HU219370B - Novel bioprocesses for preparing 7-aca and 7-adac - Google Patents
Novel bioprocesses for preparing 7-aca and 7-adac Download PDFInfo
- Publication number
- HU219370B HU219370B HU9401073A HU9401073A HU219370B HU 219370 B HU219370 B HU 219370B HU 9401073 A HU9401073 A HU 9401073A HU 9401073 A HU9401073 A HU 9401073A HU 219370 B HU219370 B HU 219370B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- adipoyl
- enzyme
- expandase
- gene
- dna
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin
- C12P37/04—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin by acylation of the substituent in the 6 position
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/933—Penicillium
- Y10S435/935—Penicillium chrysogenum
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
A találmány tárgya új biológiai eljárás 7-amino-cefalosporánsav és 7-amino-dezacetil-cefalosporánsav előállítására. A cefalosporinantibiotikumok fontos intermedierjének számító 7-amino-cefalosporánsav(7-ACA) és 7-amino-dezacetil-cefalosporánsav (7-ADAC) előállításáraszolgáló új biológiai eljárás során transzformált Peni- cillumchrysogenum törzset adipátot tartalmazó közegben tenyésztve adipoil-6-amino-penicillánsavat bio- szintetizálnak. Az alkalmazott rekombinánsPenicillum chrysogenum törzs expendáz-, hidroxiláz- és adott eset- benacetil-transzformáz-enzimeket kódoló DNS-t tartalmazó rekombinánsvektorral van transzformálva, így az in situ expresszált enzimekadipoil-7-dezacetil-cefalosporánsav (adipoil-7-ADAC), illetve adipoil-7-amino-cefalo- sporánsav (adipoil-7-ACA) képződését eredményezik,amelyeket azután aolipoil-amidázzal érintkeztetnek, és így 7-ADAC-,illetve 7-ACA-végtermékeket nyernek. A teljes egészében biológiaieljárás hatékony és gazdaságos. A találmány tárgykörébe tartoznak arekombináns vektorok és a rekombináns gazdasejtek előállításáraszolgáló eljárások is. ŕ
Description
A találmány tárgya új biológiai eljárás 7-amino-cefalosporánsav és 7-amino-dezacetil-cefalosporánsav előállítására.
A különféle cefalosporinszármazékokat tartalmazó készítmények jelentős részt képviselnek a gyógyászatban alkalmazott antibiotikumok között. Jelenleg ezeknek a hatóanyagoknak a negyedik generációjáig jutottak el. A forgalomban lévő cefalosporinmolekulákban előforduló sok különféle oldallánc és a cefalosporinok kiemelkedő gazdasági jelentősége miatt egyre fontosabb a korábbiaknál hatékonyabb és gazdaságosabb eljárások kidolgozása az olyan kulcsintermedierek előállítására, melyekből a különböző cefalosporinok egyszerűen szintetizálhatok.
Az egyik ilyen kulcsintermedier a 7-amino-cefalosporánsav (7-ACA), melynek szerkezete az (I) képlet szerinti. Jelenleg a 7-ACA előállítása cefalosporin-C-ből történik. A cefalosporin-C fermentációs termék, amely szinte valamennyi forgalomban lévő cefalosporinszármazék alapanyaga. A különböző cefalosporinszármazékok szintézisének kezdő lépése többnyire a 7-amino-cefalosporánsav előállítása a cefalosporin-C 7-amino-adipoil-oldalláncának hasítása révén. A 7-ACA felhasználásával szintetizált, forgalomban lévő cefalosporinok jellemzően 3-acetil-oxi-metilén-oldalláncot tartalmaznak, mint például a cefotaxim, a cefaloglicin, a cefalotin vagy a cefapirin.
A másik kulcsintermedier a 7-amino-dezacetil-cefalosporánsav (7-ADAC), melynek szerkezete a (II) képlet szerinti. Jelenleg a 7-ADAC előállítása is cefalosporin-C-ből történik, a 7-D-a-amino-adipoil-oldallánc hasítása, valamint a 3-acetil-oxi-metilén-oldallánc 3-hidroxi-metillé alakítása révén. A 7-ADAC különösen azoknak a cefalosporinoknak az előállítása során előnyös intermedier, amelyek módosított szubsztituenseket tartalmaznak a C-3-helyzetben.
A technikai jelenlegi állása szerint a 7-amino-adipoil-oldallánc hasítása legelőnyösebben kémiai módszerrel végezhető el. Az imino-halid-eljáráshoz előzetesen blokkolni kell a 7-amino-adipoil-oldallánc aminoés karboxilcsoportját egyaránt. Erre jelenleg többféle módszert is alkalmaznak, de a kémiai hasításnak nyilvánvaló hátrányai vannak. Ilyen egyebek között a többlépéses, bonyolult eljárás, a biztosítandó rendkívül alacsony hőmérséklet, a drága reagensek alkalmazása, a hulladékkezelési gondokat okozó jelentős mennyiségű melléktermék keletkezése, valamint az a tény, hogy az erősen szennyezett kiindulási anyagot tisztítani kell a kémiai reakció megkezdése előtt. Mindezek miatt tovább folyt a kutatás olyan mikrobiológiai vagy fermentációs eljárások után, amelyek lehetővé tennék 7-amino-cefalosporánsav előállítását cefalosporin-C enzimatikus dezacetilezésével, a jelenleg használt kémiai eljárásnál gazdaságosabban.
Az FR-1 270 852 számú irat 6-amino-pencillinsav enzimatikus úton 6-amido-penicillin-származékokká történő acilezését ismerteti.
A Journal of Biological Chemistry, 266(&): 5087-5093. (1991) irodalmi helyen B. Baker és munkatársai a dezacetoxi-cefalosporin-C-hidroxiláz S. clavuligerusbói történő tisztítását ismertetik.
Az EP-275 901 számú irat α-keto-adipil- vagy glutaril-7-amino-cefalosporánsav transzpeptidázzal történő hidrolizálását ismerteti.
A JP-2 291 274 számú irat olyan, baktériumsejtből származó DNS-fragmenst ismertet, amely a cefalosporin bioszintézisében részt vevő enzimeket kódoló géncsoportot tartalmaz. A géncsoport legalább egy olyan gént tartalmaz, amely szintetázt, izopenicillin-N-szintetázt, izopenicillin-N-epimerázt, dezacetoxi-cefalosporin-C-szintetázt, hidroxilázt vagy β-laktamázt kódol, továbbá rekombináns expressziős vektorokat, amelyek Aspergillus eredetű izopenicillin N: acilCoA-aciltranszferázt kódolnak.
A J. Ferment. Bioeng. 72(4) 227-231. (1991) irodalmi helyen I. Aramori és munkatársai olyan, talajból izolált törzseket ismertetnek, amelyek cefalosporin-acilázt termelnek, amelyek azután cefalosporinok 7-ACAvá történő átalakítására alkalmazhatók.
A megfelelő mikrobiológiai eljárás kidolgozására irányuló kutatómunka azonban lényegében mindeddig nem érte el a célját. Az ok - amint ez a szakirodalomból kitűnik - molekulaszerkezeti, mégpedig sztereokémiái jellegű és a cefalosporin-C amino-adipoil-oldalláncával kapcsolatos, hiszen a rokon szerkezetű penicillint sikerült enzimatikusan dezacetilezni penicillin-acilázzal, melyet egy sereg mikroorganizmus is termel. Léteznek ugyan szakirodalmi közlések a cefalosparin-C sikeres, egylépéses enzimatikus dezacetilésére vonatkozóan, de az ilyen eljárások eredménye gyakran reprodukálhatatlan, vagy a hozamuk elenyésző.
A fentiek alapján a jelen találmány 7-ACA eefalosporin kulcsintermedier előállítására, közelebbről 7-ACA biológiai módszerrel történő előállítására vonatkozik.
A 7-ACA biológiai eljárással való előállítását célzó kutatások mindeddig eredménytelennek bizonyultak, legalábbis az ipari alkalmazhatóságot illetően. Az az elképzelés például, hogy a közvetlen fermentációval és/vagy penicillin-G enzimatikus hasításával előállítható 6-amino-penicillánsavból (6-APA) gyúrútágítással készítsenek 7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsavat (7-ADCA), azon bukott meg, hogy a Cephalosprorium vagy Streptomyces törzsekben lévő, a nomális anyagcsereútban a gyúrútágítást végző enzimek nem fogadták el szubsztrátumként a 6-amino-penicillánsavat. A szóban forgó enzimek, melyeket a szakirodalom összefoglalóan DAOCS vagy expandáz elnevezéssel illet, a penicillin típusú molekulákban lévő penámgyűrút tágítják a cefaiosporinokban meglévő cef-3-ém-gyúrúvé. Az ilyen enzimeket a továbbiakban „expandázenzimeknek” nevezzük.
Az expandázenzim természetes szubsztrátuma a penicillin-N, amelyből a gyúrútágítás és hidroxilezés eredményeképpen dezacil-cefalosporánsav (DAC) keletkezik. Erről a molekuláról már csak a D-a-amino-adipoil-oldalláncot kellene lehasítani, hogy megkapjuk a 7-ADAC-t, de ez az oldallánc meglepően ellenállónak bizonyul az enzimatikus hasítással szemben, ami elfogadhatatlanul alacsony hozamot eredményez.
A jelen találmány szerint lehetőség van hatékony biológiai eljárás kivitelezésére a következő módon:
HU 219 370 Β
- olyan adipoil-oldallánccal rendelkező penicillinvegyületet állítunk elő új fermentációs eljárással, magas koncentrációban, amely penicillinvegyület szubsztrátuma az expandázenzimnek;
- a penicillint bioszintetizáló mikroorganizmusban klónozzuk az expandázgént, melynek kifejeződése révén a mikroorganizmus az expandázenzimet in situ termeli;
- az expandáz a penicillinvegyületen működve tágítja a gyűrűt és magas hozammal állít elő cefalosporinvegyületet.
Az expandázenzim in situ működése során keletkező adipoil-7-ADCA 3-metiloldalláncot tartalmaz, a 7-ACA-végtermék oldallánca viszont 3-acetil-oxi-metil-csoport. A 3-metiloldallánc 3-acetil-oxi-metillé alakítása érdekében a találmány értelmében eljárva, az expandázon kívül két további enzimaktivitás in situ expresszióját valósítjuk meg. Ezek az enzimet sorrendben a hidroxiláz és az acetil-transzferáz, melyek mindketten azoknak a géneknek a termékei, melyekkel a penicillint bioszintetizáló mikroorganizmust transzformáltuk. A hidroxilázenzim az adipoil-7-ADAC 3-metiloldalláncát 3-hidroxi-metillé alakítja, majd az acetiltranszferáz működése következtében jön létre a 7-ACA 3-acetil-oxi-metil-oldallánca.
A jelen találmány szerinti módszer utolsó kritikus lépéseként az egykori penicillin-, most cefalosporinvegyület oldallánca egy másik enzimrendszer segítségével meglepően magas hozammal eltávolítható. A jelen találmány szerinti egyedülálló, teljes egészében biológiai eljárás váratlan eredménye a 7-ACA meglepően magas hozammal történő előállítása olyan gazdaságosan, hogy az ésszerű alternatíváját jelenti a jelenleg használatos kémiai és biokémiai módszereknek.
A jelen találmány szerinti biológiai eljárás olyan egyedülálló és meglepően hatékony módszert biztosít 7-ACA előállítására, amely gazdaságosságát tekintve is életképes alternatívája a jelenlegi kémiai szintézisnek. Az ilyen biológiai eljárás kidolgozására tett korábbi folyamatos erőfeszítések sorra sikertelennek bizonyultak. Az EP-A 0 422 790 számú szabadalmi bejelentés például izopenicillin-N:acil-KoA acil-transzferáz-aktivitást kódoló, Aspergillus nidulans eredetű DNS-szakaszra és annak penicillintermelő gombákban, cefalosporinok előállítására történő alkalmazására vonatkozik, ám az eljárás máig sem került ipari megvalósításra. Papíron ismeretes mindez az acetil-transzferáz-gén roncsolásával, illetve helyettesítésével, valamint a cefalosporintermelő mikroorganizmusokból származó epimeráz- és expandázgének bevitelével, de úgy tűnik, hogy valamirevaló transzformációs vagy expressziós eredményeket nem sikerült elérni. Ha az ilyen transzformáció sikeres eredménnyel is járt volna, nem befolyásolná a jelen találmány célját, hiszen a D-a-amino-adipoil-oldallánc eltávolításának problémáját nem érinti. Az ilyen sikertelen kísérletek arra, hogy penicillintermelő gombákat eredményesen használjanak fel cefalosporinok ipari előállítására, szöges ellentétben állnak a jelen találmány szerinti eljárás alkalmazása során elért eredményekkel.
A jelen találmány szerinti módszer első enzimatikus lépése az adipoil-6-ΑΡΑ gyűrűtágítása expandázenzimmel történik, mely annak az expandázgénnek az expressziós terméke, amellyel a nem rekombináns Penicillium chrysogenum gazdaszervezetet transzformáltuk. Az ilyen expandázenzim alkalmazása ismeretes korábbról. Cantwell és munkatársai [Curr. Génét. 17, 213-221. (1990)] például olyan biológiai eljárást javasoltak 7-ADAC előállítására penicillin-V-ből, melynek során a gyűrűtágítást a keletkező dezacetoxi-cefalosporin-V enzimatikus hidrolízise követi. Ennek a javaslatnak az alapját a Streptomyces clavuligerus eredetű klónozott penicillin-N expandázgén (ce/E) [Kovacevic et al., J. Bacteriol. 171, 754-760. (1989); Ingolia et al., US 5 070 020] hozzáférhetősége jelenti. Az expandáz azonban csak természetes szubsztrátumán, az izopenicillin-N-molekulán működik, penicillin-V-n nem. így a javaslat megvalósítása génsebészeti beavatkozást kíván olyan módosított expandázgén előállítása érdekében, amely képes a penicillin-V gyűrűtágításra. A szükséges módosítást nem tudták Cantwell és munkatársai végrehajtani, valójában csak annyit sikerült elérniük, hogy a Streptomyces clavuligerus eredetű ce/E génnel Penicillium chrysogenumot transzformálva a DAOCS (expandáz)-enzim alacsony szintű expresszióját figyelhették meg.
Az expandázenzimet alaposan tanulmányozták mind aktivitását, mind pedig génszekvenciáját illetően. Wolfe (US 4 510 246 és 4 536 476) például cikláz-, epimerazés expandázenzimeket izolált külön-külön β-laktámtermelő prokariótaszervezetek, egyebek között Streptomyces clavuligerus sejtmentes kivonatából, stabil enzimreagens előállítása céljából. Dotzlaf [US 5 082 772 (EP-A 0 366 354)] Streptomyces clavuligerus eredetű expandázenzim izolálását ismerteti, és jellemzi az enzimet a terminálisokkal, valamint az aminosav-összetétellel. Mérései szerint az enzimfehéqe molekulatömege 34 600 D körüli, ami azonban ellentmond a korábban közölt (US 4 536 476) 29 000 D-os értéknek. Az EP-0 233 715 számú szabadalmi leírás ismerteti a Streptomyces clavuligerus expandázgénjének izolálását, restrikciós endonukleázos térképét, valamint az aktív expandázt eredményező rekombináns expandázt kódoló DNS expresszióját cefalosporintermelésre képtelen Streptomyces clavuligerus törzsben. Ingolia és munkatársai [US 5 070 020 (EP-A 0 341 892)] közlik a Streptomyces clavuligerus expandázenzimjét kódoló DNS bázissorrendjét, valamint beszámolnak arról, hogy a szóban forgó DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós vektorral sikeresen transzformáltak Penicillium chrysogenum törzset, és megfigyelték az expandázenzim expresszióját. Jóllehet úgy tűnik, hogy ez az enzim alkalmas más szubsztrátumok gyűrűtágítására is, mint a penicillin-N, ilyesmire valójában semmi bizonyíték nincs.
A fentiekben ismertetett munka a prokarióta Streptomyces clavuligerus expandázenzimjére koncentrált. Ugyanilyen gyűrűtágító aktivitással rendelkező enzim található az eukarióta Cephalosporium acremonium (más néven Acremonium chrysogenum) törzsekben is. Az ilyen törzsekben az expandáz expressziója bifunkcioná3
HU 219 370 Β lis génről (ce/EF) történik, mely a DACS (hidroxiláz)-aktivitást is expresszálja, melynek eredeti funkciója az expandáz működésének eredményeként keletkező dezacetoxi-cefalosporánsav (DAOC) átalakítása dezacetil-cefalosporin-C (DAC)- molekulává. Az expresszió eredménye egyetlen, de bifunkcionális expandáz/hidroxiláz enzim. Jóllehet történtek erőfeszítések arra, hogy a kétféle aktivitást elkülönítsék, de ezek eddig nem jártak sikerrel. Az EP-A 0 281 391 számú szabadalmi leírásban például közlik a Cephalosporium acremonium ATCC 11550 törzsből izolált DAOCS/DACS gén DNS-szekvenciájának azonosítását, valamint a megfelelő enzim aminosavsorrendjét. Pencillium törzset transzformálva expresszálták az enzimeket, de nem igazolták penicillin-N és -V átalakítását a megfelelő cefalosporinszármazékokká. Annak ellenére, hogy a génmanipulációs módszerek látszólag lehetőséget nyújtanak a DAOCS- és DACS-aktivitást kódoló genetikai információ elkülönítésére és szeparált expressziójára, valójában ezt még senki sem demonstrálta.
A Cephalosporium acremonium DAOCS/DACS enzimjét is alaposan tanulmányozták, mind aktivitását, mind tulajdonságait, mind pedig génszekvenciáját illetően. Demain (US 4 178 210; 4 248 966 és 4 307 192) például különböző penicillin típusú vegyületeket sejtmentes Cephalosporium acremonium kivonattal kezelve epimerizáció és gyűrűtágítás révén cefalosporin antibiotikum terméket kapott. Wu-Kuang Yeh (US 4 753 881) a Cephalosporium acremonium enzimjét az izoelektromos ponttal, a molekulatömeggel, az aminosavmaradékokkal, a hidroxiláz/expandáz aktivitás arányával, valamint peptidffagmensekkel jellemzi.
A Cephalosporium acremonium acetil-transzferázenzimje is szerepel a szakirodalomban, tekintettel aktivitására, tulajdonságaira, restrikciós térképére, valamint nukleinsav- és aminosavszekvenciájára (EP-A 0437 378 és 0 450 758).
Valamennyi ismertetett munka a jelen találmánynak csak egyetlen mozzanatával foglalkozik, azzal, hogy az expandáz-, illetve az expandáz/hidroxiláz enzimet kódoló génekkel Penicillium chrysogenum törzset transzformáinak és az enzimeket expresszálják. Az expresszált enzimeket azonban kivétel nélkül a penicillin-N gyűrűtágítására használják, nem pedig a penicillin-G és -V átalakítására. Még ebben az esetben is jelentkezik azonban egy súlyos probléma: a penicillin-N olyan oldalláncot tartalmaz a 7-es helyzetben, amely enzimatikusan nem távolítható el, így szabad aminocsoport nem alakítható ki. A jelen találmány azon a meglepő felismerésen alapszik, hogy
- a Penicillium chrysogenum törzs hatékonyan képes adipoil-oldalláncot kialakítani;
- az in situ expresszált expandázenzim képes az ilyen oldallánccal rendelkező vegyületet szubsztrátumként felhasználni és abból gyűrűtágítással adipoil-7ADCA-molekulát létrehozni;
- a szintén in situ expresszált hidroxiláz- és acetiltranszferáz-enzimek képesek hasznosítani az adipoil7-ADCA-molekulát szubsztrátként és kialakítani rajta a 3-acetoxi-metil-oldalláncot, és
- az adipoil-oldallánc hatékonyan eltávolítható egy további enzim közreműködésével, és így 7-ACA-termékhez jutunk.
Jóllehet a jelen találmány egyes elemei fellelhetők a szakirodalomban, ám arra nincs utalás, hogy ezek kombinációja révén elérhetők volnának a jelen találmány szerinti módszerrel kapható váratlan eredmények.
A 6-adipoil-penicillánsav előállítása például önmagában ismeretes [Ballio, A. et al., Natúré, 185, 97-99. (1960)]. A 6-adiopil-penicillánsav enzimatikus gyűrűtágítása szintén ismert, de kizárólag in vitro körülmények között [Baldwin et al., Tetrahedron, 43, 3009-3014. (1987); EP-A 0 268 343]. Az adipoil-oldallánc enzimatikus hasítása sem ismeretlen az irodalomban [például Matsuda et al., J. Bact., 169, 5815-5820. (1987)].
Az adipoil-oldallánc szerkezete:
COOH-(CH2)4-CO~, két közeli rokon szerkezetű oldalláncnak, a glutarilnak és a D-a-amino-adipoilnak a szerkezete: COOH-(CH2)3-CO-, illetve COOH-CH(NH2)-(CH2)3-CO-. A glutariloldallánc enzimatikus hasítása az irodalomban ismert [például Shibuya et al., Agric. Bioi. Chem., 45, 1561-1567. (1981) és US 3 960 662; Matsuda & Komatsu, J. Bact., 163, 1222-1228. (1985); Matsuda et al., J. Bact., 169, 5815-5820. (1987); JP 53-086084 (1978); JP 52-128293 (1977)]. Az EP-A 0 453 048 számú szabadalmi leírás a Pseudomonas SY-77-1 törzs glutarilacilázának adipoilhasító aktivitását fokozó módszereket ismertet. Az alfa-alegység bizonyos helyein különböző aminosavakat kicserélve az adipoilhasítás (adipoil-szerin szubsztrátumon) sebességének három-ötszörös fokozódását figyelték meg. Megjegyzendő azonban, hogy az EP-A 0 453 048 számú szabadalmi leírásban kimutatják egy aciláz megnövekedett aktivitását az adipoil-oldallánc iránt, de semmi olyan módszert nem említenek (akár kémiai, akár biológiai módszert, amely megegyezne a jelen találmányban leírtakkal), amellyel közvetlenül adipoil-cefalosporin volna előállítható.
