios resultan evidentes bajo el microscopio sólo luego de tres a cinco dias cuando el asea se vuelve bien distintivo. Teóricamente, todos los aseas deben contener cuatro esporas pero en la prácticas, algunos sólo contienen dos o tres. El asea tiene una forma característica. El tratamiento de la mezcla de esporulacion con una preparación cruda disponible fácilmente de enzimas digestivas (por ejemplo Zimoliasa, Glusulasa) eliminará la pared del asea, liberando las esporas. Cuando las esporas, en el asea o luego de haber sido liberadas, son regresadas a un ambiente nutricionalmente adecuado, germinan y comienzan un crecimiento vegetativo en una fase haploide estable. Las cepas haploides ocurren en dos tipos de apareamiento, llamados a y (alfa) . En cada asea, dos esporas son normalmente tipo a de apareamiento (matA) y las otras dos son a (mata (alfa) ) . Cuando una célula de un tipo de apareamiento encuentra una del otro tipo de apareamiento, inician una serie de eventos que lleva a conjugación (Véase Conjugación sexual) . El resultado es una célula diploide, que crece por división celular mitótica en una fase diploide estable. Si uno simplemente transfiere un cultivo de células esporuladas a medio de crecimiento el resultado es una población mezcla de cepas haploides y nuevas cepas diploides que son análogas a la progenie de un apareamiento entre organismos superiores diploides.
Normalmente, los genetistas de levaduras aislan las esporas, al azar o por micromanipulación, para prevenir que las cepas haploides se apareen y formen la siguiente generación de cepas diploides. Este grado de control y la capacidad de observar las características genéticas en la fase haploide hace poderoso y eficaz al análisis genético en levaduras .
Adaptación Adaptación es el proceso evolutivo mediante el cual una población se convierte en más apropiada (adaptada) para su hábitat o hábitats. Este proceso tiene lugar a lo largo de entre varias y muchas generaciones, y es uno de los fenómenos básicos de la biología.
El término adaptación también se puede referir a una característica que es especialmente importante para la sobrevida de un organismo. Dichas adaptaciones se producen en una población variable por parte de las formas mejor adaptadas que se reproducen más exitosamente, mediante selección natural.
Los cambios de las condiciones ambientales alteran el resultado de la selección natural, lo que afecta los beneficios selectivos de adaptaciones subsiguientes que mejoran la aptitud de un organismo bajo las nuevas condiciones. En el caso de un cambio ambiental extremo, la aparición y la fijación de adaptaciones beneficiosas puede ser esencial para una supervivencia. Un gran número de diferentes factores, tales como por ejemplo disponibilidad de nutrientes, temperatura, disponibilidad de oxígeno, etcétera, pueden impulsarla evolución adaptativa.
Aptitud Hay una relación clara entre adaptabilidad (el grado al cual un organismo es capaz de vivir y reproducirse en un grupo dado de hábitats) y la aptitud. La aptitud es un estimado y un predictor de la tasa de selección natural. Mediante la aplicación de la selección natural, las frecuencias relativas de fenotipos alternativos variarán con el tiempo, si los mismos son heredables.
Cambios genéticos Cuando la selección natural actúa sobre la variabilidad genética de la población, los cambios genéticos son el mecanismo subyacente. Esto significa que la población se adapta genéticamente a sus circunstancias. Los cambios genéticos pueden resultar en estructuras visibles, o pueden ajustar la actividad fisiológica del organismo en un modo que se adapte al hábitat cambiado.
Puede ocurrir que los hábitats cambien con frecuencia. Por lo tanto, se entiende que el proceso de adaptación nunca está finalmente completado. Con el tiempo, puede pasar que el ambiente cambie gradualmente, y la especie se adapte a su entorno mejor y mejor. Por otro lado, puede pasar que los cambios en el ambiente ocurran con relativa rapidez, y entonces la especie se vuelva menos y menos bien adaptada. La adaptación es un proceso genético, que está ocurriendo todo el tiempo en alguna extensión, también cuando la población no cambia el hábitat o ambiente.
Se pueden cambiar (sustitución) , eliminar (deleciones) o agregar (inserción) nucleótidos individuales en una secuencia de ADN. La inserción o deleción de SNPs (InDels) puede alterar el marco de lectura de la traducción.
Los polimorfismos de nucleótido individual pueden caer dentro de secuencias codificantes de genes (Marcos Abiertos de Lectura u ORFs) , regiones no codificantes de genes (como secuencias de promotor, secuencias terminadoras y similares) , o en las regiones intergénicas entre los genes. Los SNPs dentro de una secuencia codificante no cambiará necesariamente a la secuencia de aminoácidos de la proteina correspondiente que se produce después de la transcripción y traducción, debido a la degeneración del código genético. Un SNP en donde ambas formas conducen a la misma secuencia polipeptidica se denomina sinónimo (una mutación silenciosa) . Si se produce una secuencia polipeptidica diferente, el mismo es no sinónimo. Un cambio no sinónimo puede ser o bien de sentido erróneo o sin sentido. Un cambio de sentido erróneo resulta en un aminoácido diferente en el polipéptido correspondiente, mientras que un cambio sin sentido resulta en un codón de detención prematuro, lo que a veces conduce a la formación de una proteina truncada.
Los SNPs que no están en regiones que codifican para proteínas, aun pueden tener consecuencias para la expresión génica, por ejemplo mediante una unión de factor de transcripción alterada o una estabilidad alterada del correspondiente ARNm.
Los cambios que pueden ocurrir en el ADN no se limitan necesariamente al cambio (sustitución, deleción o inserción) de un nucleótido individual, sino que también pueden comprender un cambio de dos o más nucleótidos (Variaciones Nucleares Pequeñas).
Además, pueden ocurrir traslocaciones cromosómicas . Una traslocación cromosómica es una anormalidad de cromosoma que está causada por un rearreglo de partes entre cromosomas no homólogos .
En particular, de conformidad a la invención se crean SNP en los siguientes marcos de lectura: SSY1, CEP3 y GAL80.
SSY1 es en la presente un componente del sistema sensor de aminoácidos de la membrana plasmática SPS (Ssylp-Ptr3p-Ssy5p) , que actúa de sensor de la concentración externa de aminoácidos y transmite señales intracelulares que resultan en la regulación de la expresión de genes permeasa para aminoácidos .
CEP3 es en la presente una proteina esencial del cinetocoro, componente del complejo CBF3 que se une a la región CDEIII del centrómero; contiene un dominio N-terminal Zn2Cys6 tipo dedos de zinc, un dominio C-terminal ácido, y un dominio putativo de dimerizacion de bobina enrollada.
GAL80 es en la presente un regulador transcripcional que está involucrado en la represión de los genes GAL en ausencia de galactosa. Típicamente el mismo inhibe la activación transcripcional mediante Gal4p y la inhibición se libera mediante la unión de Gal3p o Gallp.
De conformidad a la invención, los SNP de los genes SSY1, CEP3 y GAL80 han demostrado ser importantes para la célula sea capaz de fermentar una composición de azúcares mixtos .
Se llevaron a cabo búsquedas por BLAST para los SNP encontrados en estos genes.
Un resumen de los SNP que se identificaron se da en la Tabla 1: Tabla 1: Resumen de SNP de la invención * la A del codón de inicio ATG es la primera posición de nucleótido Un blast de los genes conteniendo los SNP resltó en los siguientes datos: Ssylp (miembro de la superfamilia de AA trans) Componente del sistema sensor de aminoácidos de membrana plasmática SPS ( Ssylp-Ptr3p-Ssy5p) , que actúa como sensor de la concentración externa de aminoácidos y transmite señales intracelulares que resultan en la regulación de la expresión de genes permeasa de aminoácidos [Saccharomyces cerevisiae] Ssylp S. cerevisiae JAY291 852 aa 99% de identidad Ssylp S. cerevisiae YJM789 852 aa 99% de identidad proteina tipo YDR160w S. cerevisiae AWRI1631 791 aa 99% de identidad ZYRO0F13838p Z. rouxii CBS 732 836 aa 56% de identidad proteina hipotética C. glabrata CBS 138 853 aa 53% de identidad KLTH0G11726p Lachancea thermotolerans 824 aa 46% de identidad Proteina más corta encontrada en S. cerevisiae, BIE201, es una característica única.
YJR154w (miembro de la superfamilia PhyH) Proteína putativa de función desconocida; proteínas de fusión con proteína fluorescente verde (GFP) localizan en el citoplasma [Saccharomyces cerevisiae] YJR154w S. cerevisiae JAY291 346 aa 100% de identidad proteina conservada S. cerevisiae YJM789 346 aa 99% de identidad putativa pimeloil-CoA sintasaS. cerevisiae 346 aa 71% de identidad proteina tipo YJR154Wp S. cerevisiae AWRI1631 227 aa 99% de identidad KLTH0E09900p Lachancea thermotolerans 340 aa 48% de identidad En todas estas proteínas, el residuo D de la posición 171 (o posición equivalente en base a los resultados de BLAST) está conservado.
CEP3 (tipo GAL4 Zn2Cys6 agrupamiento binuclear dominio de unión a ADN; encontrado en reguladores de la transcripción como GAL4) Complejo proteico de unión a ADN de centrómero CBF3 subunidad B CEP3 S. cerevisiae JAY291 608 aa 100% de identidad ZYRO0A07260p Z. rouxii CBS 732 596 aa 46% de identidad producto proteico sin nombre Candida glabrata CBS138 611 aa 44% de identidad AFL200Wp A. gossypii ATCC 10895 596 aa 41% de identidad En todas estas proteínas, el residuo S de la posición 396 (o posición equivalente en base a los resultados del BLAST) está conservado.
GAL80 (miembro de la superfamilia NADB Rossmann) Proteína reguladora del metabolismo de galactosa/lactosa GAL80 regulador transcripcional S. cerevisiae YJM789 435 aa 100% de identidad GAL80p S. kudriavzevii 435 aa 89% de identidad proteína Kpol_1059p5 V. polispora DSM 70294 429 aa 73% de identidad ZYRO0G04664p Z. rouxii CBS 732 437 aa 67% de identidad KLTH0C02838p L. thermotolerans 424 aa 64% de identidad proteína K1GAL80 Kluyveromyces lactis 457 aa 58% de identidad NECHADRAFT_86878 N. haematococca mpVI 77-13-4 367aa 30% de identidad En todas estas proteínas, el residuo T de la posición 146 (o posición equivalente según los resultados del BLAST) está conservado.
La composición de azúcares La composición de azúcares de acuerdo a la invención comprende glucosa, arabinosa y xilosa. Se puede usar cualquier composición de azúcares en la invención que cumpla con esos criterios. Los azúcares óptimos en la composición de azúcares son galactosa y rhamnosa. En una forma de realización preferida, la composición de azúcares es un hidrolizado de uno o más materiales lignocelulósicos . La lignocelulosa en la presente incluye las partes de hemicelulosa y hemicelulosa de la biomasa. También lignocelulosa incluye a las fracciones de lignocelulosa de la biomasa. Se pueden encontrar materiales lignocelulósicos apropiados en la siguiente lista: iniciadores de huerta, chaparral, desechos de molino, desechos de madera urbanos, desechos municipales, desechos de podas, materiales de poda de bosques, cultivos de arbolados de rotación corta, desechos industriales, paja de trigo, paja de avena, paja de arroz, paja de cebada, paja de centeno, paja de lino, cáscara de soja, cáscara de arroz, paja de arroz, alimento de gluten de trigo, cáscara de avena, azúcar de caña, residuos de maíz, canas de maíz, mazorcas de maíz, vainas de maíz, pasto varilla, miscanthus, sorgo dulce, tallos de cañóla, tallos de soja, pasto de pradera, pasto gama, cola de zorro; pulpa de remolacha dulce, pulpa de frutas cítricas, cáscara de semillas, desechos animales celulósicos, recortes de césped, algodón, algas marinas, árboles, madera blanda, madera dura, álamo, pino, arbustos, hierbas, trigo, paja de trigo, residuos de prensado de caña de azúcar, maíz, vainas de maíz, mazorcas de maíz, grano de maíz, fibra de granos, productos y subproductos de moliendo húmeda o seca de granos, desechos sólidos municipales, papel de desecho, desechos de patio, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, desechos sólidos municipales, desechos de papel, pulpa, residuos de molienda de papel, ramas, arbustos, cañas, maíz vainas de maíz, un cultivo energético, bosque, una fruta, una flor, un grano, una hierba, un cultivo herbáceo, una hoja, corteza, una espina, un tronco, una raíz, un árbol joven, un árbol achaparrado, pasto varilla, un árbol, un vegetal, piel de fruta, una vid, pulpa de remolacha dulce, cascarillas de trigo, cáscara de avena, madera dura o blanda, material de desecho orgánico que se genera en un proceso industrial, desechos de madera de silvicultura, o una combinación de dos o más cualesquiera de los mismos.
Un resumen de algunas composiciones de azúcares apropiadas que derivan de lignocelulosa y la composición de azúcares de sus hidrolizados se da en la Tabla 1. Las lignocelulosas listadas incluyen a: mazorcas de maiz, fibras de maiz, cáscara de arroz, cáscara de melón, pulpa de remolacha dulce, paja de trigo, residuos de prensado de caña de azúcar, madera, hierbas y residuos de prensado de olivas.
Tabla 1: Resumen de composiciones de azúcares de materiales lignocelulósicos . Gal=galactosa, Xyl=xilosa, Ara=arabinosa, Man=manosa, Glu=glutamato, Rham=rhamnosa . Se da el porcentaje de galactosa (% Gal) y la fuente de la literatura.
Es claro a partir de la Tabla 1 que en estas lignocelulosas hay presente una alta cantidad de azúcar en forma de glucosa, xilosa, arabinosa y galactosa. La conversión de glucosa, xilosa, arabinosa y galactosa a producto de fermentación es por lo tanto de gran importancia económica. También hay presente rhamnosa en algunos materiales lignocelulósicos en menores cantidades que los azúcares que se mencionaron previamente. Ventajosamente por lo tanto, también se convierte rhamnosa mediante la célula capaz de utilizar azúcares mixtos.
Pretratamiento e hidrólisis enzimática Se puede necesitar pretratamiento e hidrólisis enzimática para liberar azúcares que se pueden fermentar de acuerdo a la invención a partir del material lignocelulósico (incluyendo hemicelulósico) . Estos pasos se pueden ejecutar con métodos convencionales.
Célula capaz de utilizar azúcares mixtos La célula capaz de utilizar azúcares mixtos comprende los genes araA, araB y araD integrados en el genoma de la célula capaz de utilizar azúcares mixtos como se define más adelante en la presente. La misma es capaz de fermentar glucosa, arabinosa, xilosa, galactosa y mañosa. En una forma de realización de la invención la célula capaz de utilizar azúcares mixtos es capaz de fermentar uno o más azúcares adicionales, preferentemente azúcares C5 y/o C6. En una forma de realización de la invención la célula capaz de utilizar azúcares mixtos comprende uno o más de: un gen xylA y/o XKS1, para permitir a la célula capaz de utilizar azúcares mixtos fermentar xilosa; deleción del gen de aldosa reductasa (GRE3); sobreexpresión de genes PPP TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1 para permitir el incremento del flujo a través de la ruta de las pentosas fosfato en la célula.
Construcción de cepa capaz de utilizar azúcares mixtos Los genes se pueden introducir en la célula capaz de utilizar azúcares mixtos mediante la introducción en una célula hospedera de: a) una agrupación que consiste en genes PPP TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1, bajo el control de promotores fuertes; b) una agrupación que consiste en un gen xylA y un gen XKSl ambos bajo el control de promotores constitutivos, c) una agrupación que consiste en los genes araA, araB y araD y/o una agrupación de gen xylA y/o el gen XKSl; y d) deleción de un gen de aldosa reductasa y evolución adaptativa para producir la célula capaz de utilizar azúcares mixtos. La célula anterior se puede construir usando técnicas de expresión recombinantes .
Expresión recombinante La célula de la invención es una célula recombinante. 0 sea, una célula de la invención comprende, o está genéticamente modificada con una secuencia de nucleótidos que no existe de manera natural en la célula de interés.
Las técnicas para la expresión recombinante de enzimas en una célula, asi como también para las modificaciones genéticas adicionales de una célula de la invención son bien conocidas para las personas con experiencia en el arte. Típicamente dichas técnicas involucran la transformación de una célula con construcción de ácidos nucleicos que comprende la secuencia relevante. Dichos métodos son, por ejemplo, conocidos a partir de textos estándar tales como Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ra edición) , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, o F. Ausubel et al. , eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987). Los métodos para transformación y modificación genética de células hospederas fúngicas son conocidos a partir de por ejemplo EP-A- 0635 574, WO 98/46772, WO 99/60102, WO 00/37671, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635574 y US 6.265.186.
Típicamente, la construcción de ácido nucleico puede ser un plásmido, por ejemplo un plásmido de bajo número de copias o un plásmido de alto número de copias. La célula de acuerdo a la presente invención puede comprender una copia simple o múltiples copias de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una enzima, por ejemplo mediante múltiples copias de una construcción de nucleótidos o mediante el uso de una construcción que tiene múltiples copias de la secuencia de la enzima.
La construcción de ácidos nucleicos se puede mantener episomalmente y por lo tanto comprende una secuencia para replicación autónoma, tal como una secuencia de replicación autosómica. Una construcción de ácido nucleico episomal apropiada puede por ejemplo basarse en los plásmidos de levadura 2µ o pKDl (Gleer et al., 1991, Biotechnology 9: 968-975), o los plásmidos AMA (Fierro et al., 1995, Curr Genet . 29:482-489). Alternativamente, cada construcción de acido nucleico se puede integrar en una o más copias en el genoma de la célula. La integración en el genoma de la célula puede ocurrir al azar mediante recombinación no homologa, pero preferentemente, la construcción de ácido nucleico se puede integrar en el genoma de la célula mediante recombinación homologa como bien se conoce en el arte (véase por ejemplo WO90/14423, EP-A-0481008 , EP-A-0635 574 y US 6.265.186).
La mayoría de los plásmidos episomales o 2µ son relativamente inestables, perdiéndose en aproximadamente 10-2 o más células después de cada generación. Incluso bajo condiciones de crecimiento selectivo, solo el 60% de las células retienen el plásmido episomal. El número de copias de la mayoría de los plásmidos episomales está en el rango entre 10 y 40 por célula hospedera cir+. Sin embargo, los plásmidos no se distribuyen equivalentemente entre las células, y hay una alta varianza del número de copias por célula en las poblaciones. Las cepas transformadas con plásmidos integrativos son extremadamente estables, incluso en ausencia de presión selectiva. Sin embargo, la pérdda de plásmido ocurre a aproximadamente entre 10-3 y 10-4 frecuencias por recombinación homologa entre ADN repetido en tándem, lo que conduce a la pérdida por formación de bucle de la secuencia del vector. Preferentemente, el diseño del vector en el caso de integración estable es tal que, ante la pérdida de los genes marcadores de selección (que también ocurre mediante recombinación homologa intramolecular) , esa pérdida por formación de bucle de la construcción integrada ya no es posible. Preferentemente los genes están, por lo tanto, integrados en forma estable. La integración estable se define en la presente como la integración dentro del genoma, en donde no es posible la pérdida por formación de bucle de la construcción integrada. Preferentemente los marcadores de selección están ausentes. Típicamente, la secuencia que codifica para la enzima estará conectada en forma operable con una o más secuencias de ácidos nucleicos, capaces de colaborar o de ayudar en la transcripción y/o traducción de la secuencia de la enzima.
El término "conectado en forma operable" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes que se describen están en una relación que les permite funcionar en la manera esperada. Por ejemplo, un promotor o potenciador está conectado en forma operable a una secuencia codificante de modo que dicho promotor o potenciador afecta la transcripción de la secuencia codificante.
Como se usa en la presente, el término "promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más genes, que se localiza corriente arriba con respecto a la dirección de transcripción del sitio de inicio de transcripción del gen, y que está estructuralmente identificado por la presencia de un sitio de unión para la ARN polimerasa dependiente de ADN, de sitios de inicio de la transcripción y de cualquier otra secuencia de ADN conocida por una persona con experiencia en el arte. Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo bajo la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está activo bajo regulación del ambiente o del desarrollo.
El promotor que se puede usar para conseguir la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica para una enzima de acuerdo a La presente invención, puede no ser natural de la secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima que se va a expresar, o sea un promotor que es heterólogo a la secuencia de nucleótidos (secuencia codificante) a la que el mismo está conectado en forma operable. Sin embargo, el promotor puede ser homólogo, o sea endógeno, a la célula hospedera.
