JP2002533092A

JP2002533092A - セファロスポリンの改良されたｉｎｖｉｖｏ産生

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Publication number: JP2002533092A
Application number: JP2000589724A
Authority: JP
Inventors: ルーロフアリーランスボーフェンベルグ; リシャルトケルクマン; エリッククンヘン
Original assignee: DSM NV
Current assignee: Koninklijke DSM NV
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-21
Publication date: 2002-10-08
Also published as: EP1141372A2; HK1041610A1; AU3042600A; WO2000037671A2; WO2000037671A3; KR20010089672A; CN1331751A

Abstract

(57)【要約】本発明は、エキスパンダーゼ、ヒドロキシラーゼ及びアセチルトランスフェラーゼ活性をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物で形質転換されているP. クリソゲヌム株を、好適なアシル側鎖前駆物質、又はその塩又はエステルの存在下、N-アシル化7-ACA化合物が産性されるように発酵させる工程、このようにして産性されたN-アシル化7-ACA化合物をN-デアシル化する工程及び必要により遊離アミノ基をアシル化し、及び／又は3'アセテート基をセファロスポリン抗生物質を形成するのに適した側鎖で置換してもよい工程を含む7-ACA又はその誘導体の産性方法であって、アセチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列がアクレモニウムクリソゲヌムに由来し、該ヌクレオチド配列に存在するオープンリーディングフレームの第2 ATGで開始することを特徴とする前記方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、エキスパンダーゼ、ヒドロキシラーゼ及びアセチルトランスフェラ
ーゼをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物で形質転換されているP.
クリソゲヌム（chrysogenum）株を、N-アシル化7-ACA化合物が産生されるように
、好適なアシル側鎖前駆物質、又はその塩又はエステルの存在下、発酵させる工
程、このようにして産生されたN-アシル化7-ACA化合物をN-デアシル化する工程
及び必要により遊離アミノ基をアシル化し、及び／又は3'アセテート基をセファ
ロスポリン抗生物質を形成するのに適した側鎖で置換してもよい工程、を含むセ
ファロスポリン、特に7-ACA又はその誘導体の産生方法に関する。

【０００２】セファロスポリンを調製するための半合成ルートは、例えばK.Matsumono, Bio
process. Techn., 16, 67-88 (1993)、J.G.Shewale & H.Sivaraman, Process Bi
ochemistry, August 1989, 146-154、T.A.Savidge, Biotechnology of Industri
al Antibiotics (Ed. E.J.Vandamme) Marcel Dekker, New York, 1984、又はJ.G
.Shewaleら, Process Biochemistry International, June 1990, 97-103に開示
されているような手段で、発酵産物（例えばペニシリンG、ペニシリンV及びセフ
ァロスポリンC）から通常開始し、対応するβ-ラクタム核に変換される。得られ
たβ-ラクタム核は、引き続いて、特にEP 0 339 751、JP 53005185及びCH 640 2
40に記載されているような好適な側鎖とカップリングすることによって所望する
抗生物質に変更される。側鎖とβ-ラクタム核の異なる組合せを作ることにより
、種々のペニシリン及びセファロスポリン抗生物質が得られる。

【０００３】セファロスポリン核7-アミノデスアセトキシセファロスポラン酸（7-ADCA）及
び7-アミノセファロスポラン酸（7-ACA）は、医薬品産業で使用される抗生物質
の産生の最も重要な中間体であることが知られている。セファロスポリン Cは、7-ACAの調製のため、同様にその他の治療上使用され
るセファロスポリンのため、はるかに重要な開始材料である。しかし、セファロ
スポリン CはどのようなpHの水にも非常に可溶性であり、このことは、その産物
から変換されないセファロスポリン Cを除去するために厄介で、高価なカラム法
を使用する、長く、高価な単離方法を意味する。さらに、セファロスポリン Cの
α-アミノアジポイル側鎖は、7-ACAを産生するために必要な酵素的又は化学的切
断を非常に受けにくい。

