SK280569B6 - Biologický spôsob výroby kyseliny7-aminodeacetylce - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka biologického spôsobu výroby kyseliny

7-aminodeacetylcefalosporánovej a kyseliny 7-aminocefalosporánovej, rekombinantných DNA expresných vektorov a rekombinantných produkčných kmeňov Penicillium chrysogenum na uskutočňovanie tohto spôsobu a použitia rekombinantných produkčných kmeňov.

Doterajší stav techniky

V súčasnosti je známa už štvrtá generácia cefalosporínových antibiotík, ktoré majú nesmierny liečebný význam. Veľké množstvo rôznych bočných reťazcov v bežne používaných a dodávaných cefalosporínoch a veľká hospodárska dôležitosť týchto antibiotík podnecuje snahy dosiahnuť hospodárnejšie a účinnejšie postupy na výrobu kľúčových medziproduktov, z ktorých je potom možné ľahko vyrobiť rôzne druhy cefalosporínov.

Jedným z týchto kľúčových medziproduktov je kyselina 7-aminocefalosporánová, 7-ACA, ktorú je možne vyjadriť nasledujúcim vzorcom

V súčasnosti sa 7-ACA vyrába z cefalosporínu C. Cefalosporín C je fermentačný produkt, ktorý je východiskovou látkou pre takmer všetky bežne dodávané cefalosporíny. Ale syntetické postupy na výrobu rôznych dodávaných cefalosporínov vo väčšine prípadov vychádzajú z kyseliny 7-aminocefalosporánovej, ktorú je najskôr nutné z cefalosporínu C pripraviť odštiepením 7-aminoadipoylového bočného reťazca. Typické bežne dodávané cefalosporíny, ktoré sú takto synteticky odvodené od 7-ACA a ktoré teda majú 3-acetyloxymetylénový bočný reťazec, sú napríklad cefotaxím, cefaloglycín, cefalotín a cefapirín.

Ďalším z kľúčových medziproduktov je kyselina 7-aminodeacetylcefalosporánová, 7-ADAC, ktorú je možné vyjadriť nasledujúcim vzorcom

V súčasnosti je táto látka taktiež vyrábaná z cefalosporínu C odstránením 7-D-alfa-aminoadipoylového bočného reťazca so súčasnou premenou 3-acetyloxymety Iónového bočného reťazca na 3-hydroxymetyl. 7-ADAC je užitočným medziproduktom na výrobu tých cefalosporínových derivátov, ktoré obsahujú modifikované substituenty na uhlíkovom atóme v polohe 3.

V súčasnosti je pri odštiepení 7-aminoadipoylového bočného reťazca metódou voľby chemický postup. Pri základnom iminohalogenidovom postupe je nutné chrániť aminoskupinu a karboxylovú skupinu na 7-aminoadipoylovom bočnom reťazci, bežne sa na tento účel používa niekoľko postupov. Chemické štiepenie, v súčasnej dobe používané, však má niekoľko vážnych nevýhod. Ide o veľastupňový a zložitý postup, pri ktorom je nutné používať veľmi nízke teploty, nákladné reakčné činidlá, pričom vzniká podstatné množstvo vedľajších produktov, ktoré je nutné ďalej spracovať a okrem toho je nutné nečistý vý chodiskový materiál pred chemickým spracovaním čistiť. V dôsledku týchto nevýhod sú stále vyvíjané snahy navrhnúť mikrobiologický alebo fermentačný postup, ktorým by bolo možné dosiahnuť enzymatickú deacyláciu cefalosporínu C tak, aby bolo možné získať kyselinu 7-aminocefalosporánovú hospodárnejším spôsobom než súčasnými chemickými postupmi.

Uvedené snahy nájsť úspešný mikrobiologický postup boli však dosiaľ do značnej miery vynakladané máme. Predpokladalo sa, že bude možné takýto postup uskutočniť vzhľadom na stereochémiu aminoadipoylového bočného reťazca v molekule cefalosporínu C a tiež vzhľadom na to, že penicilín bol úspešne deacylovaný enzymatickým štiepením s použitím enzýmu penicilín acylázy, ktorá je produkovaná celým radom mikroorganizmov. Správy o úspešnosti enzymatickej deacylácie cefalosporínu C v jednom sň pni sú na druhej strane v literatúre často nereprodukova.eľné alebo poskytujú len malé výťažky.

Vynález sa teda týka zvlášť vyriešenia úlohy, ako pripraviť kľúčový medziprodukt 7-ACA a zvlášť, ako ho pripraviť biologickým postupom tak, aby bolo možné hospodá nejšie vyrobiť bežné cefalosporíny.

Ako už bolo uvedené, boli až dosiaľ snahy navrhnúť biologický postup na výrobu 7-ACA z väčšej časti bezvýsledné, zvlášť pokiaľ ide o výrobu tejto látky vo veľkom meradle. Hoci je napríklad možné pripraviť kyselinu 6-aminopenicilanovú, 6-APA, priamou fermentáciou a/alebo enzymatickým spracovaním penicilínu G, takže zostáva expandovať kruh, aby bolo možné pripraviť 7-ADCA, bolo preukázané, že nanešťastie enzýmy Cephalosporium alebo Stí eptomyces, ktorými sa vykonáva za zvyčajných metaboliccých podmienok v týchto mikroorganizmoch expanzia knihu, nespracovávajú 6-APA ako substrát. Tieto enzýmy, ktoré sa v danej oblasti techniky označujú ako DAOCS alebo aj ako expandázy, sú definované ako enzýmy, ktoré kaialyzujú expanziu penamového kruhu, to znamená, štruktúry, ktorá sa nachádza v molekulách penicilínového typu až k cef-3-emovým kruhom, ktoré sa vyskytujú v cefal ísporíne. V priebehu prihlášky budú uvedené enzýmy súhrne označované ako expandázy.

Substrát, ktorý je expandázami spracovávaný, je penicil n N, z ktorého po expanzii kruhu a po hydroxylácii vzniká kyselina deacetylcefalosporánová, DAC. Je len potrebné odštiepiť (D)-alfa-aminoadipoylový bočný reťazec, aby bolo možné získať 7-ADAC, ale práve tento bočný reťazec je nesmieme odolný na enzymatické štiepenie, takže je možné dosiahnuť len neprijateľne nízke výťažky.

Pri postupe, ktorý je podľa vynálezu navrhovaný, je mežné dosiahnuť účinný biologický postup, pri ktorom je produkovaná penicilínová zlúčenina s adipoylovým bočným reťazcom vo vysokom množstve pomocou nového fer nentačného postupu, pričom táto penicilínová zlúčenina je súčasne prijateľným substrátom pre enzým expandázu, který je in situ produkovaný tým istým mikroorganizmom, ktorý produkuje penicilínovú zlúčeninu vzhľadom na to, že bol transformovaný tak, aby pri ňom dochádzalo k expanzii tejto expandázy. Produkovaná expandáza potom expanduje krt h penicilínovej zlúčeniny za vzniku cefalosporínovej zlúčeniny vo vysokých výťažkoch.

Adipoyl-7-ADCA, produkovaná pôsobením enzýmu expandázy in situ má 3-metylový bočný reťazec, zatiaľ čo 7-ACA, ktorá je výsledným produktom, má 3-acetyloxymetylový (-CH₂OC(O)CH₃) bočný reťazec. Aby bolo možné previesť 3-metylový bočný reťazec na 3-acetyloxymetylový bočný reťazec, dochádza podľa vynálezu aj in situ k expresii dvoch ďalších enzýmov okrem expandázy. Ide o hydroxylázu a o acetyltransferázu, oba tieto enzýmy sú

SK 280569 Β6 vytvárané na základe expresie génov, ktorými bol mikroorganizmus, produkujúci penicilínovú zlúčeninu, tiež transformovaný. Enzým hydroxyláza mení 3-metylový bočný reťazec v adipoyl-7-ADCA na 3-hydroxymetylový reťazec a enzým acetyltransferáza mení 3-hydroxymetylový’ bočný reťazec na 3-acetyloxymetylový bočný reťazec 7-ACA.

Je veľmi dôležité, že v poslednom kritickom stupni spôsobu podľa vynálezu je bočný reťazec pôvodnej penicilínovej zlúčeniny, teraz cefalosporínovej zlúčeniny odstrániteľný ďalším enzymatickým systémom v neočakávane vysokom výťažku. Prekvapujúcim výsledkom tohto biologického postupu je teda príprava 7-ACA v neočakávane vysokom výťažku a s dostatočnou hospodárnosťou tak, aby tento postup mohol byť použitý ako alternatívny postup k súčasne používanému chemickému a biologickému spracovaniu.

Nový biologický postup podľa vynálezu je teda jedinečným a prekvapivo účinným postupom na výrobu 7-ACA a je veľmi hospodárnou alternatívou súčasných chemických postupov. Úspešnosť tohto postupu je veľmi prekvapujúca vzhľadom na to, že až dosiaľ boli všetky snahy navrhnúť takýto biologický postup opakovane neúspešné. Napríklad v európskom patentovom spise EP-A-0 422 790 sa opisuje DNA, ktorá je kódom pre izopenicilín N : acyl-CoA-acyltransferázu z Aspergillus nidulans, opisuje sa tiež použitie tohto enzýmu na prípravu cefalosporínu z pliesní, produkujúcich penicilín, tento postup až dosiaľ nebol opísaný. Tento postup je však opisovaný ako porušenie alebo presun génu pre acyltransferázu spolu s pridaním génov, ktoré sú kódom pre enzýmy epimerázu a expandázu z organizmov, produkujúcich cefalosporín. Pri praktickom uskutočnení postupu však nedošlo v dostatočnom stupni ani k transformácii, ani k expresii. Okrem toho, aj v prípade, že by bola transformácia úspešná, bola by stále ešte nedostatočná na účely vynálezu vzhľadom na to, že by stále pretrvával problém, ako odstrániť D-alfa-aminoadipoylový bočný reťazec. Tento nedostatočný pokus na získanie dostatočných výsledkov pri výrobe medziproduktov na výrobu bežných cefalosporínov z kultúr húb, produkujúcich penicilín je v kontraste s výsledkami, ktoré je možné dosiahnuť pri použití spôsobu podľa vynálezu.

Prvým enzymatickým biologickým postupom pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu je expanzia kruhu adipoyl-6-APA, ktorá je vykonávaná enzýmom expandázou, ktorá je produktom expresie génu pre expandázu, ktorým bol transformovaný nerekombinantný hostiteľ P. Chrysogenum. Použitie enzýmu expandázy bolo už doporučené v literatúre. Napríklad v publikácii Cantwell a ďalší, Cuir Genet, 1990, 17:213 až 221, sa doporučuje biologický postup na výrobu 7-ADCA expanziou kruhu penicilínu V s následnou enzymatickou hydrolýzou výsledného deacetoxycefalosporínu V za vzniku 7-ADCA. Uvedený návrh je založený na dostupnosti klonovaného génu pre expandázu penicilínu N (cefE) zo S. clavuligerus podľa publikácií Kovacevic a ďalší, J. Bacteriol., 1989, 171:754 až 760 a Ingolia a ďalší, US 5 070 020. Ale vzhľadom na to, že expandáza pôsobí na penicilín N, to znamená na svoj prírodný substrát, ale nie na penicilín V, je ešte potrebný genetický postup na získanie modifikovaného génu pre expandázu, schopnú spôsobiť expanziu kruhu penicilínu V. Táto požadovaná modifikácia nebola podľa publikácie Cantwell a ďalší dosiahnutá a autorom sa podarila len transformácia Penicillium chrysogenum s použitím génu cefE zo Streptomyces slavuligenus a dosiahnutie úrovne expresie enzýmu expandázy.

Expandázy boli veľmi podrobne v danej oblasti techniky študované a to tak vzhľadom na svoju účinnosť, ako aj pokiaľ ide o genetický reťazec. Napríklad podľa US paten tových spisov č. 4 510 246 a 4 536 476 (Wolfa), boli oddelene izolované enzýmami cykláza, epimeráza a enzýmami kruhu z bezbunkového extraktu prokaryotických organizmov, produkujúcich beta-laktámové zlúčeniny včítane Streptomyces clavuligerus za získania stabilných enzymatických reakčných činidiel. V US patentovom spise č. 5 082 772, ktorému zodpovedá EP-A 366 354 (Dotzlaf) sa opisuje izolovaný a čistený enzým expandáza z S. clavuligerus, ktorého vlastnosti sú plne opísané včítane terminálneho zvyšku a zloženia aminokyselín, pričom sa uvádza molekulová hmotnosť približne 34 600. To je však v kontraste s molekulovou hmotnosťou 29 000, ktorá je pre tento enzým uvádzaná v US 4 536 476. EP-A- 233 715 opisuje izoláciu a restrikčú mapu endonukleáz pre gén pre expandázu, získaný z S. clavuligerus, opisuje sa taktiež expresia DNA kódujúcej rekombinantnú expandázu za dosiahnutia účinnej expandázy pri kmeni S. clavuligerus, ktorý nemá schopnosť produkovať cefalosporín. V US 5 070 020, ktorému zodpovedá EP-A 341 892 (Ingolia a ďalší) sa opisuje reťazec DNA kódujúci enzým expandázu, získaný z S. clavuligerus a súčasne sa opisuje aj transformácia kmeňa P. chrysogenum s použitím vektora na expresiu s obsahom uvedeného reťazca DNA a dosiahnutia expresie enzýmu expandázy. Uvádza sa, že získaný enzým je použiteľný na expanziu substrátov, odlišných od penicilínu N, neuvádza sa však žiadny konkrétny výsledok pokusu o takú expanziu.

Uvedené snahy sa sústredili na enzým expandázu, odvodený od prokaryotického organizmu S. clavuligerus. K expresii enzýmu, ktorý má zrejme rovnakú účinnosť na expanziu kruhu, dochádza aj pri kmeňoch eukaryotického organizmu Cephalosporium acremonium, organizmus sa tiež označuje ako Acremonium chrysogenum. K expresii expandázy pri týchto kmeňoch však dochádza na základe prítomnosti bifúnkčného génu, cefEF, ktorý súčasne zaisťuje expresiu hydroxylázy DACS, ktorej prirodzenou funkciou je premena kyseliny desacetoxycefalosporánovej, DAOC, produktu enzýmu expandázy, na deacetylcefalosporín C, DAC. Výsledkom uvedenej expresie je jediný, ale bifúnkčný enzým, ktorý pôsobí súčasne ako expandáza aj ako hydroxyláza. Boli vyvíjané snahy oddeliť od seba účinnosti týchto dvoch produktov uvedeného génu, ale tieto snahy dosiaľ neboli úspešné. Napríklad v EP-A 281 391 sa opisuje izolácia a identifikácia reťazca génu pre expandázu DAOCS a DACS, získaného z C. acremonium ATCC 11550 spolu so zodpovedajúcim reťazcom aminokyselín tohto enzýmu. Došlo k transformácii kmeňa Penicillium a k expresii uvedených enzýmov, ale nikdy nebol uvedený úspešný výsledok pokusu o premenu penicilínov G a V na zodpovedajúci cefalosporín. Okrem toho cez myšlienku, že by genetickou technikou bolo možné od seba oddeliť genetickú informáciu, ktorá je kódom pre DAOCS od kódovej informácie pre DACS a potom dosiahnuť oddelenú expresiu týchto enzýmov, nikdy nebol uvedený skutočný dôkaz takéhoto rozdelenia.

Enzým DAOCS/DACS, to znamená expandáza a hydroxyláza z C. acremonium bol taktiež v danej oblasti techniky dôkladne preštudovaný a to pokiaľ ide o jeho účinnosť, jeho vlastnosti a jeho genetický reťazec. Napríklad podľa US patentových spisov č. 4 178 210, 4 248 966 a 4 307 192 (Demain) boli rôzne východiskové látky typu penicilínu spracovávané bezbunkovým extraktom C. acremonium, čim došlo k epimerácii a k expanzii kruhu za vzniku cefalosporínového antibiotika ako výsledného produktu. V US 3 753 881 (Wu-Kuang Yeh) sa opisuje enzým z C. acremonium, pokiaľ ide o jeho izoelektrický bod, molekulovú hmotnosť, zvyšky aminokyselín, pomer účinnosti

SK 280569 Β6 hydroxylázy k účinnosti expandázy a tiež peptidové fragmenty týchto enzýmov.

Enzým acetyltransferáza z C. acremonium bol taktiež podrobne opísaný, pokiaľ ide o jeho účinnosť, vlastnosti, mapu s použitím restrikčých enzýmov a reťazce nukleotidov a aminokyselín, výsledky boli uvedené napríklad v EP-A437 378aÉP-A450 758.

Uvedený doterajší stav techniky sa zaoberá len jedným hľadiskom vynálezu, to znamená transformáciou kmeňa P. chrysogenum s použitím génov na expresiu enzýmu expandázy alebo enzýmu expandázy/hydroxylázy, opisuje sa aj pokus na dosiahnutie expresie týchto enzýmov. V doterajšom stave techniky sa však opisuje len použitie enzýmov, ktorých expresia bola dosiahnutá na expanziu kruhu v prípade penicilínu N, ale nie v prípade penicilínu G a V. Ale aj v opísanom prípade má penicilín N v polohe 7 bočný reťazec, ktorý nie je možné odštiepiť enzymatickým spôsobom tak, aby v tejto polohe bola zvyšná voľná aminokyselina. Vynález je však založený na prekvapujúcom zistení, že adipoylový bočný reťazec môže byť s použitím kmeňa P. chrysogenum účinne naviazaný, že je možné použiť enzým expandázu, ktorého expresia sa dosahuje in situ na expanziu kruhu v získanej zlúčenine za vzniku adipoyl-7-ADCA, že enzýmy hydroxyláza a acetyltransferáza, ktorých expresia sa taktiež dosahuje in situ, je možné využiť na získanie 3-acetoxymetylového bočného reťazca 7-ACA s použitím adipoyl-7-ADCA ako substrátu a že je potom možné účinne odštiepiť adipoylový’ bočný reťazec pôsobením ďalšieho enzýmu za vzniku 7-ACA. Aj keď teda je možné v doterajšom stave techniky nájsť rôzne izolované fragmenty poznatkov, ktoré sú základom spôsobu podľa vynálezu, až dosiaľ nebolo nikdy navrhované, že by tieto poznatky bolo možné spojiť na dosiahnutie neočakávaných výsledkov, ktoré je spôsobom podľa vynálezu možné dosiahnuť.