D-a-Amino-adipoil-oldallánc jelenléte esetén ismeretes az irodalomban olyan megoldás is, hogy előbb az aminocsoport enzimatikus eltávolításával, D-aminosavoxidáz segítségével megrövidítik a láncot, és a visszamaradó glutariloldalláncot egy második enzim (glutarilaciláz) alkalmazásával hasítják le. Ilyen kétlépéses hasítás több irodalmi helyen is megtalálható [Matsuda, US 3 960 662; JP 61-218057 (1988); WO 90/12110 (1990); EP-A 0436 355; Isogai et al., Bio/Technology, 9, 188-191.(1991)].
Ismertek olyan megoldások is, melyekben a D-aadipoil-oldallánc hasítása egyetlen lépésben történik, elsősorban rekombináns technikák alkalmazásával. Ilyenek például az alábbiak:
Egylépéses D-ct-amino-adipoil-oldallúnc hasítása
- JP 53-94093 (Meiji, Pseudomonas sp. BN-188);
- JP 52-143289 (=US 4 141 790, Meiji, Aspergillus sp.)·,
- US 4 774 179 (Asahi, 1988, Pseudomonas sp. SE-83 és SE-495)=JP 61-21097 és JP 61-152286;
HU 219 370 Β
- F 2 241 557 (Aries, 1975, Bacillus cereus var. fluorescens);
- JP 52-082791 (Toyo Jozo, 1977, Bacillus megaterium NRRL B 5385);
- EP-A 0 321 849 (Hoechst, Pseudomonas, Bacillus subtilis, γ-glutamil-transzpeptidáz);
- EP-A 0 322 032, 0 405 846 és US 5 104 800 (Merck, Bacillus megaterium);
- EP-A 0 283 218 és US 4 981 789 (Merck, Arthrobacter viscosus).
Egylépéses rekombináns technika: cefalosporin-C-7-ACA;
- JP 60-110292 (Asahi, 1985, Comamonas, rekombináns Escherichia coli, Comamonas sp. SY-77-1 génnel, egylépéses átalakítás);
- JP 61-152286 (Asahi, 1986, Pseudomonas, rekombináns Escherichia coli, Pseudomonas SE-83 génnel, génszekvenciák, egylépéses eljárás, bejelentve US 4 774 179);
- JP 63-74488 (Asahi, 1988, Trigonopsis variábilis, Comamonas, D-aminosav-oxidáz- és GL-7-ACAoxidáz-konstrukció expressziója rekombináns Escherichia coliban);
- EP-A 0 475 652 (Fujisawa, cefalosporin-C-aciláz és előállítása rekombináns technológiával).
Ismeretesek különböző módszerek 7-ADAC előállítására is (US 3 304 236 és 3 972 774; EP-A 0 454 478; valamint a 04 53 499 számú japán közrebocsátási irat).
Hivatkozunk még a 07/933469 sorszámú, 1992. augusztus 28-i keltezésű szabadalmi bejelentésre (magyar ügyiratszáma P 94 00715), amely 7-ADCA biológiai módszerrel történő előállítására vonatkozik. Az eljárás lényege expandázenzim-aktivitás expressziója Penicillium chrysogenum transzformánsban éppúgy, mint a jelen találmány szerinti, 7-ADAC és 7-ACA előállítására szolgáló eljárásban. A jelen találmány szerinti biológiai eljárás során azonban további transzformációkat alkalmazunk további enzimaktivitások expressziója érdekében, hogy végül is teljesen eltérő anyagcsereúton egyértelműen más termékekhez jussunk, amelyek egyikére sincs utalás az említett bejelentésben.
A jelen találmány szerinti módszerek, valamint a hivatkozott irodalmi közlések lényegének teljesebb érhetősége érdekében mellékeljük az anyagcsereutak sémáját, melyen a 6-adipoil-APA-, adipoil-7-ADCA-, adipoil-7-ACA- és 7-ACA-mtermedierek, illetve -termékek keletkeznek, feltüntetve a bioszintézis során szerepet játszó enzimeket is.
A jelen találmány tárgya új biológiai eljárás 7-amino-dezacetil-cefalosporánsav (7-ADAC) előállítására, amely a következő lépésekből áll:
1. izopenicillin-N-termelő Penicillium chrysogenum törzset a megfelelő növekedést biztosító tápközegben tenyésztünk, a tenyészethez adipátot (adipinsavat, sóit és/vagy észtereit tetszőleges arányban) tartalmazó tápanyagot adunk, amelyet a szóban forgó Penicillium chrysogenum törzs képes hasznosítani az adipoil-6-amino-penicillánsav (adipoil-6APA) bioszintézise során, és így adipoil-6-ΑΡΑ képződik;
2. a megfelelő gének in situ expressziója révén az alábbi enzimatikus átalakításokat hajtjuk végre:
a) adipoil-6-APA-molekulából in situ gyűrűtágítással adipoil-7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsavat (adipoil-7-ADCA) állítunk elő expandázenzim segítségével, minthogy a szóban forgó Penicillium chrysogenum törzset adipoil-6-APA-szubsztrátumot hasznosítani képes expandázenzim-aktivitást kódoló DNS-sel transzformáltuk, és a gén expressziója révén keletkező enzim a törzs által termelt adipoil-6-ΑΡΑ in situ gyűrűtágításával hozza létre az adipoil-7-ADCA- molekulát;
b) az adipoil-7-ADCA 3-metiloldalláncát in situ hidroxilezve adipoil-7-amino-dezacetil-cefalosporánsavat (7-ADAC) állítunk elő hidroxilázenzim segítségével, minthogy a szóban forgó Penicillium chrysogenum törzset adipoil-7ADCA-szubsztrátumot hasznosítani képes hidroxilázenzim-aktivitást kódoló DNS-sel transzformáltuk, és a gén expressziója révén keletkező enzim a törzs által termelt adipoil-7-ADCA in situ hidroxilezésével hozza létre az adipoil-7ADAC-molekulát;
3. a képződött adipoil-7-ADAC adipoil-oldalláncát adipoil-amidáz-enzim segítségével eltávolítjuk, hogy megkapjuk a 7-ADAC-terméket, melyet azután elkülönítünk.
A találmány tárgya továbbá olyan új biológiai eljárás is, amely 7-amino-cefalosporánsav (7-ACA) előállítására vonatkozik, és a következő lépésekből áll:
1. izopenicillin-N-termelő Penicillium chrysogenum törzset a megfelelő növekedést biztosító tápközegben tenyésztünk, a tenyészethez adipátot (adipinsavat, sóit és/vagy észtereit tetszőleges arányban) tartalmazó tápanyagot adunk, amelyet a szóban forgó Penicillin chrysogenum törzs képes hasznosítani az adipoil-6-amino-penicillánsav (adipoil-6APA) bioszintézise során, és így adipoil-6-ΑΡΑ képződik;
2. a megfelelő gének in situ expressziója révén az alábbi enzimatikus átalakításokat hajtjuk végre:
a) adipoil-6-APA-molekulából in situ gyűrűtágítással adipoil-7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsavat (adipoil-7-ADCA) állítunk elő expandázenzim segítségével, minthogy a szóban forgó Penicillium chrysogenum törzset adipoil-6-APA-szubsztrátumot hasznosítani képes expandázenzim-aktivitást kódoló DNS-sel transzformáltuk, és a gén expressziója révén keletkező enzim a törzs által termelt adipoil-6-ΑΡΑ in situ gyűrűtágításával hozza létre az adipoil-7-ADCA- molekulát;
b) az adipoil-7-ADCA 3-metiloldalláncát in situ hidroxilezve adipoil-7-amino-dezacetil-cefalosporánsavat (7-ADAC) állítunk elő hidroxilázenzim segítségével, minthogy a szóban forgó Penicillium chrysogenum törzset adipoil-7ADCA-szubsztrátumot hasznosítani képes hidroxilázenzim-aktivitást kódoló DNS-sel transzformáltuk, és a gén expressziója révén keletkező enzim a törzs által termelt adipoil-7-ADCA in
HU 219 370 Β situ hidroxilezésével hozza létre az adipoil-7ADAC-molekulát;
c) az adipoil-7-ADAC-t acetilezve adipoil-7-amino-cefalosporánsavat (adipoil-7-ACA) állítunk elő acetil-transzferáz-enzim segítségével, minthogy a szóban forgó Penicillium chrysogenum törzset adipoil-7-ADAC-szubsztrátumot hasznosítani képes acetil-transzferáz-enzim-aktivitást kódoló DNS-sel transzformáltuk, és a gén expressziója révén keletkező enzim a törzs által termelt adipoil-7-ADAC in situ acetilezésével hozza létre az adipoil-7-ACA-molekulát;
3. a képződött adipoil-7-ACA adipoiloldalláncát adipoil-amidáz-enzim segítségével eltávolítjuk, hogy megkapjuk a 7-ACA-terméket, melyet ezután elkülönítünk.
Az itt használt rövidítések az alábbi vegyületekre vonatkoznak:
„7-ACA”=3-[(acetil-oxi)-metil]-7-amino-8-oxo-5-tia1- azabiciklo[4.2.0]okt-2-én-2-karbonsav „adipoil-6-APA”=[2S-(2a,5a,6b)]-3,3-dimetil-7-oxo6-[(hexán-l,6-dioil)-amino]-4-tia-l-azabiciklo[3.2.0]heptán-2-karbonsav;
,,adipoil-7-ADCA” = 3-metil-7-[(hexán-l,6-dioil)amino]-3-metil-8-oxo-5-tia-l-azabiciklo[4.2.0]okt2- én-2-karbonsav;
„adipoil-7-ADAC”=3-hidroxi-metil-7-[(hexán-1,6dioil)-amino]-3-metil-8-oxo-5-tia-l-azabiciklo[4.2.0]okt-2-én-2-karbonsav.
A találmány tárgya közelebbről a fentiek szerint új biológiai eljárás 7-amino-dezacetil-cefalosporánsav (7-ADAC) és 7-amino-cefalosporánsav (7-ACA) előállítására, melyben adipáttartalmú tápanyagként dinátrium-adipátot alkalmazunk; amelyben az expandáz-, a hidroxiláz- és az acetil-transzferáz-enzimeket kódoló DNS Cephalosporium acremonium törzsből származik; és amelynek során Pseudomonas törzsből származó adipoil-aciláz-enzimet használunk.
A találmány vonatkozik továbbá azokra a rekombináns DNS-expressziós vektorokra is, melyek a Cephalosporium acremonium törzsből származó expandáz-, hidroxiláz- és acetil-transzferáz-enzimeknek megfelelő aktivitást kódoló DNS-t tartalmazzák, valamint azokra a promoterekre is, amelyek a szóban forgó enzimeket kódoló gének expresszióját vezérlik a pPEN/CEPH-1, pPENCACT és pTS-8 plazmidokon a későbbiekben ismertetettek szerint.
Vonatkozik továbbá a találmány a Cephalosporium acremonium törzsből származó expandáz-, hidroxilázés acetil-transzferáz-enzimeknek megfelelő aktivitást kódoló DNS-t tartalmazó rekombináns DNS- expressziós vektorokkal transzformált Penicillium chrysogenum gazdasejtekre is, melyek tartalmazzák a szóban forgó enzimeket kódoló DNS expresszióját vezérlő promotert, ami a Penicillium chrysogenum IPNS- gén promotere. A találmány közelebbről olyan Penicillium chrysogenum gazdasejtekre vonatkozik, melyeket pPEN/CEPH-1, pPENCACT és pTS-8 plazmid-alapú rekombináns DNS-expressziós vektorokkal transzformáltunk a későbbiekben ismertetett módon.
Végül vonatkozik a találmány a rekombináns Penicillium chrysogenum gazdasejtek tenyésztésének olyan módszereire, melyek megfelelőek a gének expressziójához olyan rekombináns gazdasejtek esetében, melyek tartalmazzák a Cephalosporium acremonium törzsből származó expandáz-, hidroxiláz- és acetil-transzferázenzimeknek megfelelő aktivitást kódoló DNS-t hordozó rekombináns DNS-expressziós vektorokat, valamint a szóban forgó enzimeket kódoló DNS expresszióját vezérlő promotert, ami a Penicillium chrysogenum IPNSgén prometere. A találmány közelebbről a rekombináns Penicillium chrysogenum gazdasejtek tenyésztésének olyan módszereire vonatkozik, melyek megfelelőek a gének expressziójához olyan rekombináns gazdasejtek esetében, melyek a pPEN/CEPH-1, pPENCACT és pTS-8 plazmid-alapú rekombináns DNS-expressziós vektorokat tartalmazzák a későbbiekben ismertetettek szerint.
A jelen találmány elsődleges célja új biológiai eljárás biztosítása 7-amino-cefalosporánsav (7-ACA) és 7amino-dezacetil-cefalosporánsav (7-ADAC) előállítására. Ezek a vegyületek a forgalomban lévő szintetikus cefalosporin gyógyszerhatóanyagok kulcsintermedierjei, szerkezetük az (I) és (II) képlet szerinti.
A cefalosporinváz mellett jellegzetes szerkezeti eleme a 7-ACA-molekulának a 7-aminocsoport, valamint a 3-acetil-oxi-metil-csoport (melyet gyakran 3-acetoximetilnek is hívnak). A 7-aminocsoport az egyik olyan pontja a molekulának, melyhez különböző oldalláncok kapcsolhatók, és így különféle forgalomban lévő cefár losporin gyógyszerhatóanyagok szintézise valósítható meg. A 3-acetil-oxi-metil-csoportot gyakran más oldallánccá alakítják forgalomban lévő cefalosporin gyógyszerhatóanyagok szintézise érdekében.
A jelen találmány szerinti eljárás végterméke, a 7-ACA, valamint intermedierje, a 7-ADAC lényegileg tér el egy másik cefalosporin kulcsintermediertől, a cefalosporin-C-től, melynek szerkezete a (D) képlet szerinti. Ennek az intermediernek a 7-D-a-amino-adipoiloldallánca nem alkalmas szintetikus származékok előállítására, ezért el kell távolítani, hogy a sokkal megfelelőbb 7-aminocsoporthoz jussunk. Sajnálatos módon a 7-D-a-amino-adipoil-oldallánc eltávolítása mindig is nehéz dolognak bizonyult, kémiai és biokémiai úton egyaránt.
A jelen leírásban, különösen annak a példákra vonat-
| kozó részében az alábbi rövidítéseket használjuk: | |
| 7-ACA | 7-amino-cefalosporánsav |
| 7-ADAC | 7-amino-dezacetil-cefalosporánsav |
| 7-ADCA | 7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsav |
| 6-APA | 6-amino-penicillánsav |
| DAOC | dezacetoxi-cefalosporánsav |
| DAOCS | DAOC-szintetáz |
| DAC | dezacetil-cefalosporin-C |
| DACS | DAC-szintetáz |
| IPNS | izopenicillin-N-szintetáz |
| Tris | Tris[hidroxi-metil]-amino-metán |
| EDTA | etilén-diamin-tetraecetsav |
| DEPC | dietil-pirokarbonát |
| TE | Tris/EDTA puffer |
HU 219 370 Β
SSC nátrium-klorid/nátrium-citrát puffer
SDS nátrium-dodecil-szulfát
PEG polietilénglikol
A jelen találmány szerinti eljárás első lépésében izopenicillin-N-termelő Penicillium chrysogenum törzset a megfelelő növekedést biztosító tápközegben tenyésztünk, a tenyészethez adipátot (adipinsavat, sóit és/vagy észtereit tetszőleges arányban) tartalmazó tápanyagot adunk, amelyet a szóban forgó Penicillium chrysogenum törzs képes hasznosítani az adipoil-6amino-penicillánsav (adipoil-6-ΑΡΑ) bioszintézise során. Az adipáttartalmú tápanyag hozzáadható a tápközeghez a Penicillium chrysogenum törzssel végzett oltás után is, de előnyösen a tápközeg már oltás előtt tartalmazza.
A Penicillium chrysogenum törzsön kívül más, a Penicillium nemzetséghez tartozó vagy akár távolabbi fajok, például az Aspergillus nidulans is termelnek izopenicillin-N-t. Történetileg úgy alakult azonban, hogy a legjobb izopenicillin-N-termelő törzseket a chrysogenum fajból nemesítették ki, közismert módszerekkel. Gyakorlati szempontok indokolják, hogy a jelen találmányt a Penicillium chrysogenum törzsekre korlátozzuk, jóllehet nyilvánvalóan más fajok is alkalmazhatók erre a célra. Bármely közgyűjteményben szereplő vagy más forrásból nyilvánosan hozzáférhető Penicillium chrysogenum törzs alkalmas kiindulópontja a jelen találmány szerinti módszer kivitelezésének.
Az izopenicillin-N-termelő Penicillium chrysogenum törzs megfelelő növekedést biztosító tápközegben való tenyésztése a szakmában jártasak számára nem jelent gondot. A tenyésztés például kivitelezhető szubmerz aerob fermentációs módszerrel, a tápközeg pedig egy sor alkalmas táptalaj közül tetszés szerint választható. Szénforrásként a tápközegben általában szacharózt, glükózt vagy keményítőt; nitrogénforrásként szójalisztet vagy -darát, gyapotmagolajat, földimogyorólisztet, különböző aminosavakat, ezek elegyét vagy peptonokat használhatunk. A termelés szempontjából nem közömbös a hozam, valamint a termék kinyerhetősége, ezért előnyösen melasz szénforrást és szójaliszt, valamint aminosav nitrogénforrást alkalmazunk.
Szokás szervetlen tápsókat is adni a tápközeghez, amelyek biztosítják a mikrobasejtek ellátottságát nátrium-, kálium-, ammónium-, kalcium-, foszfát-, szulfát-, klorid-, bromid-, nitrát-, karbonát-, vas-, magnézium-, mangán- stb. ionokból. A nyomelemek általában szintén elengedhetetlenek a Penicillium chrysogenum növekedéséhez, fejlődéséhez és anyagcseréjéhez, és hozzáadhatok a tenyészethez, amennyiben a többi tápanyag nem tartalmazza ezeket szennyezésként.
A Penicillium chrysogenum törzs tenyészthető kis térfogatban, például 1 dm3-es Erlenmeyer-lombikban rázatva, amennyiben kis mennyiségű adipoil-7-ACA, illetve 7-ACA előállítása a célunk. Ha nagyobb mennyiségű adipoil-7-ACA-termelésre van szükség, akkor azonban nagyméretű tankfermentorokban szubmerz fermentációs körülmények között kell végezni a tenyésztést.
Nagyléptékű adipoil-7-ACA-gyártáshoz a Penicillium chrysogenum törzs spóráinak fenntartása szilárdított táptalajon történik. A szilárdított táptalajon előállított spórák felhasználásával kis térfogatú vegetatív táptalajt oltunk. A beoltott vegetatív táptalajon sűrű, friss, aktív növekedésű tenyészetet hozunk létre. Ez a vegetatív tenyészet szolgál a nagyléptékű fermentációs tápközeg oltóanyagául. Némely esetben ajánlatos még egy vegetatív fázisú tenyésztés közbeiktatása, mielőtt a fermentációs táptalajt oltanánk. Általában akkor alkalmazzuk ezt a második vegetatív lépcsőt, ha a fermentációs táptalaj térfogata jelentősen nagyobb, mint a vegetatív tenyészeté. Ebben az esetben a spórákkal indított vegetatív tenyészet szolgál a második vegetatív fázis oltóanyagául. A második, nagyobb térfogatú vegetatív tenyészet már kellő mikrobakoncentrációt biztosít az iparim méretű fermentorban lévő táptalaj oltásához, a fermentációs folyamat gyors beindításához. A vegetatív táptalaj összetétele megegyezhet a fermentációs táptalajéval, de adott esetben tartalmazhat további komponenseket, a mikroorganizmus növekedésének és fejlődésének serkentésére a kisebb méretben.
A találmány szerinti eljárás során alkalmazott Penicillium chrysogenum törzs sikeresen tenyészthető 20 és 30 °C közötti hőmérsékleten, optimális eredmény eléréséhez azonban 22 és 28 °C közötti, előnyösen 25 °C körüli hőmérsékletet kell biztosítanunk számára.
A maximális adipoil-7-ACA-képződés úgy érhető el, hogy a Penicillium chrysogenum törzset nagyméretű fermentorban tenyésztjük 10-30, előnyösen 15—25 napon át. Abban az esetben, ha a tenyésztés kisebb térfogatban, például 250 cm3-es Erlenmeyer lombikban, rázatással történik, a mikroorganizmus növekedése gyorsabb, és hamarabb termel adipoil-7-ACA-t, például 4-15, előnyösen 5-7 nap alatt.
Ha a pH a fermentáció végére a nagyméretű fermentorokban meghaladja a 8,0 értéket, az hátrányosan befolyásolhatja az adipoil-7-ACA-szintet. Ilyen esetben kívánatos a tenyészet pH-jának alakulását figyelemmel kísérni a fermentáció folyamán. Ha azt tapasztaljuk, hogy a pH ilyen magas értéket ér el az adipoil-7ACA-termelés maximuma előtt, akkor a pH megfelelő sav vagy puffer adagolásával csökkenthető.
Az adipoil-7-ACA képződése a fermentléből vett minták kromatográfiás vizsgálatával nyomon követhető.
Mint a legtöbb aerob fermentációnál, itt is steril levegőt kell átbuborékoltatnunk a tenyészeten annak érdekében, hogy a Penicillium chrysogenum törzs erőteljes növekedését és a számottevő adipoil-7-ACA-képződést biztosítsuk. A tenyészeten átvezetett levegő mennyisége általában legalább 0,2 térfogat/táptalajtérfogat percenként. Mindazonáltal az erőteljesebb levegőztetés gyakran jótékony hatású az adipoil-7-ACA képződésére.