【０００４】上記欠点の幾つかを克服するために、発酵方法が7-ACAの産生について開示さ
れ、ある種のN-置換セファロスポリンの発酵産生を含み、その側鎖は、簡単な酵
素的又は化学的切断反応によって容易に除去できる。これらのN-置換セファロスポリンの発酵産生（例えばアジポイル-7-ACA）は、
酵素活性デスアセトキシセファロスポリン合成酵素（“エキスパンダーゼ”とし
ても知られる）、デスアセチルセファロスポリン C合成酵素（“ヒドロキシラー
ゼ”）同様にセファロスポリン C合成酵素（“アセチルトランスフェラーゼ”）
を発現することができる組換えペニシリウム（Penicillium）クリソゲヌム株に
よって達成される（EP 0 540 210）。組換えP. クリソゲヌム株を使用するアジポイル-7-ACAのin vivo産生方法にお
いて、アジポイル-7-ACA、アジポイル-7-アミノデスアセチルセファロスポラン
酸（アジポイル-7-ADAC）の前駆物質がアジポイル-7-ACAと比較すると実質的な
量で存在することが観測された。明らかに、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子
は、アジポイル-7-ADACのアジポイル-7-ACAへの実質的な変換を得るのに充分な
量で発現されない。

【０００５】本発明はアセチルトランスフェラーゼ発現構築物を開示し、それは高い発現レ
ベルのアセチルトランスフェラーゼを得るようにデザインされる。この方法にお
いて、増加する量の前駆物質アジポイル-7-ADACはアジポイル-7-ACAに変換され
る。アクレモニウム（Acremonium）クリソゲヌム（cefG）に由来するアセチルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子のクローニング及びヌクレオチド配列を記載する文献は、
アセチルトランスフェラーゼオープンリーディングフレーム（ORF）の第1（EP 0
437 378; Gutierreszら, J.Bacteriol. 174: 3056-3064 (1992)）、第2（Mathi
sonら, Curr Genet. 23: 33-41 (1992)）又は第3 ATG（EP 0 450 758）のいずれ
かで始まるコード配列を開示する。さらに、A. クリソゲヌムでアセチルトラン
スフェラーゼを発現するための種々のプロモーターの効力の研究において、試験
される構築物の1種は、第2 ATGで始まるアセチルトランスフェラーゼコード配列
を含む融合構築物である（Gutierrezら, Apple. Microbiol. Biotechnol. 48:60
6-614 (1997)）。上で引用した文献はいずれも、7-ACA又はその誘導体の発酵産生方法の使用に
ついて、組換えP. クリソゲヌム株において効率的なアセチルトランスフェラー
ゼ発現を得るcefG ORFの特定の開始コドンの選択の利点を開示しない。

【０００６】本発明は、その方法はエキスパンダーゼ、ヒドロキシラーゼ及びアセチルトラ
ンスフェラーゼ活性をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物で形質転換
されているP. クリソゲヌム株を、好適なアシル側鎖前駆物質、又はその塩又は
エステルの存在下、N-アシル化7-ACA化合物が産生されるように発酵させる工程
、このようにして産生されたN-アシル化7-ACA化合物をN-デアシル化する工程及
び必要により遊離アミノ基をアシル化し、及び／又は3'アセテート基をセファロ
スポリン抗生物質を形成するのに好適な側鎖で置換してもよい工程を含む7-ACA
又はその誘導体の産生方法であって、アセチルトランスフェラーゼをコードする
ヌクレオチド配列はA. クリソゲヌムに由来し、該ヌクレオチド配列の第2 AGTで
始まることを特徴とする前記方法を開示する。

【０００７】驚いたことに、A. クリソゲヌムに由来するアセチルトランスフェラーゼコー
ド配列を含む発現構築物は、コード配列がオープンリーディングフレーム（ORF
）の第2 ATGで始まる場合には、該ORFの第1又は第3 ATGで始まる場合よりも効率
良く発現されることが、本発明により見出された。より効率的なアセチルトラン
スフェラーゼ発現の効果の1つは、N-アシル化7-ADAC誘導体がより効率的にN-ア
シル化7-ACA誘導体に変換されることである。本発明の方法において、形質転換されたP. クリソゲヌム株は、3'-アセチル化
セファロスポリン化合物の産生を引き起こすセファロスポリン生合成経路の3種
の酵素活性の発現に使用される。該3種の酵素活性をコードする遺伝子の好適な
ソースは、エキスパンダーゼ遺伝子cefE及びヒドロキシラーゼ遺伝子cefFについ
ての細菌ストレプトミセスグラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）又は
ノカルジアラクタムジェランス（Nocardia lactamdurans）（cefEについてはEP
0 341 892及びcefFについてはEP 0 465 189を参照されたい）又は二官能エキス
パンダー／ヒドロキシラーゼ遺伝子cefEF及びアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子cefGについての菌A. クリソゲヌム（cefEFについてはEP 0 281 391及びCoque
ら, Mol. Gen. Genet. 236:453-458 (1993)及びcefGについてはEP 0 437 378及
びEP 0 450 758を参照されたい）である。