Napríklad výroba kyseliny 6-adipoylpenicilanovej je známa napríklad z publikácie Ballio A. a ďalší, Náture, 1960, L85, 97 až 99. Enzymatická expanzia kyseliny 6-adipoylpenicilanovej, ale len in vitro je taktiež známa napríklad z publikácie Baldwin a ďalší, Tetrahedron, 1987, 43, 3009 až 3014 a EP-A 268 343. Konečne enzymatické odštiepenie adipoylového bočného reťazca je taktiež známe napríklad z publikácie Matsuda a ďalší, J. Bact., 1987, 169, 5815 až 5820.

Adipoylový bočný reťazec má nasledujúcu štruktúru: COOH-(CH₂)₄-CO-, existujú ešte dva ďalšie štruktúrne príbuzné bočné reťazce a to glutarylový reťazec so štruktúrou COOH-(CH₂)₃-CO- a (D)-a-amino-adipoylový reťazec so štruktúrou COOH-CH(NH₂)-(CH₂)₃-CO-. Enzymatické odštiepenie glutarylového bočného reťazca je známe a bolo opísané napríklad v publikácii Shibuya a ďalší, Agric. Biol. Chem., 1981,45,1561 až 1567 a US 3 960 662, ďalej Matsuda aKomatsu, J. Bact., 1985, 163, 1222 až 1228, Matsuda a ďalší, J. Bact., 1987, 169, 5815 až 5820, japonský patentový spis 53-086084 (1978 - Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.) a japonský patentový spis 52-128293 (1977 - Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.). Tiež EP-A 453 048 opisuje spôsob na zlepšenie účinnosti odštiepenia adipoylového reťazca s použitím enzýmu gluotarylacylázy, produkovanej Pseudomonas SY-77-1. Pri náhrade rôznych aminokyselín v určitých polohách v alfa-podjednotke, bolo možné dosiahnuť 3x až 5x vyššiu rýchlosť odštiepenia adipoylovej skupiny z adipoylserínu. Je nutné uviesť, že v EP-A 453 048 sa zjavne opisuje acyláza so zlepšenou účinnosťou k adipoylovým bočným reťazcom, v žiadnom prípade sa neopisuje chemický ani biologický postup, obdobný spôso bu podľa vynálezu, predovšetkým taký, ktorým by bolo možné vytvoriť adipoyl-cefalosporín.

V prípade, že je prítomný (D)-a-ammoadipoylový bočný reťazec, je známe najprv enzymatický odštiepiť aminosk ipinu a skrátiť tento bočný reťazec oxidázou (D)-aminokyselín, takže zostáva glutarylový bočný reťazec GL-7 a tento reťazec sa potom odstráni ďalším enzýmom glutaj ylacylázou. Takýto postup s dvoma stupňami je opísaný v Matsuda, US 3 960 662, EP-A 275 901, japonský patento'ý spis 61-218057 (1988 - Komatsu, Asahi Chemical Industry Co.), WO 90/12110 (1990 - Wong, Biopure Corp.) a El’-A 436 355, Isogai a ďalší, Bio/Technology, 1991, 9, 188 až 191.

Je tiež známe uskutočniť v jednom stupni odštiepenie (Ľ)-a-aminoadipoylového bočného reťazca, zvlášť s použitím rekombinantnej techniky. Tento postup je opísaný napríklad v nasledujúcich publikáciách:

Odštiepenie (D)-a-aminoadipoylového reťazca v jednom stupni:

- Jap. 53-94093 (Meiji, Pseudomonas sp. BN-188),

- Jap. 52-143289 (= US 4 141 790, Meiji, Aspergillus sp.),

- 1JS 4 774 179 (Asji 1988, Pseudomonas sp. SE-83 a SE-4)5), = Jap. 61-21097 a Jap. 61-152286,

- ľr. pat. 2 241 557 (Aries 1975, Bacillus cereus var. fluorescens),

- Jap. 52-082891 (Toyo Jožo 1977, Bacillus megaterium NRRLB 5385),

- HP-A 321 849 (Hoechst, Pseudomonas, Bacillus subtilis, γ-glutamyltranspeptidáza),

- EP-A 322 032, EP-A 405 846 a US 5 104 800 (Merck, Bccíllus megaterium),

- EP-A 283 218 a US 4 981 789 (Merck, Arthrobacter visccsus).

Rekombinantný postup v jednom stupni: Ceph C - 7-/CA:

- Jap. 60-110292 (Asahi 1985, Comamonas, rekombinantný kneňE. coli s génom z Comamonas sp. SY-77-1, premena v ednom stupni),

- lap. 61-152-286 (Asahi 1986, Pseudomonas, rekombinantný kmeň E. coli s génom z Pseudomonas sp. SE83, sú opísané genetické reťazce, postup v jednom stupni už bol medený vUS 4 774 179),

- Jap. 63-74488 (Asahi 1988, Trigonopsis variabilis, Comamonas, rekombinantný E. coli, expresia oxidázy D-a ninokyseliny a acylázy GL-7-ACA ako genetickej konštiukcie),

EP-A-475 652 (Fujisawa, acyláza cefalosporínu C a jej vy roba rekombinantnou technológiou).

V danej oblasti techniky sú taktiež opísané rôzne spôsoby na výrobu 7-ADAC, napríklad v publikáciách US 3 304 236 a 3 972 774 (EH Lilly a Co.), EP-A 454 478 (Shionogi a Co., Ltd.) a vo zverejnenej japonskej patentovej prihláške č. 04 53 499 (Shionogi a Co., Ltd.).

Odkaz na súčasne prejednávanú patentovú prihlášku

V tejto súvislosti je potrebné upozorniť na súčasne prejednávanú US patentovú prihlášku č. 07/933469, podanú 21. augusta 1992, v ktorej sa opisuje biologický postup na výrobu 17-ADCA, spočívajúci v expresii enzýmu expandázy v transformovanom P. chrysogenum a celý biologický p< stup na výrobu 7-ADAC a 7-ACA, tak ako je opísaný v predmetnej prihláške. Ale biologický postup v predmetnej prihláške spočíva ešte v ďalších transformáciách na expresiu ďalších enzýmov tak, že je nakoniec dosiahnutý celkom oelišný rekombinantný metabolický postup, vedúci k odliš ným výsledným produktom, z ktorých žiadny nie je v uvedenej prihláške opísaný.

Aby bolo možné zaistiť lepšie porozumenie spôsobu podľa vynálezu v súvislosti s opísanými postupmi, ktoré boli uvedené v známom stave techniky, sú ďalej uvedené rôzne stupne metabolických postupov, ktoré môžu viesť k získaniu adipoyl-6-ΑΡΑ, adipoyl-7-ADCA, adipoyl-7-ACA, opísané sú taktiež medziprodukty a enzýmy, ktorými je možne transformáciu uskutočniť.

Kyselina L-aKa-am'noadipová +

L-cysteln + L-valin

penicilín G

expandáza penicilínu N

DAOC 3* - hydoxyláza

kyselina

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvorí biologický spôsob výroby kyseliny 7-aminodeacetylcefalosporánovcj, 7-ADAC, spočívajúci v tom, že sa

i) v živnom prostredí, vhodnom pre jeho rast kultivuje produkčný kmeň Penicillium chrysogenum, produkujúci izopenicilín N a k živnému prostrediu sa pridáva adipát, obsahujúci jednu alebo väčší počet zložiek zo skupiny kyselina adipová, jej soli a jej estery, ktoré sú produkčným kmeňom Penicillium chrysogenum asimilované a využívané na produkciu kyseliny adipoyl-6-aminopenicilánovej, adipoyl-6-ΑΡΑ, potom sa ii) vykonávajú in situ expresiou zodpovedajúceho génu nasledujúce enzymatické premeny:

a) je expandovaný in situ kruh adipoyl-6-ΑΡΑ za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminodesacetoxycefalosporánovej, adipoyl-7-ADCA, pôsobením enzýmu expandázy, pričom kmeň P. chrysogenum bol predtým transformovaný DNA kódujúcou enzým expandázu, ktorá je schopná pôsobiť na adipoyl-6-ΑΡΑ ako na substrát, a potom je

b) 3-metylový bočný reťazec vzniknutej adipoyl-7-ADCA in situ hydroxylovaný za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminodeacetylcefalosporánovej, adipoyl-7-ADAC, pôsobením hydroxylázy, pričom kmeň P. chrysogenum bol predtým transformovaný DNA kódujúcou enzým hydroxylázu, ktorá je schopná pôsobiť na adipoyl-7-ADCA ako na substrát, a iii) vzniknutá adipoyl-7-ADAC sa uvedie do styku s adipoylamidázou, čím dôjde k odstráneniu bočného reťazca za vzniku 7-ADAC, ktorá sa izoluje.

Podstatu vynálezu tvorí aj biologický spôsob výroby kyseliny 7-aminoceťalosporánovej, 7-ACA, spočívajúci v tom, že sa

i) v živnom prostredí, vhodnom pre jeho rast pestuje produkčný kmeň Penicillium chrysogenum, produkujúci izopenicilín N a k živnému prostrediu sa pridáva adipát, obsahujúci jednu alebo väčší počet zložiek zo skupiny kyselina adipová, jej soli alebo jej estery, ktoré sú kmeňom Penicillium chrysogenum asimilované a využívané na produkciu kyseliny adipoyl-6-aminopenicilánovej, adipoyl-6-ΑΡΑ, potom sa ii) vykonávajú in situ expresiou zodpovedajúceho génu nasledujúce enzymatické premeny:

a) je expandovaný in situ kruh adipoyl-6-ΑΡΑ za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminodesacetoxycefalosporánovej, adipoyl-7-ADCA, pôsobením enzýmu expandázy, pričom kmeň P. chrysogenum bol predtým transformovaný DNA kódujúcou enzým expandázu, ktorá je schopná pôsobiť na adipoyl-6-ΑΡΑ ako na substrát, a potom je

b) 3-metylový bočný reťazec vzniknutej adipoyl-7-ADCA in situ hydroxylovaný za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminodeacetylceťalosporánovej, adipoyl-7-ADAC, pôsobením hydroxylázy, pričom produkčný kmeň P. chrysogenum bol predtým transformovaný DNA kódujúcou tento enzým, schopný pôsobiť na adipoyl-7-ADCA ako na substrát, a

c) vzniknutá adipoyl-7-ADAC sa in situ acetyluje za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminocefalosporánovej, adipoyl-7-ACA, pôsobením enzýmu acetyltransťerázy, pričom uvedený produkčný kmeň P. chrysogenum bol predtým transformovaný DNA kódujúcou pre enzým acetyltransťerázu, ktorá je schopná pôsobiť na adipoyl-7-ADAC ako substrát, a vzniknutá adipoyl-7-ACA sa uvedie do styku s adipoylamidázou, čím dôjde k odstráneniu adipoylového bočného reťazca za vzniku 7-ACA, ktorá sa izoluje.

Jednotlivé pojmy, tak ako boli použité, majú nasledujúci význam:

7-ACA je kyselina 3-[(acetoyloxy)metyl]-7-amino-8-οχο-5-tia-l -azabicyklo [4.2.0]okt-2-en-2-karboxylová, adipoyl-6-ΑΡΑ je kyselina [2S-(2alťa,5alfa,6beta)]-3,3-dimetyl-7-oxo-6-[(hexán-1,6-dioyl)amino]-4-tia- 1-azabicyklo-[3.2.0]heptán-2-karboxylová, adipoyl-7-ADCA je kyselina 3-metyl-7-[(hexán-l,6-dioyl)-amino]-3-metyl-8-oxo-5-tia-l-azabicyklo[4.2.0]okt-2-en-2-karboxylová a adipoyl-7-ADAC je kyselina 3-hydroxymetyl-7-[(hexán-l,6-dioyl)amino]-3-metyl-8-oxo-5-tia-l-azabicyklo[4.2.0]okt-2-en-2-karboxylová.

Vynález sa zvlášť týka nových biologických postupov na prípravu kyseliny 7-aminodeacetylccfalosporánovej, 7-ADAC a kyseliny 7-aminoceťalosporínovej, 7-ACA, tak ako boli uvedené, v týchto postupoch sa ako adipát výhodne použije disodná soľ kyseliny adipovej a DNA, ktorá obsahuje reťazec kódujúci enzýmy expandázu, hydroxylázu a acetyltransťerázu sa vo všetkých troch prípadoch odvodí od Cephalosporium acremonium, reťazec pre adipoylacylázu je odvodený od čeľade Pseudomonas.

Podstatu vynálezu tvoria aj vektory na expresiu, ktoré obsahujú DNA kódujúcu enzýmy expandázu, hydroxylázu a acetyltransťerázu, odvodené od Cephalosporium acremonium a promótory, ktoré riadia expresiu génov pre tieto enzýmy, vektor zahŕňa plazmidy pPEN/CEPH-1 a pTS-8, ako bude ďalej vysvetlené.

Podstatu vynálezu tvoria aj hostiteľské bunky Penicillium chrysogenum, transformované rekombinantnými DNA expresnými vektormi, ktoré obsahujú DNA kódujúcu enzýmy expandázu, hydroxylázu a acetyltransťerázu, odvodené od Cephalosporium acremonium, a promótor, riadiaci expresiu tejto DNA, pričom promótorm je promótor génu IPNS Penicillium chrysogenum. Vynález sa zvlášť týka hostiteľských buniek Penicillium chrysogenum, transformovaných rekombinantnými DNA expresnými vektormi zahŕňajúcimi plazmidy pPEN/CEPH-1 a pTS-8, ako bude ďalej opísané.

Podstatu vynálezu tvorí aj použitie rekombinantných produkčných kmeňov Penicillium chrysogenum na kultivácii v podmienkach vhodných na expresiu génu, pričom uvedené rekombinantné produkčné kmene sú transformované rekombinantnými DNA expresnými vektrormi obsahujúi imi DNA kódujúcu enzýmy expandázu, hydroxylázu a acetyltransťerázu, odvodenú od Cephalosporium acremonium, a promótor, riadiaci expresiu tejto DNA kódujúcej uvedené enzýmy, ktorý je v podstate promótorom génu IPNS Penicillium chrysogenum.

Podrobnejší opis výhodných uskutočnení

V jednom z výhodných uskutočnení sa vynález týka nového biologického postupu na výrobu kyseliny 7-amino teťalosporánovej 7-ACA a kyseliny 7-aminodeacetylceťafosporánovej, ide o kľúčové produkty na výrobu bežných syntetických ceťalosporínov aje možné ich vyjadriť pomocou nasledujúcich štruktúrnych vzorcov:

COOH COOH

Okrem cefalosporínového jadra je význačnou vlastnosťou 7-ACA jej 7-aminoskupina a jej 3-acetyloxymetylová skupina, často uvádzaná ako 3-acetoxymetylová skupina. 7-ariinoskupina je skupina, ktorú je možné previesť na veľký počet rôznych ďalších ceťalosporínov. 3-acetyloxymetylová skupina sa taktiež často prevádza na iný bočný reťazec za vzniku bežných ceťalosporínov.

7-ACA ako výsledný produkt a adipoyl-7-ACA ako medziprodukt spôsobu podľa vynálezu je možné uviesť do kontrastu s ceťalosporínom C, iným kľúčovým medziproduktom pri výrobe ceťalosporínu, ktorý je možné vyjadriť

COOH

V prípade tohto medziproduktu nie je 7-(D)-alťa-aminoadipoylový bočný reťazec vhodný pre ďalšie syntetické manipulácie a musí byť odštiepený za vzniku požadovanej a prijateľnej 7-aminoskupiny. Nanešťastie je odstránenie uvedeného reťazca veľmi ťažké, a to tak chemickým, ako aj biochemickým spôsobom.

Vysvetlenie skratiek

V priebehu opisu, zvlášť pri opise výhodných uskutočnení sú použité niektoré skratky, ktoré majú nasledujúci význam:

7-ACA kyselina 7-aminoceťalosporánová

7-aDCA kyselina 7-aminodesacetoxyceťalosporánová

6-/\PA kyselina 6-aminopenicilanovej

DAOC kyselina desacetoxyceťalosporánová

DAOCS DAOC-syntetáza

DAC deacetylcefalosporín C

DACS DAC syntetáza

IPNS izopenicilín N syntetáza

Tris tris/hydroxymetyl/aminometán

EDTA kyselina etyléndiamíntetraoctová

DEPC dietylpyrokarbonát

TE pufer tris/EDTA

SSC chlorid sodný a citrát sodný v zmesi ako pufer

SDS dodecylsíran sodný

PEG polyetylénglykol.

Kultúra Pemcillium chrysogenum

V prvom stupni spôsobu podľa vynálezu sa udržuje v živnom prostredí, schopnom udržať jeho rast kmeň Penicillium chrysogenum, produkujúci izopenicilín N, pričom sa k živnému prostrediu pridáva adipát, tvorený kyselinou adipovou, jej soľami a jej estermi v akejkoľvek zmesi, tieto látky sú kmeňom Penicillium chrysogenum asimilované a využívané za vzniku adipoyl-6-ΑΡΑ. Adipát je možné k živnému prostrediu pridávať po jeho naočkovani P. chrysogenom, ale výhodne je tento materiál v živnom prostredí už prítomný v okamihu očkovania.

Aj iné rody než Penicillium, napríklad Aspergillus nidulans a tiež iné organizmy z rodu Penicillium okrem čeľade chrysogenum produkujú izo-penicilín N. Ale historicky boli známym spôsobom na šľachtenie kmeňov vyvinuté kmene s najväčšou produkciou izopenicilínu N práve z čeľade chrysogenum. Z tohto praktického dôvodu je vynález spájaný s kmeňom Penicillium chrysogenum, hoci jeho použiteľnosť v prípade iných čeľadí je zrejmá. Akýkoľvek už uložený kmeň Penicillium chrysogenum alebo akýkoľvek iný verejne dostupný zdroj takéhoto kmeňa je vhodným východiskovým materiálom na vykonávanie spôsobu podľa vynálezu.

Živné prostredie, schopné udržovať rast kmeňa Penicillium chrysogenum, produkujúceho izopenicilín N je bežného typu, tak ako sú tieto prostredia v danej oblasti techniky známe. Je napríklad možné použiť aeróbnu submerznú fermentáciu a živné prostredie vybrať z radu dostupných vhodných prostredí. Typické prostredia obsahujú zdroje uhlíka, ako sú sacharóza, glukóza a škrob, zdroje dusíka, napríklad sójovú múku alebo drvinu, olej z bavlníkových semien, arašidovú múku, rôzne aminokyseliny, ich zmesi a peptóny. Požiadavky na produkciu sú najmä vysoký výťažok a ľahkosť izolácie a výhodným prostredím pre toto použitie môže preto byť napríklad melasa ako zdroj uhlíka a sójová múka a aminokyseliny, ako zdroje dusíka.