A Penicillium chrysogenum törzs az adipoil-7-ACA mellett rendszerint sok mellékterméket és anyagcsereterméket is bioszintetizál. Mivel ezek egy része savérzékeny, célszerű az adipoil-7-ACA kinyerése során a tenyészetet megsavanyítani és rövid ideig savas pH-értéken tartani, hogy ezeket a szennyezéseket elbontsuk. Az adipoil-7-ACA fermentációs termék kinyerése az így kezelt, szúrt fermentléből történik. Adott esetben
HU 219 370 Β ioncserés kromatografálással a tennék elválasztható a fermentlében lévő egyéb anyagoktól, és szükség esetén tovább tisztítható az adipoil-oldallánc enzimatikus hasítása előtt. Az ioncserés kromatografálással történő elválasztás az oldallánc hasítása után is elvégezhető. Az elválasztást megnehezítő legfontosabb melléktermék az adipoil-6-ΑΡΑ, melynek enzimatikus vagy kémiai módszenei való elbontásával az elválasztás megkönnyíthető. Első lépésben a szűrt fermentlé előtisztítására kerül sor, a szennyezések eltávolítása érdekében, amit vízzel nem elegyedő szerves oldószer, például n-butanol vagy amil-acetát alkalmazásával végzünk. Az extrahált szűrlet további előtisztítása aktív szenes kromatografálással történhet.
A Penicillium chrysogenum fermentációs tenyésztése során a fentiekben említett előnyös módon, oltás előtt juttatjuk az adipáttartalmú tápanyagot a tápközegbe. Adott esetben az adipátot tartalmazó tápanyag valamivel később, például 1, 2 és/vagy 3 nappal az oltás után is adagolható. Az adipáttartalmú tápanyag definíció szerint adipinsavat, az adipinsav sóit és/vagy észtereit, illetve ezek olyan kombinációját tartalmazza, amelyet a Penicillium chrysogenum törzs képes hasznosítani az adipoil-6-APA-termelés során. Az adipinsav, az adipinsav sói, illetve észterei használhatók egyenként vagy kombinálva. Előnyösen dinátriumsót használunk, bár a kálium-nátrium kevert sók is megfelelők. Metilészter használható, de az etil-észter már vízoldhatatlan. A fő szempont az, hogy az adipinsavsókat és észtereket legyen képes a Penicillium chrysogenum törzs hasznosítani adipoil-6-ΑΡΑ előállítására. Az adipinsav például alkalmas lehet annak ellenére, hogy nem oldódik vízben, de a pH megfelelő értékénél asszimilálható só képződik belőle.
A fentiek szerint tenyésztett és adipátot tartalmazó tápanyaggal ellátott adipoil-6-APA-termelő Penicillium chrysogenum törzset előzetesen expandáz- és hidroxilázenzim-aktivitást kódoló DNS-konstrukcióval transzformáltuk, így az expresszió következtében sor kerül a képződő adipoil-6-ΑΡΑ in situ gyűrűtágításával adipoil-7-ADCA kialakítására, valamint a 3-metiloldallánc átalakítására 3-hidroxi-metillé.
Az adipoil-6-ΑΡΑ az adipátot tartalmazó tápanyaggal ellátott Penicillium chrysogenum sejtekben intracellulárisan képződik. Ilyen intracelluláris körülmények között, azaz in situ, a transzformált Penicillium chrysogenum expresszálja az expandáz- és hidroxilázenzimek aktivitását kódoló DNS-t, az enzimek az adipoil-6-APA-molekulát szubsztrátként felhasználva a gyűrű tágításával előbb adipoil-7-ADCA-, majd ezt hidroxilezve adipoil-7-ADAC (adipoil-7-amino-dezacetilcefalosporánsav)-molekulát hoznak létre.
A találmány szerinti új biológiai eljárásnak része a fentiek szerinti tulajdonságokkal rendelkező Penicillium chrysogenum törzs, bármely expandáz- és hidroxilázenzim-aktivitást kódoló DNS-sel, amelynek expressziója az adipoil-6-ΑΡΑ in situ gyűrűtágításával adipoil-7-ADCA, ennek hidroxilezésével pedig adipoil-7ADAC képződését eredményezi. így annak a DNSnek, mellyel a Penicillium chrysogenum transzformációja történt, nem pusztán egy, az irodalomból ismert expandázenzim aktivitását kell expresszálnia (például az izopenicillin-N gyűrűtágításával DAOC létrehozása), hanem azt a képességet, mellyel az adipoil-6-ΑΡΑ gyűrűtágításával adipoil-7-ADCA alakítható ki. Ezenkívül a hidroxilázenzimnek képesnek kell lennie az adipoil-7-ADCA hidroxilezésére, és így adipoil-7ADAC előállítására.
Két alternatív módszer jöhet szóba a jelen találmány szerinti eljárás kivitelezése során az expandáz- és a hidroxilázenzim-aktivitások biztosítására. Az első előnyösen alkalmazható módszer értelmében az expandázés hidroxilázfunkciókat a Cephalosporium acremonium mikroorganizmusból származó egységes, de lényegében bifúnkcionális génnel biztosítjuk, melyet a Penicillium chrysogenum törzsben klónozunk. Ezt a gént, amely az expandáz- és a hidroxilázaktivitásokat együttesen expresszálja, a továbbiakban expandáz/hidroxiláz génnek nevezzük, expressziós termékét pedig expandáz/hidroxiláz enzimnek. Midőn az expandáz/hidroxiláz aktivitást kódoló Cephalosporium acremonium eredetű DNS-sel transzformálunk, a szóban forgó aktivitás expresszióját egyetlen promoterszekvencia szabályozza, jelezve ezzel egyetlen gén jelenlétét.
A jelen találmány szerinti eljárás másik, egyenértékű kiviteli módja az egyetlen expandáz/hidroxiláz génnel szemben a szóban forgó enzimaktivitásokat külön génekként kódoló DNS-sel végzett Penicillium chrysoge/i«/w-transzformáción alapszik. Meg kell jegyezni, hogy a különálló expandáz- és hidroxilázgének, valamint az enzimaktivitás, melyet kódolnak, inkább prokariótamikroorganizmusokban (például Streptomyces clavuligerus), semmint eukariótamikroorganizmusokban (például Cephalosporium acremonium) fordulnak elő, mely utóbbiak inkább az egységes expandáz/hidroxiláz gént és enzimet tartalmazzák, amint azt már korábban említettük.
A prokariótahidroxilázenzimaminosav-szekvencia, valamint az ezt kódoló nukleotidszekvencia az irodalomból ismeretes [Kovacevic et al., J. Bacteriol., 173(1), 398-400. (1991); EP-A 0 465 189] csakúgy, mint az enzim izolálására szolgáló módszer. A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a hidroxiláz szekvenciájának ismeretében közismert manuális módszerekkel vagy automatizált DNS-szintetizátorokkal lehetséges a hidroxilázenzimet kódoló DNS szintézise. Az így előállított DNS, illetve a hidroxiláz azonos aminosavszekvenciáját kódoló alternatív szekvencia, valamint ennek ffagmensei és származékai, melyek egyenértékű hidroxilázaktivitást kódolnak, alkalmasak különböző klónozó- és expressziós vektorok előállítására, amennyiben alkalmas prometerrel vagy más szabályozószekvenciával kombináljuk őket. Az így létrehozott vektorokkal a Penicillium chrysogenum gazdatörzs transzformálható annak érdekében, hogy a hidroxilázenzimet expresszáljuk és a találmány szerinti eljárást kivitelezzük. A szóban forgó DNS arra is alkalmas, hogy analitikai eszközként használva, a homológiák alapján hibridizációval azonosítsunk a megfelelő hidroxilázenzimmel rendelkező törzseket a genomkönyvtár átvizsgá8
HU 219 370 Β lása során. Az így azonosított potenciális hidroxilázok aktivitása azután a valódi adipoil-7-ADCA-szubsztrátumon tesztelhető a jelen találmány szerinti módszer alkalmazásával, majd a hiroxilált termék HPLC-vel végzett izolálásával.
Amennyiben a jelen találmány ilyen kiviteli módját (tudniillik egyetlen, csupán a hidroxilázaktivitást expresszáló gén klónozása) alkalmazzuk, abban az esetben szükségessé válik az expandázenzim-aktivitást ugyancsak egyedileg kódoló DNS biztosítása, hogy a Penicillium chrysogenum törzs megfelelő expressziós vektorral legyen transzformálható, amely biztosítja az expandázfunkció expresszióját a jelen találmány gyűrűtágítási lépésének megvalósítása érdekében. Sok expandázenzim ismeretes, melyekről - az oldalláncok hasonlósága alapján - elképzelhető, hogy sikerrel alkalmazhatók a jelen találmány szerinti új biológiai eljárás kivitelezése során.
A jelen találmány egy másik, előnyös kivitelezésekor a nem rekombináns Penicillium chrysogenum törzset olyan DNS-sel transzformáljuk, amely egynél több expandáz- és/vagy egynél több hidroxilázgént kódol. Ebben az esetben a nagyobb mennyiségű expresszált enzimfehérje következtében fokozott expandáz- és/vagy hidroxilázaktivitás kapható.
A technika állását ismertető részben említettük, hogy a Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 törzsből származó expandázenzim teljes szekvenciáját felderítették, és az enzimet kódoló DNS restrikciós térképét is közölték. A Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 törzsből származó, látszólag azonos enzim molekulatömege azonban eltérő, jóllehet ezt a fehéqét nem szekvenálták. Arról is szóltunk a technika állását ismertető részben, hogy a Cephalosporium acremonium ATCC 11550 törzs DAOCS/DACS enzimjének szekvenciáját is felderítették [Sámson et al., Bio/Technology, 5, 1207-1214 (1987); EP-A 0 281 3911].
Ezek a korábbról ismert expandázenzimek eredményesen alkalmazhatók a jelen találmány szerint új, biológiai eljárás kivitelezése során. Más, korábban nem azonosított, eltérő Streptomyces clavuligerus vagy Cephalosporium acremonium törzsekből, sőt más nemzetséghez tartozó mikroorganizmusokból származó expandázenzimek is megfelelőek lehetnek a jelen találmány szerinti új, biológiai eljárás kivitelezése során. Az ilyen új törzsek, illetve alkalmas mikroorganizmusokat tartalmazó nemzetségek azonosítására, valamint a számba jöhető enzimek izolálására és a jelen találmány szerinti eljárásban való felhasználhatóságuk igazolására szolgáló módszerek nyilvánvalóak és a szakmában jártasak számára ismertek. Az új törzsjelöltek kiválasztása elvégezhető a sejtmentes extraktumokból megbízható és reprodukálható módon, ha ezekhez az extraktumokhoz adipoil-6-APA-szubsztrátumot adunk, ismert DAOCS-kofaktorok, így vas(II)ionok, aszkorbát, a-ketoglutarát és adenozin-trifoszfát (ATP) jelenlétében. Az adipoil-6-ΑΡΑ elegendő mennyiségben előállítható oly módon, hogy adipáttartalmú tápanyagot adagolunk nem transzformált Penicillium chrysogenum tenyészethez, a későbbiekben részletesen ismertetettel analóg módon. A kérdéses expandáz- (vagy expandáz/hidroxiláz) enzim jelenlétét bizonyítja, ha adipoil-7-ADCA és/vagy adipoil-7ADAC keletkezik, ami kromatográfiás módszerrel kimutatható.
Jól ismert rekombináns technikák alkalmazásával az is lehetséges, hogy a Streptomyces clavuligerus, illetve a Cephalosporium acremonium expandázgénjeinek nukleotidszekvenciáját ismerve DNS-próbát készítsünk, melynek segítségével az új törzsjelöltek DNS-tartalmát megvizsgálva valószínűsíthető a jelen találmány szerinti eljárás során felhasználható expandázt termelő képességük.
Az expandázenzimek, mint már korábban mondottuk, olyan enzimek, amelyek katalizálják a penicillin típusú molekulákban lévő penámgyűrü tágulását a cefalosporinokban található cef-3-ém-gyürüvé. Bármely, cefémgyürüt tartalmazó metabolitot termelő mikroorganizmus tehát potenciális forrása az expandázt kódoló DNS-szekvenciának. Hasonlóképpen bármely, 3-hidroxi-metil-csoporttal rendelkező cefalosporint termelő mikroorganizmus potenciális forrása a hidroxiláz(vagy expandáz/hidroxiláz) enzimet kódoló DNS-szekvenciának. Az ilyen tulajdonságokkal rendelkező mikroorganizmusokra az alábbiakban közlünk egy listát, a teljesség igénye nélkül.
GOMBÁK
Cephalosporium acremonium
Cephalosporium sp.
Emericellopsis
Paecilomyces
Scopulariopsis
Diheterospora
Spiroidium
Anoxiopsis
AKTINOMICÉTÁK
Streptomyces clavuligerus
Streptomyces lipmanii
Streptomyces wadayamensis
Streptomyces todorominensis
Streptomyces filipinensis cephamycini
Streptomyces heteromorphus
Streptomyces panayensis
Streptomyces griseus
Streptomyces cattleya
Nocardia lactamdurans EGYÉB BAKTÉRIUMOK
Flavobacterium sp.
Alcaligenes denitrificans
Mycoplana bullata
Providencia rettgeri
Lysobacter lactamgenus
Az itt felsorolt mikroorganizmusok expandázai és hidroxilázai csupán potenciális jelöltek a további vizsgálatokhoz, és könnyen lehetséges, hogy korántsem mindegyikük alkalmazható a jelen találmány szerinti új eljárás kivitelezése során.
Ha már a kívánt expandázenzimet sikerült a fenti módszerek valamelyikével kimutatnunk, akkor az expandázaktivitást kódoló DNS nyilvánvaló és a szakemberek előtt közismert módszerekkel izolálható. Expandázenzimeket kódoló gének teljes, illetve részleges szekvenciá9
HU 219 370 Β jának ismeretében olyan DNS-próbák konstruálhatok, amelyek hibridizálódnak az izolálandó, a kívánt enzimet kódoló DNS-sel. Az ilyen DNS-próbák létrehozásának alapját az expandázenzim aminosavszekvenciájának, valamint az őt kódoló nukleotidszekvenciának az ismerete jelenti, figyelembe véve természetesen a szóban forgó mikroorganizmus kódhasználatának jellegzetességeit. Egy ilyen, tipikusnak tekinthető eljárást ismertetünk a későbbiekben, a Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 genom-DNS-ére vonatkozóan.
Az expandázenzim-aktivitást kódoló DNS izolálása a rekombináns DNS-technológiában közismert restrikciós és ligálási módszerek alkalmazásával történik. Szükség van az adott mikroorganizmus genomjának restrikciós térképére ahhoz, hogy a megfelelő restrikciós fragmenst előállíthassuk és izolálhassuk. A Streptomyces clavuligerus és a Cephalosporium acremonium genomjának restrikciós térképe rendelkezésre áll, ismert például, hogy az előbbi esetében a BamHI és Sáli restrikciós enzimekkel végzett emésztés utáni elektroforézissel megkaphatok a kívánt 1,8 és 2,2 kilobázis közötti mértékű fragmensek.
A Cephalosporium acremonium DAC acetil-transzferáz-génjének klónozása a szakmában ismert rekombináns módszerrel történhet, melyet az alábbiakban ismertetünk.
Az acetil-transzferáz-gén klónozása érdekében először is olyan Cephalosporium acremonium -mutánsokat kell előállítani, amelyek nem képesek a dezacetilcefalosporánsavat (DAC) cefalosporin-C-vé átalakítani. Ez elérhető oly módon, hogy Cephalosporium acremonium-sejtéket mutagén ágensekkel, így például Nnitrozo-guanidinnel (NTG), salétromsavval vagy ibolyántúli fénnyel kezelünk, megfelelő tápközegben szaporodni hagyjuk őket, majd kromatográfiás, illetve biológiai módszerrel vizsgáljuk a DAC felhalmozódását. A megfelelő mutáns előállítását követő lépés az acetiltranszferázt kódoló gén izolálása során a cefalosporin-C termelő Cephalosporium acremonium törzs teljes DNS-tartalmának kinyerése. A DNS-t restrikciós enzimekkel vagy mechanikai módszerrel megfelelő méretű darabokra bontjuk, és ezeket a fragmenseket olyan plazmid vagy kozmid transzformációs vektorba építjük be, amely megfelelő domináns markergént, például higromicin- vagy fleomicinrezisztenciát kódoló gént tartalmaz. A vektornak ezenkívül tartalmaznia kell olyan DNS-szekvenciát is, amely megkönnyíti a beépített DNS-szakasz későbbi visszanyerését. Ilyen szekvencia például a lambda-fágból származó cos régió, amelynek segítségével a klónozott DNS in vitro pakolás után Escherichia coli fertőzése révén szabadítható ki, ami rutinmódszerekkel megvalósítható.
Az acetil-transzferáz-hiánymutáns protoplasztjait a genom-DNS véletlenszerű fragmenseit tartalmazó vektorokkal transzformáljuk, és a transzformánsokat antibiotikumrezisztencia alapján szelektáljuk. A transzformánsokban ezután megvizsgáljuk, hogy helyreállt-e a cefalosporin-C- termelő képesség, ami azt jelzi, hogy a transzformálóvektor tartalmazta az acetil-transzferázgént. Az olyan mutánsok, melyekről gyanítható, hogy tartalmazzák az acetil-transzferáz-génnel rendelkező vektort, elszaporíthatók, DNS-tartalmuk kinyerhető, és a vektor-DNS a fentiekben ismertetett módon visszakapható. Annak a bizonyítására, hogy a vektor csakugyan tartalmazza az acetil-transzferáz-gént, szubklónozást végezhetünk Escherichia coli törzsben rutineljárások és vektorok alkalmazásával, majd az acetiltranszferáz hiányos mutánst retranszformáljuk. A gént ezután izolálhatjuk, szekvenálhatjuk, és felhasználhatjuk a molekuláris genetikában ismert és rutinszerűen alkalmazott eljárások során, ahogy az a későbbi példákban ismertetésre kerül.
Ettől eltérő, de szintén ismert módon eljárva Matsuda és munkatársai izolálták és szekvenálták az acetil-transzferáz-aktivitást kódoló, Cephalosporium acremonium törzsből származó gént, sőt magának az enzimnek az aminosavszekvenciáját is megadták (EP-A 0 450 758). Módszerük során előbb izolálták az acetiltranszferáz-enzimet, meghatározták az N-terminális aminosavszekvenciát, és erre az információra építve levezették az ezt kódoló nukleotidszekvenciát. A megállapított nukleotidszekvenciának megfelelő DNS-próbákat létrehozva hibridizációt végeztek a teljes enzimet kódoló DNS-szekvenciával, ami már lehetővé tette a gén izolálását.
Ha egyszer már rendelkezésre állnak az expandáz/hidroxiláz, expandáz- és hidroxiláz-, valamint acetil-transzferáz-aktivitásokat kódoló DNS-fragmensek, akkor nincs akadálya annak, hogy ezeket plazmid-, vagy más expressziós vektorba építsük egyéb DNS- fragmensekkel, melyek promoterek, transzlációs aktivátorszekvenciák, rezisztenciamarkerek, regulátorszekvenciák, kozmidképzők, illetve bármely olyan DNS- szekvenciák lehetnek, amelyek lehetővé teszik vagy elősegítik a transzformációt, vezérlik a géntermék expresszióját és megkönnyítik a transzformánsok izolálását. Az így létrehozott expressziós vektort azután felhasználhatjuk Penicillium chrysogenum törzs transzformálására és expandáz/hidroxiláz, expandáz- és hidroxiláz-, valamint acetil-transzferáz-enzimek aktivitásának intracelluláris expressziójára. A transzformáció és az expresszió kivitelezésére szolgáló módszerek a szakmában közismertek, és részletesen ismertetjük őket a későbbiekben.
Amint arról korábban részletesen szóltunk, a transzformáit Penicillium chrysogenum törzs intracellulárisan expresszálja az expandáz/hidroxiláz, expandáz- és hidroxiláz-, valamint acetil-transzferáz-enzimek aktivitását, és ennek megfelelően in situ bekövetkezik az adipoil-6-APA-szubsztrátum gyűrűtágítással történő átalakítása adipoil-7-ADCA-molekulává, ennek hidroxilezése adipoil-7-ADAC-molekulává, mely utóbbi pedig adipoil-7-ACA-molekulává acetileződik.
A jelen találmány szerinti eljárás előnyösen olyan, az expandáz/hidroxiláz, expandáz- és hidroxiláz-, valamint acetil-transzferáz-enzimek aktivitását expresszáló Penicillium chrysogenw/M-transzformánssal valósítható meg, amely a technika állásához képest új [Cantwell et al., Current Genetics, 17, 213-221. (1990); EP-A 0281 391 és EP-A 0 437 378]. Cantwell konstrukciója Streptomyces clavuligerus expandázgént tartalmaz Penicillium
HU 219 370 Β chrysogenum eredetű izopenicillin-N- szintetáz (IPNS)promoter irányítása alatt, így eltérő a jelen találmányban szereplő konstrukcióktól, mivel hiányzik belőle a hidroxiláz, valamint az acetil-transzferáz-aktivitást kódoló DNS.