【０００８】本発明に従って、アセチルトランスフェラーゼ酵素活性は、A. クリソゲヌム
から得られるcefG遺伝子によって提供される。特に、本発明は、開始コドンとし
てcefG ORFの第2 ATGを使用することが好適であることを示す。開始コドンとし
てのcefG ORFの第2 ATGの使用は、本発明の方法で使用されるアセチルトランス
フェラーゼ酵素がメチオニン-ロイシン-アルギニン-アスパラギン酸セリンで開
始するN-末端アミノ酸配列を有することを意味する。本発明の方法において、3種の酵素活性エキスパンダーゼ、ヒドロキシラーゼ
及びアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に、問題の遺伝子に由来す
る5'及び3'制御配列を提供してもよく、又は該遺伝子と非相同の制御配列を提供
してもよい。糸状菌宿主細胞における組換え遺伝子発現のために提供する、好適な5'及び3'
制御配列、即ちプロモーター及びターミネーターの例としては、Van den Hondel
ら（in: More Gene Manipulations in Fungi, Eds. Bennett and Lasure, 396-4
27 (1991)）又はApplied Molecular Genetics of filamentous fungi（Kinghorn
, Turner (eds.), Blackie, Glasgow, UK, 1992）が挙げられる。好ましいプロ
モーターは、ACV合成酵素、イソペニシリンNシンターゼ、アシルトランスフェラ
ーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ又は遺伝子Yをコードする遺伝子に由来する
アスペルギルスニゲル（Aspergillus niger）グルコアミラーゼプロモーター又
はP. クリソゲヌムプロモーターである。転写ターミネーターは同様の遺伝子か
ら得ることができる。

【０００９】本発明の一の実施態様において、7-ACA又はその誘導体の発酵産生方法が提供
され、該方法は発現構築物で形質転換したP. クリソゲヌム株の使用を含み、エ
キスパンダーゼ、ヒドロキシラーゼ及び／又はアセチルトランスフェラーゼ活性
をコードする遺伝子のコード配列は、該コード配列と非相同であるプロモーター
配列に融合する。例えば、該非相同プロモーター遺伝子はP. クリソゲヌムに由
来するIPNS（pcbC）プロモーターである。本発明の他の実施態様において、選ばれたプロモーター配列及びエキスパンダ
ーゼ、ヒドロキシラーゼ及び／又はアセチルトランスフェラーゼ活性をコードす
るコード配列の開始コドンとの間の正確な融合は、PCR法を使用して好適に得ら
れる。

【００１０】 P. クリソゲヌム宿主細胞の形質転換は、一般に異なるDNAデリバリー、PEG-Ca
媒介プロトプラスト取り込みに似たもの、電気穿孔法又は粒子銃法によって達成
され、次いで形質転換体が選択される。例えば、Van den Hondel en Punt, Gene
and Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, in:Applied M
olecular Genetics of Fungi（Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, eds.）, Camb
ridge University Press （1991）を参照されたい。優性及び非優性選択マーカ
ーの利用は、記載されている（Van den Hondel, 上述）。相同（P. クリソゲヌ
ム由来）及び非相同（non-P. クリソゲヌム由来）起源の両方の選択マーカーは
記載されている（Goukaら, J. Biotechnol. 20 189-200 (1991)）。ベクター配列の存在下又は非存在下での、形質転換体の選択における、非選択
DNAと物理的に結合した又は結合しない異なる形質転換体選択マーカーの利用は
、相同でも又は非相同でも、当業界でよく知られている。