K živnému prostrediu sa bežne pridávajú anorganické živné soli, ktoré dodávajú vo forme iónov nasledujúce zložky: sodík, draslík, amónny ión, vápnik, fosfát, sulfát, chlorid, bromid, dusičnan, uhličitan, železité a železnaté ióny, horčík, mangán a podobne. Pre rast, vývoj a metabolizmus Penicillium chrysogenum sú zvyčajne podstatné aj stopové prvky, ktoré je taktiež možné priamo pridávať do živného prostredia, pokiaľ už nie sú prítomné ako znečisteniny iných zložiek živného prostredia.

Kmene Penicillium chrysogenum môžu byť pestované v zariadení s malým objemom, napríklad v trepacích fľašiach s objemom 1 liter tam, kde je potrebné získať len malé množstvá adipoyl-7-ACA a prípadne 7-ACA. V prípade, že je žiaduce získať väčšie množstvo adipoyl-7-ACA, je však nutné použiť fermentačné tanky na fermentáciu vo väčšom meradle, zvyčajne pri submerznej aeróbnej fermentácii.

Na prípravu adipoyl-7-ACA vo veľkom meradle sa spóry Pemcillium chrysogenum udržujú na šikmom agare.

Tieto spóry zo šikmého agaru sa potom použijú na naočkovanie vegetatívneho živného prostredia s malým objemom. Vegetatívne prostredie sa inkubuje za vzniku intenzívne rastúcej čerstvej kultúry mikroorganizmu. Táto kultúra vo vegetatívnej rastovej fáze sa potom použije na naočkovanie veľkého množstva živného prostredia vo fermentačnej produkčnej fáze. V niektorých prípadoch môže byť žiaduce založiť ešte ďalšiu vegetatívnu kultúru ako očkovací materiál pre fermentačné prostredie. Takýto druhý stupeň vegetatívneho živného prostredia sa bežne používa v prípade, že objem fermentačného prostredia je podstatne väčší než objem prvého vegetatívneho prostredia. Postupuje sa teda tak, že sa spóry mikroorganizmu najskôr pestujú v malom vegetatívnom prostredí za získania očkovacieho materiálu pre väčší objem vegetatívneho prostredia. V tomto vegetatívnom prostredí s väčším objemom je potom možné dosiahnuť dostatočnú koncentráciu mikroorganizmu na rýchly začiatok fermentácie vo veľkom meradle vo fermentačnom tanku. Vegetatívne prostredie môže mať rovnaké zloženie ako fermentačné prostredie alebo môže obsahovať ešte ďalšie zložky na podporu rastu a vývoja mikroorganizmu v malom meradle.

Kmene Penicillium chrysogenum, používané na vykonávanie spôsobu podľa vynálezu sa najúčinnejšie pestujú pri teplotách v rozmedzí 20 až 30 °C, optimálne výťažky je možné dosiahnuť pri teplote 22 až 28 °C a zvlášť 25 °C.

K maximálnej produkcii adipoyl-7-ACA dochádza pri pestovaní kmeňa Penicillium chrysogenum v tanku s veľkým objemom počas 10 až 30, výhodne 15 až 25 dní. Ale pri pestovaní v zariadení s menším objemom, napríklad v trepacích fľašiach s objemom 250 ml je rast mikroorganizmu rýchlejší a organizmus produkuje adipoyl-7-ACA v kratšom čase, napríklad v rozmedzí 4 až 15 dní, často 5 až 7 dní.

V prípade, že konečná hodnota pH pri fermentäcii v tanku vo veľkom meradle dosiahne 8,0 alebo ešte vyššiu hodnotu, môže byť nepriaznivo ovplyvnený výťažok adipoyl-7-ACA. V takomto prípade je žiaduce v priebehu fermentácie sledovať pH živného prostredia. V prípade, že sa ukáže, že pH dosiahne uvedené hodnoty pred dosiahnutím maximálnej produkcie adipoyl-7-ACA, je nutné hodnotu pH upraviť pridaním vhodnej kyseliny alebo tlmivého roztoku do fermentačného prostredia.

Produkciu adipoyl-7-ACA je možné sledovať tak, že sa vzorky fermentačného prostredia chromatografujú.

Tak ako tomu je vo väčšine prípadov aeróbnej fermentácie, necháva sa živným prostredím prechádzať sterilný vzduch na dosiahnutie účinnejšieho rastu kmeňa Penicillium chrysogenum a zvýšenej produkcie adipoyl-7-ACA. Objem vzduchu, ktorý prechádza živným prostredím je zvyčajne aspoň 0,2 objemu vzduchu za minútu na jeden objem živného prostredia. Zvýšenie rýchlosti prechodu vzduchu však môže mať často priaznivý vplyv na rýchlosť produkcie adipoyl-7-ACA.

Kmeň Penicillium chrysogenum bude typicky produkovať okrem adipoyl-7-ACA rad vedľajších produktov a metabolitov. Vzhľadom na to, že niektoré z týchto zlúčenín sú labilné v kyslom prostredí, je žiaduce pri izolácii adipoyl-7-ACA z fermentačného prostredia postupovať tak, že sa na celé fermentačné prostredie pôsobí krátky čas kyslým pH tak, aby došlo k rozkladu aspoň niektorých súčasne produkovaných nečistôt. Fermentačný produkt, adipoyl-7-ACA sa potom z filtrovaného takto spracovaného fermentačného prostredia oddelí a pripadne je túto látku možné oddeliť od ďalších zložiek fermentačného prostredia chromatografiou na ionomeničovej živici a v prípade potreby je možné produkt ďalej čistiť pred následným enzymatickým odštiepe ním adipoylového bočného reťazca. Delenie chromatografiou na ionomeniči je možné uskutočniť tiež až po odštiepení bočného reťazca. Jedným z hlavných vedľajších produktov, ktoré spôsobujú ťažkosti pri izolácii, je adipoyl-6-APA, tento vedľajší produkt je možné chemicky alebo enzymaticky rozložiť tak, aby oddeľovanie bolo ľahšie. Na začiatku je možné filtrát fermentačného prostredia predbežne čistiť, čo môže zahrnovať počiatočnú extrakciu organickým rozpúšťadlom, nemiešateľným s vodou, ako je n-butanol alebo amylacetát na odstránenie nečistôt. Extrahované živné prostredie je potom možné ďalej čistiť predbežnou chromatografiou na aktivovanom uhlí.

Pridávanie adipátu

V čase, keď je fermentačná kultúra Penicilliwn chrysogenum pripravená, to znamená pred naočkovaním sa výhodne k ostatným zložkám fermentačného živného prostredia pridá ako substrát adipát. Adipát je prípadne možné pridávať aj určitý čas po naočkovaní fermentačného prostredia, napríklad 1, 2 a/alebo 3 dni po naočkovaní. Adipát je definovaný ako jedna alebo väčší počet zložiek zo skupiny kyselina adipová alebo soli, alebo estery kyseliny adipovej, ktoré môžu byť asimilované a využívané pestovaným kmeňom Penicillium chrysogenum za vzniku adipoyl-6-ΑΡΑ. Kyselinu adipovú, jej soli a jej estery je možné použiť jednotlivo alebo v akejkoľvek kombinácii. Výhodná je disodná soľ, ale použiť je možné aj draselnú soľ a zmesové soli so sodíkom. Použiteľný je metylester uvedenej kyseliny, ale etylester je vo vode nerozpustný. Soľ kyseliny adipovej alebo jej ester musí byť taký, aby mohol byť kmeňom Penicillium chrysogenum asimilovaný a využívaný na produkciu adipoyl-6-ΑΡΑ. Je možné použiť kyselinu adipovú samu osebe, hoci je vo vode nerozpustná, v prípade, že sa za vhodných podmienok pH vytvára asimilovateľná soľ.

Vhodné enzýmy expandáza a/alebo hydroxyláza

Kmeň Penicillium chrysogenum, ktorý bol pestovaný a ktorý je schopný spracovávať uvedený adipát tak, aby bol získaný produkt adipoyl-6-ΑΡΑ, môže byť tiež taký kmeň, ktorý bol transformovaný pomocou DNA kódujúcej enzýmy expandázu a hydroxylázu tak, že v dôsledku tejto expresie dochádza k expanzii kruhu v získanom produkte adipoyl-6-ΑΡΑ in situ za vzniku adipoyl-7-ADCA a súčasne tiež dochádza k premene 3-metylového bočného reťazca na 3-hydroxymetylový reťazec.

Adipoyl-6-APA sa tvorí vnútrobunkovo pri fermentácii Penicillium chrysogenum, pestovaného v prítomnosti adipátu. Pri tejto fermentácii dochádza pri transformovanom kmeni Penicillium chrysogenum in situ tiež k expresii DNA kódujúcej enzýmy expandázu a hydroxylázu a tieto enzýmy spracovávajú adipoyl-6-ΑΡΑ ako substrát, takže dochádza k expanzii kruhu za vzniku adipoyl-7-ADCA a tento produkt je potom hydroxylovaný na adipoyl 7-ADCA, to znamená na kyselinu adipoyl-7-aminodeacetylcefalosporánovú.

Nový biologický spôsob podľa vynálezu v sebe zahrnuje aj premenu kmeňa Penicillium chrysogenum uvedeného typu transformáciou s použitím akejkoľvek DNA kódujúcej enzýmy expandázu a hydroxylázu, v dôsledku jej expresie dochádza in situ k expanzii kruhu v adipoyl-6-ΑΡΑ za vzniku adipoyl-7-ADCA a potom v dôsledku hydroxylácie dochádza k vzniku adipoyl-7-ADAC. To znamená, že pri expresii DNA, ktorá sa použije na transformáciu použitého kmeňa Penicillium chrysogenum musí dochádzať k tvorbe enzýmov, ktoré nielen majú účinnosť enzýmu expandázy, tak ako už bolo opísané v známom stave techniky, to znamená schopnosť expanzie kruhu izopenicilínu N na

DAOC, ale tiež schopnosť expandovať kruh adipoyl-6-APA za vzniku adipoyl-7-ADCA. Okrem toho musí byť enzým hydroxyláza, ktorý sa tvorí v dôsledku expresie DNA, použitej na transformáciu, schopný spôsobiť hydroxy láciu adipoyl-7-ADCA na požadovanú adipoyl-7-ADAC.

Pokiaľ ide o zaistenie účinnosti enzýmu expandázy a hydroxylázy, je možné v rámci spôsobu podľa vynálezu použiť dve rôzne uskutočnenia. V jednom z týchto uskutočnení, ktoré je výhodným uskutočnením, je možné zaistiť funkcie enzýmov expandázy a hydroxylázy pomocou jediného, v podstate bifunkčného génu kmeňa Cephalosporium ac-emonium, ktorým sa transformuje P. chrysogenum. Tento gén, v dôsledku ktorého expresie dochádza spoločne k i vorbe expandázy a hydroxylázy bude ďalej označovaný ako gén pre expandázu/hydroxylázu podľa svojho produktu. ktorým sú enzýmy expandáza a hydroxyláza. V prípade transformácie P. chrysogenum DNA kódujúcou enzýmy expandázu a hydroxylázu z C. acremonium, bude v typických prípadoch expresia uvedenej DNA riadená jediným promótorom, čo je ukazovateľom toho, že prítomný je len jeden gén.

V ďalšom možnom uskutočnení, ktoré je taktiež vhodným uskutočnením, dochádza k transformácii P. chrysogenum ako hostiteľského kmeňa s použitím DNA kódujúcej enzýmy expandázu a hydroxylázu vo forme dvoch odlišných génov na rozdiel od uskutočnenia, kedy je pre oba enzýmy použitý jediný gén. Je nutné uviesť, že oddelené gény pre enzýmy expandázu a hydroxylázu je možné nájsť v prokaryotických mikroorganizmoch, napríklad pri S. clavu'igerus a nie v eukaryotických mikroorganizmoch, ako je C. acremonium, kde je prítomný jediný gén pre oba enzýmy, ako už bolo uvedené.

Sekvencia enzýmu hydroxylázy a prokaryotických orgaiizmov a príslušných nukleotidov, ktoré ju kódujú, boli opísané v publikácii Kovacevic a ďalší, J. Bactcriol., 173(1), 398 až 400, 1991 a EP-A 465 189, opísané sú tiež spôsoby a prostriedky na izoláciu týchto enzýmov. Ako je v da íej oblasti techniky dostatočne známe, je na základe sekve ície pre hydroxylázu možno syntetizovať laboratórnym spôsobom alebo na automatických syntetizátoroch DNA celú DNA kódujúcu enzým hydroxylázu. Túto DNA zlúčeninu alebo obdobné sekvencie, ktoré kódujú rovnakú sekvenciu aminokyselín hydroxylázy alebo fragmenty alebo deriváty tejto sekvencie so zodpovedajúcou hydroxylázovo r účinnosťou je možné použiť ako základ na prípravu rôznych vektorov na klonovanie a na expresiu po kombinácii s promótorom a s ďalšími riadiacimi reťazcami, celú ko tštrukciu je potom možné použiť na transformáciu P. chiysogenum ako hostiteľského organizmu, v ktorom potom dochádza k expresii génu pre hydroxylázu, pomocou ktorého je teda možné uskutočniť spôsob podľa vynálezu. Je tiež možné postupovať tak, že sa DNA použije ako sonda na sériové vyšetrenie knižnice genómu určitého kmeňa, ktc rý potenciálne obsahuje použiteľný enzým hydroxylázu a týmto spôsobom sa identifikuje na základe hybridizácie príslušný homológny reťazec. Účinnosť akéhokoľvek takto identifikovaného enzýmu hydroxylázy je potom možné po vrdiť s použitím adipoyl-7-ADCA ako substrátu pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu s následnou izoláciou získaných produktov tejto hydroxylácie pomocou HFLC.

V prípade, že sa použije toto uskutočnenie spôsobu podľa vynálezu, to znamená expresia génu, ktorý produkuje len enzým hydroxylázu, bude potom potrebné taktiež oddelene použiť ďalšiu DNA so sekvenciou kódujúcou enzým expandázu, takže bude možné transformovať P. chrysogenum vhodným expresným vektorom, ktorý zaistí in situ ex8

SK 28O56‘> B6 presiu génu pre enzým expandázu, takže dochádza k expanzii kruhu pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu.

Ďalšie výhodné uskutočnenia spôsobu podľa vynálezu sú založené na skutočnosti, že na transformáciu nerekombinantného kmeňa P. chrysogenum je možné použiť DNA kódujúcu viac než jednu expandázu a/alebo pre viac než jednu hydroxylázu. V priebehu týchto uskutočnení je potom možné získať zvýšenú účinnosť typu expandázy a/alebo hydroxylázy vzhľadom na zvýšené množstvo bielkoviny enzýmu, k expresii ktorého dochádza.

V odsekoch, týkajúcich sa známeho stavu techniky už bolo uvedené, že bol úplne sekvenovaný expandázový enzým, odvodený od kmeňa Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 a že tento reťazec bol charakterizovaný na základe mapovania reštrikčnými endonukleázami. Ale boli taktiež podané správy o enzýme, ktorý sa zdal byť totožným enzýmom a bol odvodený od S. clavuligerus NRRL 3585. Pri tomto enzýme bola zistená odlišná molekulová hmotnosť, ale sekvencia enzýmu dosiaľ nebola analyzovaná. V uvedených odsekoch pre známy stav techniky je taktiež opísané, že bol sekvenovaný enzým DAOCS/DACS z Cephalosporium acremonium ATCC 11550, ako je uvedené v Samson a ďalší, Bio/Technology (1987) 5 : 1207 až 1214 avEP-A 281 391.

Tieto expandázy, ktoré už boli identifikované a tvoria súčasť známeho stavu technik}', je taktiež možné použiť pri uskutočňovaní nového biologického postupu podľa vynálezu. Môže sa ukázať, že aj iné expandázy, ktoré dosiaľ neboli identifikované a môžu byť odvodené od odlišných kmeňov S. clavuligerus alebo C. acremonium, alebo dokonca od mikroorganizmov celkom odlišných rodov, môžu byť taktiež vhodné na uskutočnenie nového spôsobu podľa vynálezu. Spôsoby identifikácie takýchto nových kmeňov a rodov vhodných mikroorganizmov a spôsobmi izolácie zodpovedajúcich enzýmov typu expandázy, ako ak zistenie, či tieto enzýmy sú vhodné na použitie pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu patria do bežnej praxe v danej oblasti techniky. Sériové vyšetrenie bezbunkových extraktov prípadných nových kmeňov a rodov použiteľných mikroorganizmov je možné uskutočniť pomerne pohodlným a reprodukovateľným spôsobom tak, že sa tieto extrakty pridajú k adipoyl-6-ΑΡΑ ako substrátu v prítomnosti známych kofaktorov DAOCS, ako sú železnaté ióny, askorbát, alfa-ketoglutarát a adenozíntrifosfát, ATP. Adipoyl-6-ATA je možné v dostatočnom množstve pripraviť pridávaním adipátu ako substrátu k netransformovanému Penicillium chrysogenum spôsobom, ktorý bude ďalej podrobnejšie opísaný. Požadovaná expandáza alebo expandáza aj hydroxyláza sú prítomné v tom prípade, že sa začne vytvárať adipoyl-7-ADCA a/alebo adipoyl-7-ADAC, prítomnosť týchto látok je možné ľahko dokázať chromatograficky.

Pri použití známej rekombinantnej techniky je tiež možné vytvoriť sondy DNA na báze nukleotidových reťazcov génov pre expandázy napríklad z .S', clavuligerus a C. acremonium, napríklad na zistenie obsahu DNA vo vyšetrovaných mikroorganizmoch, ktoré by mohli produkovať expandázu, vhodnú na použitie pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu.

Potenciálne zdroje expandázy, hydroxylázy alebo expandázy/-hydroxylázy

Expandázy, ako už bolo uvedené, sú enzýmy, ktoré katalyzujú expanziu penamového kruhu, ktorý sa nachádza v molekulách typu penicilínu na cef-3-emový kruh, ktorý sa nachádza v cefalosporínoch. Akýkoľvek organizmus, produkujúci metabolity s obsahom cefemového kruhu je teda potenciálnym zdrojom DNA kódujúcej expandázu.

Taktiež akýkoľvek organizmus, ktorý produkuje cefalosporín s obsahom 3-hydroxymetylovej skupiny je potenciálnym zdrojom DNA kódujúcej hydroxylázu alebo expandázu/hydroxylázu. Príklady takýchto organizmov budú ďalej uvedené, ide však len o príklady, ktoré v žiadnom zmysle nie sú vyčerpávajúce.

Huby Cephalosporium acremonium Cephalosporium sp.