Ingolia és munkatársai (EP-A 0 281 391) olyan Penicillium chrysogenum transzformációs vektorról tudósítanak, amelyben a Cephalosporium acremonium törzsből származó expandáz/hidroxiláz bifiinkcionális enzimet kódoló DNS expresszióját Penicillium IPNS- promoter irányítja. Az egyik ilyen konstrukcióban (pPS62) az expandáz/hidroxiláz gén a higromicin- foszfotranszferáz-gén elé van kapcsolva, azzal leolvasási sorrendben. A higromicin::expandáz/hidroxiláz fuziósfehéije-géntermék eltér a jelen találmány szerintitől, mivel az ebben szereplő expandáz/hidroxiláz enzim eredendően azonos a Cephalosporium acremonium által termelttel. Az EP-A 0 281 391 szabadalmi leírásban szereplő többi vektor létrehozása kiterjedt molekuláris manipulációval, így például szintetikus DNS-linkerek alkalmazásával történt. A végső konstrukcióban (pPSól) az expandáz/hidroxiláz gén expresszióját a Penicillium IPNS 1,2 kilobázis méretű Ncol fragmensével vezérlik, és a Penicilliumtranszformáció szelekciós markereként Aspergillus nidulans acetamidázgént használnak. Az expandáz/hidroxiláz gén kilences és tízes kodonjának, melyek arginint, illetve leucint kódolnak, a szekvenciáját CGTCTC sorrendről CGCCTA sorrendre változtatták, jóllehet ez nem befolyásolja a kódolt aminosavszekvenciát.
A jelen találmány szerinti konstrukcióban az 1,2 kilobázis méretű Ncol IPNS-protomer van az expandáz/hidroxiláz génhez kapcsolva, az eredeti expandáz/hidroxiláz génszekvencia megváltoztatása nélkül. A jelen találmány szerinti konstrukcióban alkalmazott IPNS-promoter két különálló négybázisos ismétlődést tartalmaz. Az egyik ezek közül az ATG startkodon után 760 bázispár távolságra a Sáli helyen, a másik pedig a startkodon után 5 bázispár távolságra, az Xbal helyen, az 5’ nem transzlálódó vezérszekvencián belül helyezkedik el. Ezek a változások nincsenek hatással az expandáz/hidroxiláz gén intenzív expressziójára.
További eltérés van vektorokban a felhasznált markereket illetően. Az EP-A 0 281 391 számú szabadalmi leírásban közölt konstrukciók acetamidáz és higromicin szelekciós markereket tartalmaznak. Ettől eltér a jelen találmány szerinti expandáz/hidroxiláz Penicillium transzformációs vektor (pPEN/CEPH-1), mivel a fleomicinaktivitást expresszáló Penicillium chrysogenum törzs a PC200 jelzést kapta. Taxonómiai jellemzőit tekintve kékeszöld-kék színű, szétterülő bársonyos telepeket képez sárga cseppekkel; sárga színű pigmentet diffundál az agarba; konídiumtartói elágazóak, simák; a konídiumok elliptikusak vagy gömbölyűek és 3-4 mm hosszúságúak. A Penicillium chrysogenum tenyésztésére alkalmas szilárd táptalaj desztillált vízben feloldva az alábbi komponenseket tartalmazza egy dm3 térfogatban:
laktóz-víz (1:1) 15,0 g kukoricalekvár 5,0 cm3 pepton 5,0 g
NaCl 4,0 g
| MgSO4-víz (1:7) | 0,5 g |
| KH2PO4 | 0,6 g |
| FeClj-víz (1:6) | 5,0 mg |
| CuSO4-víz (1:5) | 2,0 mg |
| Agar | 30,0 g |
| A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 4,8 értékre állít- |
juk be.
A fentiekben ismertetett tulajdonságú, PC200 jelű Penicillium chrysogenum törzset az ATCC törzsgyűjteményben (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA) helyeztük letétbe 1992. szeptember 23-án, ahol az ATCC 74186 azonosítási számot kapta.
A jelen találmány szerinti másik új, adipoil-7-ACAtermelő Penicillium chrysogenum transzformáns mind az expandáz/hidroxiláz, mind pedig az acetil-transzferáz-aktivitást expresszálja annak tulajdoníthatóan, hogy transzformációja olyan vektorral történt, amely mindkét enzimet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza (pTS-8). Ez a vektor így eltér az EP-A 0 437 378 számú szabadalmi leírásban szereplő Penicillium transzformációs vektoroktól, melyek a Cephalosporium acremonium eredetű acetil-transzferáz-gént egymagában vagy mutáns expandáz/hidroxiláz polipeptidet kódoló DNS-szekvenciához kapcsolva tartalmazzák. A pTS-8 konstrukcióban az expandáz/hidroxiláz, valamint az acetil-transzferáz-gének expresszióját külön-külön, két független Penicillium chrysogenum IPNS-promoter vezérli, a promoter harmadik példánya pedig a szelekciós markerül szolgáló fleomicinrezisztenciáért felelős gén átíródását irányítja.
A jelen találmány szerinti eljárás alternatív módon úgy is kivitelezhető, hogy az expandáz/hidroxiláz és az acetil-transzferáz-géneket más-más vektorba építjük be, és egymást követően juttatjuk be a Penicillium gazdasejtbe. Az expandáz/hidroxiláz és az acetil-transzferáz-enzim-aktivitásokat kódoló DNS- fragmensek Penicillium sejtbejuttatásának sorrendisége pusztán gyakorlati jelentőséggel bír. Előnyösen az expandáz/hidroxiláz gén(ek) bejuttatása meg kell hogy előzze az acetiltranszferáz-génét, mivel ez az a sorrend, amely működésük során is érvényesül in vivő. így mód nyílik arra, hogy az expandáz/hidroxiláz expressziót nyomon kövessük az adipoil-7-ADAC-képződés mérésével. Mivel az adipoil-7-ADAC az acetil-transzferáz-enzim szubsztrátuma, ezért a később bevitt, acetil-transzferázt kódoló gén expressziója az adipoil-7-ACA mérésével követhető nyomon. Alkalmas in vitro acetil-transzferáz-meghatározási módszer felhasználásával, természetesen lehetséges az is, hogy előbb az acetil-transzferáz-génnel transzformáljuk a Penicillium-se}\e\, igazoljuk a gén expressziöját in vitro meghatározással, majd bevigyük az expandáz/hidroxiláz gént is. Mindezek alapján bármelyik módszer alkalmas a jelen találmány szerinti eljárás kivitelezésével 7-ACA előállítására.
A jelen találmány szerinti eljárás kivitelezése előnyösen azonban úgy történik, hogy mindhárom enzimaktivitást egyszerre juttatjuk be, egyetlen plazmidvektor létrehozásával, amely együttesen tartalmazza a Cephalosporium acremonium eredetű expandáz/hidro11
HU 219 370 Β xiláz és acetil-transzferáz-aktivitásokat kódoló DNSszakaszokat. Az ilyen plazmidvektorral, a pTS-8 jelű vektorral transzformált, az expandáz/hidroxiláz és az acetil-transzferáz-aktivitást expresszálni képes Penicillium chrysogenum törzset PC300 megjelöléssel láttuk el. Taxonómiai tulajdonságai megegyeznek a PC200-ra vonatkozóan korábban közöltekkel. Tenyésztési körülményei azonosak a PC200 esetében ismertetettekkel. A PC300 jelű Penicillium chrysogenum törzset az ATCC törzsgyűjteményben (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA) helyeztük letétbe 1992. szeptember 23-án, ahol az ATCC 74187 azonosítási számot kapta.
A jelen találmány szerinti eljárás előnyösen megvalósítható olyan pPenFTSO vektorral transzformált, Streptomyces clavuligerus eredetű expandázenzim-aktivitást expresszáló Penicillium chrysogenum törzzsel is, amely a technika állásához képest új [Cantwell et al., Current Genetics, 17, 213-221. (1990)]. Cantwell konstrukciója csakúgy, mint a jelen találmány szerinti, olyan módon készült, hogy a promoter és az expandázgén kapcsolása in vitro mutagenezissel történt. Cantwell konstrukciójában a manipuláció eredményeképpen az expandáz ATG startkodonjánál Ndel hasítási helyet hoznak létre, melyet Xbal/Ndel linkerrel kapcsolnak az IPNS-promoter 3’-végén lévő Xbal helyhez. A jelen találmány szerinti konstrukció esetében viszont NCoI hasítási helyet alakítunk ki az expandázgén ATG kodonjánál, és ezt ligáljuk az IPNS-promoter 3’-végén lévő Ncol helyhez. A manipulációk következtében az alábbi szekvenciák alakulnak ki a gén-promoter kapcsolódási hely környezetében:
Xbal Ncol
| IPNS-promoter | 5’ | TCTAGACACCATGG | 3’ | 1. szekvencia |
| Strep expandáz | 5’ | GTGAGAGTTGATGGAC | 3’ | 2. szekvencia |
| Cantwell | 5’ | TCTAGACACTATGGAC | 3’ | 3. szekvencia |
| A jelen találmány | 5’ | TCTAGACACCATGGAC | 3’ | 4. szekvencia |
szerinti
A Cantwell-konstrukcióban egy citozin helyett timin szerepel, a jelen találmány szerinti konstrukció viszont megőrzi a citozint, és így az ATG startkodonhoz közvetlenül kapcsolódó IPNS-promoter pontosan megegyezik a természetes IPNS-génben találhatóval. Jóllehet csupán egy bázis eltérés van a két konstrukció kö- 30 zött, nem zárható ki, hogy ennek következtében a korábbi promoter működésében ez a transzlációs hatékonyság csökkenését, és így az expandázgén alacsonyabb szintű expresszióját vonja maga után.
Vannak azonban más eltérések is a két konstrukció- 35 bán, a promoter és a gén területén. A Cantwell-konstrukció az IPNS-promoter 5’ BamHI és Xbal 3’ között szakaszát tartalmazza, a jelen találmány szerinti vektor viszont az 5’ Ncol és Ncol 3’-régiót [Diez et al., J.
Bioi. Chem., 265, 16 358-16 365 (1990)]. Ennek kö- 40 vetkeztében a Cantwell-konstrukció az IPNS 5’-végén mintegy 250 bázispárral hosszabb szakaszt tartalmaz, ám ez a régió nem más, mint az IPNS-gént követő ACV-szintetáz-gén leolvasási szakaszának töredéke.
A Cantwell-konstrukció a Streptomyces-gérmek az 45 ATG kodon és az expandázgén 3’-végén található BamHI hely közötti szakaszát tartalmazza, míg a jelen találmány szerinti vektor az ATG kodon és a 3’-végen levő Sáli hely közötti szakaszt [Kovacevic et al.,
J. Bacteriol., 171, 754-760. (1989)]. Ennek következté- 50 ben a Cantwell-konstrukció mintegy 1000 bázispárral hosszabb a 3’-végen. A jelen találmány szerinti konstrukció is tartalmazza a BamHI helyig terjedő régióját az expandázgénnek, de ezt a gén leolvasási szakaszától az IPNS-promoter választja el.
Másik eltérése a jelen találmány szerinti pPenFTSO konstrukciónak a korábbiaktól az alkalmazott szelekciós marker. A Penicillium IPNS- promoter: fleomicin fúziós gén alkalmazása a jelen találmány szerinti konstrukcióban elősegíti a vektor több példányának integráló- 60 dását, illetve olyan szakaszok integrálódását, melyek magas szintű expressziót tesznek lehetővé, és így a transzformánsok nagyobb hányada expresszálhatja igen jó hatásfokkal az expandázgént.
A jelen találmány szerinti új, biológiai eljárás utolsó lépése az adipoil-oldallánc lehasítása az adipoil-7ADAC-, illetve adipoil-7-ACA-molekuláról, aminek érdekében a korábbi lépések temrékeit adipoil-amidázenzimmel kell kezelni. Mint már említettük, a jelen találmány egyik legfőbb eredménye, hogy az adipoil-7ADAC-, illetve adipoil-7-ACA-molekulákhoz vezető lépéseket egyetlen fermentációs tenyészetben lehet megvalósítani. Mindez azért biztosíthatja az eljárás kivételesen nagy hatékonyságát, mert az egyes lépések termékeit nem kell izolálni és részlegesen tisztítani a következő lépés előtt. Ebben az utolsó lépésben azonban más a helyzet, tudniillik az adipoil-amidáz-enzim nincs jelen, nem keletkezik in situ az eredeti fermentációs tenyészetben sem természetes módon, sem pedig Penicillium chrysogenum gének rekombináns expressziója révén.
Amennyiben a jelen találmány szerinti új, biológiai eljárást szakaszosan valósítjuk meg, akkor nem kerülhető el az előző lépésből származó termék kinyerése és tisztítása, amelynek módszereiről korábban már szóltunk.
Mindazonáltal a jelen találmány szerinti eljárás minden olyan alkalmas módon kivitelezhető, amely biztosítja az adipoil-7-ADAC, valamint az adipoil-7-ACA megfelelő érintkeztetését az adipoil-amidáz-enzimmel, hogy az enzimatikus átalakítás eredményeképp 55 7-ADAC, illetve 7-ACA képződjön. Az „érintkeztetés” kifejezés itt a lehető legtágabb értelemben szerepel. Lehetséges például az adipoil-7-ADAC- vagy adipoil-7ACA-tartalmú sejtmentes szűrt fermentlé szakaszos kezelése nyers adipoil-amidáz-oldattal. Ez a megoldás némi előnnyel jár a hatékonyságot illetően, hiszen a
HU 219 370 Β reakciópartnerek előzetes tisztítását nem igényli. Módosítások természetesen elképzelhetők. A reakciópartnerek például előzetesen a szükséges mértékben megtisztíthatók, mielőtt kapcsolatba kerülnének egymással. Szakaszos módszer helyett az eljárás kivitelezhető fo- 5 lyamatosan is. A reakciópartnerek érintkeztetése az adott gyártási folyamat nyújtotta előnyöknek megfelelően többféle módon is megoldható. így például használható immobilizált adipoil-amidáz-enzim oszloptöltet formájában, melyen adipoil-7-ADAC, illetve adipoil-7- 10 ACA oldatát vezetjük át. Az immobilizált enzimet szuszpendálhatjuk egyszerűen az adipoil-7-ADAC, illetve adipoil-7-ACA oldatában is. Az ilyen immobilizált enzimkészítmények alkalmazásának nagy előnye, hogy az enzim a reakcióelegyből egyszerűen visszanyerhető és többször is felhasználható. Az eljárástechnikai változatok további példája a membránreaktorok alkalmazása. A találmány szerinti eljárás során a reakciópartnerek érintkeztetése előnyösen immobilizált enzimet tartalmazó oszloptöltet segítségével oldható meg.
Sok olyan enzim ismeretes, amely specifikus az adipoil-oldalláncra. Egy, a kereskedelemben kapható (RAEV Corp.) adipoil-amidázzal kapott eredmények a későbbi példákban szerepelnek. Hét további enzimet említenek a szakirodalomban, melyek alkalmasak cefalosporin típusú molekulák adipoil-oldalláncának eltávolítására. Hat közülük Psudomonas fajokból, egy pedig Bacillus törzsből származik. A Pseudomonas enzimek között mutatkozik ugyan némi hasonlóság, de mind a hét enzim többé-kevésbé eltér egymástól fizikai és bio15 lógiai tulajdonságaiban. Néhány rájuk jellemző adatot az alábbiakban összegzünk.
| ENZIM | IRODALOM | MOLEKULATÖMEG |
| Pseudomonas és Bacillus törzsek | (alegység) | |
| Pseudomonas sp. SY-77-1 | ||
| (Toyo Jozo) | Shibuya et al. (1981) | lásd GK16 |
| Pseudomonas sp. GK.16 | Matsuda & Komatsu (1985) | 16 000 |
| (Asahi) | 54 000 | |
| Pseudomonas sp. SE83 (acyl) | Matsuda et al.( 1987) | 38 200 |
| (Asahi) | 19 900 | |
| Pseudomonas sp. SE83 (acyll) | Matsuda et al. (1987) | 25 400 |
| (Asahi) | 58 200 | |
| Pseudomonas diminuta NI76 | Aramori et al. L(1991a)* | 58 000 |
| (Fujisawa) | 26 000 | |
| Pseudomonas diminuta V22 | Aramori et al. (1991a)* | ? |
| (Fujisawa) | ? | |
| Bacillus laterosporus J1 | Aramori et al. (1991b)** | 70 000 |
| (Fujisawa) | (monomer) | |
| Pseudomonas sp. | 16 000 | |
| (RAEV Corp.) | 54 000 |
** Aramon etal., J. Bacteriol. 173, 7848 -7855. (1991)
Valamennyi felsorolt adipoil-amidáz alkalmazható a jelen találmány szerinti új, biológiai eljárás kivitelezése során. Minden különösebb probléma nélkül találhatók egyéb olyan adipoil-amidázok is, amelyek alkalmazhatók a jelen találmány szerinti eljárás során, amennyiben a potenciális enzimjelölteket kipróbáljuk adipoil-7-ADAC-, illetve adipoil-7-ACA-szubsztrátumokon, amelyeken valójában működniük kell. A pozitív eredmény megbízható és reprodukálható módon határozza meg, hogy az adott enzimjelölt csakugyan alkalmas a jelen találmány szerinti eljárás kivitelezése során való felhasználásra. A szubsztrátum előállítható, ha 7-ACA-vegyület adipinsav-anhidriddel reagáltatunk Szewczuk és Wellman-Bednawska [Clin. Chim. Acta, 84, 19-26 (1978)] módszerének módosításával. A glutaril-7-ACA előállítására szolgáló módszer [Agric. Bioi. Chem., 45(7), 1561-1567. (1981)] is adaptálható. Az adipinsavanhidrid elkészíthető Albertson és Lundmark [J. Macromol. Sci. Chem., A27, 397-412 (1990)] módszere szerint. A 7-ACA több kereskedemi forrásból is beszerezhető (például Sigma Chemical Co.).
Ha az enzimjelöltek előszűrését gyors, kolorimetriás módszerrel akaijuk elvégezni, akkor az adipoil-7ACA-szubsztrátum helyett kolorimetriás szubsztrátum, például adipoil-PABA (para-amino-benzoesav) vagy adipoil-nNA (para-nitro-anilin) alkalmazható. Ilyen esetben a γ-glutamil-PABA esetére érvényes módszer [Szewczuk et al., Clin. Chim. Acta, 84, 19-26. (1978)] adaptálható. Az oldallánc hasításakor színes vegyület keletkezik, amelynek koncentrációja koloriméterrel egyszerűen meghatározható. Ezzel és más kolorimetriás módszerekkel kapcsolatban részletes információ található az irodalomban [Marelli, L. P., J. Pharm. Sci., 57, 2172-2173. (1968); Szász, G., Clin. Chem., 15, 124-136. (1969); Szewczuk, A. et al., Anal. Biochem., 103, 166-169. (1980); valamint Reyes, F. et al., J. Pharma. Pharmacol., 41, 136-137. (1989)/.
Összehasonlítottuk a RAEV-enzim N-terminális aminosavszekvenciáját az előző táblázatban szereplő acyll és GK16 enzimek nagy alegységének hasonló régiójával. Az összehasonlítás eredménye a következő (a zárójelek a nem teljesen meggyőző hozzárendelésekre utalnak):
HU 219 370 Β
RAEV - 5. szekvencia (S)N(S)(G)AVAPGKTANGNAL(L)LQN(P)
GK16 - 6. szekvencia
S N S W AVAPGKTANGNAL L LQN P acyll - 7. szekvencia
S Ν N W AVAPGRTATGRPI L AGD P
A bemutatott szekvenciákból nyilvánvaló, hogy rokon peptidekről van szó. Mindazonáltal ha egy fehérje N-terminális szekvenciája a fentiekhez hasonló, az nem jelenti szükségképpen, hogy adipoil-amidáz-aktivitással rendelkezik, amire jó példa egy Arthrobacter eredetű penicillin-G-aciláz. Másrészről viszont léteznek olyan, a jelen találmány szerinti eljárás kivitelezése során felhasználható adipoil-amidázok, amelyek nem mutatnak homológiát a fenti N-terminális szekvenciával. Az Asahi acyl és a Fujisawa Bacillus laterosporus J1 aciláza, melyek szintén szerepelnek a táblázatban és bizonyítottan rendelkeznek adipoil-7-ACA-aciláz-aktivitással, semmiféle homológiát nem mutatnak a fenti szekvenciával. Mindezek alapján a jelen találmány szerinti új, biológiai eljárás utolsó lépésének kivitelezésére alkalmas adipoil-amidázok körét csak annak alapján határozhatjuk meg, hogy képesek-e az adipoil-7-ACA adipoil-oldalláncát lehasítani, ami viszont a korábban ismertetett módszerrel egyszerűen és megbízhatóan megállapítható.
A következőkben részletesen ismertetjük a jelen találmány szerinti eljárás kivitelezésének néhány előnyös kivitelezési módját. Az alábbi példák azonban pusztán a találmány lényegének jobb megértését szolgálják, és semmiképpen sem kívánjuk ezekre korlátozni a találmány tárgyát.
1. példa
Penicillium chrysogenum tenyésztése
A munka során Penicillium chrysogenum törzsek fenntartása agarlemezen, LCSB táptalajon történt, mely desztillált vízben feloldva az alábbi komponenseket tartalmazza egy dm3 térfogatban:
| laktóz-víz (1:1) | 15,0 g |
| kukoricalekvár | 5,0 cm3 |
| pepton | 5,0 g |
| NaCl | 4,0 g |
| MgSO4-víz (1:7) | 0,5 g |
| KH2PO4 | 0,6 g |
| FeCl3-víz (1:6) | 5,0 mg |
| CuSO4-víz (1:5) | 2,0 mg |
| Agar | 30,0 g |
| A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 4,8 értékre állít- |
juk be.
napon át inkubáltuk az agarlemezeket 25 °C-os 65% relatív nedvességtartalmú térben, majd egyedi telepeket vettünk le róluk, és ezeket 2 cm3 steril vízzel jól zárható, üveggyöngyöt tartalmazó kémcsövekbe tettük. A tenyészeteket vortexeléssel homogenizáltuk, és a kapott szuszpenzióval rizslombikokat oltottunk. A rizslombikokat Uncle Ben’s előfőzött rizs felhasználásával készítettük oly módon, hogy a rizst három-négyszeres térfogatú desztillált vízzel, félpercenkénti átkeveréssel 7 percen át mostuk, majd lecsepegtettük, hogy a rizs vízfelvétele körülbelül 25% legyen. Az így előkészített rizsből 25-25 g mennyiséget mértünk 250 cm3-es Erlenmeyer-lombikokba, és autoklávban sterileztük. A beoltott rizslombikokat 12 napon át inkubáltuk 25 °C-os, 65% relatív nedvességtartalmú térben, majd a spórákat 50 cm3 steril vízzel lemostuk a rizsszemekről. Ezt a spóraszuszpenziót használtuk fel folyadéktenyészetek oltására, valamint a liofilizált törzskonzervek készítésére. Utóbbi céljára a spóraszuszpenzióhoz azonos térfogatú 5%-os sovány tejet adtunk, és ezt az elegyet steril ampullákba töltve liofilizáltuk. A liofilizált tenyészeteket 4 °C-on tároltuk.