【００１１】形質転換されたP. chrysogenum株の発酵は、当業界で公知のどんな好適な発酵
培地で行なってもよいが、但し発酵は好適な側鎖前駆物質の存在下で生じる。こ
の点で、好適な側鎖前駆物質は発酵産生されたセフェム化合物のN-アシル側鎖を
導くN-アシル側鎖前駆物質と定義され、該N-アシル側鎖は簡単な化学的又は酵素
的除去を受け入れる。特に、好適な側鎖前駆物質はジカルボン酸であり、より好
適には下記式（1）のジカルボン酸、又はその塩又はエステルである。 HOOC-X(CH₂)_n-COOH （1）（式中、nは少なくとも2の偶数であり、Xは (CH₂)_p-A-(CH₂)_qである（ここで、p
及びqはそれぞれ独立して0、1、2、3又は4であり、AはCH=CH-CH=CH、CH=CH、C≡
C、CHB、C=O、O、S、NH、ここで、窒素は必要により置換されてもよく又は硫黄
は必要により酸化されてもよい、Bは水素、ハロゲン、C_1-3アルコキシ、ヒドロ
キシル又は必要により置換されていてもよいメチルであるが、但しAがCH=CH-CH=
CHである場合p+qは0又は1であり、AがCH=CH又はC≡Cである場合p+qは2又は3であ
り、AがCHB、C=O、O、S又はNHである場合p+qは3又は4である））式（1）の好適な側鎖前駆物質の例としては、アジピン酸、3'-カルボキシメチ
ルチオプロピオン酸（WO 95/04148）、3,3'-チオジプロピオン酸（WO 95/04149
）又はWO 98/48034又はWO 98/48035で提供される側鎖前駆物質が挙げられる。好
ましくは、側鎖前駆物質はアジピン酸又はトランス-β-ヒドロムコン酸である。

【００１２】好適なアシル側鎖前駆物質（例えばアジピン酸）の存在下で発酵により得られ
たN-アシル化7-ACA化合物（例えばアジポイル-7-ACA）は、以下の通常の回収法
（例えば単一溶媒抽出法）によって発酵培地から効率的に回収される。ブロスをろ過し、水と混合することのできない有機溶媒をろ液に加える。pHを
調整して、水層からセファロスポリンを抽出する。pHの範囲は4.5よりも低くな
ければならず、好ましくは4から1の範囲、より好ましくは2から1の範囲である。
この方法において、セファロスポリンは発酵ブロス中に存在するその他の多くの
不純物から分離される。好ましくは、少量の有機溶媒を使用し、セファロスポリ
ンのより濃厚な溶液を与えて体積測定の流速の減少を達成する。第2の可能性は
、4以下のpHで全体のブロス抽出である。好ましくは、ブロスを4から1の範囲のp
Hで水と混合することのできない有機溶媒で抽出する。セファロスポリン分子を害さないすべての溶媒が使用できる。好適な溶媒とし
ては、例えば酢酸ブチル、酢酸エチル、メチルイソブチルケトン、ブタノールの
ようなアルコール等が挙げられる。

【００１３】以下では、セファロスポリンは水で4から10の範囲、好ましくは6から9の範囲
のpHで逆抽出される。また一方で最終体積は減少させられる。回収は0から50℃
の範囲、好ましくは0から10℃の範囲の温度で行なわれる。本発明の方法により産生されたN-アシル化セファロスポリン誘導体は、好適に
は半合成セファロスポリンの化学合成で中間体として使用され、7-アミノ基は好
適なアシル側鎖の存在により充分に保護される。あるいは、このようにして得られたN-アシル化セファロスポリン水溶液を好適
な酵素で処理して、N-アシル（例えばアジポイル）側鎖を除去し、所望する7-AC
Aを得る。好ましくは、繰り返して酵素を利用できるために、固定化酵素が使用される。
そのような粒子の調製及び酵素の固定化のための方法は、Ep 0 222 462に広範囲
に記載されている。水溶液のpHは、例えばpH4からpH9の値を有し、セファロスポ
リンの分解反応を最小限にし、酵素による所望する変換を最適化する。こうして
、例えば無機塩基（例えば水酸化ナトリウム溶液）を添加することによって、又
は陽イオン交換樹脂を利用することによって好適なレベルにpHを維持する間、酵
素をセファロスポリン水溶液に加える。反応が完了したら、固定化酵素をろ過に
より除去する。他の可能性は、固定層カラム又は流動層カラムにおける固定化酵
素の利用であり、又は溶液で酵素を使用して、メンブランろ過により生成物を除
去することである。引き続いて、水溶液のpHは2から5の範囲、好ましくは3から4
の範囲の値に調整される。次いで、結晶性7-ACAはろ過される。