Emericellopsis Paecilomyces Scopulariopsis Diheterospora Spiroidium Anoxiopsis

Aktinomycéty Streptomyces clavuligerus S. lipmanii

S. wadayamensis

S. todorominensis

S. filipinensis cephamycini

S. heteromorphus

S. panayensis

S. griseus

S. cattleya Nocardia lactamdurans

Iné baktérie Flavobacterium sp. Alcaligenes denitrificans Mycoplana bullata Providencia rettgeri Lysobacter lactamgenus

Expandázy a hydroxylázy, produkované uvedenými organizmami sú zatiaľ len materiálom na ďalšie výskumy a je možné, že len niektoré z nich budú skutočne vhodné na použitie pri vykonávaní nového spôsobu podľa vynálezu.

Izolácia DNA fragmentov kódujúcich expandázu

Hneď ako bol požadovaný enzým expandáza zistený uvedeným spôsobom, je možné použiť známe postupy na izoláciu DNA kódujúcej takýto enzým. Je potrebné skonštruovať sondy DNA na báze známych reťazcov a častí reťazcov génov kódujúcich expandázy, tieto sondy potom budú hybridizovať s DNA kódujúcou požadovaný enzým, ktorú je nutné izolovať. Konštrukcia takýchto sond je založená na znalosti reťazcov aminokyselín a reťazcov nukleotidových báz, ktoré sú sekvenciami kódujúcimi enzým expandázu a tiež na preferenciách kodónov pri určitých mikroorganizmoch. Podrobný opis typického postupu tohto typu, použitého v prípade DNA genónu mikroorganizmu Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 bude ďalej podrobnejšie opísaný.

Izoláciu DNA kódujúcej enzým expandázu je možné uskutočniť s použitím štiepenia reštrikčnými enzýmami s následnou spätnou väzbou, tak ako je to dobre známe v technológii na získavanie rekombinantnej DNA. Je potrebné poznať mapu miest pôsobenia reštrikčných endonukleáz genómu použitého mikroorganizmu tak, aby bolo možné oddeliť a izolovať príslušný reštrikčný fragment. Reštrikčné mapy pre S. clavuligerus a C. acremonium sú už dostupné. V prípade prvého mikroorganizmu sa používajú reštrikčné enzýmy Bam Hl a Sal I a elektroforézou sa potom izolujú požadované fragmenty s veľkosťou 1,8 až 2,5 kb.

SK 280569 Β6

Zdroje enzýmu acetyltransferázy a izolácia fragmentov DNA kódujúcich tento enzým

Klonovanie génov pre DAC acetyltransferázu z C. acremonium je možné uskutočniť podľa dobre známych rekombinantných postupov, ktoré budú teraz všeobecnejšie opísané.

Aby bolo možné klonovať gén pre acetyltransferázu, je najprv nutné vytvoriť mutanty C. acremonium, ktoré nemajú schopnosť premieňať kyselinu deacetylcefalosporánovú, DAC, na cefalosporín C. Tento postup spočíva v tom, že sa bunky kmeňa C. acremonium podrobia pôsobeniu mutagénov, napríklad N-nitrozoguanidínu, NTG, kyseliny dusitej alebo ultrafialového svetla, potom sa kmeň pestuje na vhodnom rastovom prostredí a potom sa napríklad chromatografickým alebo biologickým spôsobom sleduje nahromadenie DAC.

Po identifikácii vhodnej mutanty sa v nasledujúcom stupni na identifikáciu génu kódujúceho acetyltransferázu izoluje DNA kmeňa C. acremonium, ktorý produkuje cefalosporín C. Po odštiepení pôsobením reštrikčnej endonukleázy alebo mechanickým spôsobom sa získajú fragmenty s vhodnou dĺžkou reťazca a gén sa uloží do vektora pre transformáciu, napríklad plazmidu alebo kozmidu, ktorý tiež obsahuje vhodný dominantný značiaci gén, napríklad gén na odolnosť proti hygromycínu alebo proti fleomycínu. Vektor by mal tiež obsahovať reťazce DNA, ktoré môžu uľahčiť nasledujúcu spätnú izoláciu vloženej DNA, napríklad miesta z fágu lambda, ako oblasť cos, ktorá dovoľuje spätnú izoláciu klonovanej DNA in vitro po infekcii E. coli, postup je možné vykonať známym spôsobom.

Protoplasty mutovaného kmeňa, ktorý pôvodne neprodukoval acetyltransferázu sa potom transformujú s použitím vektora s obsahom statických fragmentov DNA genómu a transformované bunky sa podrobia selekcii podľa odolností proti antibiotikám. Transformované bunky je potom možné sledovať na opätovné získanie schopnosti produkcie cefalosporínu C, čo je ukazovateľom úspešnej komplementácie génom pre acetyltransferázu, obsiahnutým vo vektore. Mutanty, ktoré pravdepodobne obsahujú klonované kópie génov, je potom možné pestovať, ich DNA izolovať a izolovať aj DNA z vektora uvedeným spôsobom. Skutočnosť, že vektor obsahuje gén pre acetyltransferázu, je možné potvrdiť subklonovaním v E. coli pri použití štandardných postupov a ľahko dostupných vektorov s následnou retransformáciou mutanty, ktorá neprodukuje acetyltransferázu. Gén je potom možné izolovať, analyzovať jeho reťazec a prípadne ďalej spracovať tak, ako bude ďalej uvedené v príkladoch uskutočnenia s použitím bežne používaných postupov v molekulárnej genetike.

Podľa ďalších postupov, ktoré sú v danej oblasti techniky tiež známe, je možné napríklad podľa publikácie Matsuda a ďalší, izolovať a analyzovať reťazec génu kódujúceho acetyltransferázu z C. acremonium a tiež odvodiť príslušný reťazec aminokyselín enzýmu, ako už bolo opísané v EP-A 450 758. Tieto alternatívne postupy' spočívajú v izolácii enzýmu acetyltransferázy, analýze N-terminálneho reťazca aminokyselín a z tejto informácie sa potom odvodí reťazec nukleotidov kódujúci túto časť reťazca celého enzýmu. Na základe tejto informácie je potom možné skonštruovať sondy, ktoré budú hybridizovať na celý kódujúci reťazec, čo umožní jeho izoláciu.

Transformácia kmeňa Penicillium chrysogenum

Hneď ako sú získané fragmenty DNA kódujúce enzýmy expandázu/ hydroxylázu, expandázu a hydroxylázu a tiež pre acetyltransferázu, je možné tieto fragmenty uložiť do plazmidu alebo do iného vektora na expresiu spolu s ďalšími fragmentárni DNA, ktoré obsahujú reťazce promótora, reťazce na aktiváciu translácie, reťazce na odolnosť ako značiace reťazec, riadiace reťazce, reťazce na tvorbu kozmidov a akékoľvek ďalšie reťazce DNA, ktoré dovoľujú alebo môžu uľahčiť transformáciu a napomáhajú expresii produktov génov alebo môžu uľahčiť izoláciu transformovaných buniek. Vektor na expresiu, ktorý bol takto skonštruovaný, je potom možné použiť na transformáciu kmeňa Peniciliium chrysogenum a na vnútrobunkovú expresiu enzýmov expandázy/hydroxylázy, expandázy, hydroxylázy a acetyltransferázy. Postupy, použité na dosiahnutie transformácie a expresie sú v danej oblasti techniky dobre známe a podrobný opis typického postupu na toto použitie bude ďalej uvedený.

Ako už bolo uvedené, dochádza pri transformovanom kmeni Penicillium chrysogenum k expresii enzýmov expandázy/hydroxylázy, expandázy, hydroxylázy a acetyltransferázy vnútri buniek a potom môže in situ dochádzať v substráte, ktorým je adipoyl-6-ΑΡΑ, k expanzii kruhu za vzniku adipoyl-7-ADCA, táto látka je potom hydrolyzovaná na adipoyl-7-ADAC a tento produkt je potom acetylova tý za vzniku výslednej adipoyl-7-ACA.

Nový transformovaný mikroorganizmus

Špecifické transformanty Penicillium chrysogenum, pri ktorých dochádza k expresii génov kódujúcich enzýmy expandázu/hydroxylázu a expandázu, hydroxylázu a acetyltransferázu, ktoré tvoria výhodné uskutočnenia vynálezu, sú nové, pokiaľ ide o porovnanie s podobnými konštrukciami, ktoré boli už skôr opísané napríklad v publikácii Cantwcll a ďalší, 1990, Current Genetics, 17, 213 až 221 a v nP-A 281 391 a EP-A 437 378. Pri konštrukcii podľa Cantwella je gén pre expandázu zo Streptomyces clavuligeru: vložený pod riadením promótora P. chrysogenum pre izcpenicilín-N-syntetázu, IPNS a tak sa líši od konštrukcie podľa vynálezu tým, že chýba akákoľvek DNA kódujúca enzýmy hydroxylázu alebo acetyltransferázu.

V EP-A 281 391 (Ingolia a ďalší) sa opisujú vektory na transformáciu P. chrysogenum, ktoré obsahujú DNA kódu úcu bifúnkčný enzým expandázu/hydroxylázu C. acremenium, expresia sa dosahuje s použitím promótora IPNS z Pemcillium. V jednej z týchto konštrukcií, pPS62, je gén pri expandázu/hydroxylázu napojený v smere expresie génu a v rámci s génom pre hygromycínfosfotransferázu. Produkt génu, ktorým je zložená bielkovina, hygromycínfosfotransferáza spolu s expandázou/hydroxylázou je teda celkom odlišný od produktu spôsobu podľa vynálezu, v ku rom je enzým expandáza/hydroxyláza v podstate totožný s enzýmom, produkovaným v C. acremonium. Ďalší vektor, ktorý bol opísaný v EP-A 281 391 bol skonštruovaný dlhou sériou molekulových manipulácií včítane použitia syntetických spojovníkov DNA. V konečnej konštrukcii, pPS61 sa využíva fragment Ncol s veľkosťou 1,2 kb z promótora IPNS Penicillium na expresiu génu pre expandá/.u/hydroxylázu a gén pre acetamidázu z Aspergillus nidu.ans sa používa ako značiaci gén na selekciu transformovaných buniek Penicillium. Reťazce kodónov 9 a 10 v géne pri expandázu/hydroxylázu, ktoré sú kódom pre arginín a leucín, sú pozmenené z CGTCTC na CGCCTA, čo nemení výsledný reťazec aminokyselín.

V konštrukcii podľa vynálezu je fragment promótora IPNS po štiepení Ncol s veľkosťou 1,2 kb spojený s génom pre expandázu/hydroxylázu, bez toho aby pri tom došlo k zmenám v prirodzenom reťazci génu pre expandázu/hydrcxylázu. Promótor IPNS, použitý na konštrukciu podľa vynálezu má dva opakujúce sa reťazce štyroch báz v poroi naní s natívnym promótorom, jeden z týchto reťazcov sa nachádza v mieste štiepenia Sali 620 párov báz proti smeru expresie kodónu ATG pre začiatok, druhý z týchto reťazcov sa nachádza v mieste štiepenia enzýmom Xbal 5 párov báz proti smeru expresie kodónu pre začiatok v oblasti 5'-neprenášaného vedúceho reťazca. Tieto zmeny nespôsobujú žiadne ovplyvnenie vysokej úrovne expresie génu pre expandázu/hydroxylázu.

Ďalší rozdiel vo vektoroch spočíva v génoch, použitých na uľahčenie následnej selekcie. Konštrukcie, opísané v EP-A 281 391 používajú na označenie acetamidázu a hygromycín. To znamená veľký rozdiel v porovnaní s vektorom pre transformáciu Penicillium s obsahom génu pre expandázu a hydroxylázu, používaným pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu, pPEN/CEPH-1, ktorý obsahuje ako označenie gén na odolnosť proti fleomycínu. Jeden z kmeňov Penicillium chrysogenum, ktorý· bol transformovaný pomocou vektora pPEN/CEPH-1 a bol schopný expresie génu pre expandázu/hydroxylázu bol označený PC200. Taxonomické vlastnosti tohto kmeňa typicky zahrnujú tvorbu rozširujúcich sa kolónii modrozelenej až zelenej farby so zamatovým povrchom so žltými kvapkami, zadná strana kolónie je žltá a kolónia difunduje do agaru, hlavy konídií sú rozvetvené a všetky ich časti sú hladké, konídie sú vajcovité až guľovité s dĺžkou 3 až 4 mikrometre. Pri pestovaní P. chrysogenum je možné použiť tuhé prostredie, ktoré obsahuje 1,5 % monohydratovanej laktózy, 0,5 % objemových kukuričného výluhu, 0,5 % peptónu, 0,4 % chloridu sodného, 0,05 % síranu horečnatého x 7H₂O, 0,6 % dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,0005 % chloridu železitého x 6H₂O, 0,0002 % síranu meďnatého x 5H₂O a 3,0 % agaru v 1 litri destilovanej vody s pH 4,8. Ak nie je vyslovene uvedené inak, ide vždy o percentá hmotnostné. Opísaný kmeň P. chrysogenum, ktorý bol označený ako PC200, bol uložený do verejnej zbierky kultúr Američan Type Culture Collection, ATCC, 12301 Parklawb Drive, Rockville, Maryland 20852, pod číslom ATCC 74186, kmeň bol uložený dňa 23. septembra 1992.

Druhý nový transformovaný kmeň Penicillium chrysogenum podľa vynálezu, ktorý je schopný produkcie adipoyl-7-ACA je kmeň, pri ktorom dochádza k expresii génu pre expandázu/hydroxylázu aj pre acetyltransferázu po transformácii pomocou jediného vektora pTS-8, ktorý obsahuje DNA kódujúcu oba tieto enzýmy. Uvedený vektor sa však líši od vektorov pre transformáciu Penicillium, tak ako sú uvedené v EP-A 437 378, ktoré obsahujú DNA kódujúcu len acetyltransferázu C. acremonium alebo v spojení s reťazcom DNA kódujúcim mutant polypeptidu expandázy/hydroxy!ázy. V konštrukcii pTS-8 sú gény pre expresiu expandázy/hydroxylázy a acetyltransferázy vždy pod pôsobením oddelených kópií promótora IPNS P. chrysogenum a tretia kópia promótora IPNS je použitá na uskutočnenie transkripcie génu na odolnosť proti fleomycínu, ktorý· je určený ako značenie na uľahčenie selekcie.

V ďalšom možnom uskutočnení vynálezu je možné gény pre expandázu/hydroxylázu a pre acetyltransferázu uložiť do oddelených vektorov a použiť v hostiteľskom kmeni Penicillium postupne. Poradie, v ktorom sa ukladajú fragmenty DNA kódujúce enzýmy expandázu/hydroxylázu a pre acetyltransferázu je dôležité len z praktického hľadiska. Výhodne sa postupuje tak, že sa najskôr uloží gén pre enzýmy expandázu/hydroxylázu a potom sa kmeň Penicillium transformuje génom pre acetyltransferázu vzhľadom na to, že ide o poradie, v ktorom jednotlivé enzýmy spracovávajú substrát in vivo. To znamená, že takto transformovaný organizmus je potom možné sledovať na expresiu génu pre expandázu/hydroxylázu sledovaním produkcie adipoyl-7-ADAC. Táto zlúčenina je potom substrátom pre enzým acetyltransferázu a expresiu génu kódujúceho acetyltransferázu, je teda možné preukázať na základe produkcie adipoyl-7-ACA. Použitím vhodnej skúšky in vitro na acetyltransferázu je možné transformovať kmeň Penicillium najskôr génom pre acetyltransferázu, expresiu tohto génu preukázať skúškou in vitro a potom až uložiť gén pre expandázu/hydroxylázu. Každý z oboch uvedených postupov teda predstavuje vhodné uskutočnenie spôsobu podľa vynálezu na prípravu 7-ACA.

Vo výhodnom uskutočnení je však možné vložiť reťazce kódujúce všetky tri enzýmy súčasne s použitím konštrukcie jediného vektora vo forme plazmidu, ktorý obsahuje reťazce kódujúce tak expandázu/hydroxylázu, ako aj acetyltransferázu C. acremonium. Kmeň Penicillium chrysogenum, transformovaný takýmto vektorom vo forme plazmidu, označeným ako vektor pTS-8 bol identifikovaný ako PC300. Pri tomto kmeni dochádza tak k expresii génu pre expandázu/hydroxylázu, ako aj k expresii génu pre acetyltransferázu. Taxonomické vlastnosti tohto kmeňa sú obdobné ako vlastnosti uvedeného kmeňa PC200. Prijateľné podmienky pestovania pre PC300 sú rovnaké ako podmienky, ktoré boli uvedené na pestovanie PC200. Kmeň P. chrysogenum, označený ako PC300, bol uložený do verejnej zbierky kultúr Američan Type Culture Collection ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 pod číslom ATCC 74187, kmeň bol uložený 23. septembra 1992.

Špecifický kmeň Penicillium chrysogenum transformovaný vektorom pPenFTSO na expresiu génu pre expandázu S clavuligerus, ktorý predstavuje výhodné uskutočnenie vynálezu, je nový v porovnaní s opísanými konštrukciami, tak ako boli opísané napríklad v publikácii Cantwell a ďalší, 1990, Current Genetic., 17, 213 až 221. V oboch konštrukciách sa používa vyvolanie mutácie in vitro na spojenie promótora s génom pre expandázu. V Cantwellovej konštrukcii dochádza pri manipulácii k zavedeniu miesta pôsobenia pre Ndel v kodóne ATG génu pre expandázu, ktorý je naviazaný na miesto pôsobenia Xbal na 3'-zakončenie promótora IPNS s použitím spojovníka Xbal/Ndel. V konštrukcii podľa vynálezu je vytvorené miesto pôsobenia Ncol v kodóne ATG génu pre expandázu s väzbou na miesto pôsobenia Ncol na 3'-zakončenie spojovníka IPNS. Týmto spôsobom dochádza k vytvoreniu nasledujúcich reťazcov, susediacich v týchto konštrukciách s miestom spojenia príslušného promótora a génu:

Xbal Ncol

IPNS promótor	5'	TCTAGACACATGG	3'	reťazec č. 1
Strep. expandáza	5'	GTGAGAGTTGATGGAC	3'	reťazec č.2
Cantwell	5’	TCTAGACACTATGGAC	3'	reťazec č. 3
podľa vynálezu	5'	TCTAGACACCATGGAC	3’	reťazec č.4

V Cantwellovej konštrukcii je jeden zvyšok C nahradený zvyškom T, zatiaľ čo pri konštrukcii podľa vynálezu je uvedený zvyšok C zachovaný. To znamená, že reťazec promótora IPNS, ktorý bezprostredne susedí s kodónom ATC pre začiatok presne zodpovedá reťazcu v prírodnom géne IPNS. Je možné, že promótor, ktorý bol skôr používaný, hoci sa líšil len jedinou nukleotidovou bázou, mohol viesť k nižšej účinnosti translácie a v dôsledku toho aj k nižšej úrovni expresie génu pre expandázu.