Kétlépcsős, rázott lombikos fermentációt végeztünk a törzzsel a penicillinek előállítására, illetve micélium termelésére, amely RNS-, valamint DNS-forrásul szolgált. A folyadékkultúra első lépcsőjének indításakor lxlO8 spórával oltottunk 50 cm3, 500 cm3-es Erlenmeyer-lombikban lévő táptalajt, amely az alábbi komponenseket tar-
| talmazta egy dm3 desztillált vízben feloldva: | |
| Glükóz Gyapotmagliszt Kukoricalekvár | 30,0 g 10,0 g 30,0 cm3 |
| Ammónium-szulfát | 2,0 g |
| Kalcium-karbonát | 5,0 g |
| Kálium-dihidrogén-foszfát | 0,5 g |
| Laktóz | 10,0 g |
| Szárított élesztő | 10,0 g |
A beoltott táptalajt 70 mm kitérésű rotációs rázógépen 220 fordulat/perc sebességgel rázattuk 25 °C-os, 65% relatív nedvességtartalmú térben 48 órán át. Az így kapott vegetatív tenyészet 2 cm3-ével 35 cm3, 500 cm3-es Erlenmeyer-lombikban lévő termelő táptalajt oltottunk, mely az alábbi komponenseket tartalmazta egy dm3 desztillált vízben:
Kálium-dihidrogén-foszfát 0,5 g
Kálium-szulfát 5,0 g
Ammónium-szulfát 10,0 g
Laktóz 120 g
Gyapotmagliszt 27,5 g
Kalcium-karbonát (lecsapott) 10,0 g
Disznózsír 10,0 cm3
A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 6,6 értékre állítottuk be.
Az autoklávban történő sterilezést követően steril, 25%-os nátrium-adipát (pH=6,6) oldatot adtunk a táptalajhoz, hogy abban 2,5% végkoncentrációt kapjunk. Oltás után a táptalajt a vegetatív tenyészet elkészítésénél ismertetett körülmények között 5-7 napon át inkubáltuk.
Midőn micélium előállítására volt szükség protoplasztképzéshez a transzformáció céljára, vagy DNS kinyeréséhez, akkor a törzset 250 cm3-es Erlenmeyer lombikban, 50 cm3 komplett (CM) táptalajon tenyésztettük, mely a következő komponenseket tartalmazta egy dm3 desztillált vízben:
Tripton 5,0 g
Elesztőkivonat 5,0 g
Glükóz 10,0 g
Clutterbuck-féle sóoldat (20 χ) 50,0 cm3
Vogel-féle nyomelemoldat 2,0 cm3
HU 219 370 Β
A húszszoros töménységű Clutterbuck-féle sóoldat az alábbi komponenseket tartalmazza egy dm3 desztillált vízben:
Nátrium-klorid 120,0 g
Kálium-klorid 10,4 g
Magnézium-szulfát-víz (1:7) 10,4 g
Kálium-dihidrogén-foszfát 30,4 g
A Vogel-féle nyomelemoldat az alábbi komponenseket tartalmazza desztillált vízben :
Citromsav 0,30 M
Cink-szulfát 0,20 M
Vas(II)-ammóniumszulfát- víz (1:6) 25 mM
Réz(II)-szulfát 10 mM
Mangán(II)-szulfát 3 mM
Bórsav 8 mM
Nátrium-molibdenát-víz (1:2) 2 mM
Az inkubálást rotációs rázógépen, 25 °C-on, 2201/perc fordulatszámmal végeztük.
2. példa
Cephalosporium acremonium tenyésztése A Cephalosporium acremonium törzsek fenntartása ferdeagar-tenyészetben történt, komplett táptalajon, amely a következő komponenseket tartalmazza egy dm3 desztillált vízben:
| Szacharóz | 20,0 g |
| Agar | 20,0 g |
| Pepton | 4,0 g |
| Élesztőkivonat | 4,0 g |
| Nátrium-nitrát | 3,0 g |
| Kálium-dihidrogén-foszfát | 0,5 g |
| Kálium-klorid | 0,5 g |
| Magnézium-szulfát-víz (1:7) | 0,5 g |
| Vas(II)-szulfát-víz (1:7) | 0,01 g |
| A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 6,6 értékre állítot- |
tűkbe.
A beoltott táptalajokat 10 napon át 28 °C-os, 66% relatív nedvességtartalmú térben inkubáltuk, majd 6 cm3 steril víz hozzáadásával lekapartuk a kinőtt tenyészeteket az agar felszínéről. Az így kapott szuszpenziót jól zárható, üveggyöngyöt tartalmazó kémcsövekbe tettük. A tenyészeteket néhány perces vortexeléssel homogenizáltuk, és a kapott szuszpenzió 3,5 cm3-ét használtuk folyadéktenyészetek oltására. Ugyancsak ez a szuszpenzió szolgált kiindulási anyagul a liofilizált törzskonzervek készítéséhez. A homogenizált sejtszuszpenziót centrifugáltuk, és az üledéket 5%-os sovány tejben újból szuszpendáltuk. Az így kapott szuszpenziót steril ampullákba töltve liofilizáltuk, és a liofilizált tenyészeteket 4 °C-on tároltuk.
Kétlépcsős, rázott lombikos fermentációt végeztünk a törzzsel a cefalosporinok előállítására, illetve micélium termelésére, amely RNS-, valamint DNS-forrásul szolgált. A folyadékkultúra első lépcsőjét 250 cm3-es Erlenmeyer-lombikokban lévő 15-15 cm3 táptalaj oltásával indítottuk. A táptalaj a következő komponenseket tartalmazta egy dm3 desztillált vízben:
Glükóz 5,0 g
Szacharóz 40,0 g
| Kukoricakeményítő | 30,0 g |
| Melasz | 50,0 g |
| Szójaliszt | 65,0 g |
| Kalcium-szulfát-víz (1:2) | 15,8 g |
| Ammónium-acetát | 8,0 g |
| Kalcium-karbonát (lecsapott) | 5,0 g |
| Ammónium-szulfát | 7,5 g |
| Magnézium-szulfát-víz (1:7) | 3,5 g |
| Kálium-dihidrogén-foszfát | 1,0 g |
| Szójaolaj | 0,15 cm3/lombik |
| A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 6,2 értékre állítot- |
tűkbe.
Az inkubálást 70 mm kitérésű rázógépen, 220 fordulat/perc sebességgel 25 °C-os, 65% relatív nedvességtartalmú térben végeztük 96 órán át. Az így kapott vegetatív tenyészet 2 cm3-ével 250 cm3-es Erlenmeyer-lombikokban lévő, a fentivel megegyező összetételű táptalajokat oltottunk, és az inkubálást azonos körülmények között folytattuk további 96 órán át.
Midőn a micélium előállítására volt szükség DNS-forrásként a transzformációhoz, úgy a törzseket 500 cm3-es Erlenmeyer-lombikokban lévő 100 cm3 komplett táptalajon tenyésztettük, mely a következő komponenseket tartalmazta egy dm3 desztillált vízben:
| Glicerin | 20,0 g |
| Pepton | 4,0 g |
| Élesztőkivonat | 4,0 g |
| Kálium-dihidrogén-foszfát | 0,5 g |
| Dikálium-hidrogén-foszfát | 0,5 g |
| Kálium-klorid | 0,5 g |
| Magnézium-szufát-víz (1:7) | 1,0 g |
| Nátrium-nitrát | 3,0 g |
| Vas(II)-szulfát-víz (1:7) | 0,01 g |
| Az inkubálást rotációs rázógépen 220 1/perc fordu- |
latszámmal, 30 °C-on végeztük.
3. példa
Genom-DNS- és teljes RNS-tartalom izolálása Penicillium és Cephalosporium törzsből A fentiek szerint készített 48 órás vegetatív tenyészetet szúrővásznon szűrtük, a micéliumot folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és egy éjszakán át liofilizáltuk. A száraz micéliumot mozsárban homokkal digeráltuk, majd 25 cm3 pufiferoldatban (100 mM LiCl, 50 mM EDTA, 10 mM Tris, pH=8,0,4% SDS) felszuszpendáltuk. A szuszpenziót 60 °C-os vízfürdőn 50-55 °C-ra melegítettük, majd előbb 1 mM-os Tris (pH=8) pufferrel telített fenollal, azután fenol és kloroform 1:1 térfogatarányú, Tris pufferrel telített elegyével, végül pedig kloroformmal extraháltuk. A vizes fázisból az RNS-t azonos térfogatú hideg, 6 M LiCl-oldat hozzáadásával, majd az elegyet 2-3 órán át -20 °C-on tartva kicsaptuk. Ezután centrifugálást végeztünk 4 °C-on 12 000 g gyorsulással 20 percen át. A felülúszó etanolkoncentrációját 66 térfogat%-ra állítottuk be, és -20 °C-on tartottuk 15 percen át. A kicsapódott DNS-t az előzővel azonos módon végzett centrifugálással elkülönítettük, 70%-os etanollal mostuk, majd megszárítottuk, és TE pufiferben (10 mM Tris-HCl, pH=7,5 és 1 mM EDTA) felszuszpendáltuk. A DNS-koncentrációt agarózgél-elektroforézist követő
HU 219 370 Β etídium-bromidos festés alapján, ismert DNS-standardokhoz viszonyítva becsültük.
Az RNS-tartalom kinyeréséhez a Penicillium chrysogenum és Cephalosporium acremonium törzseket az 1. és 2. példában ismertetett módon 96 órán át tenyésztettük 35 cm3 fermentációstáptalaj-térfogatban (a fermentációs körülményeket korábban leírtuk) 25 °C-on, rotációs rázógépen 220 1/perc fordulatszámmal. A tenyészetet Whatman #1 szűrőn vákuumban szűrtük, és a micéliumot 50 cm3 vízzel mostuk. A szűrőről azonnal eltávolított micéliumot 5 cm3 feltárópufferben (50 mM Tris-HCl, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH=8,0, 5% SDS) felszuszpendáltuk, majd folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és liofilizáltuk. Egy éjszakán át történő liofilizálás után 5 cm3 0,1% DEPC-tartalmú vízzel és 5 cm31 M Tris (pH=8) pufferrel telített fenol-kloroform-izoamil-alkohol (50:50:1) elegyet adtunk hozzá, és hagytuk felengedni 37 °C-on 20 percen át rázatva. Az elegyet ezután 4 °C-on 10 percen át centrifugáltuk 12 000 g gyorsulással, majd a vizes fázist elválasztottuk, és előbb 1 M Tris (pH=8) pufferrel telített fenollal, végül pedig kloroformmal extraháltuk. Ezután a vizes fázishoz azonos térfogatú 6 M LiCl-oldatot adtunk, és az elegyet -20 °C-on tartottuk legalább órán át. A teljes RNS- tartalmat 4 °C-on, 12 000 g gyorsulással 20 percen át centrifugálva elválasztottuk, a csapadékot feloldottuk 0,3 cm3 TE puffer és 0,02 cm3 3 M nátrium-acetát-oldat elegyében, majd 2,5 térfogatnyi etanol hozzáadásával az RNS-t kicsaptuk. Ezt a csapadékot 0,1 cm3 TE pufferben feloldottuk, és az RNSkoncentrációt 260 nm hullámhosszon végzett spektrofotometriás módszerrel határoztuk meg.
4. példa
Cephalosporium acremonium -génkönyvtár létrehozása, valamint Cephalosporium acremonium expandáz/hidroxiláz és acetil-transzferáz-gének izolálása
C. acremonium expandáz/hidroxiláz gén izolálása
A Cephalosporium acremonium genom-DNS-t Sau3AI enzimmel részlegesen emésztettük, hogy 10 és 20 kilobázis közötti átlagos méretű fragmenseket kapjunk. Az ebbe a mérettartományba eső fragmenseket és 20% NaCl-sűrűséggradienst alkalmazva centrifugálással dúsítottuk. A méret szerint frakcionált DNS felhasználásával létrehoztuk a Cephalosporium acremonium genom-DNS-génkönyvtárat. Ennek során a DNSfragmenseket a λ 2001 vektor BamHI helyére ligáltuk, Gigapack (Stratagene) felhasználásával pakoltunk, és Escherichia colit fertőztünk velük. A keletkező plakkokat nitro-cellulóz-rétegre vittük át, és az expandáz/hidroxiláz gén publikált szekvenciájának (Sámson et al., 1987) 3’-végével komplementer oligonukleotidpróbát alkalmazva vizsgáltuk a hibridizációt. A próba végjelölése [t-32P]ATP-vel, T4 polinukleotid-kináz alkalmazásával történt. A pozitív kiónokat izoláltuk, és feltérképeztük a restrikciós endonukleázok hasítási helyeit. Southern biot hibridizáció alkalmazásával a fenti nukleotidpróbát, valamint egy, a gén 5’-végével komplementer szekvenciát felhasználva megállapítottuk a gén orientációját.
C. acremonium acetil-transzferáz-gén izolálása
Habár a 11. és 12. példában szereplő vektorkonstrukciókhoz az acetil-transzferáz-gént nem ezen a módon izoláltuk, némi gyakorlattal, az irodalomban hozzáférhető DNS-szekvenciák felhasználásával ez az alábbi módszerrel elvégezhető. A fentiekben leírt módon létrehozott Cephalosporium acremonium genomgénkönyvtárból kiválasztjuk az acetil-transzferáz-gént hordozó szekvenciát olyan szintetikus oligonukleotid-próbákat alkalmazva, amelyek komplementerek az acetil-transzferáz-szekvenciával [Matsuda et al., Biochem. Biophys. Rés. Commun., 182, 995-1001. (1992)].
5. példa
Streptomyces clavuligerus tenyésztése A munka során a Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 jelű törzset használtuk. A törzs fenntartása agarlemezen történt. Az alkalmazott táptalaj a következő komponenseket tartalmazta egy dm3 desztillált vízben:
| Élesztőkivonat | 4,0 g |
| Malátakivonat | 10,0 g |
| Glükóz | 4,0 g |
| Agar | 20,0 g |
| A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,2 értékre állítot- |
tűkbe.
Az agarlemezeket 5 napon át 30 °C-on inkubáltuk, majd 2 cm3 steril víz hozzáadásával a tenyészeteket lekapartuk az agarfelszínről. Az így kapott szuszpenziót jól zárható, üveggyöngyöt tartalmazó kémcsövekbe tettük. A tenyészeteket néhány perces vortexeléssel homogenizáltuk, és a kapott szuszpenziót használtuk folyadéktenyészetek oltására. Ugyancsak ez a szuszpenzió szolgált kiindulási anyagul a -70 °C-on mélyhűtött törzskonzervek készítéséhez, miután a végtérfogatra számított 15% glicerint adtunk hozzá.
Midőn micélium előállítására volt szükség protoplasztképzéshez a transzformáció céljára vagy DNS kinyeréséhez, akkor a törzset 1 dm3-es Erlenmeyer-lombikban, 200 cm3 YEME táptalajon tenyésztettük, mely a következő komponenseket tartalmazta egy dm3 desztillált vízben:
| Élesztőkivonat | 3,0 g |
| Malátakivonat | 3,0 g |
| Pepton | 5,0 g |
| Glükóz | 10,0 g |
| Szacharóz | 340 g |
| Magnézium-klorid | -víz (1:6) 1,02 g |
| Glicin | 5,0 g |
| Agar | 18,0 g |
| Az inkubálást 28 c | ’C-on rotációs rázógépen végez- |
tűk 2201/perc fordulatszámmal.
6. példa
Streptomyces genom-DNS izolálása A fentiekben ismertetett módon készített 48 órás vegetatív tenyészetet 10 percen át 22 100 g gyorsulással centrifugáltuk. A sejteket felvettük 10 cm3 TE pufferben, a szuszpenzióhoz 10 mg lizozimet adtunk, és az elegyet 15 percen át 30 °C-on tartottuk. Ezután 1 cm3 20%-os SDS oldatot, majd rögtön utána 10 cm3 TE
HU 219 370 Β
Kit (Pharmacia, Piscataway, NJ) segítségével végeztük, a gyártó előírásainak megfelelően. A hibridizálási reakció 37 °C-on egy éjszakán át tartott, az alábbi összetételű reakcióelegyben:
(pH=8) pufferrel telített fenolt és 1,5 cm3 5 M NaCl-oldatot adtunk hozzá. Az elegyet 20 percen át óvatosan forgattuk. A fázisokat 12 000 g gyorsulással 10 percen át végzett centrifugálással elválasztottuk, és a vizes fázist tiszta edénybe töltöttük, majd azonos térfogatú kloroformot adtunk hozzá, és 10 percen át óvatosan forgattuk. A fázisokat centrifugálással (12 000 g, 10 perc) ismét elválasztottuk, és a vizes fázist tiszta edénybe töltöttük. Óvatosan kétszeres térfogatú izopropanolt adtunk hozzá, és a kicsapódott DNS-t üvegbotra felcsavartuk, majd minimális térfogatú TE pufferben feloldottuk. Az oldathoz RN-áz A-t adtunk 20 mg/cm3 végkoncentrációban, majd az elegyet 50 °C-on egy órán át inkubáltuk. Ezután Proteáz K-t adtunk hozzá 100 mg/cm3 végkoncentrációban 100 mM NaCl és 0,4% SDS társaságában, majd az elegyet 37 °C-on inkubáltuk egy órán át. Az oldatot ezután azonos térfogatú, TE (pH=8) pufferrel telített fenollal, majd kloroformmal extraháltuk. Az utolsó extrakciót követően a vizes fázishoz kétszeres térfogatú izopropanolt adva a DNS-t kicsaptuk, és üvegbotra felcsavartuk. A DNS koncentrációját 260 nm hullámhosszon végzett spektrofotometrálással határoztuk meg.
7. példa
Génkönyvtár létrehozása, valamint a Streptomyces clavuligerus expandáz- és hidroxilázgéneket tartalmazó DNS-fragmensek izolálása
S. clavuligerus expandázgén izolálása
Az előzőekben ismertetett módon kapott Streptomyces clavuligerus genom-DNS-t BamHI és Sáli restrikciós enzimekkel emésztettük. Az emésztett DNS-t elektroforézisnek vetettük alá 0,8% agaróztartalmú gélen, és az 1,8-2,2 kilobázis mérettartományba eső fragmenseket eluáltuk, majd előzetesen BamHI és Sáli enzimekkel emésztett pUC18 DNS-sel ligáltuk. A megfelelően hígított ligációs eleggyel kompetens JM109 sejteket transzformáltunk elektroporációs technika alkalmazásával (Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, CA). A kompetens sejtek előállítása és az elektroporáció körülményeinek megválasztása a gyártó cég előírásai szerint történt. A transzformációs elegyet 100 mg/cm3 ampicillint és 75 ml 2%-os X-Gal-oldatot tartalmazó LB agarral szélesztettük. A lemezeket egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk, majd a rekombináns telepeket színtelen megjelenésük alapján azonosítottuk, amire az adott módot, hogy olyan vektort tartalmaznak, amelyben az eredetileg meglévő β-galaktozidázgén működésképtelen. A színtelen telepeket friss, 100 mg/cm3 ampicillint tartalmazó LB agarlemezre vittük. A lemezeket egy éjszakán át, 37 °C-on inkubáltuk, majd a telepeket nitro-cellulóz-membránra vittük. A hibridizációhoz polimeráz-láncreakcióval készített DNS-próbát használtunk, melynek szekvenciája megfelel az irodalomból ismert Streptomyces clavuligerus eredetű expandázgénszekvencia 52 és 918 közötti bázissorrendjének [Kovacevic et al., J. Bacteriol., 171, 154-760. (1989); valamint Ingóba et al., US 5 070 020]. A polimeráz-láncreakció termékének jelölését random-primer extenziós reakcióval (32P)dCTP felhasználásával, Oligolabelling
| Radioaktív jelöléssel ellátott DNS-próbalO6 cpm | |
| Formamid | 30% |
| Nátrium-klorid | 0,15 M |
| Nátrium-citrát | 0,015 M |
| Nátrium-dodecil-szulfát | 0,1% |
| Ficoll | 0,1% |
| Poli(vinil-pirrolidon) | 0,1% |
| Marha-szérumalbumin | 0,1% |
| Boíjú-csecsemőmirigy-DN S | 100 mg/cm3 |
| Több transzformáns hibridizálódott erősen a próbá- |
val, közülük az egyiknek a restrikciós enzimmel végzett analízise igazolta, hogy olyan vektort tartalmaz, amely hordozza az expandázgént. Ez a plazmid a pFTSO-1 jelölést kapta.