【００１４】好適な酵素は、例えば1つ以上の位置62、177、178及び179における変異を有す
るシュードモナスSY77微生物に由来する。また、その他のシュードモナス微生物
、好ましくは、必要によりシュードモナスSY77における62、177、178及び179位
置に対応する1つ以上の位置における変異を有してもよいシュードモナスSE83に
由来する酵素を使用してもよい。また、脱アシル化は当業界で知られているように（例えば、イミノクロリド側
鎖の形成により）、10℃よりも低い温度でリンペンタクロリド、次いで周囲温度
以下でイソブタノールのようなアルコールを添加することによって、化学的に行
なうことができる。

【００１５】本発明の一の実施態様において、N-アシル化7-ACA誘導体又は脱アシル化後に
得られる7-ACAを含む水溶液は、好適なアセチル化試薬により処理されて、該水
溶液中に存在してもよい任意の(アシル)-7-ADACを対応する(アシル)-7-ACA誘導
体に変換してもよい。例えば、前記アセチル化は、例えばUS 5,221,739に開示さ
れた方法によって無水酢酸を用いて、又は例えばEP 667 396に開示された好適な
リパーゼ又はエステラーゼを用いて行なわれる。次の工程において、本発明の方法によって得られた7-CAC化合物は、種々のセ
ファロスポリン抗生物質、最終産物、同様にその中間体の調製において、開始化
合物として使用される。例えば、任意の好適な側鎖で、通常知られている化学的
又は酵素的カップリング法を用いて、7-ACAの遊離アミノ基をアシル化し、N-ア
シル化7-ACA誘導体を得てもよい。さらに、3'位の置換が生じてもよい。このよ
うにして産生されたセファロスポリン化合物の例としては、セフォタキシム、セ
ファゾリン、セフトリアキソン、セフロキシム、セフプロジル（cefprozil）、
セフタジジム及びセファクロルが挙げられる。

【００１６】実施例１ペニシリウムクリソゲナムにおけるアセチルトランスフェラーゼ発現のための
pICG₁WA、pICG₂WA及びpICG₃WAの構築デスアセチルセファロスポリン C アセチルトランスフェラーゼ（cefG）発現
カセットpICG₁WAは、ペニシリウムクリソゲナムpcbCプロモーター及びpenDEター
ミネーターを含む野生型アクレモニウムクリソゲナムcefG遺伝子を含み、以下に
記載されるように構築した。cefG遺伝子のN-末端部（即ちORFの第1 ATGで開始す
る）は、プライマー＃１及び＃２（それぞれ、SEQ ID NO１及び２）を用いるPCR
反応のA. クリソゲナム染色体DNAに由来した。cefG遺伝子のC末端部は、プライ
マー＃３及び＃４（それぞれ、SEQ ID NO３及び４）を用いるPCR反応の同じテン
プレートに由来した。プライマー＃１及び＃４を用いる融合PCR及びテンプレー
トとしての上記断片化の後、完全なcefG遺伝子（以降、cefG₁遺伝子と示す）が
産生された。ここで内部SfiI及びHindIIIサイトが削除され、新規NsiIサイトが
生成した。

【００１７】次の工程で、pcbCプロモーターの第1部は、プライマー＃５及び＃６（それぞ
れ、SEQ ID NO５及び６）を用いるPCR増幅され、プライマー＃５及び＃４を用い
る融合PCRの後、cefG₁遺伝子の前に直接導入された。PstI/NsiIによる消化の後
、1592bp断片をpISEWA-N（以前にWO98/46772に記載されたベクター）の4.3kb Ps
tI/NsiIベクター断片と結合し、ペニシリウム形質転換ベクターpICG₁WAを得た。 cefG₂遺伝子のN-末端部（即ち、ORFの第2 ATGで開始する）は、pICG₂WAの構築
に必要であり、プライマー＃５及び＃７（SEQ ID NO７）を用いるPCR反応のpICG ₁ WAに由来した。cefG₂遺伝子のC-末端部は、プライマー＃８及び＃９（それぞれ
、SEQ ID NO８及び９）を用いるPCR反応の同じテンプレートに由来した。プライ
マー＃５及び＃９を用いる融合PCR及びテンプレートとして上記断片化の後、完
全なcefG₂遺伝子が産生した。 pICG₃WAの構築のために（cefG遺伝子は第3 ATGで開始する）、pICG₂WAの構築
についての記載と同様の手順を使用した。この構築のために、プライマー＃５／
＃１０（それぞれ、SEQ ID NO５／１０）及び＃１１／＃９（それぞれ、SEQ ID
NO１１／９）を使用した。内部PstI/NcoIサイトによる消化の後、cefG₂/cefG₃融合断片をpICG₁WAのPstI/
NcoIベクター断片と結合させ、ペニシリウム形質転換ベクターpICG₂WA及びpICG₃ WAを得た。