Ďalšie rozdiely je možné nájsť v oblasti promótora alebo génu, ktorý je do konštrukcie vložený. Cantwellova konštrukcia obsahuje oblasť 5' BamHI až Xbal 3' promótora IPNS, zatiaľ čo vektor podľa vynálezu obsahuje oblasť 5' Ncol až Ncol 3' podľa Diez a ďalší, 1990, J. Biol. Chem., 265, 16358 až 16365. To znamená, že sa v Cantwellovej konštrukcii nachádza na 5'-zakončeni promótora IPNS približne 250 prídavných báz. Táto oblasť sa však nachádza v

SK 280569 Β6 otvorenom čítacom rámci génov pre syntetáz.u ACV proti smeru translácie génu IPNS.

Cantwellova konštrukcia obsahuje aj gén zo Slreptumyces od ATG do miesta BamHI 3' génu, zatiaľ čo vektor podľa vynálezu obsahuje ATG v bezprostrednom susedstve miesta Sali 3' génu podľa Kovacevic a ďalší, 1989, J. Bacteriol., 171, 754 až 760. To znamená, že Cantwellova konštrukcia obsahuje na 3'-zakončení reťazca približne 1000 párov báz navyše. Konštrukcia podľa vynálezu stále ešte obsahuje oblasť génu pre expandázu proti smeru jeho translácie v susedstve miesta BamHI 5' ATG, táto oblasť je však oddelená od čítacieho rámca génu pre expandázu promótorom IPNS.

Ďalší rozdiel v konštrukcii pPenFTSO podľa vynálezu v porovnaní so známymi konštrukciami sa týka použitého označenia pre selekciu. Použitie promótora IPNS z Penicillium a spojenie s génom na odolnosť proti fleomycínu v konštrukcii podľa vynálezu dovoľuje selekciu na integráciu mnohopočetných kópií alebo integráciu v miestach, ktoré dovoľujú vysokú úroveň expresie, takže môže vzniknúť väčší počet transformovaných buniek, pri ktorých dochádza k vysokej úrovni expresie génu pre expandázu.

Odštiepenie adipoylového bočného reťazca

Posledným stupňom nového biologického postupu podľa vynálezu je odštiepenie adipoylového bočného reťazca z adipoyl-7-ADAC alebo z adipoyl-7-ACA, tento postup znamená nutnosť spracovania produktu z predchádzajúcich stupňov enzýmom adipoylamidázou. Ako už bolo uvedené, je jednou z podstatných výhod spôsobu podľa vynálezu možnosť uskutočniť všetky stupne, vedúce k tvorbe adipoyl-7-ADAC a adipoyl-7-ACA v jedinej fermentačnej kultúre. Týmto spôsobom je možné dosiahnuť výnimočne vysokú účinnosť vzhľadom na to, že nie je nutné izolovať a čiastočne čistiť medziprodukty stupeň po stupni. V poslednom stupni však nie je prítomný enzým adipoylamidáza vzhľadom na to, že nebol vytvorený in situ v pôvodnej fermentačnej kultúre prirodzenou ani rekombinantnou expresiou génov P. chrysogenum.

V prípade, že nový biologický postup podľa vynálezu je vykonávaný po vsádzkach, bude nevyhnutné izolovať a čiastočne čistiť produkt z prvého stupňa, už boli opísané predbežné postupy na tento účel.

Spôsob podľa vynálezu je však možné vykonávať akýmkoľvek spôsobom, pri ktorom sa účinne dostáva do styku adipoylamidáza s adipoyl-7-ADAC alebo adipoyl-7-ACA tak, že môže dôjsť k enzymatickej premene tejto zlúčeniny na 7-ADAC alebo 7-ACA. Ide teda o uvedenie do styku v najširšom zmysle. Je možné použiť bezbunkové živné prostredie s obsahom surových produktov adipoyl-7-ADAC alebo adipoyl-7-ACA a toto prostredie spracováva po jednotlivých vsádzkach pomocou surového prostredia s obsahom adipoylamidázy. Tento postup je pomerne účinný vzhľadom na to, že nemusí byť vykonané počiatočné čistenie reakčných zložiek. Sú však možné určité modifikácie. Je napríklad možné reakčné zložky predbežne čistiť do akéhokoľvek požadovaného stupňa pred vzájomným uvedením do styku. Je tiež možné vykonávať spôsob kontinuálne a nie po vsádzkach. Vlastný styk reakčných zložiek môže byť modifikovaný rôznym spôsobom na dosiahnutie lepšieho priebehu postupu. Je napríklad možné použiť imobilizovaný enzým, napríklad vo forme stĺpca, ktorý obsahuje adipoylacylázu a potom je možné nechať prechádzať stĺpcom adipoyl-7-ADAC alebo adipoyl-7-ACA. Imobilizovaný enzým je tiež možné pridať k roztoku adipoyl-7-ADAC alebo adipoyl-7-ACA vo forme suspenzie. Imobilizovaný enzým poskytuje výhodu ľahkej spätnej izolácie enzýmu a jeho opakovaného použitia. Ďalším príkladom technológie môže byť reaktor, opatrený membránou. Najvýhodnejším postupom pre styk s reakčnými zložkami je však stĺpec s imobilizovaným enzýmom.

Acipoylamidázy, vhodné na štiepenie Existuje rad enzýmov so známou špecifickosťou pre adipoylové bočné reťazce. V nasledujúcich príkladoch budú
uvedené výsledky,	ktoré boli získané s	bežne dodávanými
ad poylamidázami (RAEV Corp.). V literatúre sa uvádza ešte sedem ďalších enzýmov, schopných odstrániť adipoy-
lové bočné reťazce	z molekúl cefalosporínového typu. Šesť
z týchto siedmich enzýmov je z rodu Pseudomonas a siedmy z rodu Bacillus. Medzi enzýmami zo Pseudomonas sú niektoré podobnosti, všetky sa však fyzikálne/biologicky trochu líšia. Ďalej budú uvedené niektoré ich vlastnosti.
Enzým	Literárny údaj	Približná
(Kmene Pseudomonas		mol. hmotnosť
a BadHus)		(podjednotka)
F. SY-77-1	Shibuyaaďalší,	javí sa rovnaká
( oyo JOŽO)	(1981)	ako pre GK16
F.GK16	Matsuda, Komatsu	16 000
(/ksahi)	(1985)	54 000
F.SE83 (acyl)	Matsuda a ďalší	38 200
(Asahi)	(1987)	19 900
F-SE83 (acyll)	Matsuda a ďalší,	25400
(Asahi)	(1987)	58 200
F diminuta N176	Aramori a ďalší,	58 000
(Fujlsawa)	(1991a)*	26 000
F. diminuta V22	Aramori a ďalší,	?
(PuJIsawa)	(1991a)*	?
BadHus latemspo·	Aramori a ďalší,	70 000
n is Jl (Fujisawa)	(1991b)**	(monoméme)
Pseudomonas sp.		16000
(RAEV Corp.)		54 000

* Aramori a ďalší, J. Ferment. Bioeng., 1991, 72:232 až 243 ** Aramori a ďalší, J. Bacteriol., 1991, 173:7848 až 7855.

Všetky uvedené adipoylamidázy je možné použiť pri novom biologickom postupe podľa vynálezu. Ďalšie adipoylamidázy, použiteľné pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu je možné ľahko zistiť tak, že sa prípadné enzýmy skúšajú na adipoyl-7-ACA a dipoyl-7-ADAC ako na substrite. Pozitívny výsledok je teda dôkazom, že uvedený enzým je skutočne možné pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu použiť. Substrát je možné pripraviť reakciou anhydridu kyseliny adipovej so 7-ACA s použitím modifikácie polľa publikácie Szewczuk a Wellman-Bednawska, Clin. Chim. Acta, 1978, 74, 19 až 26. Je tiež možné upraviť postup, opísaný v Agric. Biol. Chem., 1981, 45(7), 1561 až 1557 na prípravu glutaryl-7-ACA. Anhydrid kyseliny adipovej je možné pripraviť podľa publikácie Albertson a Lundmark, J. Macromol, Sci. Chem., 1990, A27, 397 až 41l. Substrát 7-ACA je dostupný z radu bežných zdrojov, včítane Sigma Chemical Co.

V prípade, že je potrebné rýchle sériovo vyšetriť rad enzýmov s použitím kolorimetrických postupov, je možné

SK 280569 Β6 namiesto adipoyl-7-ACA použiť kolorimetrický substrát, napríklad adipoyl-PABA, kyselinu paraaminobenzoovou alebo adipoyl-pNA, paranitroanilín. Postup je potom možné upraviť podľa postupu, opísaného pre gamma-glutamyl PABA v publikácii Szewczuk a ďalší, Clinica Chimica Acta, 84, 1987, 19 až 26. Odštiepením bočného reťazca vzniká sfarbenie, ktorého prítomnosť a koncentráciu je možné stanoviť s použitím kolorimetra. Podrobnejšie informácie o tejto metóde aj o ďalších vhodných postupoch je možné nájsť v publikácii Marelli L. P., 1968, J. Pharm. Sci., 57:2172 až 2173, Szasz G., 1969, Clin. Chem., 15, 124 až 136, Szewczuk A. a ďalší, 1980, Anál. Biochem. 103, 166 až 169 a Reyes F. a ďalší, 1989, J. Pharma. Pharmacol., 41, 136 až 137.

Bolo uskutočnené porovnanie N-terminálneho reťazca aminokyselín v enzýme RAEV s veľkými podjednotkami enzýmov acyll a GK16 z uvedenej tabuľky. Výsledky tohto porovnania sú ďalej uvedené, pričom zvyšky v zátvorkách označujú zvyšky, ktoré pravdepodobne nie sú rozhodujúce.

RAEV - reťazec č. 5:

(S) N (S) (G) A V APGKTANGNAL(L)LQN(P)

GK16 - reťazec č. 6:

SNSWAVAPGKTANGNALLLQNP acyll - reťazec č. 7: SNNWAVAPGRTATGRPILAGDP

V uvedených reťazcoch je zrejmé, že všetky tri peptidy sú príbuzné. Ale bielkovina s N-terminálnym reťazcom, podobným uvedeným reťazcom nemusí mať nevyhnutne účinnosť adipoylamidázy, tak ako je tomu v prípade acylázy penicilín G, ktorá je produkovaná kmeňom Arthrobacter. Na druhej strane existujú adipoylamidázy, použiteľné pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu, pri ktorých nie je možné dokázať významnú homológiu s uvedenými Ntermi-nálnymi reťazcami. Napríklad acylázy acyl (Asahi) a B. laterosporus Jl (Fujisawa) z uvedenej tabuľky, ktoré majú určitú účinnosť pri odštiepení adipoylového reťazca z adipoyl-7-ACA, nemajú žiadnu homológiu reťazca s ostatnými uvedenými enzýmami. Je teda zrejmé, že pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu je použiteľnosť adipoylamidázy v poslednom stupni nového postupu určovaná len tým, či enzým je schopný odštiepiť adipoylový bočný reťazec z adipoyl-7-ACA, čo je možné ľahko uskutočniť, ako už bolo uvedené.

Praktické uskutočnenie vynálezu bude vysvetlené nasledujúcimi príkladmi, ktoré však nemajú slúžiť na obmedzenie rozsahu vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Podmienky pestovania Penicillium chrysogenum

Kmene Penicillium chrysogenum, použité pri týchto postupoch boli udržované na platniach, obsahujúcich prostredie LCSB, ktoré obsahovalo 1,5 % monohydratovanej laktózy, 0,5 % objemových kukuričného výluhu, 0,5 % peptónu, 0,4 % chloridu sodného, 0,05 % síranu horečnatého x 7H₂0, 0,06 % dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,0005 % chloridu železitého x 6H₂O, 0,0002 % síranu meďnatého x 5H₂O a 3,0 % agaru v 1 litri destilovanej vody s pH 4,8. Všetky percentuálne údaje sú hmotnostné, ak nie je uvedené inak. Po 12 dňoch pestovania pri teplote 25 °C pri relatívnej vlhkosti 65 % boli jednotlivé kolónie oddelené a pridané do 2 ml sterilizovanej vody v skúmavke so skrutkovacím vekom, obsahujúcej sklenené gulôčky. Po rozrušení kultúry homogenizáciou bola suspenzia použitá na naočkovanie takzvaných ryžových fľaši. Tieto fľaše obsahovali pri objeme 250 ml celkom 25 g prírodnej dlhozmnej ryže IJncle Ben's, ktorá bola vopred 7 minút premývaná tromi až štyrmi objemami destilovanej vody za premiešavania každých 30 sekúnd a potom bola uložená na sito na tak dlho, až voda, zadržaná v ryži predstavovala približne 25 %. Po 12 dňoch pri teplote 25 °C a relatívnej vlhkosti 65 % boli spóry z ryže vymyté s použitím 50 ml sterilnej vody. Suspenzia spór bola potom použitá na naočkovanie kvapalných kultúr a časť kultúry bola taktiež lyofilizovaná a potom skladovaná pri teplote 4 °C. Postup bol uskutočnený tak, že spóry boli zmiešané s rovnakým objemom 5 % odstredeného mlieka a zmes bola lyofilizovaná v sterilných ampulkách.

Na produkciu penicilínov alebo na produkciu mycélia ako zdroja RNA alebo DNA, bola použitá fermentácia kmeňa v dvoch stupňoch v trepacich fľašiach. Očkovací stupeň bol začatý pridaním 1 x 108 spór do fľaše s objemom 500 ml, obsahujúcej 50 ml živného prostredia, obsahujúceho 3,0 % glukózy, 1,0 % pharmamédia, 3,0 % objemových kukuričného výluhu, 0,2 % síranu amónneho, 0,5 % uhličitanu vápenatého, 0,05 % bezvodého dihydrogenfosfátu draselného, 1,0 % laktózy a 1,0 % primárnych sušených kvasníc v 1 litri destilovanej vody. Všetky percentuálne údaje sú hmotnostné, ak nie je uvedené inak. Zmes bola inkubovaná pri teplote 25 °C a relatívnej vlhkosti 65 % na rotačnej trepačke s výkyvom 70 mm pri 220 ot/min. Po 48 hodinách inkubácie bolo začaté produkčné pestovanie prenesením 2 ml vegetatívneho očkovacieho materiálu do fľaše s objemom 500 ml a s obsahom 35 ml živného prostredia s nasledujúcim zložením: 0,05 % dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 % síranu draselného, 1,0 % síranu amónneho, 12,0 % laktózy, 2,75 % pharmamédia, 1,0 % zrazeného uhličitanu vápenatého, 1,0 % objemových oleja v 1 litri destilovanej vody s pH 6,6. Všetky percentuálne údaje sú hmotnostné, ak nie je uvedené inak. Po sterilizácii v autokláve, ale pred naočkovaním bol pridaný ešte sterilný 25% adipát sodný pri pH 6,6 tak, aby konečná koncentrácia adipátu sodného bola 2,5 % hmotnostných. Potom bola kultúra inkubovaná za rovnakých podmienok ako očkovacia kultúra 5 až 7 dní.

V prípade, že má byť získané mycélium a protoplasty na transformáciu alebo ako zdroje DNA, je vhodné kmeň pestovať vo fľašiach s objemom 250 ml s obsahom 50 ml úplného prostredia CM so zložením: 50 ml 20 x Clutterbuckových solí (120 g Na₂NO₃, 10,4 g KC1, 10,4 g MgSO₄ x 7H₂O, 30,4 g KH₂PO₄), 2,0 ml Vogelových stopových prvkov (0,3 M kyselina citrónová, 0,2 M ZnSO₄, 25 mM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂ x 6H₂O, 10 mM CuSO₄ . 3 mM MnSO₄, 8 mM kyseliny boritej a 2 mM Na₂MoO₄ x 2H₂O), 5 g tryptónu, 5 g extraktu z kvasníc a 10 g glukózy v 1 litri destilovanej vody. Kultúra bola inkubovaná pri teplote 25 °C na rotačnej trepačke pri 220 ot/minútu.

Príklad 2

Pestovanie Cephalosporium acremonium

Kmene C. acremonium boli udržované na šikmom agare, ktorý obsahoval úplné živné prostredie so zložením: 20 g sacharózy, 20 g agaru, 4 g peptónu, 4 g extraktu z kvasníc, 3 g dusičnanu sodného, 0,5 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g hydrogénfosforečnanu draselného, 0,5 g chloridu draselného, 0,5 g síranu horečnatého x 7H₂O, 0,01 g síranu železnatého x 7H₂O v 1 litri destilovanej vody s pH 6,6. Po 10 dňoch rastu pri teplote 28 °C a

SK 280569 Β6 relatívnej vlhkosti 66 % bolo k šikmému agaru pridaných 6 ml sterilizovanej vody a kultúra bola z povrchu agaru zoškrabaná. Výsledná suspenzia bola prenesená do sterilnej skúmavky so skrutkovacím uzáverom, obsahujúcej sklenené guľôčky. Po homogenizácii niekoľko minút bolo 3,5 ml výslednej suspenzie použitých na naočkovanie kvapalných kultúr. Suspenzia bola tiež použitá na získanie lyofilizovanej kultúry na skladovanie pri teplote 4 °C. Suspenzia kultúry pritom bola odstredená, usadenina bola znova uvedená do suspenzie v 5% odstredenom mlieku a podiely získanej suspenzie boli lyofilizované v sterilných ampulkách.

Na produkciu cefalosporinu a tiež na produkciu mycélia ako zdroja DNA a RNA bola použitá fermentácia kmeňov v dvoch stupňoch v trepacích fľašiach. Očkovacia kultúra bola založená pridaním očkovacieho materiálu do fliaš s objemom 250 ml, obsahujúcich 15 ml živného prostredia s nasledujúcim zložením: 5 g glukózy, 40 g sacharózy, 30 g kukuričného škrobu, 50 g repnej melasy, 65 g sójovej múky, 15,8 g síranu vápenatého x 2H₂O, 8 g octanu amónneho, 5 g zrazeného uhličitanu vápenatého, 7,5 g síranu amónneho, 3,5 g síranu horečnatého x 7Π₂Ο, 1 g dihydrogenfosforečnanu draselného a 0,15 ml sójového oleja v 1 litri destilovanej vody pri pH 6,2. Kultúra bola inkubovaná pri teplote 25 °C a relatívnej vlhkosti 65% na rotačnej trepačke s výkyvom 70 mm pri 220 ot/min. Po 96 hodinách inkubácie sa začala produkcia kultúry prenesením 2 ml vegetatívneho očkovacieho materiálu do fľaše s objemom 250 ml a s obsahom 15 ml čerstvého uvedeného živného prostredia. Inkubácia potom bola vykonávaná ďalších 96 hodín za rovnakých podmienok.