Los promotores están ampliamente disponibles y son conocidos para una persona con experiencia. Los ejemplos apropiados de dichos promotores incluyen a, por ejemplo, promotores de genes glicolíticos, tales como los promotores de fosfofructoquinasa (PFK), triosa fosfato isomerasa (TPI), gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa (GPD, TDH3 o GAPDH) , piruvato quinasa (PYK) , fosfoglicerato quinasa (PGK) de levaduras u hongos filamentosos; se pueden encontrar más detalles acerca de dichos promotores de levaduras en O 93/03159. Otros promotores útiles son los promotores de genes que codifican para proteínas ribosomales, el promotor del gen de lactasa (LAC4), alcohol deshidrogenasa (ADH1, ADH4, y similares) , y el promotor de enolasa (ENO) . Otros promotores, tanto constitutivos como inducibles, y potenciadores o secuencias de activación corriente arriba serán conocidos por las personas con experiencia en el arte. Los promotores que se usan en las células hospederas de la invención se pueden modificar, si se desea, para afectar sus características de control. Promotores apropiados en este contexto incluyen tanto a promotores naturales constitutivos como inducibles como así también a promotores modificados por ingeniería, los cuales son bien conocidos por las personas con experiencia en el arte. Promotores apropiados para células hospederas eucariotas pueden ser GAL 7, GALIO, or GALl , CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPDH, ADC1 , TRP1 , URA3, LEU2, ENOl , TPI1, y AOX1. Otros promotores apropiados incluyen a PDC1, GPD1, PGK1, TEF1, y TDH3.
En una célula de la invención, el extremo 3' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la enzima está preferentemente conectado en forma operable a la secuencia terminadora de la transcripción. Preferentemente la secuencia terminadora es operable en una célula hospedera de elección, tal como por ejemplo las especies de levadura de elección. En cualquier caso, la elección del terminador no es critica; el mismo puede ser, por ejemplo, de cualquier gen de levadura, a pesar de que a veces los terminadores pueden funcionar si son de un gen eucariota distinto a los de levadura. Usualmente una secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima comprende un terminador. Preferentemente, dichos terminadores se combinan con mutaciones que previenen el decaimiento del ARNm mediado por mutaciones sin sentido en la célula hospedera de la invención (véase por ejemplo: Shirley et al., 2002, Genetics 161:1465-1482) .
La secuencia terminadora de la transcripción además preferentemente comprende una señal de poliadenilación.
Opcionalmente, puede haber presente un marcador de selección en una construcción de ácido nucleico apropiada para usar en la invención. Como se usa en la presente, el término "marcador" se refiere a un gen que codifica para un rasgo o un fenotipo que permite la selección de, o el cribado de una célula hospedera que contiene al marcador. El gen marcador puede ser un gen de resistencia a antibióticos en donde se puede usar el antibiótico apropiado para seleccionar a células transformadas de entre células que no están transformadas. Los ejemplos de marcadores de resistencia a antibiótico incluyen a por ejemplo dihidrofolato reductasa, higromicina-B-fosfotransferasa, 3' -O-fosfotransferasa II (resistencia a kanamicina, neomicina y G418) . Los marcadores de resistencia a antibiótico pueden ser más convenientes para la transformación de células hospederas poliploides, También se pueden usar marcadores no de resistencia a antibiótico, tales como marcadores auxotróficos (URA3, TRP1 , LEU2) o el gen TPI de S. pombe (descrito por Russell P R, 1985, Gene 40: 125-130) . En una forma de realización preferida las células hospederas transformadas con la construcción de ácido nucleico están libres de genes marcadores. Los métodos para construir células hospederas microbianas recombinantes libres de genes marcadores se exponen en EP-A-0 635 574 y se basan en el uso de los marcadores bidireccionales tales como el gen de A. nidulans amdS (acetamidasa) o los genes de levaduras URA3 y LYS2. Alternativamente, se puede incorporar un marcador cribable tal como Green Fluorescent Protein, lacL, luciferasa, cloramfenicol acetiltransferasa, beta-glucuronidasa en la construcción de ácido nucleico de la invención, lo que permite cribar las células transformadas.
Otros elementos adicionales que pueden estar presentes en la construcción de ácido nucleico apropiada para usar en la invención incluyen, pero no como limitación, a una o más secuencias líder, potenciadores, factores de integración, y/ genes reporteros, secuencias intrónicas, centrómeros, telómero y/o secuencias de pegado a matriz (MAR) . Las construcciones de ácido nucleico de la invención pueden comprender además una secuencia para replicación autónoma, tal como una secuencia ARS.
El proceso de combinación se puede ejecutar, por lo tanto, con técnicas de recombinación conocidas. Diferentes medios son conocidos para las personas con experiencia en el arte para la expresión y la sobreexpresion de enzimas en una célula de la invención. En particular, se puede sobreexpresar una enzima mediante el incremento del número de copias del gen que codifica para la enzima en la célula hospedera, por ejemplo mediante la integración de copias adicionales del gen en el genoma de la célula hospedera, mediante la expresión del gen desde un vector de expresión multicopia episomal o mediante la introducción de un vector de expresión episomal que comprende múltiples copias del gen.
Alternativamente, la sobreexpresion de enzimas en las células hospederas de la invención se puede llevar a cabo mediante el uso de un promotor que no sea nativo de la secuencia codificante de la enzima a sobreexprear, o sea un promotor que sea heterólogo a la secuencia codificante a la que está conectado en forma operable. A pesar de que el promotor es preferentemente heterólogo a la secuencia codificante a la que está conectado en forma operable, también es preferible que el promotor sea homólogo, o sea endógeno a la célula hospedera. Preferentemente el promotor heterólogo es capaz de producir un mayor nivel de estado estacionario del transcripto que comprende la secuencia codificante (o el mismo es capaz de producir más moléculas de transcripto, o sea moléculas de ARNm, por unidad de tiempo) de lo que lo hace el promotor que es nativo de la secuencia codificante. Promotores apropiados en este contexto incluyen tanto a promotores naturales constitutivos como inducibles asi como también a promotores modificados por ingeniería.
La secuencia codificante que se usa para la sobreexpresión de las enzimas que se mencionaron previamente puede preferentemente ser homologa a la célula hospedera de la invención. Sin embargo, también se pueden usar secuencias codificantes que son heterólogas a la célula hospedera de la invención .
La sobreexpresión de una enzima, cuando se refiere a la producción de la enzima en una célula genéticamente modificada, significa que la enzima se produce a un nivel mayor de actividad enzimática específica en comparación con la célula hospedera sin modificar bajo condiciones idénticas. Usualmente esto significa que la proteina activa enzimáticamente (o proteínas en el caso de enzimas con unidades múltiples) se produce en cantidades mayores, o bien a un nivel de estado estacionario mayor en comparación con la célula hospedera sin modificar, bajo condiciones idénticas. Similarmente, esto usualmente significa que el ARNm que codifica para la proteína activa enzimáticamente se produce en mayores cantidades, o nuevamente a un nivel de estado estacionario mayor, en comparación con la célula hospedera sin modificar bajo condiciones idénticas. Preferentemente in una célula hospedera de la invención, an enzyme a sobreexpresarse se sobreexpresa mediante al menos a factor de aproximadamente 1.1, aproximadamente 1.2, aproximadamente 1.5, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica excepto por la modificación genética que causa la sobreexpresión . Se comprenderá que estos niveles de sobreexpresión se pueden aplicar al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima, al nivel de estado estacionario de la proteína de la enzima así como también al nivel de estado estacionario del transcripto que codifica para la enzima.
La evolución adaptativa Las células capaces de utilizar azúcares mixtos en su preparación se pueden someter a evolución adaptativa. Una célula capaz de utilizar azúcares mixtos se puede adaptar a la utilización de azúcares mediante selección de mutantes, ya sea espontáneos o inducidos (por ejemplo mediante radiación o químicos) , para crecer en un azúcar deseado, preferentemente como única fuente de carbono, y más preferentemente bajo condiciones anaeróbicas. La selección de mutantes se puede llevar a cabo mediante técnicas que incluyen transferencia serial de cultivos como por ejemplo lo descrito por Kuyper et al. (2004, FEMS Yeast Res. 4: 655-664) o mediante cultivo bajo presión selectiva en un cultivo quimiostático . Por ejemplo en una célula hospedera preferida, al menos una de las modificaciones genéticas descritas previamente, incluyendo a las modificaciones que se obtienen mediante selección de mutantes, confieren a la célula hospedera la habilidad de crecer sobre xilosa como fuente de carbono, preferentemente como única fuente de carbono, y preferentemente bajo condiciones anaeróbicas. Cuando se usa XI como gen para convertir xilosa, preferentemente la célula esencialmente no produce xilitol, por ejemplo el xilitol que se produce está por debajo del límite de detección o por ejemplo es menos de aproximadamente 5, aproximadamente 2, aproximadamente 1, aproximadamente 0.5, o aproximadamente 0.3 % del carbono que se consume en base molar.
La evolución adaptativa también se describe por ejemplo en Wisselink H.W. et al, Applied and Environmental icrobiology Agosto 2007, p. 4881-4891 En una forma de realización de evolución adaptativa se aplica un régimen que consiste en cultivo en lote repetido con ciclos repetidos de crecimiento consecutivo en medios diferentes, por ejemplo tres medios con diferentes composiciones (glucosa, xilosa, y arabinosa; xilosa y arabinosa. Véase Wisselink et al. (2009) Applied and Environmental Microbiology, Feb. 2009, p. 907-914.
La célula hospedera La célula hospedera puede ser cualquier célula hospedera que sea apropiada para la producción de un producto útil. Una célula de la invención puede ser cualquier célula apropiada, tal como una célula procariota, tal como una bacteria, o una célula eucariota. Típicamente, la célula será una célula eucariota, por ejemplo una levadura y un hongo filamentoso.
Las levaduras se definen en la presente como microorganismos eucariotas e incluyen a todas las especies de la subdivisión Eumycotina (Alexopoulos, C. J..1962, In : Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc. , Nueva York) que crecen predominantemente en forma unicelular.
Las levaduras pueden crecer o bien mediante brotación de un tallo unicelular o pueden crecer mediante fisión del organismo. Una levadura preferida como célula de la invención puede pertenecer al género Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula , Kloeckera , Schwanniomyces o Yarrowia . Preferentemente la levadura es una que sea capaz de fermentación anaeróbica, más preferentemente una capaz de fermentación alcohólica anaeróbica.
Los hongos filamentosos se definen como microorganismos eucariotas e incluyen a todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina. Estos hongos se caracterizan por un micelio vegetativo compuesto de quitina, celulosa, y otros polisacáridos complejos.
Los hongos filamentosos que son apropiados para usar como célula de la presente invención son morfológicamente, fisiológicamente y genéticamente distintos de las levaduras. Las células de hongos filamentosos pueden usarse de forma ventajosa debido a que la mayoría de los hongos no requieren de condiciones estériles para la propagación y son no sensibles a las infecciones por bacteriófagos. El crecimiento vegetativo de los hongos filamentosos es mediante elongación de hifas y el metabolismo del carbono de la mayoría de los hongos filamentosos es obligadamente aeróbico. Los hongos filamentosos preferidos como célula hospedera de la invención pueden pertenecer al género Aspergillus, Trichoderma, Humicola , Acremoniurra , Fusarium o Penicillium. Más preferentemente, la célula de hongo filamentoso puede ser una célula de Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, un Penicillium chrysogenum, o Rhizopus oryzae.
En una forma de realización la célula hospedera puede ser levadura.
Preferentemente el hospedero es una célula industrial, más preferentemente una levadura industrial. Un hospedero industrial y una levadura industrial se pueden definir como sigue. Los ambientes vivientes de las células de levadura en procesos industriales son significativamente diferentes de los del laboratorio. Las células de levadura industriales deben ser capaces de desempeñarse bien bajo múltiples condiciones ambientales que pueden variar durante el proceso. Dichas variaciones incluyen cambios en las fuentes de nutrientes, pH, concentración de etanol, temperatura, concentración de oxigeno, etc., que juntos tienen un impacto potencial sobre el crecimiento celular y la producción de etanol de Saccharomyces cerevisiae . Bajo condiciones industriales adversas, las cepas tolerantes al entorno debieran permitir un crecimiento y producción robustos. Las cepas de levaduras industriales por lo general son más robustas a estos cambios de las condiciones ambientales que pueden existir en las aplicaciones en que se usan, tal como en la industria de la panadería, la industria cervecera, la industria de los vinos y la industria del etanol. Los ejemplos de levaduras industriales (S. cerevisiae) son Ethanol Red® (Fermentis) Fermiol® (DSM) y Thermosacc® (Lallemand) .
En una forma de realización el hospedero es tolerante a inhibidor. Las células hospederas tolerantes a inhibidor se pueden seleccionar mediante el cribado de cepas para crecimiento sobre materiales que contienen inhibidores, tal como se ilustra en Kadar et al, Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847-858, en donde se eligió una cepa de S. cerevisiae ATCC 26602 tolerante a inhibidor.
Preferentemente la célula hospedera es industrial y tolerante a inhibidores.
Genes araA, araB y araD Una célula de la invención es capaz de usar arabinosa. Una célula de la invención por lo tanto es capaz de convertir L-arabinosa y L-ribulosa y/o xilulosa 5-fosfato y/o a un producto de fermentación que se desea, por ejemplo uno de los que se mencionan en la presente.
Se pueden producir organismos, por ejemplo cepas de S. cerevisiae, capaces de producir etanol a partir de L-arabinosa mediante modificación de una célula por introducción de los genes araA (L-arabinosa isomerasa) , araB (L-ribuloquinasa) y araD (L-ribulosa-5-P4-epimerasa) a partir de una fuente apropiada. Dichos genes se pueden introducir en una célula de la invención con el objetivo de que sea pacaz de usar arabinosa. Dicha estrategia se describe en WO2003/095627. Se pueden usar los genes araA, araB y araD de Lactobacillus plantanum y se los expone en WO2008/041840. Se pueden usar los genes araA de Bacillus subtilis y los genes araB y araD de Escherichia coli y se los expone en EP1499708.
Genes PPP Una célula de la invención puede comprender una o más modificaciones genéticas que incrementan el flujo de la ruta de las pentosas fosfato. En particular, la(s) modificaciones genéticas pueden conducir a un flujo incrementado a través de la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato. Una modificación genética que cause un flujo incrementado de la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato se entiende en la presente como designando a la modificación que incrementa el flujo en al menos un factor de aproximadamente 1.1, aproximadamente 1.2, aproximadamente 1.5, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 en comparación con el flujo en una cepa que es genéticamente idéntica excepto por la modificación genética que causa el flujo incrementado. El flujo de la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato se puede medir mediante crecimiento del hospedero modificado sobre xilosa como única fuente de carbono, determinando la tasa de consumo especifico de xilosa y restando la tasa especifica de producción de xilitol de la tasa especifica de consumo de xilosa, si es que se produce xilitol. Sin embargo, el flujo de la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato es proporcional a la tasa de crecimiento sobre xilosa como única fuente de carbono, preferentemente con la tasa de crecimiento anaeróbico sobre xilosa como única fuente de carbono. Hay una relación lineal entre la tasa de crecimiento sobre xilosa como única fuente de carbono ( max) y el flujo de la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato. La tasa especifica de consumo de xilosa (Qs) es igual a la tasa de crecimiento (µ) dividido por el rendimiento de biomasa sobre azúcar (Yxs) debido a que el rendimiento de biomasa sobre azúcar es constante (bajo un grupo de condiciones dadas: anaeróbico, medio de crecimiento, pH, fondo genético de la cepa, etc.; o sea Qs = µ/ Yxs). Por lo tanto el flujo incrementado de la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato se puede deducir a partir del incremento de la tasa de crecimiento máxima bajo estas condiciones excepto por el transporte (la captación es limitante) .
Se pueden introducir una o más modificaciones genéticas que incrementen el flujo de la ruta de las pentosas fosfato en la célula hospedera de varias maneras. Estas incluyen por ejemplo conseguir mayores niveles de actividad de estado estacionario de xilulosa quinasa y/o uno o más de las enzimas de la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato y/o un menor nivel de estado estacionario de actividad inespecifica de aldosa reductasa. Estos cambios en los niveles de actividad de estado estacionario se pueden efectuar mediante selección de mutantes (espontáneos o inducidos por químicos o por radiación) y/o mediante tecnología de ADN recombinante por ejemplo mediante sobreexpresión o inactivación, respectivamente, de genes que codifican para la enzimas o factores que regulan a estos genes .
En una célula hospedera preferida, la modificación genética comprende sobreexpresión de al menos una enzima de la ruta de las pentosas fosfato (parte no oxidativa) . Preferentemente la enzima se elige del grupo que consiste en las enzimas que codifican para ribulosa-5- fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa . Se pueden sobreexpresar diferentes combinaciones de enzimas de la ruta de las pentosas fosfato (parte no oxidativa) . Por ejemplo las enzimas que se sobreexpresan pueden ser al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y ribulosa-5-fosfato epimerasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y transcetolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato epimerasa y transcetolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5- fosfato epimerasa y transaldolasa; o al menos las enzimas transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, y transcetolasa. En una forma de realización de la invención se sobreexpresa cada una de las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa en la célula hospedera. Se prefiere más una célula hospedera en donde la modificación genética comprende al menos sobreexpresion de ambas enzimas transcetolasa y transaldolasa como tal para que una célula hospedera ya sea capaz de crecimiento anaeróbico sobre xilosa. De hecho, bajo algunas condiciones las células hospederas que sobreexpresan solo la transcetolasa y la transaldolasa ya tienen la misma tasa de crecimiento anaeróbico sobre xilosa como las células hospederas que sobreexpresan las cuatro enzimas, o sea la ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa. Más aun, las células hospederas que sobreexpresan tanto la enzima ribulosa-5-fosfato isomerasa como la ribulosa-5- fosfato epimerasa se prefieren sobre las células hospederas que sobreexpresan solo la isomerasa o solo la epimerasa ya que la sobreexpresion de solo una de estas enzimas puede producir desbalances metabólicos .
La enzima "ribulosa 5-fosfato epimerasa" (EC 5.1.3.1) se define en la presente como una enzima que cataliza la epimerisation de D-xilulosa 5-fosfato a D-ribulosa 5- fosfato y vice versa. La enzima también se conoce como fosforibulosa epimerasa; eritrosa-4-fosfato isomerasa; fosfocetopentosa 3-epimerasa; xilulosa fosfato 3-epimerasa; fosfocetopentosa epimerasa; ribulosa 5-fosfato 3- epimerasa; D-ribulosa fosfato-3-epimerasa; D-ribulosa 5-fosfato epimerasa; D-ribulosa-5-? 3-epimerasa; D-xilulosa-5-fosfato 3-epimerasa; pentosa-5-fosfato 3-epimerasa; o D-ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa. Una ribulosa 5-fosfato epimerasa también se puede definir por su secuencia de aminoácidos. De forma similar una ribulosa 5-fosfato epimerasa se puede definir por una secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima asi como también por una secuencia de nucleótidos que hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia 'que codifica para una ribulosa 5-fosfato epimerasa. La secuencia de nucleótidos que codifica para ribulosa 5-fosfato epimerasa se designa en la presente como RPEl .
La enzima "ribulosa 5-fosfato isomerasa" (EC 5.3.1.6) se define en la presente como una enzima que cataliza la isomerización directa de D-ribosa 5-fosfato a D-ribulosa 5-fosfato y vice versa. La enzima también se conoce como fosfopentosisomerasa; fosforiboisomerasa; ribosa fosfato isomerasa; 5-fosforibosa isomerasa; D- ribosa 5-fosfato isomerasa; D-ribosa-5-fosfato cetol-isomerasa; o D-ribosa-5-fosfato aldosa-cetosa-isomerasa . Una ribulosa 5-fosfato isomerasa también se puede definir por su secuencia de aminoácidos. De forma similar una ribulosa 5-fosfato isomerasa se puede definir por una secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima asi como también por una secuencia de nucleótidos que hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica para una ribulosa 5-fosfato isomerasa. La secuencia de nucleótidos que codifica para ribulosa 5-fosfato isomerasa se designa en la presente como RPI1.
La enzima "transcetolasa" (EC 2.2.1.1) se define en la presente como una enzima que cataliza la reacción: D-ribosa 5-fosfato + D-xilulosa 5-fosfato <-> sedoheptulosa 7-fosfato + D-gliceraldehído 3-fosfato y vice versa. La enzima también se conoce como glicolaldehidotransferasa o sedoheptulosa-7-fosfato: D-gliceraldehido-3-fosfato glicolaldehidotransferasa . Una transcetolasa también se puede definir por sus aminoácidos. De forma similar una transcetolasa se puede definir por una secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima asi como también por una secuencia de nucleótidos que hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica para una transcetolasa. La secuencia de nucleótidos que codifica para transcetolasa se designa en la presente como TKL1.