【００１８】実施例２アセチルトランスフェラーゼの発現での異なるATG開始コドン使用の効果異なるpICGWA構築物のNotI消化の後、単離したcefG断片を、EP 635 574に記載
されたようにCa-PEG媒介プロトプラスト形質転換によりP. クリソゲナムに導入
した。使用したP.クリソゲナム株は、P.クリソゲナムpcbCプロモーター及びpenDEタ
ーミネーターの調節下でA.クリソゲナムに由来する二官能エキスパンダーゼ／ヒ
ドロキシラーゼコード配列（cefEF）を含む発現構築物で予め形質転換されてい
る。 P.クリソゲナム形質転換体が唯一の窒素ソースとしてアセトアミドを含む選択
培地で増殖することを可能にするamdS（EP 635 574）で、断片を同時形質転換し
た。選択培地での培養を繰り返すことによって、形質転換体を精製した。さらに
PCRによるcefG遺伝子の存在でスクリーニングするために、単一の好適なコロニ
ーを使用した。さらに、アジポイル-7-ACAを産生する形質転換体の能力を測定す
ることによってcefGの発現のスクリーニングのためにCefGポジティブコロニーを
使用した。この目的のため、WO 95/04149に記載されたように、形質転換体を液体培地に
接種し、生成物試験のために側鎖前駆物質として0.5から3mg/mlのアジピン酸ナ
トリウムで補充した。よく増殖させた培養物のろ液を、アジポイル-7-ACA産物の
HPLC及びNMRによって解析した。表１に示した結果は、第1 ATG（“ATG1”で示さ
れる）又は第3 ATG（“ATG3”で示される）で始まるcefGを含む形質転換体と比
較して、ORFの第2 ATG（“ATG2”で示される）で始まるcefGを含む形質転換体で
増大したアジポイル-7-ACA産物を明らかに示している。

【００１９】表１第1、第2又は第3 ATGで始まるcefGコード配列を組み込むP.クリソゲナム形質転
換体のアジポイル-7-ACA生産力

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ケルクマンリシャルトオランダエヌエル−2042 エヌエルザンドフォールトコニンギンネウェッヒ 12 (72)発明者クンヘンエリックオランダエヌエル−2134 エルデーホーフドルプダッセンボス 167 Ｆターム(参考） 4B064 AH13 CA05 CA19 CC24 DA03

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エキスパンダーゼ、ヒドロキシラーゼ及びアセチルトランス
フェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物で形質転換されてい
るP. クリソゲヌム株を、好適なアシル側鎖前駆物質、又はその塩又はエステル
の存在下、N-アシル化7-ACA化合物が産生されるように発酵させる工程、このよ
うにして産生されたN-アシル化7-ACA化合物をN-デアシル化する工程及び必要に
より遊離アミノ基をアシル化し、及び／又は3'アセテート基をセファロスポリン
抗生物質を形成するのに適した側鎖で置換してもよい工程を含む7-ACA又はその
誘導体の産生方法であって、アセチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオ
チド配列がアクレモニウムクリソゲヌムに由来し、該ヌクレオチド配列内に存在
するオープンリーディングフレームの第2 ATGで始まることを特徴とする前記方
法。
【請求項２】側鎖前駆物質がアジピン酸、3'-カルボキシメチルチオプロ
ピオン酸、3,3'-チオジプロピオン酸及びトランス-β-ヒドロムコン酸からなる
群から選択される請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】側鎖前駆物質がアジピン酸である請求の範囲第１項記載の方
法。