V prípade, že je potrebné získať mycélium ako zdroj DNA pre transformáciu, je možné kmene pestovať vo fľaši s objemom 500 ml a s obsahom 100 ml úplného živného prostredia, ktoré obsahuje 20 g glycerolu, 4 g peptónu, 4 g extraktu z kvasníc, 0,5 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g hydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g chloridu draselného, 1 g síranu horečnatého x 7H₂O, 3 g dusičnanu sodného a 0,01 g síranu železnatého x 7H₂O v 1 litri destilovanej vody. Kultúra sa pestuje pri teplote 30 °C na rotačnej trepačke pri 200 ot/min.

Príklad 3

Izolácia genomickej DNA a celkovej RNA z Penicillium a Cephalosporium

Vegetatívne mycélium z kultúry, pripravené uvedeným spôsobom a pestované 48 hodín bolo oddelené filtráciou cez plátno, zmrazené v kvapalnom dusíku a lyofilizované cez noc. Sušené mycélium sa drví spolu s pieskom s použitím mažiara a tlčika a potom sa znovu uvedie do suspenzie v 25 ml 100 mM LiCl, 50 mM EDTA, 10 mM tris s pH 8,0 so 4 % SDS. Po zohriatí suspenzie na teplotu 50 až 55 °C na vodnom kúpeli s teplotou 60 °C sa zmes najskôr extrahuje s použitím 1 M tris s pH 8, nasýteného fenolom a potom s použitím tris, nasýteného zmesou fenolu a chloroformu v objemovom pomere 1:1a nakoniec sa zmes extrahuje chloroformom. RNA sa zráža z vodnej fázy pridaním rovnakého objemu chladného 6 M LiCl a potom sa nechá zmes 2 až 3 hodiny pri teplote -20 °C. Po centrifugovaní 12 000 g celkom 20 minút pri teplote 4 °C sa k supematantu pridá do 66 % objemových etanolu a zmes sa 15 minút chladí na -20 °C na vyzrážanie DNA. Po odstredení rovnakým spôsobom ako je uvedené, sa usadenina DNA premyje 70 % etanolom, vysuší sa a znova sa uvedie do suspenzie v pufri TE (10 mM tris-HCl s pH 7,5, 1 mM EDTA). Koncentrácia DNA sa stanoví porovnaním so známym štandardom DNA pri farbení etidiumbromidom elektroforézou na agarozovom géli.

Na extrakciu RNA sa kultúry Penicillium chrysogenum a Cephalosporium acremonium, opísané v príkladoch 1 a 2, pestujú 96 hodín v 35 ml fermentačného prostredia za uvedených podmienok pri teplote 25 °C na rotačnej trepačke pr 220 ot/min. Mycélium sa oddelí filtráciou cez filter Whatman 1 za zníženého tlaku a premyje sa približne 50 ml vody. Potom sa mycélium okamžite zoberie z filtra, znova sa uvedie do suspenzie v 5 ml pufra na rozrušenie buniek (50 mM Tris-HCl s pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA s pH 8,0 a 5 % SDS), zmrazí sa v kvapalnom dusíku a lyofilizuje sa. Po lyofilizácii cez noc sa pridá 5 ml vody, obsahujúcej 0,1 % DEPC a 5 ml zmesi fenolu, chloroformu a izoamylalkoholu 50: 50:1 s 1 M Tris s pH 8 a zmes sa nechá 20 minút za pretrepávania stáť pri teplote 37 °C. Potom sa zmes odcentrifuguje pri 12 000 g 10 minút pri teplote 4 ’C, vodná vrstva sa oddelí a znova sa extrahuje najskôr s použitím zmesi fenolu, chloroformu a izoamylalkoholu 5(:50:1 s 1 M Tris s pH 8 a potom fenolom, nasýteným 1 M Tris s pH 8 a nakoniec chloroformom. Ku konečnej vednej vrstve sa pridá rovnaký objem 6 M LiCl a roztok sa nechá stáť najmenej 4 hodiny pri teplote 20 °C. Celková RNA sa odcentrifuguje pri 12 000 g celkom 20 minút pri teílote 4 °C a usadenina sa rozpustí v 0,3 ml pufra TE s 0, )3 ml 3 M octanu sodného a potom sa pridá 2,5 objemov etanolu k opätovnému vyzrážaniu RNA. Konečná usadenin< sa rozpustí v 0,1 ml pufra TE a koncentrácia RNA sa stanoví spektrofotometricky s využitím absorpcie pri 260 nm.

Pi íklad 4

Konštrukcia génovej banky Cephalosporium acremonium a izolácia génov pre expandázu/hydroxylázu a pre acetyltransferázu z C. acremonium

Izolácia génu pre expandázu/hydroxylázu C. acremonium

DNA genómu C. acremonium bola čiastočne rozštiepení. pomocou enzýmu Sau3AI za vzniku fragmentov s priemernou veľkosťou 10 až 20 kb, rozštiepený materiál bol odstredený s použitím gradientu hustoty s obsahom 5 až 20 % chloridu sodného. DNA, frakcionovaná podľa veľkost bola použitá na vytvorenie genómovej banky DNA C. acremonium cez väzbu do miesta pôsobenia BamHI vektora λ 2001, vloženie do častíc fágu s použitím Gigapak (Stratagcnc) s následnou infekciou E. coli. Výsledné plaky boli prenesené na nitrocelulózu a sériovo vyšetrené hybridizáciou s komplementárnou oligonukleotidovou sondou na 3'-zakončení známeho reťazca génu pre expandázu/hydroxylázu (Samson a ďalší, 1987). Sonda bola koncovo označená pomocou [r-32P]ATP s použitím T4-polynukleofidkinázy. Pozitívne klony boli izolované, bola skonštruovaná mapa pôsobenia restrikčých endonukleáz a orientácia génu bola určená hybridizáciou Southem blot s použitím uvedeného oligonukleotidu a ďalšieho oligonukleotidu s reť< zcom, komplementárnym k 5'-zakončeniu génu.

Izolácia génu pre acetyltransferázu z C. acremonium

Hoci nejde o postup, použitý na izoláciu génu pre acetj Itransťerázu na konštrukciu vektora, opísaného v príkladoch 11 a 12, je možné použiť nasledujúci postup s použitím známej DNA. Postupuje sa tak, že sa z genómovej banky C. acremonium, pripravenej uvedeným spôsobom vyberi.‘ kloň, obsahujúci kód pre acetyltransferázu na základe hybridizácie s použitím syntetických oligonukleotidových sond, komplementárnych k reťazcu pre acetyltransferázu spôsobom podľa publikácie Matsuda a ďalší, 1992, Biocliem. Biophys. Res. Commun., 182, 995 až 1001.

Príklad 5

Podmienky pestovania Streptomyces clavuligerus

Na pestovanie bol použitý Streptomyces clavuligerus kmeň ATCC 27064. Tento kmeň bol udržovaný na platniach, ktoré obsahovali 4 g extraktu z kvasníc, 10 g sladového extraktu, 4 g glukózy, 20 g agaru v 1 litri destilovanej vody s pH 7,2. Po piatich dňoch rastu pri teplote 30 °C boli k platniam pridané 2 ml sterilnej vody a kultúry boli zoškrabané z povrchu agaru. Výsledná suspenzia bola prenesená do sterilných skúmaviek so skrutkovačmi uzávermi, obsahujúcich sklenené guľôčky. Po homogenizácii kultúry miešaním bola suspenzia použitá na naočkovanie kvapalného živného prostredia. Suspenzia bola použitá aj na uskladnenie pri teplote -70 °C po pridaní glycerolu do 15 % konečného objemu.

V prípade, že bolo potrebné získať mycélia na prípravu protoplastov na transformáciu alebo ako zdroj DNA, boli kmene pestované vo fľašiach s objemom 1 litra s obsahom 200 ml živného prostredia YEME, ktoré obsahuje 3 g extraktu z kvasníc, 5 g peptónu, 3 g sladového extraktu, 10 g glukózy, 340 g sacharózy, 1,02 g chloridu horečnatého x 6H₂O, 5 g glycínu, 18 g agaru v 1 litri destilovanej vody. Kultúra sa inkubuje pri teplote 28 °C na rotačnej trepačke pri 220 ot/min.

Príklad 6

Izolácia genomickej DNA Streptomyces

Vegetatívna kultúra na pestovanie uvedenej kultúry sa odcentrifuguje 48 hodín pri 22 100 g celkom 10 minút. Bunkový materiál sa znova uvedie do suspenzie v 10 ml pufra TE, pridá sa 10 mg lyzozýmu a zmes sa inkubuje 15 minút pri teplote 30 °C. Potom sa pridá 1 ml 20% SDS a potom ihneď ešte 10 ml fenolu, nasýteného TE s pH 8 a 1,5 M roztoku chloridu sodného a zmes sa 20 minút opatrne mieša prevracaním. Fázy sa oddelia odstredením pri 12 000 g počas 10 minút, potom sa vodná vrstva oddelí a prenesie do čerstvej skúmavky. Pridá sa rovnaký objem chloroformu a zmes sa 10 minút opatrne mieša prevracaním skúmavky. Potom sa fázy opäť oddelia odstredením v centrifúge 10 minút pri 12 000 g, vodná vrstva sa oddelí a prenesie sa do čistej skúmavky. Opatrne sa pridajú dva objemy izopropanolu a vyzrážaná DNA sa znova rozpusti v čo najmenšom objeme pufra TE. Potom sa pridá RNA-áza A do konečnej koncentrácie 20 pg/ml a roztok sa 1 hodinu inkubuje pri teplote 50 °C. Potom sa pridá proteáza K do konečnej koncentrácie 100 pg/ml spolu so 100 mM NaCl a 0,4% SDS a zmes sa inkubuje ďalšiu hodinu pri teplote 37 °C. Roztok sa potom znova extrahuje rovnakým objemom fenolu, nasýteného TE s pH 8 a znovu sa extrahuje chloroformom. DNA sa oddelí po pridaní dvoch objemov izopropanolu a koncentrácia sa stanoví spektrofotometricky pri odčítaní absorpcie pri 260 nm.

Príklad 7

Konštrukcia génovej knižnice a izolácia DNA fragmentov obsahujúcich gény pre expandázu a hydroxylázu Streptomyces clavuligerus

Izolácia génu pre expandázu S. clavuligerus

DNA genómu Streptomyces clavuligerus, získaná uvedeným spôsobom sa rozštiepi restrikčými enzýmami BamH1 Sali. Rozštiepená DNA sa podrobí elektroforéze na 0,8 % agarozovom géli a fragmenty s veľkosťou 1,8 až 2,2 kb sa vymyjú a naviažu na DNA pUC18, vopred rozštiepenú tými istými enzýmami. Zriedené podiely získanej zmesi po väzbe sa použijú na transformáciu buniek JM109 s použitím otvorenia pórov elektrickým prúdom s použitím zaria denia Gene Pulser (Bio-Rad, Richmond, CA). Príprava buniek a otvorení pórov elektrickým prúdom sa vykonáva podľa doporučenia výrobcu. Transformovaný materiál sa nanesie na platne LB, obsahujúce 100 pg/ml ampicilínu a 75 pl 20 X-Gal. Po inkubácii cez noc pri teplote 37 °C sa rekombinantné kolónie inkubujú podľa svojho bezfarebného vzhľadu vzhľadom na inaktiváciu génu pre betagalaktozidázu vo vektore. Bezfarebné kolónie sa prenesú na čerstvú platňu s prostredím LB s obsahom 100 mikrogramov/ml ampicilínu. Po pestovaní cez noc pri teplote 37 °C sa kolónie prenesú na nitrocelulózu a hybridizujú sa s použitím sondy, získanej pomocou PCR-reakcie, zodpovedajúcej reťazcu známeho génu pre expandázu Streptomyces clavuligerus, bázy 52 až 918 podľa publikácie Kovacevic a ďalší, 1989, J. Bacteriol., 171, 754 až 760 a podľa US 5 070 020 (Ingolia a ďalší). Značenie reakčného produktu PCR-reakcie je možné uskutočniť extenziou štatistickým priemerom s použitím (32P) dCTP a skúšobného balíčka Oligolabelling Kit, podľa návodu výrobcu (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Hybridizačné reakcie sa vykonávajú v prítomnosti rádioaktívne značenej sondy (106 impulzov/min.), 30% formamidu, 5x SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M citronanu sodného s pH 7), 0,1 % SDS, 5x Denhardt (5 g ficoll, 5 g polyvinylpyrolidónu a 5 g BSA na 500 ml 50 x zásobného roztoku) a 100 pg/ml DNA z teľacieho brzlíka cez noc pri teplote 37 °C. Niekoľko transformovaných kolónií silne hybridizovalo so sondou. Bolo potvrdené, že jedna z kolónií obsahuje vektor, nesúci gén pre expandázu, analýza bola vykonávaná pomocou restrikčých enzýmov. Získaný plazmid bol označený pFTSO-1.

Izolácia génu pre hydroxylázu S. clavuligerus

DNA genómu Streptomyces clavuligerus bola čiastočne rozštiepená enzýmom BamHI a naviazaná na vektor lambda Dash II (Stratagene). Výsledná genómová banka bola sériovo sledovaná hybridizáciou na oligonukleotid, obsahujúci 30 báz, s totožným reťazcom, ako prvých 30 báz známeho reťazca génu pre hydroxylázu z publikácie Kovacevic a Miller, 1991, J. Bact., 173:398. Po vykonaní hybridizácie Southem blot s použitím DNA z dvoch pozitívnych klonov fágov po rozštiepení enzýmom BamHI bol získaný očakávaný fragment s veľkosťou 6 kb, ktorý bol subklonovaný. Z tohto subklonu bol získaný po rozštiepení enzýmom KpnI rad fragmentov v súlade so zverejnenou mapou pôsobenia restrikčých enzýmov pre gén pre hydroxylázu podľa Kovacevica a Millera, 1991.

Príklad 8

Izolácia plazmidovej DNA

Kultúry Escherichia coli, obsahujúce požadovaný plazmid, boli pestované v 500 ml prostredí LB s obsahom 20 g/1 základu pre kvapalné prostredie LB (Gibco, Paisley, Škótsko) s obsahom 15 pg/ml tetracyklínu na rotačnej trepačke pri 220 ot/minútu 12 až 16 hodín pri teplote 37 °C. Bunky boli oddelené odstredením v centrifúge pri 4000 g celkom 10 minút pri 4 °C. Usadenina buniek bola znova uvedená do suspenzie v 18 ml pufra s glukózou (50 mM glukózy, 25 mM Tris s pH 8,0 a 10 mM EDTA) a 2 ml 40 mg/ml lyzozýmu (Sigma, St. Luis, MO) v glukózovom pufri, po zmiešaní bola zmes 15 minút inkubovaná pri teplote miestnosti. Potom bolo pridaných 40 ml čerstvo pripraveného roztoku 0,2 N NaOH, 1 % SDS, zmes bola opatrne premiešaná a uložená na 10 minút do ľadu. Potom bolo pridaných 30 ml 5 M octanu draselného s pH 4,8 a po premiešaní bola zmes uložená ešte na 10 minút do ľadu. Bunková drvina potom bola usadená odstredením v centrifúge pri 4000 g na 10 minút pri 4 °C a výsledný supematant bol pre filtrovaný cez plátno. K vyčerenému supematantu bolo pridaných 0,6 objemov izopropanolu na vyzrážanie DNA plazmidu, zrazenina sa tvorila 20 minút v priebehu inkubácie pri teplote miestnosti. DNA plazmidu bola usadená odstredením 20 minút pri 4000 g pri teplote 4 °C, potom bola premytá 70 % etanolom a krátko sušená. Usadenina potom bola znovu uvedená do suspenzie v 9 ml pufra TE a potom bolo pridaných 10 g CsCl a 0,387 ml roztoku etidiumbromidu s obsahom 10 mg/ml. Tento roztok bol odstredený 24 hodín pri 313 100 g. Výsledný pás plazmidu v gradiente chloridu cézneho bol vizualizovaný pomocou ultrafialového svetla, oddelený a etidiumbromid bol odstránený extrakciou butanolom, nasýteným vodou. Potom bol chlorid cézny odstránený dialýzou proti pufru TE a nakoniec bola DNA koncentrovaná s použitím PEG s molekulovou hmotnosťou 8000. Koncentrácia DNA bola stanovená spektrofotometricky odčítaním absorpcie pri 260 nm.

Príklad 9

Konštrukcia vektora pPenFTSO na transformáciu Penicillium

Vloženie génu na odolnosť proti fleomycinu

Vektor na transformáciu Penicillium bol skonštruovaný s použitím génu na odolnosť proti fleomycinu ako dominantného označenia pre nasledujúcu selekciu. Najskôr bol izolovaný fragment s veľkosťou 660 bp s obsahom génu na odolnosť proti fleomycinu (išlo o gén pre bielkovinu, ktorá viaže fleomycín zo Streptoalloteichus hindustamts) a bola vykonaná jeho väzba na terminátor cytochrómu Cl z kvasiniek s použitím plazmidu pUT713, rozštiepeného enzýmami BamHI/BglII (CAYLA, Toulouse Cedex, Francúzsko), postup bol vykonávaný s použitím elektroforézy s následnou clúciou z agarozového gélu. Izolovaný fragment bol vložený do miesta štiepenia BamHI vektora pSELECT® 1 (Promega Corporation) a orientácia génu bola overená analýzou reštrikčnými enzýmami. Jediné miesto pôsobenia HindlII výsledného plazmidu bola odstránená rozštiepením enzýmom HindlII, vyplnením vzniknutých zakončení Klenowovou polymerázou a opätovným naviazaním. Potom bol vložený fragment Pst I s veľkosťou 550 bp a s obsahom λ cos, ktorý umožňuje použitie vektora na tvorbu kozmidu v prípade, že sa použijú na vloženie fragmentov príslušnej veľkosti. Tento vektor bol označený pSCP4.

DNA genómu P. chrysogenum bola čiastočne rozštiepená enzýmom Sau3A a použitá na prípravu banky fágu λ EMBL3 ako vektora. Kloň, obsahujúci gén pre syntetázu izopenicilínu N, IPNS bol z banky izolovaný a použitý na prípravu radu subklonov, z ktorých jeden obsahoval fragment s veľkosťou 3,6 kb z prvého miesta pôsobenia BamHI proti smeru translácie génu IPNS až k prvému miestu pôsobenia HindlII v smere translácie tohto génu. Jediné miesto pôsobenia Sali v tomto subklone bolo odstránené rozštiepením Sali, vyplnením vzniknutých zakončení Klenowovou polymerizáciou a opätovným naviazaním. Potom bolo obdobným spôsobom odstránené jediné miesto pôsobenia Xbal rozštiepením pomocou Xbal, vyplnením miest a opätovnou väzbou. Výsledný plazmid bol označený pSXF-1. Skonštruovaný promótor IPNS bol na géli izolovaný z plazmidu pSXF-1 ako fragment po štiepení enzýmom Ncol s 1, 2 kb a bol vložený do miesta Ncol v opísanom plazmide pSCP4. Orientácia, stanovená rozštiepením restrikčými enzýmami bola zvolená tak, že promótor bol spojený s génom na odolnosť proti fleomycinu v mieste kodónu ATG pre štart. Tento plazmid bol označený pUTZ-2.

Vloženie génu pre expandázu 5. clavuligerus

Fragment s veľkosťou 1 645 kb, obsahujúci gén pre expandázu Streptomyces clavuligerus bol čistený z materiálu, získaného zpFTSO-1, tak ako bol opísaný, enzýmami BamHI a Sali, čistenie bolo vykonávané elektroforézou a eluciou z 0,8 % agarozového gélu. Izolovaný fragment bol vložený do vektora pSELECT (Promega Corporation), taktiež rozštiepeného enzýmami BamHI a Sali. Vzniknutý vektor bol označený pFTSO-8. Nové miesto pôsobenia Ncol bolo vytvorené pri kodóne ATG pre začiatok génu pre expandázu cielenou mutagenézou in vitro Altered Sites® (Promega Corporation). Mutácia bola vyvolaná podľa návedu výrobcu. Bol skonštruovaný oligonukleotid, komplementárny ku kódujúcemu reťazcu oblasti DNA pri kodóne ATG pre začiatok zo zverejneného reťazca génu pre expandázu Streptomyces tak, ako bol opísaný v publikácii Kovacevic a ďalší, 1990, Joumal of Bacteriology, 171, str. 3S’52 až 3958. Tento oligonukleotid bol syntetizovaný kyanoetylfosforemiditovým postupom s použitím zariadenia Gene Assembler (Pharmacia), oligonukleotid mal nasledujúci reťazec.

reťazec č. 8: 3' CGAGAGGATCAGTGAGAGTCCATGGACACGACGG 5'

Vznik mutácie bol potvrdený analýzou reštrikčným enzýmom. Potom bol izolovaný fragment Ncol s 1,2 kb z plazmidu pUTZ-2, obsahujúci konštrukciu promótora IPNS z P. chrysogenum pomocou reštrikčného enzýmu Ncol s následnou elektroforézou na agarozovom géli. Oblasť promótora IPNS bola naviazaná do vektora pFTSO-8 v novom mieste pôsobenia Ncol, ktoré bolo vytvorené mutáciou na kodóne ATG pre začiatok génu pre expandázu. Orientácia ptomótora vzhľadom na gén pre expandázu bola overená analýzou reštrikčnými enzýmami. Kazeta, obsahujúca promótor IPNS a gén pre expandázu potom bola vybratá ako fragment BamHI/SalI a vložená do vektora pUTZ-2 po jeho rozštiepení BamHI/Salí na jeho transformáciu, išlo o uvedený vektor Penicillium. Konečná konštrukcia bola označená pPenFTSO.

Príklad 10

Konštrukcia vektora pPEN/CEPH-1 pre transformáciu Pemcillium

Vloženie promótorovej oblasti IPNS

Oblasť promótora IPNS bola izolovaná z plazmidu plJTZ-2, opísaného v príklade 9 rozštiepením enzýmami Xhol/Smal. Vektor pUTZ-2 bol rozštiepený enzýmom BamHI a vzniknuté zakončenia boli vyplnené s použitím dNTP a Klenowovho fragmentu za vzniku vyplnených zakončení a potom bol materiál rozštiepený pomocou enzýmu X hol a izolované fragmenty promótora IPNS po štiepení enzýmami Xhol/Smal boli vložené do tohto rozštiepeného vektora, čím vznikla konštrukcia, obsahujúca dve oblasti promótora IPNS. Tento vektor bol označený pUTZ-7.

V loženie génu pre expandázu/hydroxylázu C. acremonium

Jedna z oblastí promótora IPNS potom bola izolovaná elektroforézou s následnou elúciou z agarozového gélu z p azmidu pUTZ-7 ako fragment po štiepení Xhol/Xbal a vložená do vektora pBluescript II SK (Stratagene, La Jolla, CA) po jeho rozštiepení enzýmami Xhol/Xbal. Tento vektor bol označený pIPNSp/blue.

Gén pre expandázu/hydroxylázu Cephalosporium bol ijolovaný elektroforézou a elúciou z agarozového gélu ako fragment s veľkosťou 1,6 kb po štiepení HindlII/XabI z jedného identifikovaného klonu genómu a bol vložený do miesta HindlIIZXbal rozštiepeného vektora pSELECT. Nové miesto BspHI bolo vytvorené v mieste kodónu ATG génu pre expandázu/hydroxylázu cielenú mutáciou s použitím systému na tvorbu mutácie in vitro, Altered Sites™ (Promega Corporation). Mutácia bola vytvorená podľa inštrukcií výrobcu. Bol skonštruovaný oligonukleotid, komplementárny ku kódujúcemu reťazcu oblasti DNA v mieste kodónu ATG pre začiatok z uverejneného reťazca génu pre expandázu/hydroxylázu Cephalosporium acremonium podľa publikácie Samson a ďalší, Bio/Technology, zv. 5, november 1987. Oligonukleotid bol syntetizovaný s použitím kyanoetylfosfoamiditového postupu s použitím zariadenia Gene Assembler (Pharmacia), oligonukleotid mal tento reťazec:

reťazec č. 9: 3' GTTTTGGTGTCGTAGTAOTACTGAAGGTTCCAG 5'

Vznik mutácie bol potvrdený analýzou pomocou reštrikčných enzýmov. Potom bol elektroforézou a elúciou z agarozového gélu izolovaný gén pre expandázu/hydroxylázu Cephalosporium acremonium ako fragment BspHI/Xbal a bol vložený do vektora pIPNSp/blue, rozštiepeného Ncol/Xbal tak, ako bol opísaný v predchádzajúcich odsekoch. Tento vektor teda teraz obsahoval promótor IPNS Penicillium v mieste kodónu ATG génu pre expandázu/hydroxylázu Cephalosporium acremonium. Vektor bol označený pIPNSp/EXP/blue.

Táto kazeta s obsahom promótora IPNS a génu pre expandázu/hydroxylázu bola čiastočne rozštiepená enzýmom Xhol a úplne rozštiepená enzýmom Xbal a fragment bol izolovaný elektroforézou a elúciou z agarozového gélu a vložený do miesta Xhol/Xbal rozštiepeného vektora pUTZ-2 tak, ako bol opísaný, čím vznikol výsledný vektor pre transformáciu, pPEN/CEPH-1.

Príklad 11 Konštrukcia vektora pre transformáciu Penicillium tak, aby došlo k expresii oboch génov pre expandázu a pre hydroxyláxu S. clavuligerus

Gén pre β-tubulín P. chrysogenum bol klonovaný z banky genómu fágu lambda s použitím génu pre β-tubulín Aspergillus niger ako hybridizačné sondy. Fragment s veľkosťou 2,0 kg po štiepení Xbal/HindlII, obsahujúci promótor β-tubulín Penicillium bol vložený do miesta Xbal/HindlII plazmidu pSELECT (Promega). Miesto pôsobenia Ncol bolo vytvorené v mieste kodónu ATG pre začiatok cielenou mutagenézou reťazca AAATGCGT na reťazec ACCATGGGT. Z výsledného vektora bol na géli izolovaný po štiepení BamHI/NcoI fragment s 1,4 kb, ktorý bol vložený medzi miesta BamHI a Ncol opísaného plazmidu pUTZ-2 za vzniku vektora pCl-6. Z klonu genómu P. chrysogenum bol na géli izolovaný fragment Sali s veľkosťou 5,1 kb, obsahujúci tak IPNS, ako aj gén pre acyltransferázu a tento fragment bol vložený do miesta Sali plazmidu pUTZ-2 za vzniku plazmidu pUTZ-5. Z plazmidu pLJTZ-5 bol izolovaný 3' terminátorový reťazec génu IPNS reštrikciou enzýmami BamHI a HindlII s následnou izoláciou fragmentu s veľkosťou 1,3 kb na gcli, fragment bol potom vložený medzi miesta BamHI a HindlII opísaného plazmidu pCI-6 za vzniku plazmidu pCI-13. Jediné miesto pôsobenia Sali v blízkosti miesta BamHI v plazmide pCI-13 bolo odstránené reštrikciou, vyplnením pomocou Klenowovej polymerázy a opätovnou väzbou. Nové miesto pôsobenia Sali bolo vytvorené na druhej strane miesta BamHI cielenou mutagenézou reťazca GGAAGACG za vzniku re ťazca GGTCGACG. Potom bol z plazmidu odstránený gén na odolnosť proti ampicilínu reštrikciou enzýmom Pvul, izoláciou väčšieho fragmentu a opätovnou väzbou za vzniku plazmidu pCI-15. Nakoniec bola kazeta, obsahujúca promótor IPNS a gén pre expandázu, izolovaná z plazmidu pPENFTSO na géli ako fragment s veľkosťou 2,4 kb po štiepení BamHI/SalI a kazeta bola vložená do plazmidu pCI-15 za vzniku plazmidu pEXP-1.

Konštrukcia vektora pre expresiu oboch génov, génu pre hydroxylázu aj génu pre expandázu 5. clavuligerus, zahrnuje nasledujúce stupne. Fragment s veľkosťou 2,9 kb po štiepení Kpnl, obsahujúci gén pre hydroxylázu sa subklonuje v plazmide pSELECT tak, že miesto EcoRl v polyspojovníku sa nachádza smerom 5' v bezprostrednej blízkosti génu. Jediné miesto Ncol v plazmide sa odstráni cielenou mutagenézou reťazca TCCATGGGC za vzniku reťazca TCGATGGGC a súčasne sa vytvorí v mieste kodónu pre začiatok nové miesto pôsobenia Ncol zmenou reťazca AACATGGC na reťazec ACCATGGC. Obe zmeny uchovávajú výsledný reťazec aminokyselín. Fragment s veľkosťou 1,0 kb po štiepení AcoRI/Ncol, obsahujúci skonštruovaný promótor IPNS sa izoluje na géli z plazmidu pUTZ-2 a uloží medzi miesta pôsobenia EcoRl a Ncol uvedeného vektora, obsahujúceho pozmenený' gén pre hydroxylázu. Potom sa jediné miesto pôsobenia EcoRl vo výslednom vektore zmení na miesto pôsobenia HindlII cielenou mutagenézou. Konštrukcia, obsahujúca spojený gén pre hydroxylázu a 5'-IPNS sa z výsledného vektora izoluje ako fragment po pôsobení enzýmu HindlII a tento fragment sa uloží do jediného miesta pôsobenia enzýmu HindlII v opísanom vektore pEXP-1. Výsledný vektor obsahuje gén pre expandázu a gén pre hydroxylázu, pričom každý z týchto génov je pod riadením promótora IPNS, okrem toho obsahuje tento vektor značiaci gén na odolnosť proti fleomycínu pod riadením promótora pre β-tubulín.

Príklad 12

Konštrukcia vektora pTS-8 na transformáciu Penicillium tak, aby dochádzalo k expresii génu pre expandázu/hydroxylázu aj génu pre acctyltransferázu z Cephalosporium acremonium

Gén pre acetyltransferázu Cephalosporium bol izolovaný elektroforézou s následnou elúciou z agarozového gélu ako fragment s veľkosťou 1,8 kb kolonu genómu po rozštiepení enzýmu BglII/Sall a bol vložený do vektora pSELECT (Promega Corporation), rozštiepeného BamHI/SalI. Na uľahčenie vhodného vloženia promótora IPNS Penicillium do kodónu ATG génu pre acetyltransferázu Cephalosporium sa vytvorí nové miesto pôsobenia Ncol v kodóne ATG, vloženého pri báze - 42 (Mathison a ďalší, Current Genetics, v tlači) a odstráni sa vnútorné miesto Ncol v štruktúrnom géne vyvolaním cielenej mutácie s použitím systému na vyvolanie mutácie in vitro, Altered Sites (Promega Corporation). Mutácia bola vyvolaná podľa návodu výrobcu. Oligonukleotidy boli skonštruované tak, aby boli komplementárne ku kódujúcim oblastiam v príslušnej časti reťazca DNA, ale boli zaradené niektoré zmeny tak, aby došlo k vytvoreniu alebo odstráneniu miesta pôsobenia enzýmu Ncol. Oligonukleotid, použitý na odstránenie vnútorného miesta pôsobenia Ncol v štruktúrnom géne mal nasledujúci reťazec:

reťazec č. 16:

3' GTCGGCGCATCGATGGGTGGAAT 5'

SK 280569 Β6

Oligonukleotid, použitý na vytvorenie nového miesta pôsobenia enzýmu Ncol v kodóne ATG pri báze - 42 mal nasledujúci reťazec:

reťazec č. 17: 5' CTCCGATAGGGCGTGGTACCCGGCCCTACTCTTAT 3'

Oligonukleotidy boli syntetizované kyanoetylfosforamiditovou metódou s použitím zariadenia Gene Assembler (Pharmacia). Vznik oboch mutácií bol potvrdený analýzou reštrikčnými enzýmami. Získaný vektor bol označený pMUTACT. Promótor IPNS Penicillium bol izolovaný elektroforézou a následnou clúciou z agarozového gélu ako fragment s veľkosťou 1,2 kb z vektora pUTZ-2, ktorý bol podrobnejšie opísaný, po jeho rozštiepení enzýmom Ncol. Tento fragment promótora potom bol vložený do vektora pMUTACT po jeho rozštiepení enzýmom Ncol, promótor IPNS bol teraz vložený priamo v -42 ATG géne pre acetyltransferázu Cephalosporium. Orientácia promótora bola potvrdená analýzou reštrikčnými enzýmami. Takto získaný vektor bol označený pMUTAC/IPNS. Z vektora pMUTACT/IPNS bol elektroforézou s následnou elúciou z agarozového gélu izolovaný fragment s veľkosťou 2,5 kb štiepením Xhol/Sall, tento fragment obsahoval kazetu s promótorom IPNS a génom pre acetyltransferázu, táto kazeta potom bola vložená do opísaného vektora pUTZ-2, rozštiepeného Sali. Tento vektor, vytvorený ako medziprodukt bol potom rozštiepený enzýmom Xbal a naviazaný na fragment Xbal s veľkosťou 2,1 kb z opísaného vektora pPEN/CEPH-1, obsahujúceho kazetu s promótorom IPNS a génom pre expandázu/hydroxylázu, čím bol získaný výsledný vektor pre transformáciu, ktorý bol označený pTS-8.

Príklad 13

Transformácia Penicillium chrysogenum

Protoplasty z uvedeného kmeňa Penicillium chrysogenum boli vytvorené naočkovanim 50 ml kvapalného živného prostredia CM s použitím 1 x 107 spór na 67 hodín, v tomto čase bolo prostredie udržované na teplote 25 °C na rotačnej trepačke pri 220 ot/min. Mycélium bolo oddelené fdtráciou cez vrstvu plátna, preneseného do fliaš s objemom 500 ml a znova uvedené do suspenzie v 25 ml prostredia KMP s obsahom 0,7 M KC1, 0,8 M manitolu, 0,02 M

K.PO4 s pH 6,3, okrem toho obsahovalo prostredie 100 mg prostriedku Novozyme 234 (Novo BioLabs, Bagsvaerd, Dánsko), potom bolo prostredie inkubované pri 30 °C a 100 ot/min. Sferoplasty boli oddelené filtráciou cez vrstvu plátna a sklenenej vaty a usadené odstredením 10 minút pri 350 g. Potom boli sferoplasty trikrát premyté 10 ml pufra KMP a znovu uvedené do suspenzie v KMPC (KMP s 50 mM CaCl₂) do koncentrácie 5 x 107 buniek/ml a zmes bola ponechaná pri teplote miestnosti 20 minút. Na transformáciu Penicillium bolo 200 μΐ suspenzie sferoplastu pridaných k DNA (5 pg DNA vektora v 6,2 μΐ KMPC s 5 mg/ml heparínu) s 50 μΐ PPC (40 % PEG s molekulovou hmotnosťou 3500, 20 mM KPO₄ s pH 6,3 5 % CaCl₂ bol pridaný tesne pred použitím) a výsledná zmes bola inkubovaná v ľade celkom 30 minút. Potom bol pridaný 1 ml čerstvo pripraveného PPC a zmes bola prenesená do 50 ml agaru na regeneráciu s teplotou 50 °C (CM plus 1,3 M mannitolu a 3 % agaru). Transformačná zmes bola potom rozdelená do piatich Petriho misiek. Po regenerácii 24 hodín pri 25 °C boli platne prevrstvené OL (1 % peptón v 10 agare) s obsahom 100 pg/50 ml fleomycínu. Množstvo materiálu na prevrstvenie bolo rovnaké ako množstvo agaru na regeneráciu. Platne potom boli inkubované 7 až 14 dní pri 25 °C a bola pozorovaná tvorba kolónií transformovaného organizmu.

Príklad 14

Skúšky na biologickú účinnosť

Biologická skúška s difúziou v agare bola použitá na stanovenie antibiotickej účinnosti fermentačných produktov adipoyl-6-ΑΡΑ a adipoyl-7-ADCA, izolovaných pomocou HPLC. 20 mikrolitrov izolovaného produktu bolo nanesené na kotúče s priemerom 5 mm na platni agaru LB (20 g/liter základného bujónu LB s 3% agarom, Gibco, Paisley, Škótsko), agar bol naočkovaný kmeňom Bacillus subtilis ATCC 33577 alebo E. coli, supersenzitívnym kmeňom (Prof. Arnold L. Demain, MIT). Bacillus subtilis bol použitý ako indikátorový kmeň na zistenie adipoyl-6-ΑΡΑ a supersenzitívny kmeň E. coli bol použitý' ako indikátorový kmeň na zistenie adipoyl-7-ADCA. Po 15 hodinách inkubácie pri teplote 37 °C bolo možné pozorovať halo inhibície rastu indikátorovej baktérie okolo kotúča, čo znamená, že produkty mali biologickú účinnosť. Ako kontroly v tomto poku >c boli použité deacetoxycefalosporín C, cefalosporín C, penicilín V a agar s obsahom alebo bez obsahu penicilinázy ako kontrola na potvrdenie beta-laktámovej štruktúry.