La enzima "transaldolasa" (EC 2.2.1.2) se define en la presente como una enzima que cataliza la reacción: sedoheptulosa 7-fosfato + D-gliceraldehido 3-fosfato <-> D-eritrosa 4-fosfato + D-fructosa 6-fosfato y vice versa. La enzima también se conoce como dihidroxiacetonatransferasa ; dihidroxiacetona sintasa; formaldehido transcetolasa; o sedoheptulosa-7- fosfato : D-gliceraldehido-3 -fosfato glicerinatransferasa. Una transaldolasa también se puede definir por su secuencia de aminoácidos. De forma similar una transaldolasa se puede definir por una secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima asi como también por una secuencia de nucleótidos que hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica para una transaldolasa . La secuencia de nucleótidos que codifica para transcetolasa se designa en la presente como TALl.
Gen de xilosa isomerasa La presencia de la secuencia de nucleótidos que codifica para una xilosa isomerasa confiere a la célula la habilidad para isomerizar xilosa a xilulosa. De acuerdo a la invención, entre dos y quince copias de uno o más genes de xilosa isomerasa se introducen en la célula hospedera.
En una forma de realización, se introducen los entre dos y quince copias de uno o más genes de xilosa isomerasa en la célula hospedera.
Una "xilosa isomerasa" (EC 5.3.1.5) se define en la presente como una enzima que cataliza la isomerización directa de D-xilosa en D-xilulosa y/o vice versa. La enzima también se conoce como una D-xilosa cetoisomerasa . Una xilosa isomerasa de la presente también puede ser capaz de catalizar la conversión de D-glucosa y D-fructosa (y por consiguiente puede por lo tanto denominarse como una glucosa isomerasa) . Una xilosa isomerasa de la presente puede requerir un catión bivalente, tal como magnesio, manganeso y cobalto como cofactor .
Por consiguiente, una célula de la invención es capaz de isomerizar xilosa a xilulosa. La habilidad para isomerizar xilosa a xilulosa se confiere a la célula hospedera mediante transformación de la célula hospedera con una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una xilosa isomerasa definida. Una célula de la invención isomeriza xilosa a xilulosa mediante isomerización directa de xilosa a xilulosa. Se comprende que esto significa que se isomeriza xilosa a xilulosa e una reacción simple catalizada por una xilosa isomerasa, en oposición a la conversión en dos pasos de xilosa a xilulosa a través de un intermediario de xilitol como está catalizado por xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa , respectivamente.
Una unidad (U) de actividad de xilosa isomerasa se puede definir en la presente como la cantidad de enzima que produce 1 nmol de xilulosa por minuto, bajo condiciones como las que se describieron en Kuyper et al. (2003, FEMS Yeast Res. 4_: 69-78) . El gen de xilosa isomerasa puede tener diferentes orígenes, tales como por ejemplo de Pyromyces sp. como se expone en WO2006/009434. Otros orígenes apropiados son Bacteroides, en particular Bacteroides unifomis como se describe en PCT/EP2009/52623, Bacillus, en particular Bacillus stearother ophílus como se describe en PCT/EP2009/052625, Thermotoga, en particular Thermotoga marítima, como se describe en PCT/EP2009/052621 y Clostridium, en particular Clostridium cellulolyticum como se describe en PCT/EP2009/052620.
Gen XKS1 Una célula de la invención puede comprender una o más modificaciones genéticas que incrementen la actividad especifica de xilulosa quinasa. Preferentemente la modificación o modificaciones genéticas causan la sobreexpresion de una xilulosa quinasa, por ejemplo mediante sobreexpresion de una secuencia de nucleótidos que codifica para una xilulosa quinasa. El gen que codifica para la xilulosa quinasa puede ser endógeno a la célula hospedera o puede ser una xilulosa quinasa que es heteróloga a la célula hospedera. Una secuencia de nucleótidos que se usa para la sobreexpresion de xilulosa quinasa en la célula hospedera de la invención es una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido con actividad de xilulosa quinasa.
La enzima "xilulosa quinasa" (EC 2.7.1.17) se define en la presente como una enzima que cataliza la reacción ATP + D-xilulosa = ADP + D-xilulosa 5-fosfato. La enzima también se conoce como una xiluloquinasa fosforilante, D-xiluloquinasa o ATP :D- xilulosa 5-fosfotransferasa . Una xilulosa quinasa de la invención también se puede definir por su secuencia de aminoácidos. De forma similar una xilulosa quinasa se puede definir por una secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima asi como también por una secuencia de nucleótidos que hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica para una xilulosa quinasa.
En una célula de la invención, una modificación o modificaciones genéticas que incrementa (n) la actividad especifica de xilulosa quinasa se puede combinar con cualquiera de las modificaciones que incrementan el flujo de la ruta de las pentosas fosfato como se describió previamente. Esto no es, sin embargo, esencial.
Por lo tanto, una célula hospedera de la invención puede comprender solo una modificación genética o modificaciones genéticas que incrementen la actividad especifica de xilulosa quinasa. Los diferentes medios disponibles en el arte para conseguir y para analizar la sobreexpresion de una xilulosa quinasa en las células hospederas de la invención son los mismos que se describieron previamente para las enzimas de la ruta de las pentosas fosfato. Preferentemente en las células hospederas de la invención, una xilulosa quinasa a sobreexpresarse se sobreexpresa mediante al menos un factor de aproximadamente 1.1, aproximadamente 1.2, aproximadamente 1.5, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica excepto por la (las) modificación (es) genética (s) que causan la sobreexpresioón . Se comprenderá que estos niveles de sobreexpresion se pueden aplicar al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima, al nivel de estado estacionario de la proteina de la enzima asi como también al nivel de estado estacionario del transcripto que codifica para la enzima.
Deleción del gen de aldosa reductasa (GRE3) Una célula de la invención puede comprender una o más modificaciones genéticas que reduzcan la actividad inespecifica de aldosa reductasa en la célula hospedera. Preferentemente, la actividad inespecifica de aldosa reductasa se reduce en la célula hospedera mediante una o más modificaciones genéticas que reducen la expresión o inactivan un gen que codifica para una aldosa reductasa inespecifica. Preferentemente, la(s) modificación (es ) genética (s) reducen o inactivan la expresión de cada una de las copias endógenas de un gen que codifica para una aldosa reductasa inespecifica en la célula hospedera (en la presente denominado deleción de GRE3) . Las células hospederas pueden comprender múltiples copias de genes que codifican para aldosa reductasa inespecifica como resultado de de di-, poli- o aneuploidia, y/o la célula hospedera puede contener varias (iso) enzimas con actividad de aldosa reductasa que difieren en su secuencia de aminoácidos y que codifican cada una para un gen diferente. También en dichas instancias se reduce o se inactiva preferentemente la expresión de cada uno de los genes que codifican para una aldosa reductasa inespecifica.
Preferentemente, el gen se inactiva por deleción de al menos parte del gen o mediante ruptura del gen, en donde, en este contexto, el término gen también incluye a cualquier secuencia no codificante corriente arriba o corriente abajo de la secuencia codificante, en donde la deleción (parcial) o inactivación resulta en una reducción de la expresión de aldosa reductasa de actividad inespecifica en la célula hospedera .
Una secuencia de nucleótidos que codifica para una aldosa reductasa cuya actividad se va a reducir en la célula hospedera de la invención es una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido con actividad de aldosa reductasa .
Por lo tanto, una célula hospedera de la invención que comprende solo una modificación o modificaciones genéticas que reduzca (n) la actividad inespecifica de aldosa reductasa en la célula hospedera está especialmente incluida en la invención .
La enzima "aldosa reductasa" (EC 1.1.1.21) se define en la presente como una enzima que es capaz de reducir xilosa o xilulosa a xilitol. En el contexto de la presente invención una aldosa reductasa puede ser cualquier aldosa reductasa inespecifica que sea nativa (endógena) de una célula hospedera de la invención y que sea capaz de reducir xilosa o xilulosa a xilitol. Las aldosas reductasa inespecificas catalizan la reacción: aldosa + NAD ( P) H + H+ - alditol + NAD(P)+ La enzima tiene una amplia especificidad y también se conoce como aldosa reductasa; poliol deshidrogenasa (NADP+) ; alditol :NADP oxidoreductasa; alditol : NADP+ 1- oxidoreductasa; NADPH-aldopentosa reductasa; o NADPH-aldosa reductasa.
Un ejemplo particular de dicha aldosa reductasa inespecifica es endógena a S. cerevisiae y está codificada por el gen GRE3 (Traff et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 5668-74). Por lo tanto, una aldosa reductasa de la invención también se puede definir por su secuencia de aminoácidos. De forma similar una aldosa reductasa se puede definir por la secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima asi como también por una secuencia de nucleótidos que hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica para una aldosa reductasa.
Producción de bioproductos A lo largo de los años, se han hecho sugerencias para la introducción de diferentes organismos para la producción de bio-etanol a partir de azúcares de cultivo. En la práctica, sin embargo, todos los procesos de producción de bio-etanol importantes han continuado usando las levaduras del género Saccharomyces como productores de etanol. Esto es debido a las muchas características atractivas de las especies de Saccharomyces para los procesos industriales, o sea, una alta capacidad de crecimiento anaeróbico con alta tolerancia a ácido, etanol y osmolaridad, y por supuesto su alta capacidad de fermentación de etanol. Las especies de levaduras preferidas como células hospederas incluyen a S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus o K fragilis .
Una célula de la invención puede ser capaz de convertir biomasa vegetal, celulosas, hemicelulosas, pectinas, rhamnosa, galactosa, frucosa, maltosa, maltodextrinas, ribosa, ribulosa, o almidón, derivados de almidón, sacarosa, lactosa y glicerol, por ejemplo en azúcares fermentables . Por consiguiente, una célula de la invención puede expresar una o más enzimas tales como una celulasa (una endocelulasa o una exocelulasa) , una hemicelulasa (una endo- o exo-xilanasa o arabinasa) necesarias para la conversión de celulosa en monómeros de glucosa y hemicelulosa en monómeros de xilosa y arabinosa, una pectinasa capaz de convertir pectinas en ácido glucurónico y ácido galacturónico o una amilasa para convertir almidón en monómeros de glucosa.
La célula además preferentemente comprende esas actividades enzimáticas gue se requieren para la conversión de piruvato a un producto de fermentación que se desea, tal como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido acrilico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido itacónico, un aminoácido, 1.3-propanodiol, etileno, glicerol, un antibiótico ß lactámico o una cefalosporina .
Una célula preferida de la invención es una célula que naturalmente es capaz de fermentación alcohólica, preferentemente, fermentación alcohólica anaeróbica. Una célula de la invención preferentemente tiene una alta tolerancia el etanol, una alta tolerancia al bajo pH (o sea es capaz de crecer a un pH menor que aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, o aproximadamente 2.5) y hacia ácidos orgánicos tales como ácido láctico, ácido acético o ácido fórmico y/o productos de degradación de azúcares tales como furfural e hidroxi-metilfurfural y/o una alta tolerancia a temperaturas elevadas.
Cualquiera de las características o actividades previas de una célula de la invención puede estar presente en forma natural en la célula o se puede introducir o modificar por modificación genética.
Una célula de la invención puede ser una célula apropiada para la producción de etanol. Una célula de la invención puede, sin embargo, ser apropiada para la producción de productos de fermentación distintos a etanol.
Dichos productos de fermentación no etanólicos incluyen a, en principio, cualquier químico a granel o refinado que se pueda producir mediante un microorganismo eucariótico tal como una levadura o un hongo filamentoso.
Dichos productos de fermentación pueden ser, por ejemplo, butanol, ácido láctico, ácido 3 -hidroxi-propiónico, ácido acrilico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacónico, un aminoácido, 1.3-propano-diol , etileno, glicerol, un antibiótico ß lactámico o una cefalosporina . Una célula preferida de la invención para la producción de productos de fermentación no etanólicos es una célula hospedera que contiene una modificación genética que resulta en una menor actividad de alcohol deshidrogenasa .
En otro aspecto la invención se relaciona con procesos de fermentación en los que las células de la invención se usan para la fermentación de una fuente de carbono que comprende una fuente de xilosa, tal como xilosa. Además de una fuente de xilosa, la fuente de carbono en el medio de fermentación también puede comprender una fuente de glucosa. La fuente de xilosa o glucosa puede ser xilosa o glucosa como tal, o puede ser cualquier carbohidrato oligo- o polimérico que comprenda unidades de xilosa o glucosa, tales como por ejemplo lignocelulosa, xilanos, celulosa, almidón y similares. Para la liberación de unidades de xilosa o glucosa a partir de dichos carbohidratos, se pueden agregar carbohidrasas apropiadas (tales como xilanasas, glucanasas, amilasas y similares) al medio de fermentación o las mismas pueden ser producidas por la célula. En el último de los casos, la célula se puede modificar por ingeniería genética para producir y excretar dichas carbohidrasas. Una ventaja adicional de usar fuentes oligo- o poliméricas de glucosa es que las mismas permiten mantener una (más) baja concentración de glucosa libre durante la fermentación, por ejemplo mediante el uso de cantidades limitantes de velocidad de las carbohidrasas. Esto, a la vez, prevendrá la represión de sistemas que se requieren para el metabolismo y el transporte de azúcares distintos a glucosa tales como xilosa.
En un proceso preferido, la célula fermenta tanto la xilosa como la glucosa, preferentemente en forma simultánea en cuyo caso preferentemente se usa una célula que no es sensible a la represión por glucosa para prevenir el crecimiento diáuxico. Además de la fuente de xilosa (y glucosa) como fuente de carbono, el medio de fermentación además comprenderá el ingrediente apropiado que se requiere para el crecimiento de la célula. Las composiciones de medios de fermentación para crecimiento de microorganismos, tales como levaduras, son bien conocidos en el arte. El proceso de fermentación es un proceso para la producción de un producto de fermentación tal como por ejemplo etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3 -hidroxi-propiónico, ácido acrilico, ácido acético, ácido succinico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacónico, un aminoácido, 1.3-propano-diol, etileno, glicerol, un antibiótico ß-lactámico, tal como Penicilina G o Penicilina V y derivados de fermentación de los mismos, y una cefalosporina .
Producción de bioproductos A lo largo de los años, se han hecho sugerencias para la introducción de diferentes organismos para la producción de bio-etanol a partir de azúcares de cultivo. En la práctica, sin embargo, todos los procesos de producción de bio-etanol importantes han continuado usando las levaduras del género Saccharomyces como productores de etanol. Esto es debido a las muchas características atractivas de las especies de Saccharomyces para los procesos industriales, o sea, una alta capacidad de crecimiento anaeróbico con alta tolerancia a ácido, etanol y osmolaridad, y por supuesto su alta capacidad de fermentación de etanol. Las especies de levaduras preferidas como células hospederas incluyen a S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus or K fragilis .
Una célula capaz de utilizar azúcares mixtos puede ser una célula apropiada para la producción de etanol. Una célula capaz de utilizar azúcares mixtos puede, sin embargo, ser apropiada para la producción de productos de fermentación distintos a etanol. Dichos productos de fermentación no etanólicos incluyen a, en principio, cualquier químico a granel o refinado que se pueda producir mediante un microorganismo eucariótico tal como una levadura o un hongo filamentoso .
Una célula capaz de utilizar azúcares mixtos que se puede usar para la producción de productos de fermentación no etanólicos es una célula hospedera que contiene una modificación genética que resulta en una menor actividad de alcohol deshidrogenase .
En una forma de realización la célula capaz de utilizar azúcares mixtos se puede usar en un proceso en donde azúcares que se originan en lignocelulosa se convierten a etanol.
Lignocelulosa Lignocelulosa, que se puede considerar como una materia prima potencialmente renovable, por lo general comprende los polisacáridos celulosa (glucanos) y hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xyloglucanos ) . Además, algo de la hemicelulosa puede estar presente como glucomananos, por ejemplo en materias primas que derivan de madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos a azúcares solubles, incluyendo tanto monómeros como multimeros, por ejemplo glucosa, celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, mañosa, rhamnosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico y otras hexosas y pentosas ocurre bajo la acción de diferentes enzimas que actúan en concierto.
Además, pectinas y otras sustancias pécticas tales como arabinanos pueden constituir una porción considerable de la materia seca de paredes celulares típicas de tejidos vegetales distintos a la madera (aproximadamente a entre un cuarto y la mitad de la materia seca puede ser de pectinas) .
Pretratamiento Antes del tratamiento enzimático, el material lignocelulósico se puede pretratar. El pretratamiento puede comprender exponer el material lignocelulósico a un ácido, una base, un solvente, calor, un peróxido, ozono, ruptura mecánica, afinado, molienda o despresurización rápida, o una combinación de dos o más cualquiera de los mismos. Este pretratamiento químico se combina frecuentemente con pretratamiento con calor, por ejemplo entre 150 y 220°C entre 1 y 30 minutos.
Hidrólisis enzimática El material pretratado comúnmente se somete a hidrólisis enzimática para liberar azúcares que se pueden fermentar de acuerdo a la invención. Esto se puede llevar a cabo con métodos convencionales, por ejemplo poniendo en contacto con celulasas, por ejemplo celobiohidrolasa (s) , endoglucanasa (s) , beta-glucosidasa ( s ) y opcionalmente otras enzimas. La conversión con las celulasas se puede llevar a cabo a temperatura ambiente o a temperaturas más altas, con un tiempo de reacción para liberar suficientes cantidades de azúcar (es). El resultado de la hidrólisis enzimática es el producto de hidrólisis que comprende azúcares C5/C6, en la presente designados como la composición de azúcares.
Fermentación El proceso de fermentación puede ser un proceso de fermentación aeróbico o anaeróbico. Un proceso de fermentación anaeróbico se define en la presente como un proceso de fermentación que se corre en ausencia de oxigeno o en donde sustancialmente no se consume oxigeno, o preferentemente se consume menos de aproximadamente 5, aproximadamente 2.5 o aproximadamente 1 mmol/L/h, más preferentemente 0 mmol/L/h (o sea el consumo de oxigeno no es detectable) , y en donde las moléculas orgánicas sirven tanto como donores de electrones como aceptores de electrones. En ausencia de oxigeno, el NADH que se produce en la glicolisis y la formación de biomasa, no se puede oxidar mediante la fosforilación oxidativa. Para resolver este problema, muchos microorganismos usan piruvato o uno de sus derivados como aceptor de electrones y de hidrógeno requiriendo por lo tanto NAD+.
Por lo tanto, en un proceso de fermentación anaeróbico preferido se usa piruvato como aceptor de electrones (e hidrógenos) y se reduce a productos de fermentación tales como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3 -hidroxi-propiónico, ácido acrilico, ácido acético, ácido succinico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, un aminoácido, 1.3-propano-diol, etileno, glicerol, un antibiótico ß-lactámico y una cefalosporina .
El proceso de fermentación se corre preferentemente a una temperatura que es óptima para la célula. Por lo tanto, para la mayoría de las células de levadura o de hongos, el proceso de fermentación se lleva a cabo a una temperatura que es menor que aproximadamente 42oC, preferentemente menos de aproximadamente 38oC. Para las células hospederas de levaduras o de hongos filamentosos, el proceso de fermentación se lleva a cabo preferentemente a una temperatura que es menor que aproximadamente 35, aproximadamente 33, aproximadamente 30 o aproximadamente 28oC y a una temperatura que es mayor que aproximadamente 20, aproximadamente 22, o aproximadamente 25oC.
El rendimiento de etanol en xilosa y/o glucosa en el proceso preferentemente es de al menos aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 95 o aproximadamente 98%. El rendimiento de etanol se define en la presente como un porcentaje del rendimiento teórico máximo.
La invención también se relaciona con un proceso para producir un producto de fermentación.
Los procesos de fermentación se pueden llevar a cabo en modo de lote, lote alimentado o continuo. También se puede aplicar un proceso de hidrólisis y fermentación (SHF) separados o un proceso de sacarificación y fermentación (SSF) simultáneos. Una combinación de estos modos de proceso de fermentación también puede ser posible para una óptima productividad.
El proceso de fermentación de acuerdo a la presente invención se puede correr bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas. Preferentemente, el proceso se lleva a cabo bajo condiciones microaerófilas o limitadas en oxigeno.
Un proceso de fermentación anaeróbico se define en la presente como un proceso de fermentación que se corre en ausencia de oxigeno o en el que sustancialmente no se consume oxigeno, preferentemente menos de aproximadamente 5, aproximadamente 2.5 o aproximadamente 1 mmol/L/h, y en donde las moléculas orgánicas sirven tanto como donores como aceptores de electrones.
Un proceso de fermentación limitado en oxigeno es un proceso en donde el consumo de oxigeno está limitado por la transferencia de oxigeno desde el gas hacia el liquido. El grado de limitación de oxigeno se determina mediante la cantidad y composición del gas que ingresa asi como también mediante las propiedades de transferencia de masa/ de mezclado reales del equipo de fermentación que se usa. Preferentemente, en un proceso bajo condiciones limitadas de oxigeno, la tasa de consumo de oxigeno es de al menos aproximadamente 5.5, más preferentemente al menos aproximadamente 6, tal como al menos 7 mmol/L/h. Un proceso de la invención comprende recuperar el producto de fermentación .