5. clavuligerus hidroxilázgén izolálása
A BamHI enzimmel részlegesen emésztett Streptomyces clavuligerus genom-DNS-ből származó fragmenseket lambda Dash II vektorral (Stratagene) ligáltuk. Az így kapott génkönyvtár szűrővizsgálatát hibridizálással végeztük el, egy 30 bázisból álló oligonukleotid segítségével, melynek szekvenciája azonos volt a hidroxilázgén irodalomban közölt [Kovacevic & Miller, J. Bact., 173, 398 (1991)] szekvenciájának első 30 bázisával. Két BamHI emésztett pozitív fágklón DNS Southem-hibridizációja igazolta a várt 6 kilobázis méretű fragmens jelenlétét, melyet szubklónozunk. Ebből a szubklónból KpnI enzimmel végzett emésztés hatására egy sor fragmens keletkezett, a hidroxilázgén régiójának irodalomban közölt restrikciós térképével összhangban [Kovacevic & Miller, 1991],
8. példa
Plazmid-DNS izolálása
A megfelelő plazmidot hordozó Escherichia coli tenyészetek előállítása 500 cm3 LB táptalajon (20 g/dm3 LB Broth Base, Gibco, Paisley, Skócia), 15 mg/cm3 jelenlétében 37 °C-on történt 12-16 órás rázatással, melyet 220 1/perc fordulatszámmal üzemelő rotációs rázógépen végeztük. A sejteket 4 °C-on centrifugálva (4000 g, 10 perc) nyertük ki a tenyészetből. A kiülepedett sejteket felszuszpendáltuk 18 cm3 glükózpufferben (50 mM glükóz, 25 mM Tris pH=8,10 mM EDTA), és 2 cm3 40 mg/cm3 koncentrációjú glükózpufferrel készített liozim (Sigma, St. Louis, MO) oldatot adtunk hozzá, majd megkevertük, és az elegyet 15 percen át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ezután 40 cm3 frissen készített, 1% SDS-tartalmú 0,2 N nátrium-hidroxid-oldatot adtunk az elegyhez, óvatosan megkevertük, és 10 percen át jegeltük. Ezt követően 30 cm3 5 M káliumacetátot (pH=4,8) adtunk hozzá, jól összekevertük, majd újabb 10 percen át jegeltük az elegyet. A sejttörmeléket 4 °C-on végzett centrifugálással (4000 g, 10 perc) elválasztottuk, a felülúszót pedig szűrővásznon leszűrtük. Hattizedszeres térfogatú izopropanol hozzáadásával (szobahőmérséklet, 20 perc) a plazmidDNS-t kicsaptuk. A keletkezett csapadékot 4 °C-on vég17
HU 219 370 Β zett centrifugálással (4000 g, 20 perc) elválasztottuk, 70%-os etanollal mostuk, majd rövid ideig szárítottuk. Az így kapott plazmid-DNS-t 9 cm3 TE pufferben felszuszpendáltuk, és hozzáadtunk 10 g cézium-kloridot, valamint 0,387 cm3 10 mg/cm3 koncentrációjú etídium-bromid-oldatot. Ezt az elegyet 313 100 g gyorsulással 24 órán át centrifugáltuk. A cézium-klorid-gradiensben keletkező plazmidsávot ibolyántúli fényben vizualizáltuk, majd izoláltuk, és az etídium-bromidot vízzel telített butanollal végzett extrakcióval eltávolítottuk. Ezután a cézium-klorid eltávolítására a plazmidkészítményt TE pufferrel szemben dializáltuk, és végül a DNS-t PEG-8000 alkalmazásával koncentráltuk. A DNS koncentrációját 260 mm hullámhosszon végzett spektrofotometrálással határoztuk meg.
9. példa
A pPenFTSO Penicillium transzformációs vektor megalkotása
Fleomicinrezisztencia-gén beiktatása
A Penicillium transzformációs vektorban domináns szelekciós markerként fleomicinrezisztenciáért felelős gént alkalmaztunk. Ezt oly módon hajtottuk végre, hogy először is izoláltunk egy 660 bázispár méretű fragmenst, amely tartalmazta a fleomicinrezisztencia-gént (Streptoalloteichus hindustanus törzsből származó fleomicinkötő fehérje génjét), és ezt egy élesztőcitokróm Cl terminátorhoz kapcsoltuk. A citokróm Cl terminátorhoz a BamHI/BglII emésztett pUT713 (CAYLA, Toulouse Cedex, Francé) plazmid elektroforézisét követően, az agarózgélről történő eluálás révén jutottunk. Az izolált fragmenst a pSELECTR 1 (Promega Corporation) vektor BamHI helyére ligáltuk, és a gén orientációját restrikciós enzimes analízissel határoztuk meg. Az így kapott plazmidon lévő egyetlen HindlII hasítási hely eltávolítása érdekében a plazmidot HindlII enzimmel hasítottuk, Klenow-polimerázzal feltöltöttük, majd visszaligáltuk. Ezután egy, a lambda cos helyet tartalmazó 550 bázispár méretű PstI fragmenst építettünk be, amely a vektort képessé teszi kozmidképzésre, amennyiben megfelelő méretű inszertek vannak benne. Ez a vektor a pSCP4 jelzést kapta.
A Penicillium chrysogenum genom-DNS-t részlegesen emésztettük Sau3A enzimmel, és génkönyvtárat hoztunk létre lambda EMBL3 fágvektorban. A könyvtárból izoláltuk az izopenicillin-N-szintetáz (IPNS)gént tartalmazó kiónt, amelynek felhasználásával szubklónokat készítettünk. Az egyik ezek közül egy 3,6 kilobázis méretű fragmenst hordozott, amely az IPNS-gént megelőző első BamHI helytől a gén utáni első HindlII helyig terjedő DNS-szakaszt tartalmazta. A szubklón egyetlen Sáli hasítási helyének eltávolítása érdekében Sáli enzimmel hasítottunk, Klenow- polimerázzal feltöltöttünk, majd visszaligáltunk. Ezután az egyetlen Xbal hasítási hely eltávolítása érdekében hasonlóképpen eljárva Xbal enzimmel hasítottunk, Klenow-polimerázzal feltöltöttünk, majd visszaligáltunk. Az így kapott plazmid a pSXF-1 jelzést kapta. A kialakított IPNS-protomert agarózgél-elektroforézissel 1,2 kilobázis méretű Ncol fragmensként kinyertük a pSXF-1 plazmidból, és a korábban ismertetett pSCP4 plazmid Ncol helyére építettük be. Az orientációt, melyet restrikciós emésztéssel igazoltunk, úgy választottuk meg, hogy a promoter az ATG startkodonnál csatlakozzon a fleomicinrezisztencia-génhez. Az így kapott plazmid a pUTZ-2 jelzést kapta.
S. clavuligerus expandázgén beiktatása
A Streptomyces clavuligerus expandázgénjét tartalmazó, 1645 kilobázis méretű fragmens tisztítását az előbbiekben ismertetett pFTSO-1 plazmid BamHI és Sáli enzimekkel való emésztés után, 0,8% agaróztartalmú gélen történő elektroforézissel, majd eluálással végeztük. Az izolált fragmenst BamHI és Sáli enzimekkel emésztett pSELECT (Promega Corporation) vektorba építettük be. Az így kapott vektor a pFTSO-8 jelzést kapta. Új Ncol hasítási helyet hoztunk létre a pFTSO-8 vektoron helyspecifikus mutagenezissel, melyet az Altered SitesR in vitro Mutagenesis System (Promega Corporation) alkalmazásával végeztünk, a gyártó előírásainak megfelelően. Olyan oligonukleotidot készítettünk, amely komplementer a Streptomyces expandázgén ATG startkodon körüli, irodalomban közölt [Kovacevic et al., J. Bacteriol., 171, 3952-3958 (1990)] szekvenciájával. Az oligonukleotid szintézise cianoetil-foszforamidit kémiai módszerrel (Pharmacia Gene Assembler készüléken) történt, és szekvenciája a következő:
8. szekvencia
3’ CGAGAGGATCAGTGAGAGTCCATGGACACGACGG5’
A mutagenezist enzimes analízissel igazoltuk. Ezután a pUTZ-2 plazmidból Ncol-hasítással kiemeltük a módosított, Penicillium chrysogenum eredetű IPNS- promoterszakaszt tartalmazó, 1,2 kilobázis méretű Ncol fragmenst, majd agarózgél-elektroforézist végeztünk. Az IPNS-promoterszakaszt a pFTSO-8 vektor mutagenezissel létrehozott, az expandázgén ATG startkodonjánál lévő új Ncol helyére építettük be. A promotemek az expandázgénnel való kapcsolódási orientációját restrikciós enzimmel végzett analízissel állítottuk meg. Az IPNS-promoter: expandázgén kazettát ezután BamHI/SAlI fragmensként kihasítottuk, és a BamHI/Sall hasított pUTZ-2 Penicillium transzformációs vektorba építettük be. Ez a végső konstrukció a pPenFTSO jelzést kapta.
10. példa
A pPEN/CEPH-1 Penicillium transzformációs vektor megalkotása
IPNS-promoterrégió beiktatása
A 9. példában ismertetett pUTZ-2 plazmidból az
IPNS-promoterszakaszt Xhol/Smal emésztéssel kihasítottuk. A pUTZ-2 vektort BamHI enzimmel hasítottuk, és a túlnyúló végeket dNTP-k és Klenow-fragmens felhasználásával feltöltöttük, majd Xhol enzimmel emésztettük, és a izolált Xhol/Smal IPNS-fragmenst az így hasított vektorba illesztettük, aminek folytán a konstrukció az IPNS-promoterrégiót már két példányban tartalmazta. Az így keletkezett új vektor a pUTZ-7 jelzést kapta.
HU 219 370 Β
C. acremonium expandáz/hidroxiláz gén beiktatása
A pUTZ-7 vektorból Xhol/Xbal emésztéssel az IPNS-promoterrégiók egyikét izoláltuk (elektroforézist követően az agarózgélről való eluálással), és a kapott fragmenst Xhol/Xbal hasított II SK vektorba (Stratagene, La Jolla, CA) illesztettük. Az így kapott vektor a pIPNSp/blue jelzést kapta.
A Cephalosporium expandáz/hidroxiláz gént a genom-DNS-ből származó és a fentiekben ismertetett módon ilyenként azonosított klónból 1,6 kilobázis méretű HindlII/Xbal fragmensként (elektroforézist követően az agarózgélről való eluálással) izoláltuk, és HindlII/Xbal emésztett pSELECT vektorba építettük be. Új BspHI hasítási helyet hoztunk létre az expandáz/hidroxiláz gén ATG startkodonjánál helyspecifikus mutagenezissel, melyet az Altered SitesR in vitro Mutagenesis System (Promega Corporation) alkalmazásával végeztünk, a gyártó előírásainak megfelelően. Olyan oligonukleotidot készítettünk, amely komplementer a Cephalosporium acremonium expandáz/hidroxiláz gén ATG startkodon körüli, irodalomban közölt [Sámson et al., Bio/Technology, 5, November (1987)] szekvenciájával. Az oligonukleotid szintézise ciano-etil-foszforamidit kémiai módszerrel (Pharmacia Gene Assembler készüléken) történt, és szekvenciája a következő:
9. szekvencia
3’ GTTTTGGTGTCGTAGTAGTACTGAAGGTTCCAG5’
A mutagenezist restrikciós enzimes analízissel igazoltuk. A Cephalosporium acremonium expandáz/hidroxiláz gént ezután agarózgél-elektroforézist követő eluálással izoláltuk BspHI/Xbal fragmensként, és Ncol/Xbal emésztett pIPNSp/blue vektorba építettük be. Az új vektor így a Penicillium eredetű IPNS-promotert a Cephalosporium acremonium expandáz/hidroxiláz gén ATG startkodonjához kapcsolva tartalmazta. Ez a vektor a pIPNSp/EXP/blue jelzést kapta. Ezt az IPNS-promoter: expandáz/hidroxiláz kazettát Xhol enzimmel részlegesen, Xbal enzimmel pedig teljesen emésztettük, a fragmenst agarózgél-elektroforézist követő eluálással izoláltuk, és Xhol/Xbal emésztett pUTZ-2 vektorba illesztettük. Az így előállított transzformációs vektor a pPEN/CEPH-1 jelzést kapta.
11. példa
Penicillium transzformációs vektor megalkotása, amely együtt expresszálja az S. clavuligerus expandáz- és hidroxilázgéneket
A Penicillium chrysogenum b-tubulin-génjét lambda-genomkönyvtárból Aspergillus niger b-tubulin-génnek hibridizációs próbaként való alkalmazásával klónoztuk. A Penicillium chrysogenum b-tubulin-promotert tartalmazó 2,0 kilobázis méretű Xbal/HindlII fragmenst Xbal/HindlII hasított pSELECT (Promega) plazmidba építettük be. Új Ncol hasítási helyet hoztunk létre helyspecifikus mutagenezissel az ATG startkodonnál az AAAATGCGT szekvenkciát ACCATGGGT szekvenciára cserélve. Az így kapott vektorból 1,4 kilobázis méretű BamHI/NcoI fragmenst izoláltunk agarózgél-elektroforézissel, és ezt a pUTZ-2 plazmid BamHI és Ncol hasítási helyei közé beillesztve kaptuk a pCI-6 jelű vektort. Egy Penicillium chrysogenum genomklónból az IPNS- és az acil-transzferáz-géneket együttesen tartalmazó, 5,1 kilobázis méretű Sáli fragmenst izoláltunk, és ezt a pUTZ-2 plazmid Sáli hasítási helyére beillesztve kaptuk meg a pUTZ-5 vektort. A pUTZ-5 vektor BamHI/HindlII emésztését követő agarózgél-elektroforézissel az IPNS-gén 3’-terminátorszekvenciáját hordozó 1,3 kilobázis méretű fragmenst izoláltunk, melyet a korábban leírt pCI-6 plazmid BamHI és HindlII hasítási helyei közé illesztettünk be, megkapva így a pCI-13 vektort. A BamHI hasítási hely közelében lévő egyetlen Sáli hasítási helyet restrikciós enzimmel végzett hasítással, Klenow-fragmenssel történő feltöltéssel, majd visszaligálással megszüntettük. Új Sáli hasítási helyet alakítottunk ki a BamHI hasítási hely túloldalán helyspecifikus mutagenezissel, a GGAAGACG szekvenciát GGTCGACG szekvenciára változtatva. Ezután a plazmidot Pvu I enzimmel hasítva eltávolítottuk az ampicillinrezisztencia-gént, majd visszaligálva megkaptuk a pCI-15 vektort. Végül az IPNS: expandázgén kazettát a pPENFTSO plazmidból agarózgél-elektroforézissel BamHI/Sall fragmensként izoláltuk, és ezt a pCI-15 plazmidba beillesztve elkészítettük a pEXP-1 vektort.
Egy, a Streptomyces clavuligerus expandáz- és hidroxilázgénjét együttesen expresszáló vektor létrehozása érdekében a következő lépéseket hajtottuk végre. A 2,9 kilobázis méretű, a hidroxilázgént tartamazó KpnI fragmenst szubklónoztunk a pSELECT plazmidban oly módon, hogy a polilinker Eco Rí hasítási helye szomszédos legyen a gén 5’-végével. A plazmid egyetlen Ncol hasítási helyét helyspecifikus mutagenezissel, a TCCATGGGC szekvenciát TCGATGGGC szekvenciára cserélve megszüntettük, és egyidejűleg új Ncol hasítási helyet hoztunk létre az ATG startkodonnál az AACATGGC szekvenciát ACCATGGC szekvenciára változtatva. Mindkét változtatás érintetlenül hagyta az eredetileg kódolt aminosavszekvenciát. A pUTZ-2 plazmidból izoláltuk a módosított IPNS-promotert tartalmazó, 1,0 kilobázis méretű Eco RI/NcoI fragmenst, és azt a fenti, megváltoztatott hidroxilázgént tartalmazó vektor Eco Rí és Ncol hasítási helyei közé illesztettük. Az így kapott vektor egyetlen Eco Rí hasítási helyét helyspecifikus mutagenezissel HindlII hasítási hellyé alakítottuk. Az így előállított vektorból az 5’ IPNS:hidroxiláz fúziós konstrukciót HindlII fragmensként izoláltuk, majd a fentiekben ismertetett pEXP-Ι plazmid egyetlen HindlII hasítási helyére illesztettük be. így végül olyan vektort kaptunk, amely tartalmazza az expandáz- és a hidroxilázgéneket külön-külön IPNS- promoter irányítása alatt, valamint a fleomicinrezisztencia-markert, melyet a b-tubulin- promoter irányít.
12. példa
A pPenCACT Penicillium transzformációs vektor megalkotása
Higromicinrezisztencia-gén beiktatása
A Penicillium transzformációs vektor megalkotása során domináns szelekciós markerül a higromicinrezisz19
HU 219 370 Β tencia-gént választottuk. A pHpH-1 vektorból (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 1,15 kilobázis méretű fragmensként izoláltuk az Escherichia coli eredetű higromicin B foszfotranszferáz-gént agarózgél-elektroforézissel, és azt BamHI emésztett mpl9 vektorba építettük be. A higromicinrezisztencia-gén orientációját az RF DNS restrikciós enzimmel végzett analízisével állapítottuk meg. Az 5’-végen lévő BamHI hasítási hely közel van a higromicingén ATG startkodonjához. Annak érdekében, hogy megkönnyítsük ezen az 5’-végen más promotor elhelyezését, a 3’-végen lévő BamHI hasítási helyet helyspecifikus mutagenezissel, Mutator™ Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) alkalmazásával eltávolítottuk. A mutagenezist a gyártó előírásai szerint végeztük. Oligonukleotidot állítottunk elő, amelynek szekvenciája komplementer az irodalomból ismert [Gritz, L. & Davies, J., Gene, 25, 179. (1983)] Escherichia coli higromicin B foszfotranszferáz-gén 3’-végén lévő BamHI hasítási hely környezetének DNS-szekvenciájával. Az oligonukleotid szintézise ciano-etil-foszforamidit kémiai módszerrel (Pharmacia Gene Assembler készüléken) történt, és szekvenciája a következő:
10. szekvencia
5’ TACCCGGGGTTCCCGCGAACT 3’
A mutagenezist restrikciós enzimes analízissel igazoltuk. Az új rezisztenciagént ezután agarózgél-elektroforézissel Smal/Xbal fragmensként izoláltuk, és Smal/Xbal emésztett pUC18 plazmidba illesztettük be.
A korábban ismertetett pUTZ-2 vektor Ncol-hasítását követően agarózgél-elektroforézissel 1,2 kilobázis méretű fragmensként izoláltuk a Penicillium IPNS-promotert. Szintetikus oligonukleotid-linkereket szintetizáltunk, hogy az IPNS-promoter Ncol hasítási helyén túl BamHI hasítási helyet alakíthassunk ki, mi lehetővé tenné az IPNS- fragmens beillesztését a higromicinrezisztencia-gén ATG startkodonjához közeli, 5’-végen lévő BamHI hasítási helyre. Az oligonukleotidok szintézise ciano-etil-foszforamidit kémiai módszerrel (Pharmacia Gene Assembler készüléken) történt, és szekvenciájuk a következő:
11. szekvencia
5’ CATGAAGAAG 3’
12. szekvencia
3’ TTCTTCCTAG 5’
Ezek a szekvenciák megőrzik az IPNS természetes szekvenciáját, de a higromicingénben kettővel több aminosavat kódolnak. Az oligonukleotidokat összeolvasztottuk, foszforiláltuk, és az Ncol-hasított IPNS-promoterfragmenssel összekapcsoltuk, amelynek így BamHI hasítási helye jött létre mind a 3’-, mind pedig az 5’-végén. A linkerrel kapcsolt promotert a pUC18 vektorban lévő, BamHI-hasított higromicinrezisztencia-génhez illesztettük, és orientációját restrikciós enzimmel végzett analízissel igazoltuk. Ezt az IPNS:higromicinrezisztencia-gén kazettát agarózgél-elektroforézissel 2,1 kilobázis méretű Xhol/Sall fragmensként (az Xhol hasítási hely az IPNS-promoter 5’-végén, a Sáli hasítási hely pedig a pUC polilinkeren található) izoláltuk, és Sallemésztett PSELECT vektorba illesztettük be. A kazetta orientációját restrikciós enzimmel végzett analízissel határoztuk meg. Az így előállított vektor a pIPNS/HYG jelzést kapta.
C. acremonium acetil-transzferáz-gén beiktatása
A korábban ismertetett módon készített genomklónból a Cephalosporium acremonium acetil-transzferázgént agarózgél-elektroforézissel, 1,8 kilobázis méretű BglII/Sall fragmensként izoláltuk, és BamHI/Sall emésztett pSELECT vektorral ligáltuk. Annak érdekében, hogy megkönnyítsük a Penicillium IPNS-promoter kapcsolását a Cephalosporium acremonium acetiltranszferáz-gén ATG startkodonjához, új Ncol hasítási helyet hoztunk létre az acetil-transzferáz-gén ATG kodonjánál, és a struktúrgénben lévő Ncol hasítási helyet helyspecifikus mutagenezissel eltávolítottuk. A mutagenezist Altered Site™ in vitro Mutagenesis System alkalmazásával, a gyártó előírásainak megfelelően eljárva végeztük. Oligonukleotidokat készítettünk, amelyek komplementerek a Cephalosporium acremonium acetil-transzferáz-gén szóban forgó régiójával, amint az az 1. és 2. szekvencia alatt szerepel. A struktúrgénben lévő Ncol hasítási hely eltávolítására szolgáló oligonukleotid-szekvencia az alábbi:
13. szekvencia
3’ GTCGGCGCATCGATGGGTGGAAT 5’
Az ATG startkodonnál az új Ncol hasítási hely létrehozására szolgáló oligonukleotid-szekvencia az alábbi:
14. szekvencia
3’ CGCCCACCATGGCGCCTCAGAT 5’
Ezek az oligonukleotidok ciano-etil-foszforamidit kémiai módszerrel (Pharmacia Gene Assembler készüléken) a gyártó előírásainak megfelelően készültek. A mutagenezist restrikciós enzimmel végzett analízissel igazoltuk. Az így előállított vektor a pMUTACT jelzést kapta.