Príklad 15

Metóda HPLC na simultánnu analýzu adipoyl-6-ΑΡΑ, -7-ADCA, -7-ADAC a-7-ACA

Fermentačné produkty z transformovaných kmeňov Penicillium, adipoyl-6-ΑΡΑ, adipoyl-7-ADCA, adipoyl-7-ADAC a adipoyl-7-ACA boli súčasne analyzované vysoko lakovou kvapalinovou chromatografiou, HPLC. Systém HPLC bol tvorený nasledujúcimi zložkami (Waters): systém na prívod rozpúšťadla 625, detektor vlnovej dĺžky 409E (nastavený na 220 nm a 260 nm), systém pre maxim;Tne údaje 825. Stacionárnou fázou bola zlisovaná radiálna náplň Nova-Pak C]₈ s rozmermi 5 x 100 mm s vloženým systémom Nova-Pak C₁₈ Guard-Pak. Pri rýchlosti prietoku 1 inl/min. bola mobilná fáza tvorená lineárnym gradientom, ktorý sa po 10 minútach menil z počiatočného zloženia 5 % metanolu a 95 % 10 mM KPO₄ s pH 5 na 40 % metanole a 60 % KPO4 s pH 5. Adipoyl-6-APA bola kvantitatívne stanovená porovnaním so štandardnou krivkou pre penicilín N pri 220 nm. Expandované produkty boli kvantitatívne stanovené porovnaním so štandardnými krivkami pre syntetickú adipoyl-7-ADCA a adipoyl-7-ACA pri 260 nm.

Príklad 16

Skúšky na enzým RAEV

Chemicky syntetizovaná adipoyl-7-ADCA a adipoyl-7-ACA boli použité ako substráty na stanovenie špecifickej účinnosti enzýmu RAEV (bežne dodávaný RAEV Corp.). Reakčná zmes obsahovala 10 mM substrátu, 1 pg enzýmu R/diV, 5 % glycerolu v 0,16 M KH₂PO₄ v celkovom objeme 50 μΐ, zmes bola inkubovaná pri 37 °C. Optimálnejšie reakčné podmienky zahrnujú použitie aspoň 20 mM substrátu v 20 až 50 mM pufra s fosforečnanom draselným. Podiely po 5 μΐ sa odoberajú v čase 0 a po 1, 3, 5, 10, 20 a 30 minútach, zriedia sa 35 ml 0,01 M KH₂PO₄ s pH 3,5 a zmrazia sa na -70 °C pred analýzou pomocou HPLC za uvedených podmienok.

Účinnosť enzýmu RAEV na kyselinu adipoyl-p-aminooenzoovú ako na kolorimetrický substrát bola stanovená s použitím 5 mM substrátu, 8,25 pg enzýmu RAEV, 10 % ghcerolu v 0,065 M ΚΗ₂ΡΟ₄ s pH 7,0 v celkovom objeme 50 pl celkom 30 minút pri 37 °C. Reakcia bola vykonávaná s použitím mikrotitračnej platne s 96 vyhĺbeninami. Na ukončenie reakcie bolo pridaných 50 μΐ riedenie 1 : 100 1 M NaNO₂ v 0,25 M kyseline octovej a reakčná zmes bola po techaná 3 minúty pri laboratórnej teplote. Potom bolo pridaných 100 μΐ riedenie 1 : 100 hydrátu monosodnej soli kyseliny 4-amino-5-hydroxy-2,7-naftaléndisulfónovej s obsahom 10 mg/ml vo vode v 0,5 M uhličitane sodnom a vznik sfarbenia bol okamžite sledovaný pri 515 nm s použitím odčítacieho zariadenia EL 312 Biokinetics (BioTek Instruments).

Príklad 17

Stanovenie alternatívnych adipoylacyláz

Okrem skúšok s použitím enzýmu RAEV na odstránenie adipoylového bočného reťazca z adipoyl-7-ADCA alebo iných adipoylových zlúčenín boli použité aj ďalšie enzýmy, produkované celým radom mikroorganizmov. Pri počiatočných skúškach boli pestované kmene Pseudomonas sp., SE-83 a SE-495 (Asahi), uložené v zbierke Fermentation Research Inštitúte pod číslom FERM BP-817 a FERM BP-818 a kmeň Pseudomonas SY-77-1 (Toyo Jožo), uložený v zbierke Northem Regional Research Laboratory pod číslom NRRL B-8070 celkom 72 hodín v prostredí, ktoré obsahovalo 2,0 % HyCase SF, 0,5 % monosodnej soli kyseliny glutamovej, 0,5 % extraktu z kvasníc, 0,2 % tuhého podielu kukuričného výluhu, 0,5 % oleja z bavlníkových semien a 0,1 % kyseliny glutárovej, ide vždy o percentá hmotnostné. Bunky boli oddelené odstredením, premyté 50 mM fosfátovým pufrom s pH 8,0 a potom znova uvedené do suspenzie v pufri a vonkajšie membrány boli spracované pôsobením malého objemu chloroformu, čím sa stali priepustnými. Potom bol podiel bunkovej suspenzie zmiešaný s adipoyl-paranitroanilidom (ad-pNA) a inkubovaný pri teplote 30 °C celkom 2 až 18 hodín. Po inkubácii boli zmesi okyslené pridaním 10 % objemových kyseliny octovej. Uvoľnený p-nitroanilín bol potom dokázaný kolorimetricky po jeho premene na diazozlúčeninu použitím reakčných činidiel, dodávaných vo forme skúšobného balíčka na stanovenie gamma-glutamyltransferázy (Sigma Chemical Company č. 545-A). Relatívna účinnosť uvedených troch kmeňov bola 100 % pre SE-495, 85,5 % pre SE-83 a 48 % pre SY-77-1. Pri použití podobných skúšok ako s enzýmom RAEV, uvedených, bola tiež preukázaná účinnosť enzýmu SE-83 a SE-495 na adipoyl-7-ADCA ako na substrát. Produkt z beta-laktamázy kmeňom SY-77-1 zabránilo stanoveniu deacylačnej účinnosti tohto kmeňa na adipoyl-7-ADCA.

Obdobným spôsobom bola tiež preukázaná produkcia adipoylacylázy pre dva kmene húb, Alternaria sp. MA-133, ATCC č. 20492 a Aspergillus sp. MA-13, ATCC č. 20491, ATCC č. 20491, kmeň jc uvedený v US 4 141 790 (Meiji Seika Kaiska Ltd.) a tiež pre tri ďalšie bakteriálne kmene, Brevibacterium ATCC č. 14 649, Achromobacterium ATCC č. 14 648 a Flavobacterium ATCC č. 14 650, tieto kmene boli opísané ako kmene, produkujúce acylázu cefalosporínu C v US 3 239 394 (Merck & Co., Inc.).

Ďalej budú uvedené v zozname reťazcov všeobecné informácie o prihláške a podrobnejšie údaje týkajúce sa reťazcov, ktoré boli v priebehu prihlášky opísané.

Zoznam reťazcov

1. Všeobecná informácia

i) prihlasovateľ: Conder Michael J.

McAda, Phyllis Rambosek John

Reeves Cristopher D.

ii) názov vynálezu: Biologický spôsob výroby kyseliny 7-aminodeacetyl -cefalosporánovej, spôsob pestovania rekombinantných buniek Penicillium chrysogenum a vektor na expresiu rekombinantnej DNA.

iii) počet reťazcov: 17 iv) adresa na korešpondenciu:

A) adresát: Merck & Co., Inc.

B) ulica: 126 E. Lincoln Ave

C) mesto: Rahway

D) štát: New Jersey

E) krajina: USA

F) ZIP: 07065

v) forma na odčítanie počítačom:

A) typ prostredia: Floppy disk

B) počítač: IBM PC kompatibilný

C) operačný systém: PC-DOS/MS-DOS

D) Software: Patentln Release 1,0, verzia 1,25 vi) údaje o prihláške:

A) číslo prihlášky: PCT IUS 92/08585

B) deň podania: 8.10.1992

C) klasifikácia: C 12 N 15/52,1/15, C 12 P 35/02 viii) Informácie o zástupcovi:

A) meno: Speer Raymond M.

B) číslo registrácie: 26 810

C) číslo spisu: 18572IA ix) Telekomunikačné informácie:

A) telefón: (908) 594-4481

B) telefax: (908) 594-4720

2. Informácie pre reťazec č. 1:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 14 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: dvojitý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 1:

ACTAGACACC ATGG 14

2. Informácie pre reťazec č. 2:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 16 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: dvojitý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 2:

OTGAGAGTTG ATGGAC 16

2. Informácie pre reťazec č. 3:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 16 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: dvojitý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 3:

TCTAGACACT ATGGAC 16

2. Informácie pre reťazec č. 4:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 16 párov báz

SK 280569 Bé

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: dvojitý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi)Opis reťazca č. 4:

TCTAGACACC ATGGAC 16

2. Informácie pre reťazec č. 5:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 22 aminokyselín

B) druh: aminokyseliny

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: peptid xi) Opis reťazca č. 5:

Ser Asn Ser Gly Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu

10 15 20

Leu Gin Asn Pro

2. Informácie pre reťazec č. 6:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 22 aminokyselín

B) druh: aminokyseliny

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: peptid xi)Opis reťazca č. 6:

Ser Asn Ser Trp Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Ala Leu Leu Leu Gin 15 10 15 20

Asn Pro

2. Informácie pre reťazec t. 7:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 22 aminokyselín

B) druh: aminokyseliny

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: peptid xi)Opis reťazca č. 7:

Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro íle Leu Ala 15 10 15 20

Gly Asp Pro

2. Informácie pre reťazec č. 8:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 34 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ:jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 8:

CGAGAGGATC AGTGAGAGTC CATGGACACG ACGG 34

2. Informácie pre reťazec č. 9:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 33 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ:jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 9:

GTTTTGGTGT CGTAGTAGTA CTGAAGGTTC CAG 33

2. Informácie pre reťazec č. 10:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 21 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ:jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca í. 10:

TACCCGGGGT TCCCGCGAAC T 21

2. Informácie pre reťazec č. 11:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 10 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 11:

CäTGAAGAAG 10

2. Informácie pre reťazec č. 12:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 10 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 12:

T1CTTCCTAG 10

2. Informácie pre reťazec č. 13:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 23 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 13:

GTCGGCGCAT CGATGGGTGG AAT 23

2, nformácie pre reťazec č. 14:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 22 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 14:

CC CCCACCAT GGCGCCTAG AT 22

2. Informácie pre reťazec č. 15:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 22 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca č. 15:

TCTAGCTAGA CACCATGTCG CCTCAGAT 28

2. Informácie pre reťazec C. 16:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 23 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ:jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genómu) xi) Opis reťazca C. 16:

GTCGGCGGCAT CGATGGGTGG AAT 23

2. Informácie pre reťazec č. 17:

i) vlastnosti reťazca:

A) dĺžka: 35 párov báz

B) druh: nukleová kyselina

C) typ: jednoduchý

D) topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA až mRNA xi) Opis reťazca č. 17:

CTCCGATAGG GCGTGGTACC CGGCCCTACT CTTAT 35

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Biologický spôsob výroby kyseliny 7-aminodeacetylcefalosporánovej, 7-ADAC, vyznačujúci sa t ý m , že sa

   i) v živnom prostredí, vhodnom na jeho rast kultivuje produkčný kmeň Penicillium chrysogenum, produkujúci izopenicilín N a k živnému prostrediu sa pridáva adipát, obsahujúci jednu alebo väčší počet zložiek zo skupiny kyselina adipová, jej soli a jej estery, ktoré sú produkčným kmeňom Penicillium chrysogenum asimilované a využívané na produkciu kyseliny adipoyl-6-aminopenicilánovej, adipoyl-6-ΑΡΑ, potom sa ii) vykonávajú in situ expresiou zodpovedajúceho génu nasledujúce enzymatické premeny:

   c) je expandovaný in situ kruh adipoyl-6-ΑΡΑ za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminodesacetoxycefalosporánovej, adipoyl-7-ADCA, pôsobením enzýmu expandázy, pričom kmeň P. chrysogenum bol predtým transformovaný DNA kódujúcou enzým expandázu, ktorá je schopná pôsobiť na adipoyl-6-ΑΡΑ ako na substrát, a potom je

   d) 3-metylový bočný reťazec vzniknutej adipoyl-7-ADCA in situ hydroxylovaný za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminodeacetylcefalosporánovej, adipoyl-7-ADAC, pôsobením hydroxylázy, pričom kmeň P. chrysogenum bol predtým transformovaný DNA kódujúcou enzým hydroxylázu, ktorá je schopná pôsobiť na adipoyl-7-ADCA ako na substrát, a iii) vzniknutá adipoyl-7-ADAC sa uvedie do styku s adipoylamidázou, čím dôjde k odstráneniu bočného reťazca za vzniku 7-ADAC, ktorá sa izoluje.
2. 2. Biologický spôsob výroby kyseliny 7-aminocefalosporánovej, 7-ACA, vyznačujúci sa tým, že sa

   i) v živnom prostredí, vhodnom na jeho rast pestuje produkčný kmeň Penicillium chrysogenum, produkujúci izopenicilín N a k živnému prostrediu sa pridáva adipát, obsahujúci jednu alebo väčší počet zložiek zo skupiny kyselina adipová, jej soli alebo jej estery, ktoré sú kmeňom Penicillium chrysogenum asimilované a využívané na produkciu kyseliny adipoyl-6-aminopenicilánovej, adipoyl-6-ΑΡΑ, potom sa ii) vykonávajú in situ expresiou zodpovedajúceho génu nasledujúce enzymatické premeny:

   a) je expandovaný in situ kruh adipoyl-6-ΑΡΑ za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminodesacetoxycefalosporánovej, adipoyl-7-ADCA pôsobením enzýmu expandázy, pričom kmeň P. chrysogenum bol predtým transformovaný DNA kódujúcou enzým expandázu, ktorá je schopná pôsobiť na adipoyl-6-ΑΡΑ ako na substrát, a potom je

   b) 3-metylový bočný reťazec vzniknutej adipoyl-7-ADCA in situ hydroxylovaný za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminodeacetylcefalosporánovej, adipoyl-7-ADAC, pôsobením hydroxylázy, pričom produkčný kmeň P. chrysogenum bol predtým transformovaný DNA kódujúcou tento enzým, schopný pôsobiť na adipoyl-7-ADCA ako na substrát, a

   c) vzniknutá adipoyl-7-ADAC sa in situ acetyluje za vzniku kyseliny adipoyl-7-aminocefalosporánovej, adipoyl-7-ACA, pôsobením enzýmu acetyltransferázy, pričom uvedený produkčný kmeň P. chrysogenum bol predtým transformovaný DNA kódujúcou pre enzým acetyltransferázu, ktorá je schopná pôsobiť na adipoyl-7-ADAC ako substrát, a iii) vzniknutá adipoyl-7-ACA sa uvedie do styku s adipoylamidázou, čim dôjde k odstráneniu adipoylového bočného reťazca za vzniku 7-ACA, ktorá sa izoluje.
3. 3. Biologický spôsob podľa nároku 1 alebo 2, v y značujúci sa tým, že sa ako adipát použije disodná soľ kyseliny adipovej.
4. 4. Biologický spôsob podľa nároku 1, 2 alebo 3, vyzná í u j ú c i sa tým, že DNA kódujúca enzýmy expandázu, hydroxylázu a acetyltransferázu je odvodená od Cephalosporium acremonium.
5. 5. Biologický spôsob podľa nároku laž 4, vyznačujúci sa tým, že sa použije jediný bifunkčný enzým expandáza/hydroxyláza.
6. 6. Biologický spôsob podľa nároku 1 až5,vyznačujúci sa tým, že sa použije adipoylamidáza odvodená od baktérie rodu Pseudomonas.
7. 7. Rekombinantný DNA expresný vektor s označením pPEN/CEPH-1, využiteľný na produkciu podľa nároku 1, ktorý je schopný integrovať sa do chromozomálnej DNA rekombinantného kmeňa Penicillium chrysogenum, ktorý pozostáva v podstate z DNA kódujúcej expandázu/hvdrolázu odvodenú od Cephalosporium acremonium, a promótora riadiaceho expresiu DNA kódujúcej uvedenú expandázu/hydrolázu, ktorým je v podstate promótor génu IPNS Penicillium chrysogenum, pričom promótor je spojený s expandáza/hydrolázovým génom bez toho, aby sa zmenila pôvodná sekvencia génu, pričom vektor sa nachádza v produkčnom kmeni P. chrysogenum označenom PC 200 a uloženom v ATCC 74186.
8. 8. Rekombinantný DNA expresný vektor s označením pTS-8, využiteľný na produkciu podľa nároku 2, ktorý je schopný integrovať sa do chromozomálnej DNA rekombinantného kmeňa Penicillium chrysogenum, ktorý pozostáva v podstate z DNA kódujúcej expandázu/hydrolázu a acetyltransferázu, ktoré sú odvodené od Cephalosporium acremonium, a promótora riadiaceho expresiu DNA kódujúcej uvedenú expandázu/hydrolázu a acetyltransferázu, ktorým je v podstate promótor génu IPNS Penicillium chrysogenum, pričom promótor je spojený s expandáza/hydrolázovým a acetyltransferázovým génom bez toho, aby sa zmenila pôvodná sekvencia génu, pričom vektor sa nachádza v produkčnom kmeni P. chrysogenum označenom PC 300 a uloženom v ATCC 74187.
9. 9. Produkčný kmeň Penicillium chrysogenum, označený ako PC 200 a uložený v ATCC 74186, transformovaný rekombinantným DNA expresným vektorom podľa nároku 7.
10. 10. Produkčný kmeň Penicillium chrysogenum, označený ako PC 300 a uložený v ATCC 74187, transformovaný rekombinantným DNA expresným podľa nároku 8.
11. 11. Použitie rekombinantného produkčného kmeňa Penicillium chrysogenum. ktorý' obsahuje rekombinantný DNA konštrukt podľa nároku 7, na kultiváciu v podmienkach vhodných pre expresiu génu.
12. 12. Použitie rekombinantného produkčného kmeňa Penicillium chrysogenum, ktorý obsahuje rekombinantný DNA konštrukt podľa nároku 8, na kultiváciu v podmienkach vhodných pre expresiu génu.