Producto de fermentación El producto de fermentación de la invención puede ser cualquier producto útil. En una forma de realización, el mismo es un producto que se elige del grupo que consiste en etanol, n-butanol, isobutanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido acrilico, ácido acético, ácido succinico, ácido fumárico, ácido mélico, ácido itacónico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido adípico, un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptofano, treonina, y ácido aspártico, 1.3-propano-diol , etileno, glicerol, un antibiótico ß-lactámico y una cefalosporina, vitaminas, fármacos, suplementos para alimento animal, especialidades químicas, materias primas químicas, plásticos, solventes, combustibles, incluyendo biocombustibles y biogas o polímeros orgánicos, y una enzima industrial, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidoreductasa, una transferasa o una xilanasa. Por ejemplo los productos de fermentación se pueden producir mediante células de acuerdo a la invención, siguiendo además los métodos de preparación de células y procesos de fermentación del arte previo, cuyos ejemplos sin embargo no se deben interpretar en la presente como limitantes. Por ejemplo, se puede producir n-butanol mediante células como se describe en WO2008121701 o WO2008086124 ; ácido láctico como se describe en US2011053231 o US2010137551 ; ácido 3-hidroxipropiónico como se describe en O2010010291 ; ácido acrílico como se describe en WO2009153047. Un resumen de todos los tipos de productos de fermentación y de cómo se los puede preparar en levaduras, se da en Romanos, MA, et al, "Foreign Gene Expression in Yeast:: a Review", yeast vol. 8: 423-488 (1992), véase por ejemplo la Tabla 7. La producción de glicerol, 1.3 propano diol, ácidos orgánicos, y vitamina C (Tabla 2) se describe en Negvoigt, E. ,Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72(3) 379-412 (2008). Giddijala, L., et al, BMC Biotechnology 8(29) (2008) describe la producción de beta-lactamas en levaduras.
Recuperación del producto de fermentación Para la recuperación del producto de fermentación se usan las tecnologías existentes. Para diferentes productos de fermentación son apropiados diferentes procesos de recuperación. Los métodos existentes para recuperar etanol de mezclas acuosas comúnmente usan técnicas de fraccionamiento y adsorción. Por ejemplo, se puede usar aun una cerveza para procesar un producto fermentado que contiene etanol en una mezcla acuosa, para producir una mezcla enriquecida que contiene etanol que luego se somete a fraccionamiento (por ejemplo, destilación fraccionada u otras técnicas) . Luego, las fracciones que contienen las mayores concentraciones de etanol se pueden pasar a través de un absorbente para eliminar la mayoría, sino todo, el agua remanente del etanol.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención: EJEMPLOS A menos que se indique lo contrario, los métodos que se describen en la presente son técnicas bioquímicas convencionales. Los ejemplos de manuales apropiados de metodología general incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.
Composición del medio Experimentos de cultivo. Las cepas de Saccharomyces cerevisiae se cultivan en un medio que tiene la siguiente composición: 0.67% (p/v) de base nitrogenada o medio sintético para levaduras (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992) y glucosa, arabinosa, galactosa o xilosa, o una combinación de estos sustratos, en concentraciones variables (los detalles pueden hallarse en los ejemplos respectivos; las concentraciones se expresan como el porcentaje en peso/volumen (p/v) ) . Para las placas con agar, al medio se le agrega 2% (p/v) de agar bacteriológico.
Producción de etanol Los precultivos se prepararon inoculando 25 mi del medio de Verduyn (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992) con la adición de glucosa al 2% en un frasco de agitación de 100 mi, con un cultivo madre congelado o con una colonia individual de una placa con agar. Después de incubar a 30°C en un agitador orbital (a 280 rpm) durante aproximadamente 24 horas, este cultivo se cosechó y se usó para determinar la evolución de C02 y la producción de etanol en sendos experimentos .
Los cultivos para analizar la producción de etanol se llevaron a cabo a 30°C, en 100 mi de un medio modelo sintético (el medio de Verduyn (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992), con 5% de glucosa, 5% de xilosa, 3.5% de arabinosa y 1% de galactosa) , en el dispositivo BAM (monitor de la actividad biológica, Países Bajos) . El pH del medio se ajustó en 4.2 con NaOH/H2S04 2 M antes de la esterilización. Al medio sintético para el cultivo anaeróbico se le agregaron 0.01 g 1-1 de ergosterol y 0.42 g 1-1 de Tween 80 disuelto en etanol (Andreasen y Stier. J. Cell Physiol. 41:23-36, 1953; y Andreasen y Stier. J. Cell Physiol. 43:271-281, 1954). El medio fue inoculado en una OD600 inicial de aproximadamente 2. Los cultivos se agitaron con un agitador magnético. Las condiciones anaeróbicas se desarrollaron rápidamente durante la fermentación, ya que los cultivos no fueron aireados. La producción de C02 se monitoreó constantemente. La conversión de los azúcares y la formación de los productos (etanol, glicerol) se analizaron por RMN. El crecimiento se monitoreó siguiendo la densidad óptica del cultivo a 600 nm, en un espectrofotómetro LKB Ultrospec K.
Transformación de S. cereylslae La transformación de S. cerevisiae se realizó como se describe en Gietz y Woods (2002; Transíormation of the yeast by the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Methods in Enzymology 350: 87-96) .
PCR de las colonias Se tomó una colonia individual aislada con un palillo plástico y se la suspendió nuevamente en 50 µ? de agua milliQ. La muestra se incubó durante 10 minutos a 99°C. Se usaron 5 µ? de la muestra incubada como molde para la reacción de PCR, donde se empleó la ADN polimerasa Phusion® (Finnzymes), de acuerdo con las instrucciones provistas por el fabricante.
Condiciones para la reacción de PCR paso 1 3' 98°C paso 2 10" 98°C 30 ciclos paso 4 30" 72°C paso 5 4' 72°C paso 6 30" 20°C Aislamiento del ARN cromosómico Las células de levadura se cultivaron en un medio YEP que contenía 2% de glucosa, en un agitador rotativo (durante la noche, a 30°C y a 280 rpm) . Se transfirieron 1.5 mi de estos cultivos a un tubo Eppendorf y se centrifugó durante 1 minuto a velocidad máxima. Se decantó el sobrenadante y se suspendió nuevamente el precipitado en 200 µ? de un medio YCPS (0.1% SB3-14 (Sigma Aldrich, Países Bajos) en Tris-HCl 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 m ) y 1 µ? de ARNasa (20 mg/ml de ARNasa A de páncreas bovino, Sigma, Países Bajos) . La suspensión celular se incubó durante 10 minutos a 65°C. La suspensión se centrifugó en una centrifuga Eppendorf durante 1 minuto a 7000 rpm. Se descartó el sobrenadante. El precipitado se disolvió cuidadosamente en 200 µ? de CLS (EDTA 25 mM, 2% de SDS) y 1 µ? de ARNasa A. Después de incubar a 65°C durante 10 minutos, se enfrió la suspensión en hielo. Luego se agregaron 70 µ? de PPS (acetato de amonio 10 M), y posteriormente se mezclaron exhaustivamente las soluciones en un agitador Vortex. Una vez completa la centrifugación (durante 5 minutos en una centrifuga Eppendorf a velocidad máxima) , se mezcló el sobrenadante con 200 µ? de isopropanol helado. Se precipitó rápidamente el ADN por centrifugación (durante 5 minutos a velocidad máxima) . El precipitado se lavó con 400 µ? de etanol al 70% helado. El precipitado se secó a temperatura ambiente y se disolvió en 50 µ? de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM) .
Ejemplo 1. Construcción de la cepa BIE104A2P1 1.1. Construcción de un vector de expresión que contenia los genes de la via de la arabinosa El plásmido pP T018, que se ilustra en la figura 2, se construyó como se describe a continuación. Se digirió el vector pPWT006 (figura 1, que consiste en un locus SIT2 (Gottlin-Ninfa y Kaback (1986) Molecular and Cell Biology, vol. 6, N° 6, 2185-2197) y los marcadores que permiten seleccionar las transformantes con el antibiótico G418, y que confiere la capacidad de crecimiento en acetamida) con las enzimas de restricción BsiWl y Mlul. El marcador kanMX, que confiere resistencia a G418, se aisló a partir de p427TEF (Dualsystems Biotech) . En la literatura se ha descripto un fragmento que contiene el marcador amdS (Swinkels, B. ., Noordermeer, A.C.M. y Renniers, A.C.H.M (1995) The use of the amdS cDNA of Aspergillus nidulans as a dominant, bidirectional selection marker for yeast transformation . Yeast, volumen 11, número 1995A, página S579; y US 6051431). Los genes que codifican la arabinosa isomerasa (araA) , la L-ribuloquinasa (araB) y la L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa (araD) de Lactobacillus plantarum, que se describen en la solicitud de patente WO2008/041840, fueron sintetizados por BaseClear (Leiden, Países Bajos). Se sintetizó un fragmento grande que alojaba los tres genes que se mencionaron con anterioridad, bajo el control de promotores fuertes de S. cerevisiae (o en unión operativa con ellos) , es decir, el promotor TDH3, que controla la expresión del gen araA, el promotor ENOl, que controla el gen araB, y el promotor PGI1, que controla el gen araD. Este fragmento estaba rodeado por las enzimas de restricción únicas Acc65I y Mlul. pPWT006, que contenía el fragmento clonado, se digirió con Mlul y BsiWI para obtener el plásmido pPWT018 (figura 2) . La secuencia del plásmido pPWT018 se detalla en SEQ ID NO 1. 1.2. Transformación de la levadura Se transformó CEN.PK113-7D (MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2) con el plásmido pPWT018, que había sido linealizado con antelación con Sfil (New England Biolabs) , de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se introdujo un sitio sintético para Sfil en el flanco 5' del gen SIT2 (véase la figura 2) . Las mezclas para la transformación se sembraron en agar YPD (10 gramos por litro de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa, 20 gramos por litro de agar) que contenia 100 µg de G418 (Sigma Aldrich) por mi. Después de 2-4 días, aparecieron colonias en las placas, mientras que el control negativo (es decir, la muestra en la que no se había colocado ADN durante el experimento de transformación) resultó en placas YPD/G418 vacías. La integración del plásmido pPWT018 tuvo lugar en el locus SIT2. Las transformantes se caracterizaron usando técnicas de PCR y de transferencia Southern.
Las reacciones de PCR para determinar la integración correcta de una copia del plásmido pPWT018 se llevaron a cabo con los cebadores de SEQ ID NO 2 y 3 y de SEQ ID NO 3 y 4. Con el par de cebadores de SEQ ID NO 2 y 3, se verificó la integración correcta en el locus SIT2. Si el plásmido pP T018 se hubiera integrado en múltiples copias (una integración de cabeza-a-cola) , el par de cebadores de SEQ ID NO 3 y 4 proveería un producto en la PCR. La ausencia de este producto en la PCR reflejaría la integración de una copia de pPWT018. Una cepa donde se integró una copia del plásmido pPWT018 en el locus SIT2 se designó BIE104R2. 1.3. Rescate de los marcadores Para poder transformar la cepa de levadura con otras construcciones usando los mismos marcadores de selección, es necesario eliminar los marcadores de selección. El diseño del plásmido pP T018 fue tal que, al integrarse pPWT018 en el cromosoma, las secuencias homologas quedaran próximas. Este diseño permite que los marcadores de selección se pierdan debido a la recombinación intramolecular espontánea entre estas regiones homologas.
Cuando ocurra el crecimiento vegetativo, tendrá lugar la recombinación intramolecular, pero en una frecuencia baja. La frecuencia de esta recombinación depende de la extensión de la homología y del locus en el genoma (resultados no publicados) . Después de realizar la transferencia consecutiva de una subfracción del cultivo a un medio fresco, se acumularán los recombinantes intramoleculares con el correr del tiempo.
Con este objetivo, se cultivó la cepa BIE104R2 en un medio YPD (10 gramos por litro de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa) a partir de una colonia individual aislada. Se usaron 25 µ? de un cultivo que se había desarrollado durante la noche para inocular un medio YPD fresco. Después de al menos cinco de estas transferencias en serie, se determinó la densidad óptica del cultivo y se diluyeron las células hasta una concentración de aproximadamente 5000 por mi. Se sembraron 100 µ? de la suspensión celular en un medio de carbono básico para levadura (Difco) que contenía KPi 30 mM (pH 6.8), 0.1% de (NH4)2S04, fluoro-acetamida 40 mM (Amersham) y 1.8% de agar (Difco) . Las células idénticas a las células de la cepa BIE104R2, es decir, las que no presentan una recombinación intracelular, todavía contienen el gen amdS. Para estas células, la fluoro-acetamida es tóxica. Estas células no podrán desarrollarse y no formarán colonias en un medio que contenga fluoro-acetamida . Sin embargo, si ha ocurrido la recombinación intramolecular, las variantes de BIE104R2 que hayan perdido los marcadores de selección podrán desarrollarse en el medio con fluoro-acetamida, ya que no podrán convertir la fluoro-acetamida en compuestos que inhiban el crecimiento. Estas células formarán colonias en el medio con agar.
Las colonias resistentes a fluoro-acetamida obtenidas se sometieron a un análisis de PCR con los cebadores de SEQ ID NO 2 y 3 y de SEQ ID NO 4 y 5. Los cebadores de SEQ ID NO 2 y 3 proveerán una banda cuando haya ocurrido la recombinación deseada de los marcadores de selección. Como resultado, el cásete con los genes araA, araB y araD bajo el control de promotores fuertes para levadura se habrá integrado en el locus SIT2 del genoma de la cepa hospedera. En este caso, una reacción de PCR con los cebadores de SEQ ID NO 4 y 5 no debería resultar en un producto, ya que el cebador 4 actúa sobre una región que debería perderse debido a la recombinación. La obtención de una banda con estos últimos cebadores refleja la presencia del plásmido pPWT018 completo en el genoma, lo que es indicativo de la ausencia de recombinación .
Si los cebadores de SEQ ID NO 2 y 3 no dan como resultado un producto en la PCR, habrá ocurrido la recombinación, pero de una manera tal que el plásmido pPWT018 completo habrá sido eliminado del genoma por recombinación. No solamente se habrán perdido los marcadores, sino también los genes relacionados con la arabinosa. De hecho, se habrá recuperado una levadura salvaje.
Los aislados que presentaron resultados en la PCR acordes con la integración de una copia de pP T018 se sometieron a un análisis de transferencia Southern. El ADN cromosómico de la cepa CEN.PK113-7D y de las recombinantes correctas se digirió con EcoRI y HindIII (digestión doble) . Se preparó una sonda para SIT2 con los cebadores de SEQ ID NO 6 y 7, usando pPW018 como molde. El resultado del experimento de hibridación se ilustra en la figura 3.
En la cepa salvaje se observa una banda de 2.35 kb, lo que concuerda con el tamaño esperado del gen salvaje. Una vez ocurrida la integración y la pérdida parcial del plásmido pPWT018 por recombinación, ha de esperarse una banda de 1.06 kb. En efecto, se observa esta banda, como se ilustra en la figura 3 (carril 2) .
Una de las cepas que presentó el patrón de bandas correcto en la transferencia Southern (como puede deducirse a partir de la figura 3) es la cepa denominada BIE104A2. 1.4. Introducción de cuatro genes con expresión constitutiva de la via no oxidativa de las pe tosas fosfato Se transformó Saccharomyces cerevisiae BIE104A2, a partir de la cual se expresan de manera constitutiva los genes araA, araB y araD, con el plásmido pPWT080 (figura 4). La secuencia del plásmido pPWT080 se detalla en SEQ ID NO 8. El procedimiento para la transformación y la selección, después de seleccionar una transformante con la integración de una copia, son idénticos a los que se describieron con anterioridad en las secciones 1.1, 1.2 y 1.3. En resumen, se transformó BIE104A2 con pP T080 digerido con Sfil. Las mezclas para la transformación se sembraron en agar YPD (10 gramos por litro de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa, 20 gramos por litro de agar) que contenia 100 pg de G418 (Sigma Aldrich) por mi .
Después de 2-4 días, aparecieron colonias en las placas, mientras que el control negativo (es decir, la muestra en la que no se había colocado ADN durante el experimento de transformación) resultó en placas YPD/G418 vacías.
La integración del plásmido pPWT018 tuvo lugar en el locus GRE3. Las transformantes se caracterizaron usando técnicas de PCR y de transferencia Southern. La integración correcta del plásmido pP T080 en el locus GRE3 se verificó por PCR usando el par de cebadores de SEQ ID NO 9 y SEQ ID NO 10. Se empleó el par de cebadores de SEQ ID NO 9 y SEQ ID NO 11 para detectar la integración de una o múltiples copias del plásmido pPWT080. Para el análisis Southern, se preparó una sonda por PCR usando SEQ ID NO 12 y SEQ ID NO 13, de manera tal de amplificar una parte del gen RKI1 de S. cerevisiae . Junto con el gen RKI1 nativo, se obtuvo una señal adicional como resultado de la integración del plásmido pPWT080 (datos no presentados) Una transformante que presentó la integración correcta de una copia del plásmido pPWT080, de acuerdo con el patrón de hibridación esperado, se denominó BIE104A2F1. Con el fin de remover los marcadores de selección que se habían introducido mediante la integración del plásmido pPWT080, se cultivó la cepa BIE104A2F1 en un medio YPD, a partir de una colonia individual aislada. Se usaron 25 µ? de un cultivo que se había desarrollado durante la noche para inocular un medio YPD fresco. Después de cinco de transferencias en serie, se determinó la densidad óptica del cultivo y se diluyeron las células hasta una concentración de aproximadamente 5000 por mi. Se sembraron 100 µ? de la suspensión celular en un medio de carbono básico para levadura (Difco) que contenía KPi 30 mM (pH 6.8), 0.1% de (NH4)2S04, fluoro-acetamida 40 mM (Amersham) y 1.8% de agar (Difco) . Las colonias resistentes a fluoro-acetamida se sometieron a un análisis de PCR con los cebadores de SEQ ID NO 9 y SEQ ID NO 10. En los casos donde se obtuvieron los perfiles de PCR correctos, se llevó a cabo un análisis de transferencia Southern para verificar la integración correcta, nuevamente usando la sonda del gen RKI1. Una de las cepas que presentó el patrón de bandas correcto en las transferencias Southern es la cepa que se conoce como BIE104A2P1.
Ejemplo 2. Evolución adaptativa para producir BIE104A2Plc y BIE201 en matraces de agitación 2.1. Evolución adaptativa (aeróbica) Se usó una colonia individual aislada de la cepa BIE104A2P1 para inocular un medio YNB (Difco) con la adición de 2% de galactosa. El precultivo se incubó durante aproximadamente 24 horas a 30°C y a 280 rpm. Las células se cosecharon y se inocularon en un medio YNB que contenia 1% de galactosa y 1% de arabinosa, con una OD600 inicial de 0.2 (figura 5) . Las células se cultivaron a 30°C y a 280 rpm. La densidad óptica a 600 nm se monitoreó de manera regular.
Cuando la densidad óptica alcanzó un valor de 5, se transfirió una alícuota a un medio YNB fresco con la misma composición. La cantidad de células agregadas fue tal que la OD600 inicial del cultivo fue de 0.2. Una vez alcanzada una OD600 de 5, se transfirió una alícuota del cultivo a un medio YNB que contenía 2% de arabinosa como única fuente de carbono (momento que se indica con (1) en la figura 5) .
Al realizarse la transferencia al medio YNB con 2% de arabinosa como única fuente de carbono, fue posible observar crecimiento después de aproximadamente dos semanas. Cuando la densidad óptica a 600 nm alcanzó un valor de al menos 1, las células se transfirieron a un frasco de agitación con un medio YNB fresco al que se había agregado 2% de arabinosa, con una OD600 inicial de 0.2 (figura 5, día 28).
Se realizaron tres transferencias consecutivas, como se indica en la figura 5. La cepa resultante, que podía desarrollarse con velocidad en arabinosa, se denominó BIE104A2P1C. 2.2. Evolución adaptativa (anaerobica) Después de la adaptación al cultivo en arabinosa bajo condiciones aeróbicas, se inoculó una colonia individual de la cepa BIE104A2Plc en un medio YNB con la adición de 2% de glucosa. El precultivo se incubó durante aproximadamente 24 horas a 30°C y a 280 rpm. Las células se cosecharon y se inocularon en un medio YNB que contenia 2% de arabinosa, con una densidad óptica OD600 inicial de 0.2. Los frascos se cerraron con tapones impermeables para asegurar que hubiera condiciones de cultivo anaeróbicas una vez que se hubiera eliminado el oxigeno del medio y del espacio de cabeza. Cuando se alcanzó una OD600 mínima de 3, se transfirió una alícuota del cultivo a un medio YNB fresco que contenía 2% de arabinosa (figura 6), en cada ocasión con una OD600 inicial con un valor de 0.2. Después de varias transferencias, la cepa resultante se denominó BIE104A2Pld (=BIE201) .