A korábban ismertetett pUTZ-2 vektorból agarózgél-elektroforézissel 1,2 kilobázis méretű Ncol fragmensként izoláltuk a Penicillium IPNS-promotert, melyet Ncol-hasított pMUTACT vektorral ligáltunk. Az így kapott új vektor az IPNS-promotert közvetlenül a Cephalosporium acremonium acetil-transzferáz-génhez kapcsolva tartamazza. A promoter orientációját restrikciós enzimes analízissel igazoltuk. Ezt az IPNSpromoter : acetil-transzferáz-gén kazettát Xhol/Sall emésztés után (az Xhol hasítási hely az IPNS-promoter 5’-végén található) Sall-emésztett pSELECT vektorral ligáltuk. A fragmens orientációját restrikciós enzimes analízissel határoztuk meg. Az így előállított vektor a pMUTACT/IPNS jelzést kapta.
Az acetil-transzferáz-gén ATG kodonjánál létrehozott új Ncol hasítási hely az enzim második aminosavában változást okozott: a szerint alaninra cserélte. Annak érdekében, hogy megőrizzük az eredeti aminosavszekvenciát, helyspecifikus mutagenezist hajtottunk végre Altered Sites™ in vitro Mutagenesis System alkalmazásával. Olyan oligonukleotidot állítottunk elő, amely az acetil-transzferáz-gén szóban forgó DNS-szakaszának szekvenciájával (1. és 2. szekvencia) komplementer. A második aminosavat alaninról szerűire változtatás érdekében felhasznált oligonukleotid szekvenciája a következő:
HU 219 370 Β
15. szekvencia
3’ TCTAGCTAGACACCATGTCGCCTCAGAT 5’ Az oligonukleotidot ciano-etil-foszforamidit módszerrel (Pharmacia Gene Assembler készülék alkalmazásával) szintetizáltuk. A mutagenezist DNS-szekvenálással igazoltuk, melyet USB Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit (USB, Cleveland, Ohio) segítségével végeztünk. A szekvenáláshoz használt printereket cianoetil-foszforamidit módszerrel (Pharmacia Gene Assembler készülék alkalmazásával) szintetizáljuk. Az így létrehozott vektor a pMUTACT/IPNS-2 jelzést kapta.
Az IPNS-promoter:higromicinrezisztencia-gén kazettát a pIPNS/HYG vektorból Xbal fragmensként kihasítottuk, és Xbal-emésztett pMUTACT/IPNS-2 vektorba ligálásával megkaptuk a pPenCACT transzformációs vektort. A higromicinkazetta orientációját restrikciós enzimes analízissel állapítottuk meg.
13. példa
A pTS-8 Penicillium transzformációs vektor megalkotása, amely expresszálja a Cephalosporium acremonium expandáz/hidroxiláz és acetil-transzferázgénjét egyaránt
A Cephalosporium acremonium acetil-transzferázgénjét genomklónból 1,8 kilobázis méretű BglII/Sall fragmensként agarózgél-elektroforézis alkalmazásával izoláltuk és BamHI/Sall emésztett pSELECT vektorba (Promega Corporation) ligáljuk. Annak érdekében, hogy a Penicillium IPNS-promoter pozicionálását megkönnyítsük a Cephalosporium acremonium acetiltranszferáz-gén ATG kodonjánál, új Ncol hasítási helyet hoztunk létre a -42 helyen lévő bázisnál, egy másik, a struktúrgénen belül lévő Ncol hasítási helyet pedig eltávolítottunk helyspecifikus mutagenezissel, melyet Altered Sites™ in vitro Mutagenesis System (Promega Corporation) alkalmazásával, a gyártó előírásainak megfelelően hajtottunk végre. Olyan oligonukleotidot állítottuk elő, amely a szóban forgó DNS-szakasz szekvenciájával komplementer, de változtatásokat tartalmaz az Ncol hasítási hely létrehozása, illetve eltávolítása érdekében. A struktúrgén belsejében lévő Ncol hasítási hely eltávolítására szolgáló oligonukleotid szekvenciája a következő:
16. szekvencia
3’ GTCGGCGCATCGATGGGTGGAAT 5’
A -42 helyen lévő ATG startkodonnál új Ncol hasítási hely kialakítására szolgáló oligonukleotid szekvenciája az alábbi:
17. szekvencia
5’ CTCCGATAGGGCGTGGTACCCGGCCCTACTCTTAT3’
Az oligonukleotidokat ciano-etil-foszforamidit módszerrel (Pharmacia Gene Assembler készülék alkalmazásával) szintetizáltuk. Mindkét mutagenezist restrikciós enzimes analízissel igazoltuk. Az így létrehozott új vektor a pMUTACT jelzést kapta. A korábban ismertetett pUTZ-2 vektorból a Penicillium IPNS-promotert 1,2 kilobázis méretű Ncol fragmensként izoláltuk agarózgél-elektroforézissel. A promotert tartalmazó fragmenst Ncol enzimmel hasított pMUTACT vektorba ligáltuk, így az közvetlenül illeszkedett a Cephalosporium acremonium acetil-transzferáz-gén -42 helyén lévő ATG startkodonhoz. A promoter orientációját restrikciós enzimes analízissel igazoltuk. Az így előállított vektor a pMUTACT/IPNS jelzést kapta. A pMUTACT/IPNS vektorból az IPNS-promoter: acetil-transzferáz kazettát 2,5 kilobázis méretű XhoI/Sall-fragmensként izoláltuk agarózgél-elektroforézissel, és Sall-emésztett pUTZ-2 vektorba ligáltuk. Ezt az átmeneti vektort Xbal enzimmel emésztettük, és a korábban ismertetett pPEN/CEPH-1 vektorból származó, az IPNS- promoter'.expandáz/hidroxiláz kazettát tartalmazó, 2,1 kilobázis méretű Xbal fragmenssel ligáltuk. Az így létrehozott transzformációs vektor a pTS-8 jelzést kapta.
14. példa
Penicillium chrysogenum transzformációja Protoplasztot képezünk a korábban ismertetett
Penicillium chrysogenum törzsből oly módon, hogy lxlO7 spórával 50 cm3 CM táptalajt oltottunk, amelyet rotációs rázógépen 2201/perc fordulatszámmal 67 órán át 25 °C-on rázattunk. A micéliumot szűrővásznon szűrve kinyertük, és 500 cm3-es lombikba téve 100 mg Novozyme 234 enzimet (Novo BioLabs, Bagsvaerd, Dánia) tartalmazó 25 cm3 KMP pufferben (0,7 M kálium-klorid, 0,8 M mannit, 0,02 M kálium-dihidrogénfoszfát, pH=6,3) felszuszpendáltuk, majd 100 1/perc fordulatszámmal 30 °C-on inkubáltuk. A keletkezett szferoplasztokat szűrővászon/üveggyapot szűrőrétegen elválasztottuk, és 350 g gyorsulással 10 percen át centrifugálva összegyűjtöttük. A szferoplasztokat háromszor 10 cm3 KMP pufferrel mostuk, KMPC pufferben (50 mM kalcium-klorid-tartalmú KMP puffer) szuszpendáltuk oly módon, hogy 5 χ 107 sejt/cm3 koncentrációjú szuszpenzió keletkezett, melyet 20 percen át szobahőmérsékleten tartottunk. A Penicillium transzformálása érdekében 200 ml szferoplasztszuszpenzióból, DNS-oldatból (5 mg vektor DNS 6,2 ml KMPC pufferben, mely 5 mg/cm3 koncentrációban heparint tartalmaz) és 50 ml PPC pufferből (40% PEG-3500,20 mM kálium-dihidrogén-foszfát, pH=6,3, melyhez közvetlenül a felhasználás előtt kalcium-kloridot adtunk 5% végkoncentrációban) transzformációs elegyet állítottunk össze, és azt 30 percen át jegeltük. A transzformációs elegyhez ezután 1 cm3 frissen készített PPC puffért adtunk, majd 50 cm3 olvadt (50 °C) regenerálóagarba kevertük (1,3 M mannitot és 3% agart tartalmazó CM táptalaj). Az így kapott elegyet 5 Petri-csészébe osztottuk szét, melyeket 24 órán át 25 °C-on tartottunk, majd felülrétegeztünk 100 mg/50 cm3 fleomicint tartalmazó OL agarral (1% pepton és 1% agar). A felülrétegezéshez ugyanolyan mennyiségű agart használunk, mint amennyi a regenerálóagar volt. A Petri-csészéket ezután 25 °C-on 7-14 napon át inkubáltuk, és figyeltük a transzformáns telepek képződését.
15. példa
Az aktivitás meghatározása biológiai módszerrel Agardiffúziós biológiaiérték-mérést alkalmaztunk a nagynyomású folyadékkromatografálással (HPLC) izo21
HU 219 370 Β
Iáit adipoil-6-ΑΡΑ és adipoil-7-ADCA fermentációs termékek antibiotikus aktivitásának meghatározására. Szűrőpapírkorongba itatott 20 ml fermentációs terméket Bacillus subtilis ATCC 33677 vagy szuperérzékeny Escherichia coli (melyet Prof. Amold E. Demain, MIT bocsátott rendelkezésünkre) törzzsel beoltott LB agarlemezekre (20 g/dm3 LB táptalaj-koncentrátum, 3% ágánál, Gibco, Paisley, Skócia) vittünk. A Bacillus subtilis törzset az adipoil-6-ΑΡΑ-, az Escherichia coli törzset pedig az adipoil-7-ADCA-termék, meghatározása során használtuk. A 37 °C-on 15 órán át tartó inkubáció alatt keletkező kioltási gyűrű, amely a szűrőpapírkorong körül figyelhető meg, a tesztbaktérium növekedését gátló hatás miatt, jelzi a termékek biológiai aktivitását. A kísérletek során kontrollként dezacetoxi-cefalosporin-C-t, cefalosporin-C-t, penicillin-V-t, valamint penicillináz nélküli és penicillinázt tartalmazó kontrolibeállításokkal igazoltuk a β-laktámszerkezetű vegyületek jelenlétét.
16. példa
A 6-APA-, 7-ADCA-, 7-ADAC- és 7-ACA-adipoilszármazékok szimultán kimutatása HPLC-módszerrel
A transzformált Penicillium chrysogenum törzsek fermentációs termékeinek (adipoil-6-ΑΡΑ, adipoil-7ADCA, adipoil-7-ADAC és adipoil-7-ACA) analízisét nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel (HPLC) végeztük. HPLC-rendszerünk az alábbi Waters készülékekből állt: 625 Solvent Delivery System, 409E változtatható hullámhosszú detektor (220 és 260 nm hullámhosszra beállítva), 825 Maxima adatfeldolgozó rendszer. Nova-Pak C185xl00 mm méretű, Nova-Pak C18 Guard-Pak előtéttel ellátott radiális kompressziós oszlopon végeztük az analízist gradienselúciós módszerrel. Az 1 cm3/perc sebességgel áramoltatott metanol-10 mM kálium-dihidrogén-foszfát puffer (pH=5) eluens-összetételét 10 perc alatt lineárisan változtattuk 5:95 arányról 40:60 arányra. Az adipoil-6-APA-koncentrációját penicillin-N standard görbe segítségével 220 mm hullámhosszon határoztuk meg. A gyűrűtágított termékek meghatározása szintetikus adipoil-7ADCA, illetve adipoil-7-ACA standard görbék alapján 260 nm hullámhosszon történt.
17. példa
RAE V-enzim-vizsgálatok
Kémiai úton szintetizált adipoil-7-ADCA- és adipoil-7-ACA-szubsztrátumokat használtunk a RAEV-enzim (kereskedelmi forgalomban beszerezhető, RAEV Corporation) fajlagos aktivitásának meghatározására. A 10 mM szubsztrátumot, 1 mg RAEV-enzimet és 5% glicerint 50 ml térfogatú 0,16 M kálium-dihidrogénfoszfát-pufferben tartalmazó reakcióelegyet 37 °C-on inkubáltuk. (A körülmények még kedvezőbbek voltak, amennyiben 20 mM vagy nagyobb szubsztrátumkoncentrációt és 20-50 mM kálium-dihidrogén-foszfát puffért alkalmaztunk.) A reakcióelegyből 5 ml térfogatú alikvot mintákat vettünk ki 0, 1, 3, 5, 10, 20 és 30 perc elteltével, melyeket 35 pl koncentrációjú foszfátpufferrel (pH=3,5) hígítottunk, és a korábbiakban ismertetett módon végzett HPLC-analízisig -70 °C-on tároltuk.
A RAEV-enzim aktivitásának kolorimetriás meghatározását adipoil-p-amino-benzoesav-szubsztrátummal végeztük. Az 5 mM szubsztrátumot 8,25 mg RAEV-enzimet és 10% glicerint 50 ml térfogatú 0,065 M kálium-dihidrogén-foszfát-pufferben (pH=7) tartalmazó reakcióelegyet 37 °C-on inkubáltuk. Az enzimreakciót 96 lyukú mikrotiterlemezben végeztük. A reakció leállítására 1 M koncentrációjú nátrium-nitrit 0,25 M koncentrációjú ecetsavval készült oldatának százszoros hígításából 50 ml-t adtunk a reakcióelegyhez, majd 3 percen át szobahőmérsékleten tartottuk. 4-Amino-5-hidroxi-2,7-naftalindiszulfonsav- mononátriumsó-monohidrát 10 mg/cm3 koncentrációjú, 0,5 M nátrium-karbonáttal készített vizes oldatát százszorosára hígítottuk, és ebből 100 ml-t adtunk a reakcióelegyhez, majd a szín kifejlődését haladéktalanul követtük EL 312 Biokinetics Plate Reader (BioTek Instruments) készülék segítségével.
8. példa
Alternatív adipoil-aciláz-enzimek kimutatása
A RAEV-enzimmel végzett vizsgálatokon túlmenően az adipoil-7-ADCA (és egyéb adipoilszármazékok) adipoil-oldalláncát egy sor más, mikrobiális eredetű enzimmel is el tudtuk végezni. Egy előkísérlet során az Asahi cég SE-83 és SE-495 jelű Pseudomonas sp. törzseit (FERM BP-817, illetve FERM BP-818), valamint a Toyo Jozo cég SY-77-1 jelű Pseudomonas törzsét (NRRL B-8070) 72 órán át tenyésztettük az alábbi összetételű táptalajon:
HyCase SF 20,0 g/dm3
Nátrium-hidrogén-glutamát 5,0 g/dm3
Élesztőkivonat 5,0 g/dm3
Kukoricalekvár-por 2,0 g/dm3
Gyapotmagolaj 5,0 g/dm3
Glutársav 1,0 g/dm3
A sejteket centrifugálással elválasztottuk, 50 mM koncentrációjú foszfátpufferrel (pH=8) mostuk, majd ugyanebben a pufferben felszuszpendáltuk. A külső sejtmembránt kis mennyiségű kloroform hozzáadásával áteresztővé tettük, és a szuszpenzió alikvotjait adipoilp-nitro-aniliddel (ad-pNA) elegyítve 2-18 órán át 30 °C-on inkubáltuk. Az inkubáció után az elegyet 10 térfogat% ecetsav hozzáadásával megsavanyítottuk. A keletkezett p-nitro-anilint a g-glutamil-transzferáz meghatározására szolgáló reagenskészlet (Sigma 545-A) alkalmazásával diazovegyületté alakítottuk, és kolorimetriásan mértük. A relatív aktivitás rendre 100%, 85,5% és 48% volt az SE-495, SE-83, illetve SY-77-1 törzsek esetében. A RAEV-enzimmel kapcsolatban korábban ismertetett módszerrel is kimutattuk az SE-83 és SE-495 enzimek aktivitását adipoil-7-ADCA-szubsztrátumon. Az SY-77-1 törzs β-laktamáztermelése miatt adipoil-7-ADCA-szubsztrátumon dezacetilázaktivitás kimutatása nem volt lehetséges.
Hasonló módon kimutattunk adipoil-aciláz-termelést két gombatörzs (Alternaria sp. MA-133, ATCC
HU 219 370 Β
20492 és Aspergillus sp. MA-13, ATCC 20491; Meiji Seika Kaisha Ltd., US 4 141 790 számú szabadalmi leírás), valamint további három, cefalosporin-C-aciláztermelő baktériumtörzs (Brevibacterium ATCC 14649, Achromobacterium ATCC 14648 és Flavobacterium ATCC 14650; Merck & Co., Inc., US 3 239 394 számú szabadalmi leírás) esetében.
SZEKVENCIALISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ (i) BEJELENTŐ: Merck & Co. Inc.
(ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Új biológiai eljárás
7-ACA és 7-ADAC előállítására (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 17 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:
(v) KOMPUTERREL OLVASHATÓ FORMA:
(vi) AKTUÁLIS BEJELENTÉSI ADATOK:
(viii) KÉPVISELŐ:
(ix) TELEKOMMUNIKÁCIÓS ADATOK:
(2) INFORMÁCIÓK AZ 1. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(a) HOSSZ: 14 bázispár (b) TÍPUS: nukleinsav (c) SZÁLSZÁM: kettős (d) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 1. szekvencia
TCTAGACACC ATGG 14 (2) INFORMÁCIÓK A 2. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(a) HOSSZ: 16 bázispár (b) TÍPUS: nukleinsav (c) SZÁLSZÁM: kettős (d) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 2. szekvencia
GTGAGAGTTG ATGGAC 16 (2) INFORMÁCIÓK A 3. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(a) HOSSZ: 16 bázispár (b) TÍPUS: nukleinsav (c) SZÁLSZÁM: kettős (d) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 3. szekvencia
TCTAGACACT ATGGAC 16 (2) INFORMÁCIÓK A 4. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(a) HOSSZ: 16 bázispár (b) TÍPUS: nukleinsav (c) SZÁLSZÁM: kettős (d) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍUSA: DNS (genomiális) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 4 szekvencia
TCTAGACACCATGGAC 16 (2) INFORMÁCIÓK AZ 5. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(a) HOSSZ: 22 aminosav (b) TÍPUS: aminosav (c) SZÁLSZÁM: egyszeres (d) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 5. szekvencia
Ser Asn Ser Gly Alá Val Alá Pro Gly Lys Thr Alá Asn Gly Asn Alá Leu Leu Leu Gin Asn Pro 15 10 15 20 (2) INFORMÁCIÓK A 6. SZEKVENCIÁHOZ (c) SZÁLSZÁM: egyszeres (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK: (d) TOPOLÓGIA: lineáris (a) HOSSZ: 22 aminosav (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (b) TÍPUS: aminosav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 6. szekvencia
Ser Asn Ser Trp Alá Val Alá Pro Gly Lys Thr Alá Asn Gly Asn Alá Leu Leu Leu Gin Asn Pro 15 10 15 20 (2) INFORMÁCIÓK A 7. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(a) HOSSZ: 22 aminosav (b) TÍPUS: aminosav (c) SZÁLSZÁM: egyszeres 45 (d) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 7. szekvencia
Ser Asn Asn Trp Alá Val Alá Pro Gly Arg Thr Alá Thr Gly Arg Pro Ile Leu Alá Gly Asp Pro 15 10 15 20 (2) INFORMÁCIÓK A 8. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(a) HOSSZ: 34 bázispár (b) TÍPUS: nukleinsav (c) SZÁLSZÁM: egyszeres (d) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 8. szekvencia
CGAGAGGATC AGTGAGAGTC CATGGACACG ACGG 34 (2) INFORMÁCIÓK A 9. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(a) HOSSZ: 33 bázispár (b) TÍPUS: nukleinsav (c) SZÁLSZÁM: egyszeres (d) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális)
HU 219 370 Β (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 9. szekvencia GTTTTGGTGT CGTAGTAGTA CTGAAGGTTC CAG 33 (2) INFORMÁCIÓK A 10. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (a) HOSSZ: 21 bázispár (b) TÍPUS: nukleinsav (c) SZÁLSZÁM: egyszeres (d) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 10. szekvencia
TACCCGGGT TCCCGCGAACT 21 (2) INFORMÁCIÓK All. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(a) HOSSZ: 10 bázispár (b) TÍPUS: nukleinsav (c) SZÁLSZÁM: egyszeres (d) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 11 szekvencia
CATGAAGAAG 10 (2) INFORMÁCIÓK A 12. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (a) HOSSZ: 10 bázispár (b) TÍPUS: nukleinsav (c) SZÁLSZÁM: egyszeres (d) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 12. szekvencia
TTCTTCCTAG 10 (2) INFORMÁCIÓK A 13. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(a) HOSSZ: 23 bázispár (b) TÍPUS: nukleinsav (c) SZÁLSZÁM: egyszeres (d) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 13. szekvencia
GTCGGCGCAT CGATGGGTGG AAT 23 (2) INFORMÁCIÓK A 14. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(a) HOSSZ: 22 bázispár (b) TÍPUS: nukleinsav (c) SZÁLSZÁM: egyszeres (d) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (ix) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 14. szekvencia
CGCCCACCAT GGCGCCTCAG AT 23 (2) INFORMÁCIÓK A 15. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(a) HOSSZ: 28 bázispár (b) TÍPUS: nukleinsav (c) SZÁLSZÁM: egyszeres (d) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 15. szekvencia
TCTAGCTAGA CACCATGTCG CCTCAGAT 28 (2) INFORMÁCIÓK A 16. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(a) HOSSZ: 23 bázispár (b) TÍPUS: nukleinsav (c) SZÁLSZÁM: egyszeres (d) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS-mRNS (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 16. szekvencia GTCGGCGCAT CGATGGGTGG AAT 23 (2) INFORMÁCIÓK A 17. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(a) HOSSZ: 35 bázispár (b) TÍPUS: nukleinsav (c) SZÁLSZÁM: egyszeres (d) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA : cDNS-mRNS (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 17. szekvencia
CTCCGATAGG GCGTGGTACC CGGCCCTACT CTTAT 35
Claims (8)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Biológiai eljárás 7-amino-dezacetil-cefalosporánsav (7-ADAC) és 7-amino-cefalosporánsav (7-ACA) előállítására, amelynek során- izopenicillin-N-termelő Penicillium chrysogenum törzset a megfelelő növekedést biztosító tápközegben tenyésztünk, a tenyészethez olyan, adipátot - előnyösen adipinsavat, annak sóit és/vagy észtereit tetszőleges arányban - tartalmazó tápanyagot adunk, amelyet a szóban forgó Penicillium chrysogenum törzs képes hasznosítani az adipoil-6-amino-penicillánsav (adipoil-6-ΑΡΑ) bioszintézise során, és- az adipoil-6-APA-molekulából in situ gyűrűtágítással adipoil-7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsavat (adipoil-7-ADCA) állítunk elő expandázenzim segítségével úgy, hogy olyan Penicillium chrysogenum törzset alkalmazunk, amely adipoil-6-APA-szubsztrátumot hasznosítani képes expandázenzim-aktivitást kódoló DNS-sel van transzformálva, és a gén expressziója révén keletkező enzimmel a törzs által termelt adipoil-6APA in situ gyűrűtágítását hatjuk végre, azzal jellemezve, hogy- a képződött adipoil-7-ADCA-molekula 3-metiloldalláncát in situ hidroxilezve adipoil-7-amino-dezacetil-cefalosporánsavat (adipoil-7-ADAC) állítunk elő hidroxilázenzim segítségével úgy, hogy olyan Penicillium chrysogenum törzset alkalmazunk, amely adipoil7-ADCA-szubsztrátumot hasznosítani képes hidroxilázenzim-aktivitást kódoló DNS-sel van transzformálva, és a gén expressziója révén keletkező enzimmel a törzs által termelt adipoil-7-ADCA in situ hidroxilezését hajtjuk végre, és- a képződött adipoil-7-ADAC-molekulán a következő enzimatikus átalakításokat hatjuk végre:a) a képződött adipoil-7-ADAC adipoil-oldalláncát adipoil-amidáz-enzim segítségével eltávolítjuk, és az így képződött 7-ADAC-terméket elkülönítjük, vagyb) kívánt esetben a képződött adipoil-7-ADAC-molekulát acetilezve adipoil-7-amino-cefalosporánsavat (adipoil-7-ACA) állítunk elő acetil-transferáz-enzim segítségével úgy, hogy olyan Penicillium chrysogenumHU 219 370 Β törzset alkalmazunk, amely adipoil-7-ADAC-szubsztrátumot hasznosítani képes acetil-transzferáz-enzim-aktivitást kódoló DNS-sel van transzformálva, és a gén expressziója révén keletkező enzim a törzs által termelt adipoil-7-ADAC in situ acetilezését hajtjuk végre, és- a képződött adipoil-7-ACA-molekula adipoil-oldalláncát adipoil-amidáz-enzim segítségével eltávolítjuk, és az így képződött 7-ACA-terméket elkülönítjük.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy adipáttartalmú tápanyagként dinátrium-adipátot használunk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az expandáz-, hidroxiláz- és acetil-transzferáz-enzim-aktivitásokat kódoló DNS-ként Cephalosporium acremonium eredetű DNS-t alkalmazunk.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyetlen, bifunkcionális expandáz/hidroxiláz enzimet használunk.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy adipoil-amidázként Pseudomonas törzsből származó enzimet alkalmazunk.