Ejemplo 3. Evaluación del desempeño de las cepas en un BA para demostrar que la evolución adaptativa dio como resultado una conversión (mejorada) de arabinosa; fermentación concurrente con galactosa Se usaron colonias individuales aisladas de las cepas BIE104, BIE104A2Plc y BIE201 para inocular un medio YNB (Difco) con la adición de 2% de glucosa. Los precultivos se incubaron durante aproximadamente 24 horas a 30°C y a 280 rpm. Las células se cosecharon y se inocularon en un medio modelo sintético (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992, con 5% de glucosa, 5% de xilosa, 3.5% de arabinosa, 1% de galactosa) , en una OD600 inicial de aproximadamente 2 en el BAM. La producción de C02 se monitoreó constantemente. La conversión de los azúcares y la formación de los productos se analizaron por RMN. Los datos representan la cantidad residual de azúcares (glucosa, arabinosa, galactosa y xilosa, en gramos por litro) en los puntos de tiempo indicados y la formación de los (sub) productos (etanol, glicerol) . El crecimiento se monitoreó siguiendo la densidad óptica del cultivo a 600 nm (figuras 7, 8 y 9) . El experimento se prolongó durante aproximadamente 140 horas.
Con los experimentos, se demostró claramente que la cepa de referencia BIE104 convirtió rápidamente la glucosa, pero no fue capaz de convertir la arabinosa, la xilosa y/o la galactosa después de 140 horas (figura 7). Sin embargo, las cepas BIE104A2Plc y BIE201 fueron capaces de convertir la arabinosa y la galactosa (figura 8 y 9, respectivamente) . La utilización de la galactosa y la arabinosa comenzó inmediatamente después del agotamiento de la glucosa, una vez transcurridas menos de 20 horas. Ambos azúcares fueron convertidos de manera simultánea. Sin embargo, la cepa BIE201, que había sido mejorada para que pudiera desarrollarse en arabinosa bajo condiciones anaeróbicas, consumió ambos azúcares más rápidamente (figura 9) . En todas las fermentaciones, solamente se generó glicerol como subproducto.
Ejemplo 4. Nueva secuenciación de las cepas e identificación de los SNP que participan en la fermentación de la arabinosa Como puede concluirse a partir de los ejemplos 1, 2 y 3, la mera introducción de los genes que codifican las enzimas necesarias para poder utilizar la arabinosa o para mejorar su utilización no es suficiente para permitir el crecimiento en arabinosa como única fuente de carbono. Como se ilustra en el ejemplo 2, es necesario un proceso que se conoce como evolución adaptativa para seleccionar las células que utilizan arabinosa como única fuente de C.
Se presume que hay mutaciones espontáneas (SNP, es decir, polimorfismos de un solo nucleótido) en el genoma que son responsables de este cambio fenotípico. Como alternativa, pueden haber ocurrido variaciones más grandes en el genoma (no limitadas a la sustitución, la inserción o la supresión de un solo nucleótido) .
Con el fin de identificar cuáles mutaciones o SNP son responsables de este cambio fenotipico, se secuenció nuevamente el ADN genómico de las transformantes usando la tecnología que se conoce como Solexa®, con un analizador genómico Illumina®.
Con este propósito, se aisló ADN cromosómico de la cepa BIE104, de la transformante primaria BIE104A2P1, de la transformante evolucionada BIE104A2Plc y de la transformante evolucionada en mayor medida BIE201, a partir de un cultivo en un medio YEP con 2% de glucosa que se había desarrollado durante varias noches. El ADN se envió a ServiceXS (Leiden, Países Bajos) para que fuera secuenciado nuevamente con el analizador genómico Illumina® (con lecturas de 50 bp y la secuenciación de pares de extremos) .
Se obtuvieron aproximadamente 1800 Mb de secuencias de cada cepa, lo que corresponde a una cobertura promedio del genoma de 140, es decir, cada base se leyó un promedio de 140 veces .
Usando el software NextGene (SoftGenetics LLC, State College, PA 16803, EEUU), se alinearon las lecturas de las secuencias con S288c como molde. Las mutaciones (los polimorfismos de un solo nucleótido y las inserciones/supresiones de hasta 30 bp) se detectaron usando el software NextGene y se resumieron en un informe. Se compararon los alineamientos de las distintas cepas para identificar variaciones únicas entre ellas. Cada ingreso en el informe de mutaciones fue verificado manualmente para excluir la posibilidad de que se hubieran alineado erróneamente las lecturas o de que hubieran ocurrido errores de secuenciación o mutaciones en las áreas con muy baja cobertura de secuenciación. Las mutaciones falsas positivas se eliminaron del informe.
La secuencia de la transformante primaria (BIE104A2P1) fue idéntica a la secuencia de la cepa salvaje BIE104, con la excepción de las secuencias que habían sido introducidas y las secuencias que habían sido suprimidas al integrarse los plásmidos y al eliminarse posteriormente los marcadores por recombinación .
En la transformante evolucionada, la cepa BIE104A2P1C, se introdujo una cantidad limitada de SNP.
SSY1 YDR160W, G -> T, introducción de un codón de detención YJR154W, A -» G, D -> G CEP3 YMR168c , A G, S -> G YPL277c, C -> T, silencioso En la transformante evolucionada en mayor medida, la cepa BIE201, se observó un SNP adicional, además de los 4 SNP que se mencionaron con anterioridad.
GAL80 YML051w, A -» C, T -> P Las secuencias de los cinco marcos abiertos de lectura de los genes que contenían los SNP, tanto en la cepa salvaje BIE104 como en las cepas evolucionadas BIE104A2Plc y BIE201, se proveen en SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15 (SSY1), SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17 (YJR154w) , SEQ ID NO 18, SEQ ID19 (CEP3), SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21 (YPL277c) , SEQ ID NO 22 y SEQ ID NO 23 (GAL80) .
Ejemplo 5. Confirmación de los SNP Con el fin de confirmar (nuevamente) los SNP que se habían detectado en el ejemplo precedente, se emplearon dos métodos diferentes. El primer método comprendió amplificar las regiones que contenían los SNP, a lo que siguió una secuenciación con una sola lectura (Sanger) en un secuenciador ABI3730XL (lo que se derivó a Baseclear BV, Leiden, Países Bajos) . El segundo método consistió en un análisis de fusión de alta resolución (Hi-Res) . 5.1. Secuenciación de Sanger con una sola lectura Se usó ADN genómico aislado de cultivos de las cepas BIE104A2P1 y BIE201 como molde para reacciones de PCR con una ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (Finnzymes, Vantaa, Finlandia) . Las reacciones de PCR se llevaron a cabo de acuerdo con las sugerencias del proveedor. Se emplearon los siguientes cebadores para amplificar los genes respectivos, de los que se esperaba que contuvieran los SNP.
Tabla 2. Cebadores usados para amplificar los productos de la PCR Gen de interés Cebador directo Cebador inverso SSY1 (YDR160W) SEQ ID NO 24 SEQ ID NO 25 YJR154w SEQ ID NO 26 SEQ ID NO 27 CEP3 (Y R168C) SEQ ID NO 28 SEQ ID NO 29 YPL277c SEQ ID NO 30 SEQ ID NO 31 GAL80 (YML051W) SEQ ID NO 32 SEQ ID NO 33 Los productos de la PCR se clonaron en el vector pTOPO Blunt II (Invitrogen, Carlsbad, EEUU). Los clones correctos se seleccionaron sobre la base de un análisis con enzimas de restricción. Los clones correctos se enviaron a BaseClear BV (Leiden, Países Bajos) para realizar un análisis de Sanger de con una sola lectura.
La clonación del fragmento CEP3 en TOPO no fue exitosa. No se obtuvieron datos de la secuencia de Sanger para este gen.
La secuencia de YPL277c pareció ser idéntica a la secuencia de la cepa salvaje BIE104.
A partir de los resultados correspondientes de la secuenciación de Sanger, fue posible confirmar los SNP en los genes SSY1, YJR154w y GAL80, es decir, los SNP fueron idénticos a los que se describieron en el ejemplo 4. 5.2. Análisis Hi-Res La tecnología Hi-Res es comercializada por Idaho Technologies (Salt Lake City, Utah 84108, EEUU) . En resumen, las mutaciones en los productos de PCR se detectan a partir de la presencia de heteroduplas, óptimamente con un colorante LCGreen®. Las variaciones se identifican a partir de los cambios en la forma del perfil de fusión, en comparación con una muestra de referencia. La fusión Hi-Res® (HRM) en el dispositivo LightScanner® se usa para analizar las mutaciones en numerosas aplicaciones investigativas y clínicas.
Para cada SNP, se diseñaron dos cebadores con el propósito de amplificar una región de aproximadamente 100-200 bp que contenía el SNP o la secuencia salvaje. Además, se diseñó un tercer cebador para que actuara como sonda en los experimentos para detectar el perfil de fusión. Este último cebador se diseñó de manera tal que abarcara la región del SNP, y fue exactamente complementario de la secuencia salvaje. La coincidencia con la secuencia del SNP es imperfecta, es decir, todos los nucleótidos de la sonda menos uno son complementarios de la región de interés. Las cadenas de ADN no coincidentes se separarán por fusión más temprano que las cadenas de ADN coincidentes, por lo que se obtendrán distintas curvas de fusión con los amplicones salvajes o con SNP. La detección se realizará usando el dispositivo LightScanner® (Idaho Technologies, Salt Lake City, Utah, EEUU) .
En la tabla a continuación se resumen las secuencias de los cebadores que se emplearon para amplificar el gen o el ORF de interés cuyos SNP se verificarían en la cepa BIE201.
Tabla 3. Cebadores para amplificar los productos de la PCR Gen de interés Cebador directo Cebador inverso SSY1 (YDR160w) SEQ ID NO 24 SEQ ID NO 25 YJR154w SEQ ID NO 26 SEQ ID NO 27 CEP3 (YMR168c) SEQ ID NO 28 SEQ ID NO 29 YPL277C SEQ ID NO 30 SEQ ID NO 31 GAL80 (YML051w) SEQ ID NO 32 SEQ ID NO 33 En la tabla continuación se resumen los dentificadores de secuencias que se usaron para verificar os SNP en la cepa BIE201 (las sondas) .
Tabla 4. Cebadores usados como sondas en el análisis Hi- Gen de interés Secuencia de la sonda salvaje SSY1 (YDR160w) SEQ ID NO 34 YJR154w SEQ ID NO 35 CEP3 (YMR168C) SEQ ID NO 36 YPL277c SEQ ID NO 37 GAL80 ( YMLO 5 lw ) SEQ ID NO 38 Las reacciones de PCR se efectuaron usando ADN cromosómico de la cepa BIE104 (una cepa de levadura salvaje) y de la cepa BIE201 (una cepa de levadura capaz de desarrollarse de manera anaeróbica en arabinosa) , con los pares de cebadores de SEQ ID NO 24 y 25 (SSY1) , SEQ ID NO 26 y 27 (YJR154w), SEQ ID NO 28 y 29 (CEP3 ) , SEQ ID NO 30 y 31 (YPL277c) y SEQ ID NO 32 y 33 (GAL80), de acuerdo con las instrucciones provistas por Idaho Technologies, pero en ausencia de sondas. El rendimiento y la integridad de los fragmentos amplificados se verificaron en un gel de agarosa al 2%.
El análisis HiRes se llevó a cabo como se describe a continuación, de manera análoga al protocolo provisto por Idaho Technologies. Se agregaron 2 µ? de la sonda (5 µ?) a 10 µ? del producto de la PCR en una microplaca para PCR ( titude Framestart 96, marco negro, cavidades blancas (Bioké, Leiden, Países Bajos) ) . Después de mezclar, se centrifugó la microplaca. Se incubó la placa durante 30 segundos a 99°C y se la enfrió hasta la temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) . Luego se siguió el protocolo de fusión del dispositivo Lightscanner, con una temperatura inicial de 55°C, una temperatura final de 94 °C y parámetros de exposición "automática". Una vez completas las mediciones, se llevó a cabo el análisis de los datos. Los límites de temperatura para el análisis del cambio de la fluorescencia se fijaron manualmente, dentro del intervalo de temperatura donde se esperaría que la sonda se separara por fusión de los productos obtenidos por PCR.
Se ilustra un ejemplo de una curva de fusión en la figura 11. En la figura 11 puede observarse un ejemplo de "curvas de fusión normalizadas" (curvas de fusión, panel superior) y de una curva de "picos de fusión normalizados" (panel inferior) . Esta última deriva del primer gráfico y representa el cambio en la señal de fluorescencia en función de la temperatura. Se ilustran las cepas BIE104A2P1 y BIE201. El gen que se representa en esta figura es YJR154w. Es evidente la diferencia en la temperatura de fusión de la sonda entre las dos cepas evaluadas, BIE201 y BIE104A2P1.
Se confirmaron todos los SNP esperados, excepto el de YPL277c. La secuencia del ORF (YPL277c) en BIE201 pareció ser idéntica a la secuencia de la cepa salvaje BIE104.
En resumen, en el ejemplo 5 se confirmó el SNP en el ORF de SSY1 (YDRl60w) y los SNP YJR154w, CEP3 (YMR168c) y GAL80 (YML051w) . Se determinó la falsedad del SNP que se había identificado con anterioridad (ejemplo 4) en el ORF de YPL277c usando dos métodos independientes.
Ejemplo 6. Amplificación de partes del cromosoma VII 6.1. Amplificación de una par-be del cromosoma VII Como se describió en el ejemplo 4, mediante una nueva secuenciación de la cepa salvaje BIE104, de la transformante primaria BIE104A2P1, de la transformante evolucionada BIE104A2Plc y de la cepa evolucionada en mayor medida BIE201, fue posible descubrir diversos SNP de interés.
Usando las representaciones de cobertura, que reflejan la profundidad de la lectura de cada nucleótido individual del genoma, se buscaron áreas en el genoma que estuvieran representadas de una manera excesiva o deficiente. De esta manera, se identificó una región en el cromosoma VII que estaba representa excesivamente (véase la figura 12).
A partir de la profundidad de la lectura, se concluyó que se hablan amplificado las partes del cromosoma VII que rodean el centrómero. Una región en el brazo izquierdo del cromosoma VII se había amplificado tres veces. Una parte del brazo derecho del cromosoma VII se había amplificado dos veces, y una parte adyacente se había amplificado tres veces (véase la figura 12) .
La parte del brazo derecho del cromosoma VII que se había amplificado tres veces contiene el cásete de expresión relacionado con la arabinosa, es decir, los genes araA, araB y araD, bajo el control de promotores constitutivos fuertes.
Primero, se confirmó la cantidad de copias de diversos genes por Q-PCR. Segundo, se investigó si la amplificación había tenido lugar en el mismo cromosoma (una duplicación o una triplicación) o si la región amplificada se había integrado en otro cromosoma (translocación) . 6.2. Determinación de la cantidad de copias por Q-PCR Con el propósito de verificar la amplificación de partes del cromosoma VII, lo que se había determinado en la representación de la cobertura de la figura 12, se llevaron a cabo experimentos de Q-PCR. Específicamente, con este método puede medirse la cantidad relativa de copias de un gen de interés al compararlo con otro gen con una cantidad conocida de copias.
Para esto, se usó el sistema Bio-Rad iCycler iQ de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EEUU) . Se empleó el reactivo iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) . Los experimentos se prepararon como se sugiere en el manual del proveedor.
A partir de la representación de la cobertura (particularmente a partir de la profundidad de la lectura), se dedujo que los genes SDS23 e YGL057c podrían ser parte de la región amplificada en el brazo izquierdo del cromosoma VII. Como referencia de un gen con una sola copia, se seleccionó el gen ACT1.
Los cebadores que se emplearon para detectar los genes YGL057c, SDS23 y ACT1 se resumen en la tabla a continuación.
Tabla 5. Cebadores usados para la amplificación en el experimento de Q-PCR Gen de Cebador Cebador interés directo inverso YGL057c SEQ ID NO 39 SEQ ID NO 40 SDS23 SEQ ID NO 41 SEQ ID NO 42 ACT1 SEQ ID NO 43 SEQ ID NO 44 A continuación se detallan las condiciones de la Q-PCR. 1) 95°C durante 3 minutos 40 ciclos de los pasos 2-4 2) 95°C durante 10 segundos 3) 58°C durante 45 segundos 4) 72°C durante 45 segundos 5) 65°C durante 10 segundos 6) incremento de la temperatura en 0.5°C cada 10 segundos, hasta alcanzar los 95°C La curva de fusión se determina comenzando a medir la fluorescencia a 65°C durante 10 segundos. La temperatura se incrementa 0.5°C cada 10 segundos, hasta que se alcanza una temperatura de 95°C. La cantidad de copias del gen de interés puede calcularse y/o estimarse a partir de las lecturas. Los resultados se presentan en la tabla a continuación.
Tabla 6. Cantidad relativa de copias de los genes seleccionados en las cepas BIE104A2P1 y BIE201 Gen de Cantidad de Cantidad de interés copias en copias en BIE104A2P1 BIE201 YGL057c 1.2 5.1 SDS23 1.2 4.4 ACT1 1.0 1.0 (referencia) (referencia) Con los resultados se corrobora la amplificación, que era evidente a partir del análisis de la profundidad de la lectura del ejemplo 6 (sección 6.1). Los valores observados son mayores que la cantidad esperada de copias, 3.0. La diferencia puede deberse a diversos factores, como lo describió con anterioridad Klein (Klein, D. (2002) TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 8, N° 6, 257-260). 6.3. Análisis de la naturaleza de la duplicación Con el fin de determinar si las regiones amplificadas se localizan en el mismo cromosoma en el que se localizaban originalmente los genes, es decir, el cromosoma VII, o si se han translocado a otro cromosoma, se aplicó una electroforesis CHEF (una electroforesis de campos eléctricos homogéneos de contorno afianzado con el sistema de ángulo variable CHEF-DR® III, Bio-Rad, Hercules, CA 94547, EEUU). Se prepararon tapones con las cepas de levadura en agarosa (véase la descripción más adelante) usando el conjunto de elementos para preparar tapones con ADN genómico de levadura CHEF (BioRad) , de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se prepararon geles de agarosa al 1% (Pulse Field Agarose, Bio-Rad) en TBE 0.5x (Tris-Borato-EDTA) de acuerdo con las instrucciones de los proveedores. Los geles se analizaron de acuerdo con los parámetros que se detallan a continuación.
Bloque 1, tiempo inicial: 60 segundos tiempo final: 80 segundos proporción: 1 duración del experimento: 15 horas Bloque 2, tiempo inicial: 90 segundos tiempo final: 120 segundos proporción: 1 duración del experimento: 9 horas Como marcador para determinar el tamaño de los cromosomas, en el experimento se incluyeron tapones de agarosa con la cepa YNN295 (Bio-Rad) .
Después de la electroforesis, los geles se colorearon usando bromuro de etidio en una concentración final de 70 pg por litro, durante 30 minutos. En la figura 13 se ilustra un ejemplo de un gel coloreado.
Después de la coloración, los geles se transfirieron a membranas Amersham Hybond N+ (GE Healthcare Life Sciences, Diegem, Bélgica) .
Con el fin de establecer si los genes establecidos están localizados en un cromosoma o si se han translocado a otros cromosomas, se prepararon sondas para llevar a cabo una hibridación con las membranas transferidas. Las sondas (véase la tabla a continuación) se elaboraron usando el conjunto de elementos para sintetizar sondas para PCR DIG (Roche, Almere, Países Bajos) , de acuerdo con las instrucciones del proveedor .
Se prepararon las sondas que se detallan a continuación. Tabla 7. Cebadores para amplificar las sondas indicadas Sonda Nombre Cebador Cebador Tamaño del Cro sistemátic directo inverso producto de o del gen la PCR (bp) araA SEQ ID NO 45 SEQ ID NO 46 641 VII ACT1 YFL039C SEQ ID NO 47 SEQ ID NO 48 392 VI PNC1 YGL037c SEQ ID NO 49 SEQ ID NO 50 384 VII HSF1 YGL073w SEQ ID NO 51 SEQ ID NO 52 381 VII YGR031w YGR031w SEQ ID NO 53 SEQ ID NO 54 392 VII Se espera que el gen araA esté amplificado tres veces en BIE104A2Plc y en BIE201.
El gen ACT1 está localizado en el cromosoma VI, y no se espera que esté amplificado. Por consiguiente, esta sonda sirve como control.
PNC1 está localizado en el brazo izquierdo del cromosoma VII, y se espera que esté amplificado tres veces en BIE104A2Plc y en BIE201.
HSFl está localizado en el brazo izquierdo del cromosoma VII y está localizado hacia el extremo 5' de la región amplificada. Por consiguiente, se espera que este gen esté presente en el genoma de las cepas evaluadas como un único gen .
YGR031w está localizado en el brazo derecho del cromosoma VII. Se espera que este gen esté presente en dos copias en el genoma de las cepas BIE104A2Plc y BIE201.
Las membranas fueron sometidas a una hibridación preliminar en el amortiguador DIG Easy Hyb (Roche) , de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las sondas se desnaturalizaron a 99°C durante 5 minutos, se enfriaron en hielo durante 5 minutos y se colocaron sobre las membranas que habían sido sometidas a la hibridación preliminar. La hibridación se realizó durante la noche a 42°C.
El lavado de las membranas y el bloqueo de las membranas previo a la detección de las sondas que habían hibridado se efectuaron usando el conjunto de elementos de lavado DIG y los amortiguadores de bloqueo correspondientes (Roche) , de acuerdo con las instrucciones del proveedor. La detección se realizó por medio de una incubación con fragmentos Fab anti-dioxigenina-AP (Roche) , y le siguió la adición de los reactivos de detección del conjunto de elementos listo para usar CDP-Star (Roche) . Las señales quimioluminiscentes se detectaron usando el sistema Bio-Rad Chemidoc XRS+ con los parámetros apropiados, en un aparato Chemidoc.
Los resultados se ilustran en las figuras 13, 14, 15, 16, 17 y 18.
A partir de la figura 13, ya es posible inferir que hay diferencias en el tamaño de los cromosomas en el linaje de cepas desde BIE104 hasta BIE201. En la cepa BIE104A2P1 (a) , la transformante primaria, no se observan grandes diferencias con relación al tamaño de los cromosomas cuando se realiza una comparación con BIE104. Sin embargo, en las cepas BIE104A2Plc y BIE201, el tamaño del cromosoma VII se ha incrementado. En la cepa BIE104, el cromosoma VII tiene un tamaño similar al del cromosoma XV; pero en BIE104A2Plc y en BIE201, el tamaño del cromosoma se ha incrementado y es casi tan importante como el del cromosoma IV.
Al realizar una hibridación con las sondas de los genes araA (figura 14), PNC1 (figura 16) y HSF1 (figura 17), se obtuvo una imagen idéntica. A partir de esto, puede concluirse que la amplificación ha tenido lugar en el mismo cromosoma, es decir, que todas las regiones amplificadas todavía se hallan en el cromosoma VII. De haber ocurrido una translocación, se habrían observado múltiples señales, lo que no ocurrió. En la cepa BIE104A2P1 (a) , con las tres sondas se observa una banda más pequeña debajo de la banda del cromosoma VII. Esto refleja que hay presente una segunda versión más pequeña del cromosoma VII. Debido a que la intensidad es menor que la de la banda más grande, es posible que esté presente en tan solo una fracción de las células. Esto también puede explicarse a través de un artefacto de la electroforesis .
La hibridación con la sonda ACT1 (figural5) dio como resultado una sola banda en todas las cepas, según se había esperado. Ésta representa el cromosoma VI.
Finalmente, la hibridación con la sonda YGR031w (figura 18) dio como resultado numerosas bandas. Aparentemente, tuvo lugar una hibridación transversal que produjo múltiples señales en cada cepa. Entonces, este resultado no puede usarse para el propósito del presente experimento.
Aunque se observan algunas diferencias en la intensidad entre las cepas, a partir de estos datos es difícil concluir si se ha comprobado la amplificación. Aunque el incremento en la intensidad de la señal podría ser indicativo de un incremento en la cantidad de copias de un gen determinado, otros factores también podrían influir en la fuerza de la señal, por ejemplo, la cantidad de ADN aplicado sobre el gel, la eficiencia de la transferencia, la saturación de la detección, y semejantes.
En conjunto, los resultados del ejemplo 6 reflejan claramente que ha habido una amplificación en el cromosoma VII. No hay evidencias de una translocación del contexto genético de los genes araA, araB y araD (incluyendo las secuencias circundantes) a otro cromosoma.
Ejemplo 7. Convalidación fenotipica de los SNP y de la amplificación Con el fin de convalidar si los SNP descubiertos y la amplificación contribuían a la capacidad de las células de levadura de convertir arabinosa en etanol (aparte de las vías homologas y heterólogas introducidas), y en caso afirmativo, determinar cuan importante era esta contribución, se llevaron a cabo experimentos de cruzamiento. Para ello, se analizó la alteración del tipo de conjugación de la cepa BIE201, el cruzamiento de una cepa BIE201 con un tipo de conjugación alterado con la cepa progenitora no evolucionada BIE104A2P1, la esporulación de la cepa diploide después de la disección de las cuatro ascosporas, la capacidad de utilizar arabinosa como única fuente de carbono y energía en la descendencia haploide y la presencia de SNP en la descendencia haploide con un análisis Hi-Res. También se analizaron los datos en conjunto.
Mediante el cruzamiento de una cepa evolucionada BIE201 con el tipo de conjugación alterado con la transformante primaria no evolucionada BIE104A2P1, podrá obtenerse una célula diploide completamente homocigota, excepto por los cambios identificados en el genoma (los SNP y la amplificación) . A través de la esporulación subsiguiente de esta célula diploide, seguida por la disección de las ascosporas, podrán obtenerse células haploides que presenten la totalidad, algunos o ninguno de los cambios introducidos en el genoma durante la evolución adaptativa. La distribución de los cambios en el genoma de los cuatro derivados haploides de una célula diploide es azarosa, aunque para cada SNP, DIP o amplificación, se espera una segregación de los derivados haploides de 2:2. Para hallar una justificación teórica más detallada, véase, por ejemplo, Mortimer R.K. y Hawthorne D.C. (1975) Genetic Mapping in Yeast. Methods Cell Biol., 11:221-33. 7.1. Alteración del tipo de conjugación de la cepa BIE201 El plásmido pGal-HO (KAN) es un derivado del plásmido pGAL-HO (Herskowitz, I. y Jensen, R.E. (1991) Methods in Enzymology, 194:132-146). Se reemplazó el marcador URA3 en pGAL-HO por el marcador kanMX mediante el corte de pGAL-HO con EcoRV, a lo que siguió la unión del fragmento kanMX de pUG6 (Güldener, U. et al. (1996) Nucleic Acids Research 24: 2519-2524). El marcador kanMX, que permite la selección con G418 en S. cerevisiae, se separó de pUG6 con las enzimas de restricción Xbal y Xhol, a lo que siguió el relleno de los extremos sobrantes con la polimerasa Klenow. El plásmido resultante es pGal-HO (KAN) .
La cepa BIE201 (el genotipo relevante con relación a este experimento fue matA) se transformó con el plásmido pGal-HO (KAN) de acuerdo con el método de Gietz y Woods (2002) . Las transformantes se seleccionaron en placas con el medio YEP/agar que contenían glucosa (2%) y G418 (100 g/ml) . Aparecieron colonias después de dos días de incubación a 30°C. Se sembraron nuevamente ocho colonias en placas frescas con el medio YEP/agar que contenían glucosa y G418. Se usaron dos colonias de cada transformación para inocular 20 mi de un medio YEP que contenía 1% de galactosa y 0.1% de glucosa. Después de incubar durante 2 días a 30°C y a 280 rpm, se sembraron nuevamente las células en placas con el medio YEPD. Las placas se incubaron durante 2 días a 30°C, momento en el cual pudieron observarse colonias. Se llevaron a cabo reacciones de PCR para determinar el tipo de conjugación usando los cebadores de SEQ ID NO 55 y 56 (para identificar las células matA) y los cebadores de SEQ ID NO 55 y 57 (para identificar las células mata (alfa) ) .
Se obtuvieron diversas variantes mata (alfa) de BIE201. Con el objeto de establecer si estos derivados efectivamente presentaban un tipo de conjugación alterado, se los sembró nuevamente en placas frescas con el medio YEPD. También se sembró nuevamente la cepa BIE104A2P1 (la transformante primaria, cuyo genotipo relevante con relación a este experimento fue matA) en una placa fresca separada con el medio YEPD.
Posteriormente, se cruzaron ambas cepas mezclando una muestra de cada cepa en una placa fresca con agar YEPD. Después de incubar durante 6 a 30°C, se determinó la conjugación al microscopio. En efecto, se estableció que algunos aislados parecían formar cigotos, es decir, estructuras donde dos células con tipos de conjugación opuestos se habían fusionado para formar una cepa diploide. A partir de esto, puede concluirse que los derivados de BIE201 habían sufrido una alteración en su tipo de conjugación por mata (alfa) . 7.2. Cruzamiento de una cepa BIE201 con el tipo de conjugación alterado con la cepa progenitora no evolucionada BIE104A2P1 Las preparaciones donde se había observado la formación de híbridos (cigotos) al microscopio (sección 7.1) se sembraron en placas con agar YEPD. Las placas se incubaron a 30°C durante dos días. Se tomaron las colonias más grandes y se las sembró nuevamente en placas con un medio YEPD fresco. Luego se llevó a cabo una PCR de las colonias con los cebadores de SEQ ID NO 55 y 56 y de SEQ ID NO 55 y 57. Las colonias diploides formarán un producto en la PCR con ambos pares de cebadores. Se obtuvieron varias de estas colonias y se las usó para inocular un medio YEP con 2% de glucosa (30°C, 280 rpm) . 7.3. Esporulación de la cepa diploide y disección de las ascosporas Después de realizar un cultivo durante la noche a 30°C y a 280 rpm, se transfirieron 2.5 mi a 25 mi de KAc al 1.5% en agua corriente (esterilizada) . Se continuó con la incubación a 30°C y a 280 rpm. Se verificó el grado de esporulación diariamente al microscopio. Cuando la proporción entre los asci y las células vegetativas superó un valor de 2, se disectaron 60 asci usando un aparato Singer MSM System©, serie 300 (Somerset, Reino Unido) , de acuerdo con las instrucciones y los protocolos del proveedor. La disección se realizó en placas con el medio YEPD. Las placas se incubaron durante 2 días a 30°C. Se ilustra un ejemplo de los resultados en la figura 19.
En la figura 19 se ilustran 10 asci disectados. Las ascosporas de cada ascus se separaron y se colocaron en la placa con agar a distancias determinadas. Las colonias en una "columna" (se ilustran 10 columnas) se originan en un mismo ascus .
Como resulta evidente a partir de la figura 19, no todas las esporas (que eran cuatro en total) fueron viables en todos los casos. En una minoría de los casos, solamente tres y ocasionalmente apenas dos ascosporas se desarrollaron para proveer colonias viables.
También se observaron algunas diferencias en el tamaño entre las colonias provenientes de una misma ascospora. 7.4. Determinación de la capacidad de utilizar arabinosa como única fuente de carbono y energia en la descendencia haploide Se inoculó la totalidad de los conjuntos completos de derivados haploides, es decir, los casos donde se habían obtenido cuatro esporas viables a partir de un ascus, en agar YEPD en microplacas de 96 cavidades. Como control, en cada microplaca se incluyó BIE104A2P1 y BIE201 al menos por duplicado. Las placas se incubaron durante 2 días a 30°C.
Estas placas se conocen como las "placas maestras".
Se inocularon microplacas de 96 cavidades que contenían 200 µ? del medio de Verduyn y 2% de glucosa con material de colonias de las placas maestras, con la ayuda de una herramienta punzante descartable. De esta manera, fue posible transferir material celular de las 96 cepas a la microplaca en un solo movimiento.
La microplaca que contenía el medio de Verduyn líquido con 2% de glucosa se cultivó durante dos días a 30°C y a 550 rpm, en un agitador para microplacas Infors, con 80% de humedad.
Luego se transfirieron 10 µ? de los cultivos en las microplacas con glucosa a microplacas que contenían 200 µ? de un medio de Verduyn con 2% de arabinosa como única fuente de carbono. La incubación en el agitador Infors a 30°C, a 550 rpm y con 80% de humedad se prolongó durante cuatro días. El crecimiento se monitoreó diariamente, para lo cual se midió la densidad óptica a 620 nm usando a un lector de microplacas BMG FLUOstar (B G, Offenburg, Alemania) . La capacidad de utilizar la arabinosa se expresó dividiendo la densidad óptica final después de 4 días de incubación en arabinosa como única fuente de carbono por la densidad óptica inicial de la misma microplaca. Se resume un ejemplo de los resultados en la tabla 8.
Tabla 8. Se determinó el crecimiento (definido como la densidad óptica final a 620 nm dividida por la densidad óptica inicial a 620 nm) para cada derivado haploide de los asci disectados y de los controles BIE104A2P1 y BIE201 Cepa haploide Crecimiento Al 27 A2 7 A3 5 A4 26 Bl 6 B2 29 B3 9 B4 5 BIE201 25 BIE104A2Pla 5 Cl 9 C2 11 C3 25 C4 12 DI 17 D2 8 D3 11 D4 15 El 18 E2 6 E3 9 E4 10 Fl 9 F2 8 F3 10 F4 7 Gl 9 G2 9 G3 17 G4 32 A partir de la tabla 8, y según se había esperado, resulta evidente que hay una gran diferencia entre las dos cepas control, BIE104A2P1 y BIE201. BIE104A2P1 alcanza un nivel de 5, lo que en la práctica representa que no hubo crecimiento. Aunque un factor 5 es indicativo de la ocurrencia de una cierta medida de crecimiento, la causa de esto probablemente sea el arrastre de nutrientes (glucosa residual, etanol) desde el precultivo. La cepa BIE201 presentó una proporción de crecimiento de 25, que es significativamente mayor que la de la cepa BIE104A2P1.
Los derivados haploides presentan un amplio rango de fenotipos de crecimiento, que varían entre un crecimiento bajo (similar al de BIE104A2P1) y niveles elevados de crecimiento (similares o superiores al nivel de BIE201) . También se obtuvieron cepas con niveles de crecimiento intermedios. Por ejemplo, para el primer ascus, el ascus A, que dio como resultado las cuatro cepas haploides Al, A2, A3 y A4, se obtuvo una segregación de 2:2 del fenotipo de crecimiento en arabinosa. En algunos otros asci, la segregación entre los niveles de crecimiento bajos y altos que se obtuvo no siguió un patrón de 2:2. Por ejemplo, del ascus B se obtuvo una cepa con un fenotipo de crecimiento con un nivel elevado, una con un nivel intermedio de crecimiento (un valor de 9) y dos haploides con un fenotipo de bajo crecimiento. Pueden realizarse observaciones similares a partir de las cepas haploides derivadas de los otros asci. 7.5. Detección de los SNP en la descendencia haploide con un análisis Hi-Res Se inocularon microplacas de 96 cavidades que contenían un medio YEP con la adición de 2% de glucosa con material de colonias de las placas maestras (sección 7.4). Las células se dejaron crecer en un agitador Infors a 30°C, a 550 rpm y con 80% de humedad durante 2 días. Como controles, se incluyeron las cepas BIE104A2P1 y BIE201.
Se aisló ADN cromosómico usando el protocolo que se describió con anterioridad, pero en una escala menor. El ADN cromosómico sirvió como molde para un análisis Hi-Res, como se describió en la sección 5.2. Con el análisis Hi-Res, fue posible identificar los SNP en cada segregante haploide del cruzamiento BIE201 (mata) x BIE104A2P1 (matA) . Asimismo, la presencia de las regiones amplificadas en el cromosoma VII se determinó de acuerdo con los métodos que se describen en la sección 6.2. De determinó el genotipo de cada segregante haploide para analizar los SNP y la amplificación. Los resultados se presentan en la tabla 9.
Tabla 9. Información general de la presencia de los SNP y la amplificación en los derivados haploides del cruzamiento ???104?2?1 x BIE201; como controles, se incluyó BIE104A2P1 y BIE201 Cepa haploide YJR154W SSY1 CEP3 GAL80 Amiplificac ón Al salvaje salvaje salvaje SNP + A2 SNP SNP SNP salvaje - A3 salvaje salvaje salvaje salvaje - A4 salvaje SNP salvaje SNP + Bl SNP salvaje SNP SNP - B2 salvaje salvaje salva e SNP + B3 salvaje SNP SNP salvaje + B4 SNP SNP salvaje salvaje - BIE201 SNP SNP SNP SNP + BIE104A2Pla salvaj e salvaj e salvaj e salvaje - Cl SNP SNP SNP salvaj e - C2 salvaje salvaje SNP SNP - C3 salvaj e salvaj e salvaj e SNP + C4 SNP SNP salvaj e salvaj e + DI salvaje SNP SNP salvaje + D2 SNP SNP salvaj e SNP - D3 SNP salva e SNP SNP - D4 salvaje salvaje salvaje salvaje - El salvaje SNP salvaje salvaje + E2 salvaj e salvaj e SNP SNP - E3 SNP SNP salvaje SNP - E4 SNP salvaje SNP salvaje + Fl SNP salvaje salvaje salvaje - F2 salvaj e salvaj e SNP SNP - F3 salvaj e SNP SNP salvaje - F4 SNP SNP salvaje SNP - Gl SNP SNP salvaje SNP - G2 salvaj e salvaj e salvaje salvaj e - G3 salvaje SNP SNP salvaje + G4 SNP salvaje SNP SNP + En la mayoría de los asci, se observa una segregación de 2:2 entre los SNP y la amplificación. Hay algunas excepciones que pueden deberse, por ejemplo, a la conversión de los genes durante la meiosis. 7.6. Análisis de los conjuntos de datos Al combinarse los conjuntos de datos de las secciones 7.4 y 7.5 (tablas 8 y 9, respectivamente), se obtiene la tabla 10 a continuación. Sin embargo, los resultados en esta tabla han sido ordenados desde un crecimiento elevado hasta un crecimiento reducido en arabinosa.
Tabla 10. Información general de los SNP, la amplificación y el fenotipo de crecimiento de derivados haploides del cruzamiento BIE104A2P1 x BIE201 y de las cepas progenitoras respectivas Cepa YJR154w SSY1 CEP3 GAL80 Amplifi Cr« cación G4 SNP salvaje SNP SNP + 32 B2 salvaje salvaj e salvaj e SNP + 29 Al salvaje salvaje salvaje SNP + 27 A4 salvaje SNP salvaje SNP + 26 BIE201 SNP SNP SNP SNP + 25 C3 salvaj e salvaje salvaje SNP + 25 El salva e SNP salvaje salvaje + 18 G3 salvaj e SNP SNP salvaje + 17 DI salvaje SNP SNP salvaje + 17 D4 salvaj e salvaj e salvaje salvaje - 15 C4 SNP SNP salvaje salvaje + 12 D3 SNP salvaje SNP SNP - 11 C2 salvaje salvaje SNP SNP - 11 E4 SNP salvaj e SNP salvaj e + 10 F3 salvaje SNP SNP salvaje - 10 E3 SNP SNP salvaj e SNP - 9 G2 salvaje salvaje salva e salvaje - 9 B3 salvaje SNP SNP salvaje + 9 Gl SNP SNP salvaje SNP - 9 Cl SNP SNP SNP salvaj e - 9 Fl SNP salvaje salvaje salvaje 9 F2 salvaje salvaj e SNP SNP 8 D2 SNP SNP salvaj e SNP 8 F4 SNP SNP salvaje SNP 7 A2 SNP SNP SNP salvaje 7 Bl SNP salvaj e SNP SNP 6 E2 salvaje salvaj e SNP SNP 6 BIE104A2 salvaje salvaj e salvaje salvaje 5 Pla A3 salvaje salvaje salvaje salvaje 5 B4 SNP SNP salvaj e salvaje 5 A partir de los resultados de la tabla 10, pude inferirse con certeza que la amplificación es el factor fundamental que determina la capacidad de desarrollarse en arabinosa con una velocidad de crecimiento relativamente alta. La mayoría de las cepas que comprenden la amplificación se hallan entre las 9 mejores de la tabla 10. Dos tercios de estas cepas también comprenden un SNP en el gen GAL80, lo que podría ser indicativo de una interacción entre la presencia del SNP en el gen GAL80 y la presencia de la amplificación.
Con el fin de determinar en términos estadísticos cuáles factores eran relevantes para el crecimiento incrementado y cuáles presentaban efectos sinérgicos, se realizó un análisis de ANOVA. Aunque el diseño no está balanceado, sobre la base de la evaluación estadística de los datos es evidente que la presencia de la amplificación (p<<0.01) tiene un efecto positivo sobre el crecimiento. Los resultados también reflejan que hay una interacción notable entre el SNP de GAL80 y la presencia de la amplificación (p«0.01), mientras que los otros SNP no tienen efectos significativos (p>0.01).
Se estimó una mediana del crecimiento de 8.4 en el caso de la ausencia de la amplificación, mientras que en presencia de la amplificación, se obtuvo una mediana del crecimiento de 17.6. Se estimó una mediana del crecimiento de 8.7 en el caso de la ausencia del SNP de GAL80 y la amplificación, mientras que en presencia de ambos, se obtuvo una mediana del crecimiento de 26.8.
También, la interacción entre la presencia del SNP de CEP3 y la presencia de la amplificación pareció resultar en un efecto sinérgico, aunque en una medida menor que la interacción entre la presencia del SNP de GAL80 y la amplificación .
En conclusión, fue posible determinar los efectos y la significación de los efectos de la presencia de los SNP y/o de la amplificación sobre el crecimiento. La amplificación tiene un efecto significativo sobre el crecimiento. Este efecto se incrementa en combinación con la amplificación y el SNP de GAL80. Se detectó un efecto de interacción menor para la combinación de la amplificación y el SNP de CEP3 y para la combinación de la amplificación, el SNP de GAL80 y el SNP de CEP3.
Ejemplo 8. La supresión de GAL80 da como resultado una conversión aun mejor de la arabinosa En el ejemplo 7, se había demostrado que el SNP que se había identificado en el gen GAL80 presentaba un efecto positivo aditivo sobre el crecimiento en arabinosa si también había presente una amplificación de una parte del cromosoma VII.
GAL80 codifica un represor de la transcripción que participa en la regulación de la transcripción en respuesta a la galactosa (Timson DJ, et al. (2002) Biochem. J. 363 (parte 3): 515-20). En combinación con Gal4p y Gal3p, Gal80p regula de manera coordinada la expresión de los genes que contienen un sitio de activación de GAL hacia el extremo 5' del promotor (UAS-GAL) , lo que afecta a los genes del metabolismo de GAL GAL1, GALIO, GAL2 y GAL! (puede hallarse una revisión en Lohr D, et al. (1995) FASEB J 9 ( 9 ) : 777-87 ) . En las células nulas para gal80 se expresan de manera constitutiva genes GAL, incluso en medios no inductores (Torchia TE, et al. (1984) Mol. Cell Biol. 4 (8 ) : 1521-7 ) .
La hipótesis es que el SNP identificado en el gen GAL80 influye en la interacción entre Gal80p, Gal3p y Gal4p. Por consiguiente, la expresión de los genes del metabolismo de la galactosa, incluyendo GAL2, que codifica la galactosa permeasa, cambiará con relación a una levadura con un alelo GAL80 salvaje. Gal2p (la galactosa permeasa) es el transportador principal para la arabinosa (Kou et al. (1970) J. Bacteriol. 103 ( 3) : 671-678 ; Becker y Boles (2003) Appl . Environ. Microbiol. 69(7): 4144-4150).
Aparentemente, el SNP en el gen GAL80 presenta un efecto positivo sobre la capacidad de convertir L-arabinosa. Con el objeto de investigar si el fenotipo de crecimiento en arabinosa podía ser mejorado en mayor medida, se suprimió la secuencia codificante del gen GAL80 por completo usando una estrategia de reemplazo de genes mediada por PCR. 8.1. Alteración del gen GAL80 Se usaron los cebadores de SEQ ID NO 58 y 59 (los cebadores directo e inverso, respectivamente) para amplificar el marcador kanMX del plásmido p427-TEF (Dualsystems Biotech, Solieren, Suiza) . Los flancos de los cebadores son homólogos a la región 5' y la región 3 del gen GAL80. Una vez ocurrida la recombinación homologa, el ORF del gen GAL80 será reemplazado por el marcador kanMX, de una manera similar a la descripta por Wach (Wach et al. (1994) Yeast 10, 1793-1808). El fragmento obtenido se conoce como el fragmento GAL80: : kanMX.
La cepa de levadura BIE252 se transformó con el fragmento GAL80 : : kanMX purificado de acuerdo con el protocolo descripto por Gietz y Woods (2002) , Methods in Enzymology 350: 87-96). La construcción de la cepa BIE252 ha sido descripta en EP10160622.6. La cepa BIE252 es una cepa de S. cerevisiae que puede fermentar xilosa y arabinosa y que deriva de BIE201. La cepa BIE252 también contiene el SNP de GAL80.
Las células transformadas se sembraron en agar YEPD que contenia 100 µg/ml de G418 para la selección. Las placas se incubaron a 30°C hasta observar colonias. Se incluyó el plásmido p427-TEF como control positivo y se obtuvieron numerosas colonias. Se incluyó MilliQ (es decir, sin ADN) como control negativo y no se obtuvieron colonias. Con el fragmento GAL80 :: kanMX, se obtuvieron numerosas colonias. Se evaluaron dos colonias independientes por medio de una transferencia Southern para verificar la integración correcta (datos no presentados) . Una colonia con la supresión correcta del gen GAL80 se denominó BIE252AGAL80. 8.2. Efecto del reemplazo del gen GAL80 sobre el desempeño en el BAM Se llevó a cabo un experimento con un BAM (monitor de la actividad biológica; Halotec BV, Veenendaal, Países Bajos) . Se usaron colonias individuales aisladas de la cepa BIE252 y la cepa BIE252AGAL80 (una transformante donde el ORF del gen GAL80 había sido reemplazado correctamente por el marcador kanMX) para inocular un medio de Verduyn (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992) con la adición de 2% de glucosa. Los precultivos se incubaron durante aproximadamente 24 horas a 30°C y a 280 rpm. Las células se cosecharon y se inocularon en un medio modelo sintético (un medio de Verduyn con la adición de 5% de glucosa, 5% de xilosa, 3.5% de arabinosa, 1% de galactosa y 0.5% de mañosa, pH 4.2), en una densidad celular de aproximadamente 1 gramo de peso seco por kg del medio. La producción de C02 se monitoreó constantemente. La conversión de los azúcares y la formación de los productos se analizaron por RMN . Los datos representan la cantidad residual de azúcares (glucosa, arabinosa, galactosa, mañosa y xilosa, en gramos por litro) en los puntos de tiempo indicados y la formación de los (sub) productos (etanol, glicerol y semejantes) . El crecimiento se monitoreó siguiendo la densidad óptica del cultivo a 600 nm. El experimento se prolongó durante aproximadamente 72 horas.
Los gráficos se proveen en las figuras 20 (BIE252) y 21 (BIE252AGAL80) .
Con los experimentos, se demostró claramente que la cepa de referencia BIE252 convirtió rápidamente la glucosa y la mañosa. Una vez agotada la glucosa (lo que demoró aproximadamente 10 horas), comenzó la conversión de la xilosa y la arabinosa. Parte de la galactosa ya estaba siendo fermentada aproximadamente después de 10 horas, lo que podría deberse a la presencia del SNP de GAL80 en esta cepa, que permitiría la utilización (parcial) simultánea de glucosa y galactosa. Al final del experimento, que se prolongó durante aproximadamente 72 horas, se habían convertido prácticamente todos los azúcares. Se obtuvo un rendimiento de etanol de 0.37 gramos de etanol por gramo de azúcar.
La cepa BIE252ñGAL80 puede convertir los azúcares más rápidamente que la cepa BIE252. También en el caso de esta cepa, la mañosa y la glucosa son convertidas durante las primeras horas de la fermentación. Sin embargo, en contraste con la cepa BIE252, en esta transformante hay un consumo concurrente parcial de glucosa, galactosa y mañosa con la arabinosa y especialmente la xilosa. En general, el consumo de los azúcares es más veloz, lo que da como resultado un uso más completo de los azúcares disponibles. Esto también resulta evidente a partir de la evolución de C02 en el tiempo. En el caso de BIE252, se observa un primer pico que es básicamente el C02 que se forma a partir de la glucosa y la mañosa. Una vez que se alcanza un máximo apenas superior a 10 ml/hora (figura 20), se observa un segundo pico más plano. Sin embargo, en el caso de BIE252AGAL80 (figura 21), el segundo pico parece ser una cola del primer pico, debido a un uso concurrente intensificado de la glucosa, la xilosa, la arabinosa, la mañosa y la galactosa, lo que es evidente a partir del análisis de los azúcares por RMN. En la cepa progenitora BIE252, el uso de los distintos azúcares es más secuencial. Por lo tanto, el rendimiento de la cepa BIE252AGAL80 es mayor al final del experimento (72 horas) : 0.40 gramos de etanol por gramo de azúcar.
En conclusión, la supresión del ORF del gen GAL80 resultó en un desempeño mejorado en mayor medida, lo que se comprobó en la cepa BIE252.
Ejemplo 9. Producción de ácido adipico en la cepa BIE201 9.1. Fragmentos de ADN sintético encargados en DNA2.0 En DNA2.0 (Menlo Park, CA 94025, EEUU), se encargaron nueve fragmentos de ADN sintético que contenían los nueve marcos abiertos de lectura que participan en la vía del ácido adipico (véase la Solicitud de Patente Europea EP11160000.3, presentada el 28 de Marzo de 2011) y un promotor y un terminador de S. cerevisiae para una expresión eficiente. En algunos casos, al fragmento sintético se le agregó una región de homología, en una parte adyacente a los genes de la vía del ácido adipico, para la recombinación in vivo de la vía después de la introducción por transformación en BIE201. Los fragmentos sintéticos se recibieron de DNA2.0 como insertos clonados en un vector de clonación convencional. De esta manera, se obtuvieron los siguientes plásmidos (entre paréntesis se indica la abreviatura correspondiente) : pADI141 (Adi21), pADI142 (Adi22), pADI143 (Adi23) , pADI199 (Adi8), pADI145 (Adi24), pADI146 (Adi25) , pADI149 (SucC) , pADI150 (SucD) y pADI200 (Acdh67) . En la tabla 11 se detallan los genes que participan en la via, las abreviaturas usadas, la fuente, el código Uniprot y la función en la via.
Tabla 11. Información general de los genes de la via del ácido adipico introducidos por transformación en la cepa BIE201 Abreviatura Nombre Fuente Código Paso en la Uniprot vía Adi21 beta-cetodipil CoA Acinetobacter Q6FBN0 tiolasa (DcaF) sp.
Adi22 beta-hidroxi- Acinetobacter Q937T5 adipoil sp. dehidrogenasa (DcaH) Adi23 enoíl-CoA hidratasa Acinetobacter Q937T3 (DcaE) sp.
Adi8 trans-2-enoíl-CoA- Candida Q8WZM3 reductasa tropicalus Adi24 acil-CoA Acinetobacter Q937T0 transferasa (Dcal) Sp. (subunidad A) Adi25 acil-CoA Acinetobacter Q937S9 transferasa (Dcal) Sp. (subunidad B) Acdh67 Acetaldehído histeria Q92CP2 Suministro deshidrogenasa innocua de acetil- acetilante CoA SucC Succinil-CoA E. coli P0A836 Suministro sintetasa, de subunidad A succinil- CoA SucD Succinil-CoA E. coli P0AGE9 Suministro ssiinntteettaassaa,, de subunidad B succinil- CoA 9.2. Preparación de los fragmentos de PCR para la transformación de BIE201 Se usó una recombinación homologa in vivo para ensamblar e integrar la vía completa del ácido adípico en BIE201. Se agregaron las regiones de homología necesarias para la recombinación de la vía completa (50-250 bp) durante la síntesis de los fragmentos sintéticos o mediante la adición de la secuencia correspondiente a los cebadores que se emplearon para amplificar cada fragmento. Las secuencias de los cebadores se detallan en la tabla 12.
Tabla 12. Lista de las secuencias de los cebadores que se usaron en las reacciones de PCR para crear los fragmentos que se emplearon en la transformación de la cepa BIE201 Cebador Descripción breve SEQ ID NO 60 Cebador directo para amplificar INT1LF SEQ ID NO 61 Cebador inverso para amplificar INT1LF, con 50 bp en el flanco superpuestos con el cásete de expresión de Adi21 SEQ ID NO 62 Cebador directo para amplificar el cásete de expresión de Adi21, con 50 bp en el flanco de INT1LF SEQ ID NO 63 Cebador inverso para amplificar el cásete de expresión de Adi21 SEQ ID NO 64 Cebador directo para amplificar el cásete de expresión de Adi22 SEQ ID NO 65 Cebador inverso para amplificar el cásete de expresión de Adi22 SEQ ID NO 66 Cebador directo para amplificar el cásete de expresión de Adi23 SEQ ID NO 67 Cebador inverso para amplificar el cásete de expresión de Adi23 SEQ ID NO 68 Cebador directo para amplificar el marcador kanMX a partir de pUG7, con 50 bp en el flanco superpuestos con Adi23 SEQ ID NO 69 Cebador inverso para amplificar el marcador kanMX a partir de pUG7, con 50 bp en el flanco superpuestos con Adi8 SEQ ID NO 70 Cebador directo para amplificar el cásete de expresión de Adi8, con 25 bp en el flanco superpuestos con kanMX de pUG7 SEQ ID NO 71 Cebador inverso para amplificar el cásete de expresión de Adi8 SEQ ID NO 72 Cebador directo para amplificar el cásete de expresión de Adi2 SEQ ID NO Cebador inverso para amplificar el cásete de expresión 73 de Adi24 SEQ ID NO Cebador directo para amplificar el cásete de expresión 74 de Adi25 SEQ ID NO Cebador inverso para amplificar el cásete de expresión 75 de Adi25, con 50 bp superpuestos con SucC SEQ ID NO Cebador directo para amplificar SucC, con 50 bp 76 superpuestos con Adi25 SEQ ID NO Cebador inverso para amplificar el cásete de expresión 77 de SucC SEQ ID NO Cebador directo para amplificar el cásete de expresión 78 de SucD SEQ ID NO Cebador inverso para amplificar el cásete de expresión 79 de SucD SEQ ID NO Cebador directo para amplificar el cásete de expresión 80 de acdh67 SEQ ID NO Cebador inverso para amplificar la construcción acdh67, 81 con 50 bp en el flanco superpuestos con INTRF SEQ ID NO Cebador directo para amplificar el sitio INT1LF en el 82 genoma de la levadura SEQ ID NO Cebador inverso para amplificar el sitio INT1LF en el 83 genoma de la levadura En total, fueron necesarios 12 fragmentos (véase la figura 22) para integrar la vía completa del ácido adipico en el genoma de BIE201: 9 fragmentos para la PCR que contenían los casetes para la expresión de los genes que pertenecían a la vía del ácido adipico (SEQ ID NO 84-92), un fragmento para la PCR que contenía el marcador kan X, que confiere resistencia a G418 (SEQ ID NO 93) , y finalmente los flancos INT1LF (flanco izquierdo para la integración) e INT1RF (flanco derecho para la integración) (SEQ ID NO 94 y SEQ ID NO 95, respectivamente) . Todos los fragmentos fueron creados con regiones de homología superpuestas con el fragmento adyacente dentro de la vía, así como fuera de la vía con INT1LF e INT1RF, para la integración de la vía a través de un cruzamiento doble en el genoma. El proceso de recombinación homologa, el ensamblaje completo y la integración de la vía se ilustran en la figura 22. Los fragmentos creados para la PCR que se emplearon en la transformación se detallan en la tabla 13. Las secuencias se incluyen en la presente como SEQ ID NO 84 a SEQ ID NO 95, inclusive. En la tabla 13 se provee información sobre los promotores y los terminadores que se emplearon en los genes, y también sobre los cebadores que se usaron en las reacciones de amplificación por PCR para crear los fragmentos que se emplearían en la transformación.
Tabla 13. Información general de los elementos de ADN que se usaron para la recombinación/integración in vivo de la via del ácido adipico; los fragmentos con un promotor, un ORF y un terminador se conocen a través del nombre del ORF; en las columnas de la homología en las regiones 5' y 3' , se indica con qué otros fragmentos hay homología (véase la figura 22) ; en la columna del nombre del plásmido se indica el nombre del plásmido creado por DNA2.0 que contenia el fragmento sintético Identi Promot ORF/e Termin Cebado Cebad Elemen Element Nombre ficaci or lemen ador r or to con o con del ón del to direct inver el que el que plásmi elemen o so hay hay do to homolo homolog gía en ia en la la región región ADI21, pTPIl ADI21 tGND2 SEQ ID SEQ INT1LF ADI22 pADI14 SEQ ID NO 62 ID NO 1 NO 84 63 ADI22, pFBAl ADI22 tPMAl SEQ ID SEQ ADI21 ADI23 pADI14 SEQ ID NO 64 ID NO 2 NO 85 65 ADI23, pADHl ADI23 tTDHl SEQ ID SEQ ADI22 KANMX pADI14 SEQ ID NO 66 ID NO 3 NO 86 67 ADI8, pENOl ADI8 tPDCl SEQ ID SEQ KANMX ADI24 pADI19 SEQ ID NO 70 ID NO 9 NO 87 71 ADI24, pTDHl ADI24 tADH2 SEQ ID SEQ ADI8 ADI25 pADI1 SEQ ID NO 72 ID NO 5 NO 88 73 ADI25, pEN02 Adi25 tGPMl SEQ ID SEQ ADI24 SUCC pADI14 SEQ ID NO 74 ID NO 6 NO 89 75 SUCC, pPDCl SucC tGND2 SEQ ID SEQ ADI25 SUCD pADI14 SEQ ID NO 76 ID NO 9 NO 90 77 SUCD, pGPMl SucD tADHl SEQ ID SEQ SUCC ACDH67 pADI15 SEQ ID NO 78 ID NO 0 NO 91 79 A67, pOYE2 acdh6 tTPIl SEQ ID SEQ SUCD INT1RF pADI20 SEQ ID 7 NO 80 ID NO 0 NO 92 81 INT1LF INT1L SEQ ID SEQ ADI21 , SEQ F NO 60 ID NO ID NO 61 94 INT1RF INT1R SEQ ID SEQ ACDH67 SEQ F NO 82 ID NO ID NO 83 95 KANMX, KANMX SEQ ID SEQ ADI23 ADI8 pUG7 SEQ ID NO 68 ID NO NO 93 69 Todas las reacciones de PCR se llevaron a cabo con la polimerasa Phusion® (Finnzymes), de acuerdo con el manual. Los plásmidos que se habían encargado en DNA2.0 fueron usados como moldes para amplificar los 9 genes de la vía del ácido adípico. El marcador kanMX se amplificó a partir de un plásmido pUG7 que contenía la secuencia del marcador. pUG7 se construyó como se describe a continuación. Se reemplazaron los sitios loxP del plásmido pUG6 (Güldener, U. et al. (1996) Nucleic Acids Research 24: 2519-2524) en dos pasos, mediante la clonación de conectores que contenían los sitios loxP modificados lox66 y lox71 (Araki et al. (1997) Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, N° 4, pp 868-872). Se realizó un análisis de restricción y una secuenciación para confirmar el reemplazo correcto.
Las regiones INT1LF e INT1RF (los flancos izquierdo y derecho, respectivamente) para la integración en el "locus INT1" se amplificaron usando ADN cromosómico aislado de BIE104 como molde.
El tamaño de los fragmentos producidos por PCR se verificó con técnicas convencionales de electroforesis en agarosa. Los fragmentos de ADN amplificados por PCR se purificaron y se concentraron con el conjunto de elementos de purificación por PCR de Qiagen, de acuerdo con el manual. La concentración del ADN se midió usando el dispositivo Nanodrop de Thermo Scientific (a través de la absorbancia A260/A280). 9.3. Transformación de la levadura La transformación de S. cerevisiae se realizó como se describe en Gietz y Woods (2002; Methods in Enzymology 350: 87-96) . BIE201 se transformó con 1 \iq de cada uno de los 12 fragmentos que se habían obtenido por PCR, que luego habían sido amplificados y purificados. Las mezclas de transformación se sembraron en agar YPD (10 gramos por litro de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa, 20 gramos por litro de agar) que contenía 100 g de G418 (Sigma Aldrich) por mi. Después de 2-4 días, aparecieron colonias en las placas, mientras que el control negativo (es decir, la muestra en la que no se había colocado ADN durante el experimento de transformación) resultó en placas YPD/G418 vacías. A partir de la transformación, se transfirieron colonias de placas individuales a nuevas placas que contenían agar YPD con la adición de 100 pg de G418 por mi. Las placas se incubaron durante 2 días a 30°C. 9.4. Producción de ácido adipico en arabinosa Se inocularon colonias individuales de 4 transformantes (de las cepas 1, 2 3 y 4) y la cepa BIE201 como control por duplicado, en una microplaca MTP con cavidades de profundidad media que contenía 200 µ? de un medio de Verduyn con 2% de arabinosa y 0.05% de glucosa por cavidad. La microplaca MTP se incubó durante 48 horas a 30°C, a 550 rpm y con 80% de humedad, en un agitador para microplacas Infors. Después de incubar durante 48 horas, se transfirieron 40 µ? de cada cultivo a dos placas de 24 cavidades que contenían 2.5 mi de un medio de Verduyn con 2% de arabinosa por cavidad. Las placas de 24 cavidades se cubrieron con una tapa para microplacas convencional y se incubaron durante 24 horas a 30°C, a 550 rpm y con 80% de humedad. Después de incubar durante 24 horas, se centrifugaron las placas de 24 cavidades durante 10 minutos en una centrífuga Heraeus a 2750 G. Se retiró el sobrenadante y se agregaron 4.5 mi de un medio de Verduyn fresco con 2% de arabinosa a cada cavidad que contenía un precipitado celular. El precipitado celular se suspendió nuevamente con una pipeta. En una placa, se reemplazó la tapa convencional de la microplaca por una lámina permeable al aire (Qiagen) , con el fin de mejorar la aireación. En la segunda placa de 24 cavidades, se reemplazó la tapa por una tapa BugStopper™ (Whatman) , que crea un ambiente micro-aeróbico . Las placas de 24 cavidades se incubaron en una incubadora Infors Microtron durante 72 horas a 30°C, a 350 rpm y con 80% de humedad. Después de la incubación, las placas se centrifugaron durante 10 minutos en una centrífuga Heraeus a 2750 G. Las concentraciones de ácido adípico en el sobrenadante se midieron por LC-MS . Los resultados se detallan en la tabla 14.
Tabla 14. Concentraciones resultantes de ácido adipico en el sobrenadante obtenido de transformantes de BIE201 después de un cultivo en arabinosa Cepa Tapa usada Concentración adipico (mg/1 BIE201 Láminas Airpore < 0.2 BIE201 Láminas Airpore < 0.2 Cepa 2 Láminas Airpore 1. ,4 Cepa 2 Láminas Airpore 1. .4 Cepa 3 Láminas Airpore 1. .2 Cepa 3 Láminas Airpore 1. ,3 Cepa 4 Láminas Airpore 1. , 6 Cepa 4 Láminas Airpore 2. .0 BIE201 Bugstopper < 0.2 BIE201 Bugstopper < 0.2 Cepa 2 Bugstopper 3, .0 Cepa 2 Bugstopper 2, .4 Cepa 3 Bugstopper 1, .8 Cepa 3 Bugstopper 2, .2 Cepa 4 Bugstopper 2, .5 Cepa 4 Bugstopper 2 .8 Las cepas 2, 3 y 4 producen ácido adipico en un medio de Verduyn con arabinosa como única fuente de C. Bajo condiciones de limitación de oxigeno, es decir, con las tapas Bugstopper, se obtiene un nivel mayor que en las placas con láminas Airpore.
La cepa de referencia BIE201 se desarrolla en arabinosa, pero no produce ácido adipico. 9.5. Análisis de UPLC-MS/MS (modo ESI negativo) Las muestras se analizaron en una columna con las siguientes especificaciones: Waters Acquity ÜPLC HSS T3, de 1.8 µp?, 100 mm*2.1 mm I.D. El volumen de inyección fue de 5 µ?. Se usó un ciclo completo. La velocidad de flujo en la columna fue de 0.250 ml/minuto, y la temperatura de la columna fue de 40°C. En la tabla 15 se detalla el gradiente que se empleó para las fases móviles A y B. La fase móvil A contenía 0.1% de ácido fórmico en agua y la fase móvil B contenía 0.1% de ácido fórmico en acetonitrilo .
Tabla 15. Gradiente usado durante el análisis de UPLC-MS/MS de las concentraciones de ácido adipico en el sobrenadante En la figura 23 se ilustra un cromatograma de MRM de una referencia que contenía 10.5 mg/1 de ácido adípico y de una muestra obtenida de la cepa 3 cultivada en arabinosa, que contenía 3 mg/1 de ácido adípico y una tapa Bugstopper.
Ejemplo 10. Producción de ácido succinico 10.1. Construcciones de expresión La construcción de expresión pGBS414PPK-3, que comprendía una fosfoenol piruvato carboxiquinasa PCKa (E.C. 4.1.1.49) de Actinobacillus succinogenes y una fumarato reductasa glicosomal FRDg (E.C. 1.3.1.6) de Trypanosoma brucei, y la construcción de expresión pGBS415FUM3, que comprendía una fumarasa (E.C. 4.2.1.2) de Rhizopus oryzae y una malato deshidrogenasa peroxisomal MDH3 (E.C. 1.1.1.37), se prepararon como se describió con anterioridad en WO2009/065778, p. 19-20 y 22-30, que se incorpora en la presente a modo de referencia, incluyendo las figuras y el listado de secuencias.
La construcción de expresión pGBS416ARAABD, que comprendía los genes araA, araB y araD de Lactobacillus plantarum, se construyó clonando un producto obtenido por PCR que comprendía el cásete de expresión araABD del plásmido pPWT018 en el plásmido pRS416. El fragmento obtenido por PCR se generó usando la ADN polimerasa Phusion® (Finnzymes) y los cebadores de PCR que se definen en la presente como SEQ ID NO 96 y SEQ ID NO 97. El producto de la PCR se cortó con las enzimas de restricción Salí y Notl, al igual que el plásmido pRS416. Una vez realizada la unión y la transformación de E. coli TOP10, se seleccionaron las recombinantes correctas sobre la base de un análisis con enzimas de restricción. El mapa físico del plásmido pGBS 16ARAABD se ilustra en la figura 24. 10.2. Cepas de S. cerevisiae Los plásmidos pGBS414PPK-3 y pGBS415-FUM-3 se introdujeron por transformación en la cepa de S. cerevisiae CEN.PK113-6B (MATA ura3-52 leu2-112 trpl-289) . Además, el plásmido pGBS416ARAABD se introdujo por transformación en esta levadura para crear cepas de levadura prototróficas . La transformación de la levadura con los vectores de expresión se efectuó por electroporacion. Las mezclas de transformación se sembraron en una base nitrogenada para levadura (YNB) sin AA (Difco) pero con 2% de glucosa. Una de estas transformantes se denominó SUC595.
Como control, la cepa CEN.PK113-6B se transformó solamente con el plásmido pGBS416ARAABD. Una de estas transformantes se denominó SUC600.
Las cepas se sometieron a una evolución adaptativa (véase el ejemplo 2, sección 2.1) para poder desarrollarlas en arabinosa como única fuente de carbono. En el ejemplo 2 se había usado un medio YNB que contenía arabinosa, mientras que en este ejemplo se usó un medio de Verduyn con 2% de arabinosa.
Se caracterizaron colonias individuales aisladas provenientes de los matraces de agitación donde se había realizado la evolución adaptativa en función de su capacidad de desarrollarse en arabinosa como única fuente de carbono.
SUC689, un derivado de SUC595 obtenido por evolución adaptativa, tiene una velocidad de crecimiento de 0.1· h-1 en arabinosa como única fuente de carbono. SUC694, un derivado de SUC600 obtenido por evolución adaptativa, tiene una velocidad de crecimiento de 0.09 h-1 en arabinosa como única fuente de carbono. 10.3. Experimentos de cultivo y producción de ácido succinico Se inocularon colonias individuales aisladas de las transformantes SUC689 y SUC694 en microplacas de 96 cavidades que contenían un medio YNB (Difco) con 4% de galactosa y 2% de agar. Se inocularon cuatro colonias independientes por cepa. Después de realizar un cultivo durante 2 días a 30°C, se transfirió material de las colonias a una microplaca de 96 cavidades que contenía 200 µ? de un medio de precultivo que consistía en un medio de Verduyn (Verduyn et al., 1992, Yeast. Jul. 8(7):501-17) con 4% de galactosa (p/v) , con la ayuda de una herramienta punzante, después de lo cual se realizó un cultivo bajo condiciones aeróbicas en una incubadora Infors, a 30°C, a 550 rpm y con 80% de humedad, con agitación. Después de aproximadamente 48 horas, las células se transfirieron por duplicado a microplacas de 24 cavidades que contenían 2.5 mi de un medio de Verduyn fresco con la adición de 4% de galactosa. Después de 72 horas de incubación a 30°C, las placas se centrifugaron en una centrífuga para microplacas para separar las células del medio. Se descartó el sobrenadante. Las células se suspendieron nuevamente en 4 mi de un medio de Verduyn que comprendía 8% de arabinosa. Una vez transcurridas 48 horas (para la microplaca 1) y 72 horas (para la microplaca 2), se detuvo la incubación centrifugando las células. Se usó el sobrenadante para medir los niveles de ácido succínico por RMN, como se describió en la sección 10.4. 10.4. Análisis de RMN Se llevó a cabo una RMN para determinar los ácidos orgánicos y los azúcares en ambas muestras.
Los resultados se presentan en las tablas 16 y 17.
Tabla 16. Resultados del análisis de RMN después de 48 horas; todos los valores se expresan en gramos por litro; N.D . denota no detectado Cepa Arabinosa Ácido Glicerol Ácido Etanol mélico succinico SUC689 18.5 0. .4 3. .3 0.7 8.4 SUC689 14.5 0. .4 4. , 3 0.8 10.0 SUC689 16.6 0. .4 4. ,3 0.8 9.7 SUC689 14.9 0. , 4 4. , 1 0.7 9.1 SUC694 0.7 N. . D. N. , D. 0.2 18.8 SUC694 0.4 N, , D. 0. ,0 0.2 18.5 SUC694 1.1 N. ,D. N. ,D. 0.3 18.4 SUC694 0.7 N. . D . N. .D. 0.2 17.8 Tabla 17. Resultados del análisis de RMN después de 72 horas / todos los valores se expresan en gramos por litro ; N.D. denota no detectado Cepa Arabinosa Ácido Glicerol Ácido Etanol málico succínico SUC689 14.0 0. 5 3. ,5 0. 7 6.7 SUC689 11.2 0. 5 4. .3 0. 8 6.8 SUC689 13.7 0. .5 3. .9 0. ,8 6.0 SUC689 10.3 0. ,5 3. .9 0. ,7 7.5 SUC694 0.1 N. .D. N. .D. 0. 2 15.6 SUC694 0.1 N. . D. N. , D. 0. .2 15.2 SUC694 0.2 N. , D. N. . D. 0. .2 15.6 SUC694 0.3 N. .D. N, .D. 0. ,3 13.6 A partir de las tablas 16 y 17, resulta evidente que la cantidad de ácido succínico es mayor en la cepa SUC689 que en la cepa SUC694. Esta última convierte prácticamente la totalidad de la arabinosa, y como productos se forma principalmente biomasa y etanol. En el caso de la cepa SUC689, se forma menos etanol, pero se obtiene una cantidad significativamente mayor de ácido succínico (entre 3 y 4 veces mayor en comparación con SUC694). Se calcularon los rendimientos de ácido succínico y se los detalla en la tabla a continuación.
Tabla 18. Rendimientos de ác do succínico en arabinosa como única fuente de carbono Cepa Rendimiento promedio de Rendimiento promedio de ácido succínico (gramos de ácido succínico (gramos de ácido succínico por gramo ácido succínico por gramo de de arabinosa) después de 48 arabinosa) después de 72 horas horas SUC689 0.012 0.011 SUC694 0.003 0.003 En conclusión, se produjo ácido succínico a partir de la arabinosa en la cepa SUC689. El rendimiento fue significativamente menor en la cepa SUC694, donde no se expresa la vía del ácido succínico.
E emplo 11. Introducción de copias adicionales de los genes araA, araB y araD 11.1. Amplificación de cásete araABD Con el propósito de introducir copias adicionales de los genes arah, araB y araD en el genoma, se efectuó una reacción de PCR usando la ADN polimerasa Phusion® (Finnzymes), con el plásmido pPWT018 como molde y los oligonucleótidos de SEQ ID NO 98 y SEQ ID NO 99 como cebadores. Con estos cebadores se amplificó el cásete araABD. El diseño de los cebadores es tal que los flancos del fragmento que se obtenga por PCR serán homólogos a las secuencias de consenso delta del transposón Ty-1 de la levadura. Estas secuencias pueden obtenerse en el NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y pueden alinearse usando un conjunto de software apropiado, tal como, por ejemplo, Clone Manager 9 Professional Edition (Scientific & Educational Software, Cary, EEUU) .
El cásete araABD no contiene un marcador de selección con el que pueda seleccionarse la integración en el genoma . Con el fin de estimar la frecuencia de la transformación, se realizó una segunda transformación de control con el marcador kanMX. Para esto, se amplificó el cásete con kanMX a partir del plásmido p427TEF (Dualsystems Biotech) , en una reacción de PCR donde se usaron los cebadores de SEQ ID NO 100 y SEQ ID NO 101. 11.2. Transformación de BIE104A2P1 BIE104A2P1 se transformó de acuerdo con el protocolo de electroporación (que se describió con anterioridad), con fragmentos que comprendían 30 \iq del cásete araABD (denominado Tyl::araABD) o 10 g del cásete con kanMX. La mezcla de transformación con kanMX se colocó en agar YPD (10 gramos por litro de extracto de levadura, 20 gramos por litro de peptona, 20 gramos por litro de dextrosa, 20 gramos por litro de agar) que contenía 100 g de G418 (Sigma Aldrich) por mi. Después de 2-4 días, aparecieron colonias en las placas, mientras que el control negativo (es decir, la muestra en la que no se había colocado ADN durante el experimento de transformación) resultó en placas YPD/G418 vacías. La frecuencia de la transformación fue superior a 600 colonias por µq del cásete con kanMX.
Se usó la mezcla de transformación con Tyl::araABD para inocular un frasco de agitación que contenía 100 mi de un medio de Verduyn con la adición de 2% de arabinosa . Como control, se usó el control negativo de la transformación (es decir, sin la adición de ADN en el experimento de transformación) . Los matraces de agitación se incubaron a 30°C y a 280 rpm en un agitador orbital. El crecimiento se siguió midiendo la densidad óptica a 600 nm de manera regular.
Después de aproximadamente 25 días, se incrementó la densidad óptica del frasco de agitación con Tyl::araABD, mientras que aún no había crecimiento en el control negativo. El día 25, se inoculó un frasco que contenía un medio de Verduyn fresco con la adición de 2% de arabinosa con el cultivo Tyl::araABD, en una densidad óptica inicial a 600 nm de 0.15. El cultivo comenzó a desarrollarse en arabinosa de inmediato y rápidamente. Como era probable que el cultivo consistiera en una mezcla de subcultivos, es decir, que consistiera en células con diferencias en la cantidad de copias del cásete Tyl::araABD y en la velocidad de crecimiento en arabinosa, las células se diluyeron en agua milliQ y se sembraron en placas con agar YPD para obtener colonias individuales aisladas. Se evaluó la capacidad de las colonias individuales aisladas de utilizar distintas fuentes de carbono. 11.3. Selección de las cepas que convertían mejor la arabinosa Con el propósito de seleccionar una cepa que hubiera adquirido una capacidad de crecimiento mejorada en arabinosa como única fuente de carbono, sin perder su capacidad de utilizar otros azúcares importantes (glucosa, y galactosa) , se sembraron nuevamente diez colonias individuales aisladas del cultivo de evolución adaptativa en agar YPD. Luego se realizó un precultivo en un medio YPD con la adición de 2% de glucosa. Los diez cultivos se desarrollaron durante la noche a 30°C y a 280 rpm. Se usaron alícuotas de cada cultivo para inocular un medio de Verduyn fresco con la adición de 2% de glucosa, 2% de arabinosa o 2% de galactosa, con una densidad óptica inicial de 0.15. Como controles, en el experimento se incluyeron las cepas BIE201 y BIE104A2P1 y la población mixta (de la cual se habían obtenido las diez colonias individuales aisladas) . Las células se cultivaron a 30°C y a 280 rpm en un agitador orbital. El crecimiento se evaluó sobre la base de mediciones de la densidad óptica a 600 nm.
Los resultados reflejan que el cultivo mixto y las diez colonias individuales aisladas presentan una mayor densidad óptica final a 600 nm.
Se seleccionó una colonia (la colonia T) sobre la base de su capacidad de desarrollarse en arabinosa como única fuente de carbono. Si se inocula esta colonia en un medio de Verduyn con la adición de 2% de arabinosa, presenta una mayor velocidad de crecimiento que la cepa progenitora BIE104A2P1. Su velocidad de crecimiento es comparable a la velocidad de crecimiento de la cepa BIE201.
Se realizó una Q-PCR con ADN cromosómico de las cepas BIE201 y BIE104A2P1 y de la colonia T. Se estableció que la cantidad de copias del cásete araABD era de 1 en el caso de BIE104A2P1 y mayor que 2 en los casos de la colonia T y de BIE201.

Claims (14)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES
1. Un proceso para producir células capaces de convertir arabinosa, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) introducir los genes araA, araB y araD en una cepa hospedera que no puede convertir arabinosa, donde la célula resultante se conoce como una célula construida; b) someter la célula construida a una evolución adaptativa hasta obtener una célula capaz de convertir arabinosa, c) opcionalmente, someter la primera célula capaz de convertir arabinosa a una evolución adaptativa para mejorar la conversión de la arabinosa, donde la célula que se obtiene en el paso b) o c) se conoce como la primera célula capaz de convertir arabinosa; d) analizar la totalidad o una parte del genoma de la primera célula capaz de convertir arabinosa y de la célula construida; e) identificar los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en la primera célula capaz de convertir arabinosa; f) usar la información de los SNP en el diseño racional de una célula capaz de convertir arabinosa; y g) construir la célula capaz de convertir arabinosa diseñada en el paso f ) .
2. Un proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en los pasos e) , f ) y/o g) , se usan una o más técnicas para determinar el fenotipo en combinación con una o más técnicas para determinar el genotipo.
3. Un proceso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque en el proceso, la célula de levadura capaz de convertir arabinosa comprende un cromosoma que está amplificado con relación a la cepa hospedera, donde el cromosoma amplificado presenta el mismo número que el cromosoma en el cual se han introducido los genes araA, araB y araD en la cepa hospedera.
4. Un proceso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el cromosoma amplificado es el cromosoma VII.
5. Una célula de levadura que presenta los genes araA, araB y araD, caracterizada porque el cromosoma VII tiene un tamaño de entre 1300 y 1600 Kb, lo que puede determinarse por electroforesis, con la exclusión de una célula de levadura BIE201.
6. Una célula de levadura de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la cantidad de copias de cada uno de los genes araA, araB y araD es de entre tres y cinco .
7. Una célula de levadura de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque presenta uno o más polimorfismos de un solo nucleótido seleccionados del grupo que consiste en la mutación G1363T en el gen SSY1, la mutación A512T en el gen YJR154w, la mutación A1186G en el gen CEP3 y la mutación A436C en el gen GAL80.
8. Una célula de levadura de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque presenta el polimorfismo de un solo nucleótido A436C en el gen GAL80.
9. Una célula de levadura de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque también presenta el polimorfismo de un solo nucleótido A1186G en el gen CEP3.
10. Un polipéptido caracterizado porque pertenece al grupo que consiste en los siguientes polipéptidos : a. un polipéptido que tiene la secuencia codificada por el polinucleótido de SEQ ID NO 14, que tiene una sustitución E455stop en SSY1, o variantes de dicho polipéptido, en donde una o más de las otras posiciones presentan una mutación en el aminoácido por otro aminoácido que es un aminoácido propio de la superfamilia AA trans; b. un polipéptido que tiene la secuencia codificada por el polinucleótido de SEQ ID NO 16, que tiene una sustitución D171G en YJR154w, o variantes de dicho polipéptido, en donde una o más de las otras posiciones presentan una mutación en el aminoácido por otro aminoácido que es un aminoácido conservado propio de la superfamilia PhyH; c. un polipéptido que tiene la secuencia codificada por el polinucleótido de SEQ ID NO 18, que tiene una sustitución S396G en CEP3; d. un polipéptido que tiene la secuencia codificada por SEQ ID NO 20, que tiene una sustitución T146P en GAL80; así como variantes de éstos, en donde una o más de las otras posiciones presentan una mutación en el aminoácido por otro aminoácido que es un aminoácido conservado propio de la superfamilia NADB Rossmann.
11. Un proceso para la fabricación de uno o más productos de fermentación a partir de una composición de azúcares que comprende glucosa, galactosa, arabinosa y xilosa, caracterizado porque comprende fermentar la composición de azúcares con una célula de levadura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-9.
12. Un proceso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la composición de azúcares se produce a partir de materia prima lignocelulósica a través de las siguientes etapas: a) el pretratamiento de uno o más tipos de materia prima lignocelulósica para producir una materia prima lignocelulósica pretratada; b) el tratamiento enzimático de la materia prima lignocelulósica pretratada para producir la composición de azúcares .
13. Un proceso de conformidad con las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizado porque la fermentación se efectúa de manera anaeróbica.
14. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, caracterizado porque el producto de fermentación se selecciona del grupo que consiste de etanol, n-butanol, isobutanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrilico, ácido acético, ácido succinico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacónico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido adípico, un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptofano, treonina y ácido aspártico, el 1.3-propanodiol, etileno, glicerol, un antibiótico de ß-lactama y una cefalosporina, una vitamina, un fármaco, un suplemento para pienso, un agente químico especializado, una sustancia química que puede usarse como materia prima, un plástico, un solvente, un combustible, lo que incluye un biocombustible , un biogás o un polímero orgánico, y una enzima industrial, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidorreductasa, una transferasa o una xilanasa.
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