- 6. Eljárás a rekombináns Penicillium chrysogenum törzs kromoszomális DNS-ébe integrálható rekombinánsDNS expressziős vektor pPEN/CEPH-1, pPenCACT és pTS-8 plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy Cephalosporium acremonium eredetű expandáz/hidroxiláz és/vagy acetil-transzferáz-enzim-aktivitásokat kódoló DNS-szakaszt, valamint ennek expresszióját irányító, a Penicillium chrysogenum IPNS-gén promoterét valamely alkalmas vektorba inszertáljuk.
- 7. Eljárás rekombináns DNS expressziős vektorral transzformált, PC200 jelű, ATCC 74 186 számon letétbe helyezett és PC300 jelű, ATCC 74 187 számon letétbe helyezett Penicillium chrysogenum gazdasejtek előállítására, amelyek Cephalosporium acremonium eredetű expandáz/hidroxiláz és acetil-transzferáz-enzim-aktivitásokat kódoló DNS-szakaszt, valamint ennek expresszióját irányító, Penicillium chrysogenum IPNS-gén promoterét tartalmazzák, azzal jellemezve, hogy Penicillium chrysogenum sejteket pPEN/CEPH-1 és/vagy pTS-8 expressziős vektorral transzformálunk.
- 8. Eljárás rekombináns Penicillium chrysogenum gazdasejt tenyésztésére a génexpresszióhoz megfelelő körülmények között, azzal jellemezve, hogy valamely, a 7. igénypont szerinti eljárással előállított rekombináns gazdasejteket alkalmazunk.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US77783391A | 1991-10-15 | 1991-10-15 | |
| US95349292A | 1992-10-06 | 1992-10-06 | |
| PCT/US1992/008585 WO1993008287A1 (en) | 1991-10-15 | 1992-10-08 | Novel bioprocesses for preparing 7-aca and 7-adac |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9401073D0 HU9401073D0 (en) | 1994-07-28 |
| HUT69783A HUT69783A (en) | 1995-09-28 |
| HU219370B true HU219370B (en) | 2001-03-28 |
Family
ID=27119363
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9401073A HU219370B (en) | 1991-10-15 | 1992-10-08 | Novel bioprocesses for preparing 7-aca and 7-adac |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5559005A (hu) |
| EP (2) | EP0856516B1 (hu) |
| JP (1) | JP2655790B2 (hu) |
| KR (1) | KR100227711B1 (hu) |
| CN (1) | CN1074484A (hu) |
| AT (2) | ATE174057T1 (hu) |
| AU (1) | AU657800B2 (hu) |
| BG (1) | BG62261B1 (hu) |
| CA (1) | CA2080573C (hu) |
| CZ (1) | CZ288721B6 (hu) |
| DE (2) | DE69232581T2 (hu) |
| DK (2) | DK0540210T3 (hu) |
| ES (2) | ES2127205T3 (hu) |
| FI (1) | FI106965B (hu) |
| GR (1) | GR3029343T3 (hu) |
| HU (1) | HU219370B (hu) |
| IL (3) | IL103419A (hu) |
| MX (1) | MX9205902A (hu) |
| NO (1) | NO315802B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ244714A (hu) |
| RO (1) | RO116648B1 (hu) |
| RU (1) | RU2002130702A (hu) |
| SK (1) | SK280569B6 (hu) |
| TW (1) | TW272233B (hu) |
| UA (1) | UA47385C2 (hu) |
| WO (1) | WO1993008287A1 (hu) |
| YU (1) | YU48930B (hu) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0233715B1 (en) * | 1986-01-31 | 1994-05-25 | BEECHAM GROUP plc | Isolation and expression of genes involved in the biosynthesis of beta-lactams |
| US6709859B1 (en) * | 1986-01-31 | 2004-03-23 | Beecham Group P.L.C. | Chromosomal DNA Fragments Encoding Enzymes for Encoding B-Lactam Biosynthesis Enzymes, and Vector and Transformants for Their Expression |
| KR0171897B1 (ko) * | 1989-12-27 | 1999-02-01 | 후지사와 도모끼찌로 | 7-아미노세펨 화합물 또는 그 염류의 제조 방법 |
| US5318896A (en) * | 1991-09-11 | 1994-06-07 | Merck & Co., Inc. | Recombinant expandase bioprocess for preparing 7-aminodesacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA) |
| HU219259B (en) * | 1993-07-30 | 2001-03-28 | Gist Brocades Bv | Process for the efficient production of 7-adca via 2-(carboxyethylthio)acetyl-7-adca and 3-(carboxymethylthio)propionyl-7-adca, recombinant dna vectrors and transformed host cells |
| ES2194873T3 (es) * | 1993-07-30 | 2003-12-01 | Dsm Ip Assets Bv | Procedimiento para la produccion eficaz de 7-adca a traves de 3-(carboxietil)propionil-7-adca. |
| WO1996010084A1 (en) * | 1994-09-28 | 1996-04-04 | Novo Nordisk A/S | Process for the production of secondary metabolites |
| DE4437420A1 (de) * | 1994-10-19 | 1996-04-25 | Hoechst Ag | Verbessertes, induktionsfreies Verfahren zur gentechnischen Herstellung von Glutarylamidase |
| US5731165A (en) * | 1995-06-02 | 1998-03-24 | Gist-Brocades, B.V. | Process for the production of 7-ADCA via expandase activity on penicillin G |
| DE69617228T2 (de) * | 1995-06-02 | 2002-06-27 | Dsm N.V., Heerlen | Verfahren zur herstellung von 7-adca durch umsetzung penicillins g mittels expandase |
| WO1997038107A1 (en) * | 1996-04-04 | 1997-10-16 | Gist-Brocades B.V. | An enzyme with high adipoyl-coenzyme a synthetase activity and uses thereof |
| EP0914463A2 (en) | 1996-07-16 | 1999-05-12 | Gist-Brocades B.V. | NOVEL PROCESS FOR THE PREPARATION OF CEPHALOSPORINS USING $i(ACREMONIUM CHRYSOGENUM) |
| CN1224468A (zh) * | 1997-04-22 | 1999-07-28 | 吉斯特-布罗卡迪斯有限公司 | 去酰基化头孢菌素的发酵生产的方法 |
| CN1137271C (zh) | 1997-04-22 | 2004-02-04 | 吉斯特-布罗卡迪斯有限公司 | 头孢菌素发酵生产的改进方法 |
| BR9804854A (pt) * | 1997-04-22 | 1999-09-08 | Gist Brocades Bv | Processo para a produção fermentativa de cefalosporinas desaciladas |
| ZA983396B (en) * | 1997-04-22 | 1998-10-27 | Gist Brocades Bv | A method for controlling the solubility of a beta-lactam nucleus |
| EP1015600A1 (en) * | 1997-08-22 | 2000-07-05 | Dsm N.V. | Statin production by fermentation |
| AU3419399A (en) | 1998-03-27 | 1999-10-18 | Dsm N.V. | Novel process for the fermentative production of cephalosporin |
| US6383773B2 (en) | 1998-04-23 | 2002-05-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Penicillin conversion |
| EP1141372A2 (en) * | 1998-12-22 | 2001-10-10 | Dsm N.V. | Improved in vivo production of cephalosporins |
| ES2165276B1 (es) * | 1999-06-18 | 2003-03-01 | Antibioticos Sau | Procedimiento biotecnologico para la produccion de acido 7-aminocefal osporanico (7-adca) y compuestos de sintesis intermedios particularmente penicilina n y desacetoxicefalosporina c (daoc) |
| WO2001087891A1 (en) | 2000-05-13 | 2001-11-22 | Smithkline Beecham P.L.C. | Process for the purification of a salt of clavulanic acid |
| US6699699B2 (en) | 2002-03-26 | 2004-03-02 | Synmax Biochemical Co., Ltd. | Mutated penicillin expandases |
| ES2400562T3 (es) | 2003-05-28 | 2013-04-10 | Dsm Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. | Compuesto de cefem |
| BRPI0708232A2 (pt) * | 2006-02-23 | 2011-05-17 | Dsm Ip Assets Bv | microorganismo que produz cefalosporina, método para a construção de um microorganismo e processo para a produção de uma cefalosporina |
| KR101569832B1 (ko) * | 2008-11-19 | 2015-11-18 | 삼성전자주식회사 | 시료 중의 게놈 ｄｎａ 및 플라스미드 ｄｎａ를 서로 분리하는 방법 및 그를 위한 키트 |
| CN101429538B (zh) * | 2008-12-12 | 2011-05-25 | 河北九派制药有限公司 | 7-α-甲氧基-3-去乙酰基头孢噻吩苄星盐的制备方法 |
| CN102369290A (zh) | 2009-04-03 | 2012-03-07 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 发酵工艺 |
| US8863444B2 (en) | 2010-05-31 | 2014-10-21 | Feature Walters | Assembly system for modular building units |
| EP2585608B1 (en) | 2010-06-22 | 2017-07-26 | DSM Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. | Air bubble fermentation process |
| CN103108879B (zh) | 2010-09-07 | 2016-08-17 | 中化帝斯曼制药有限公司荷兰公司 | 用于生产头孢菌素类的方法 |
| CN102702229A (zh) * | 2011-08-04 | 2012-10-03 | 重庆天地药业有限责任公司 | 一种头孢唑肟钠关键中间体的制备及高含量头孢唑肟钠的制备 |
| WO2015091455A1 (en) | 2013-12-17 | 2015-06-25 | Dpx Holdings B.V. | Bioreactor |
| KR101808192B1 (ko) * | 2016-08-26 | 2018-01-18 | 아미코젠주식회사 | 7-아미노세팔로스포란산의 고농도 생산 재조합 아크레모니움 크리소제눔 균주의 제조방법 및 이 방법으로 제조된 균주 |
Family Cites Families (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1270852A (fr) * | 1960-09-20 | 1961-09-01 | Bayer Ag | Procédé d'acylation enzymatique d'acide 6-aminopénicillanique |
| FR2241557A1 (en) * | 1973-08-22 | 1975-03-21 | Aries Robert | 7-Amino-desacetoxy cephalosporanic acid prepn - from cephalosporin C, using an amido hydrolase enzyme |
| JPS5417032B2 (hu) * | 1974-01-23 | 1979-06-27 | ||
| JPS5282791A (en) * | 1975-12-27 | 1977-07-11 | Toyo Jozo Co Ltd | Preparation of 7-amino compounds |
| JPS5920360B2 (ja) * | 1976-04-19 | 1984-05-12 | 萬有製薬株式会社 | ７−アミノセフアロスポラン酸および其の誘導体の製造法 |
| JPS5386094A (en) * | 1977-01-06 | 1978-07-29 | Banyu Pharmaceut Co Ltd | Preparation of 7-amino-cephem derivatives |
| US4178210A (en) * | 1977-03-07 | 1979-12-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Accellular synthesis of cephalosporins |
| US4248966A (en) * | 1979-05-17 | 1981-02-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Synthesis of isopenicillin derivatives in the absence of living cells |
| US4307192A (en) * | 1979-05-17 | 1981-12-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Cell-free synthesis of deacetoxycephalosporin C |
| US4510246A (en) * | 1982-08-23 | 1985-04-09 | Queen's University At Kingston | Isolation of cyclase, epimerase and a ring expansion enzyme for producing unnatural cephalosporins |
| US4536476A (en) * | 1982-08-23 | 1985-08-20 | Queen's University At Kingston | Stable epimerase reagent, cyclase reagent and ring expansion reagent for cell-free production of cephalosporins |
| JPS60110292A (ja) * | 1983-11-22 | 1985-06-15 | Asahi Chem Ind Co Ltd | セフアロスポリン・アシラ−ゼ産生遺伝情報を担うｄνａ断片 |
| JPS6121097A (ja) * | 1984-07-10 | 1986-01-29 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ７−アミノセフアロスポラン酸及びその誘導体の製造法 |
| FR2569723B1 (fr) * | 1984-08-31 | 1986-09-19 | Centre Nat Rech Scient | Application des antibiotiques de la famille des phleomycines a titre d'agent de selection dans le domaine du genie genetique |
| JPS61152286A (ja) * | 1984-12-27 | 1986-07-10 | Asahi Chem Ind Co Ltd | セフアロスポリンｃアシラ−ゼ産生遺伝情報を担うｄｎａ断片 |
| EP0233715B1 (en) * | 1986-01-31 | 1994-05-25 | BEECHAM GROUP plc | Isolation and expression of genes involved in the biosynthesis of beta-lactams |
| US4753881A (en) * | 1986-09-10 | 1988-06-28 | Eli Lilly And Company | Purified enzyme and process therefor |
| JPH0829114B2 (ja) * | 1986-09-18 | 1996-03-27 | 旭化成工業株式会社 | ７−アミノセフアロスポラン酸およびその誘導体の製造法 |
| IL81555A0 (en) * | 1986-11-17 | 1987-09-16 | Baldwin Jack Edward | Enzymatic process for 3-substituted cephalosporins |
| ATE90382T1 (de) * | 1987-01-17 | 1993-06-15 | Hoechst Ag | Verwendung von gamma-glutamyl-transpeptidase. |
| CA1327170C (en) * | 1987-03-04 | 1994-02-22 | Stephen Wyatt Queener | Recombinant dna expression vectors and dna compounds that encode deacetoxycephalosporin c synthetase and deacetylcephalosporin c synthetase |
| US4981789A (en) * | 1987-03-18 | 1991-01-01 | Merck & Co., Inc. | One-step enzymatic conversion of cephalosporin C and derivatives to 7-aminocephalosporanic acid and derivatives |
| EP0322032A3 (en) * | 1987-12-21 | 1991-01-30 | Merck & Co. Inc. | One-step enzymatic conversion of cephalosporin c and derivatives to 7-aminocephalosporanic acid and derivatives |
| DE3743323A1 (de) * | 1987-12-21 | 1989-06-29 | Hoechst Ag | Verfahren zur enzymatischen hydrolyse von (alpha)-aminoadipinyl-monoaminoverbindungen |
| US5070020A (en) * | 1988-05-09 | 1991-12-03 | Eli Lilly And Company | Recombinant dna expression vectors and dna compounds that encode deacetoxycephalosporin c synthetase |
| US5082772A (en) * | 1988-10-24 | 1992-01-21 | Eli Lilly And Company | Process for preparing deacetylcephalosporin c |
| JP2928884B2 (ja) * | 1989-02-01 | 1999-08-03 | 武田薬品工業株式会社 | Ｄｎａおよびその用途 |
| DE69019967T2 (de) * | 1989-04-04 | 1996-02-22 | Biopure Corp | Enzymatisches verfahren zur herstellung von 7-aminocephalosporansäure. |
| US5104800A (en) * | 1989-06-27 | 1992-04-14 | Merck & Co., Inc. | One-step cephalosporin c amidase enzyme |
| IL95766A (en) * | 1989-09-27 | 1996-12-05 | Lilly Co Eli | Recombinant DNA expression vectors And DNA compounds. Which encode Aspergillus acyltransferase activity |
| KR0171897B1 (ko) * | 1989-12-27 | 1999-02-01 | 후지사와 도모끼찌로 | 7-아미노세펨 화합물 또는 그 염류의 제조 방법 |
| DE69131238T2 (de) * | 1990-01-12 | 1999-11-11 | Glaxo Group Ltd., Greenford | Für ein Enzym der Antibiotika-Biosynthese kodierende DNA-Sequenz |
| JPH03254684A (ja) * | 1990-03-02 | 1991-11-13 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規ｃＤＮＡ化合物 |
| CA2045951A1 (en) * | 1990-07-06 | 1992-01-07 | Steven Kovacevic | Recombinant dna expression vectors and dna compounds that encode deacetylcephalosporin c synthase activity |
| US5318896A (en) * | 1991-09-11 | 1994-06-07 | Merck & Co., Inc. | Recombinant expandase bioprocess for preparing 7-aminodesacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA) |
-
1992
- 1992-10-08 SK SK431-94A patent/SK280569B6/sk unknown
- 1992-10-08 RO RO94-00603A patent/RO116648B1/ro unknown
- 1992-10-08 WO PCT/US1992/008585 patent/WO1993008287A1/en active IP Right Grant
- 1992-10-08 HU HU9401073A patent/HU219370B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-10-08 KR KR1019940701210A patent/KR100227711B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-10-08 CZ CZ1994884A patent/CZ288721B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-10-08 UA UA94005496A patent/UA47385C2/uk unknown
- 1992-10-13 NZ NZ244714A patent/NZ244714A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-10-14 AT AT92309351T patent/ATE174057T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-10-14 DE DE69232581T patent/DE69232581T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-14 ES ES92309351T patent/ES2127205T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-14 MX MX9205902A patent/MX9205902A/es not_active IP Right Cessation
- 1992-10-14 CA CA002080573A patent/CA2080573C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-14 AU AU27016/92A patent/AU657800B2/en not_active Ceased
- 1992-10-14 AT AT97204046T patent/ATE216700T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-10-14 IL IL10341992A patent/IL103419A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-10-14 DE DE69227750T patent/DE69227750T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-14 DK DK92309351T patent/DK0540210T3/da active
- 1992-10-14 DK DK97204046T patent/DK0856516T3/da active
- 1992-10-14 ES ES97204046T patent/ES2176613T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-14 EP EP97204046A patent/EP0856516B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-14 EP EP92309351A patent/EP0540210B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-14 CN CN92113331A patent/CN1074484A/zh active Pending
- 1992-10-15 JP JP4319194A patent/JP2655790B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-15 YU YU92592A patent/YU48930B/sh unknown
- 1992-10-22 TW TW081108424A patent/TW272233B/zh not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-04-13 BG BG98714A patent/BG62261B1/bg unknown
- 1994-04-14 FI FI941730A patent/FI106965B/fi not_active IP Right Cessation
- 1994-04-14 NO NO19941345A patent/NO315802B1/no unknown
- 1994-05-27 US US08/250,310 patent/US5559005A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-05-11 US US08/439,404 patent/US5629171A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-04-17 US US08/839,327 patent/US6017726A/en not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-02-10 GR GR990400429T patent/GR3029343T3/el unknown
- 1999-06-28 US US09/340,781 patent/US6071713A/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-12-27 IL IL13373499A patent/IL133734A0/xx unknown
- 1999-12-27 IL IL13373399A patent/IL133733A0/xx unknown
-
2002
- 2002-11-15 RU RU2002130702/13A patent/RU2002130702A/ru not_active Application Discontinuation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU219370B (en) | Novel bioprocesses for preparing 7-aca and 7-adac | |
| US5318896A (en) | Recombinant expandase bioprocess for preparing 7-aminodesacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA) | |
| RU2202616C2 (ru) | Способ получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты, вектор экспрессии, рекомбинантный штамм | |
| PL172155B1 (pl) | Sposób biotechnologiczny wytwarzania pochodnych kwasu cefalosporanowego | |
| PL174984B1 (pl) | Nowy proces biologiczny wytwarzania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (kwasu 7-ADC) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: GIST-BROCADES B.V., NL |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |