JPH03254684A - 新規ｃＤＮＡ化合物 - Google Patents

新規ｃＤＮＡ化合物

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JPH03254684A
JPH03254684A JP2049434A JP4943490A JPH03254684A JP H03254684 A JPH03254684 A JP H03254684A JP 2049434 A JP2049434 A JP 2049434A JP 4943490 A JP4943490 A JP 4943490A JP H03254684 A JPH03254684 A JP H03254684A
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JP
Japan
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cdna
deacetylcephalosporin
acetyltransferase
acremonium chrysogenum
amino acid
Prior art date
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Pending
Application number
JP2049434A
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English (en)
Inventor
Akio Matsuda
昭生 松田
Kokichi Sugiura
杉浦　弘吉
Kenji Matsuyama
健二 松山
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Asahi Chemical Industry Co Ltd
Original Assignee
Asahi Chemical Industry Co Ltd
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Publication date
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Priority to US08/178,606 priority patent/US5466598A/en
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C12P35/06—Cephalosporin C; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
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    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｓ
ｏｎｉｕｍ　Ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕ＋ｍ）由来であり、
デアセチルセファロスポリンＣアセチルトランスフェラ
ーゼ前駆体をコードする新規ｃＤＮＡ化合物に関するも
のである。
（従来の技術） 臨床上重要なセファロスポリン系抗生物質の出発原料で
あるセファロスポリンＣは、糸状菌であるアクレモニウ
ム・クリソゲナムを用いた発酵法により製造されている
。従来、該菌のセファロスポリンＣ生産能力を向上させ
るために用いられてきた技術は、突然変異生成およびラ
ンダムスクリーニングであった。
しかし、近年、該菌を宿主とする形質転換系が開発され
〔例えば、Ｑｕｅｅｎｅｒら、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ　１９８５、　Ａｓ＋ｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔ
ｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＋　（１９８５
）　ｐｐ４６８　４７２．５ｋａｔｒｕｄ　ら、　Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８７）　１２：　
３３７−３４８　、ｌ　、優良菌株の育種に遺伝子工学
的アプローチを施す道が開けてきた。セファロスポリン
Ｃは、アクレモニウム・クリソゲナムにおいて３種のア
ミノ酸を出発原料として、下記に示す経路で生合成され
ることが知られている〔例えば、Ｍａｒｔｉｎら、　Ｔ
ｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９
８５）　３：　３９−４４参照〕。
Ｌ−α−アミノアジピン酸＋Ｌ−システィン＋Ｌ−バリ
ン↓　ステップｌ Ｌ−α−ア短ノアジビル・Ｌ−システイニル・Ｄバリン
↓　ステップ２ イソペニシリンＮ ↓　ステップ３ ペニシリンＮ ↓　ステップ４ デアセトキシセファロスポリンＣ ↓　ステップ５ デアセチルセファロスポリンＣ ↓　ステップ６ セファロスポリンＣ すでに、上記ステップ２を触媒する酵素、すなわち、イ
ソペニシリンＮ合成酵素およびステップ４．５を触媒す
るデアセトキシセファロスポリンＣ合戒酵素／デアセチ
ルセファロスポリンＣ合威酵素（アクレモニウムの場合
、単一のポリペプチドが両酵素活性を有していることが
明らかになっている。以下、該酵素をＤＡＯＣ３／ＤＡ
Ｃ３と略す）は、アクレモニウム・クリソゲナムから純
化され、対応する遺伝子も単離され、それぞれ塩基配列
まで明らかになっている（Ｓａｍｓｏｎら、　Ｎａｔｕ
ｒｅ　（１９８５）　３１８，１９１　、Ｄｏｔｚｌａ
ｆ　ら、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ　（１９８７）　１６９．１６１１−１６１８．
５ａｌｌ＋ｓｏｎら。
ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　（１９８７）　５．１
２０７　）。
さらに、最近、５ｋａｔｒｕｄらは、アクレモニウムの
発酵液中に、セファロスポリンＣ生合成中間体の一種で
あるペニシリンＮ（上記の生合成経路）が著量蓄積して
いることに着目し、ペニシリンＮを基質とする上記酵素
ＤＡＯＣ３／ＤＡＣ３をコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡ断片を、アクレモニウム・クリソゲナム内に導入し
た。その結果、該酵素の細胞内レベルを上昇させ、セフ
ァロスポリンＣ生産能を向上させることに成功した（Ｓ
ｋａｔｒｕｄ　ら、　ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　
（１９８９）　７．４７７）　、一方、上記発酵液中に
は、他のセファロスポリンＣ生合成中間体であるデアセ
チルセファロスポリンＣもかなりの量存在することも以
前から知られていた（Ｈｕｂｅｒ　ら、　Ａｐｐｌｉｅ
ｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　（１９６８）　１６＋
１０１１−１０１４　　）。
したがって、該中間体を基質としてセファロスポリンＣ
を生成させる（前記生合成経路のステップ６の反応を触
媒する）酵素、すなわち、デアセチルセファロスポリン
Ｃアセチルトランスフェラーゼの細胞内レベルを上昇さ
せること、該酵素の性質をセファロスポリンＣ生産にと
って、より好適なものに改良することは、セファロスポ
リンＣ生産能の向上につながると考えられる。
以上の理由から、該酵素の精製および該酵素をコードす
る遺伝子の単離は、当業者間で強く望まれていた。しか
し、該酵素は極めて不安定であることが知られており〔
例えば、Ｓｈｅｉｄｅｇｇｅｒら、　Ｊ。
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１
９８５）　３．１０９−１１７）、精製の報告すら全く
なされていなかった。本発明者らは、先に該酵素の安定
化および純化方法を開発し、また、かくして得られる該
酵素の生化学的特徴および一部の構造的特徴を下記のご
とく解明した。
ａ、　　ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による
測定で分子量が、サプユニツ）１：２７，０００±２．
０００ダルトンおよびサブユニット２：１４，０００±
２，０００ダルトンｂ、ゲルろ過による測定で分子量が
５５，０００±２，０００ダルトン Ｃ１等電点がｐＨ４，Ｏ±０．５ ｄ、　　Ｎ末端アミノ酸配列が下記に示す配列０プスニ
フト１）　　Ｌｅｕ−Ｘ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ−１
１ｅ−Ａｌａ−Ａｒｇｌｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＧｌｕＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−１
１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ０プユニフト２）　　Ａｓｐ−５
ｅｒ−Ｇｌｙ−＾ｓｎ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−ＡｒｇＡｌａ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−
Ｖａｌ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ＝Ａｒｇ−Ｔ
ｙｒ−Ｇ　ｉｎ　−Ａ　ｌ　ａ　−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｌｙ
ｓ　−Ｐｈｅ−＾１ａｅ、　デアセチルセファロスポリ
ンＣアセチル基転移酵素活性が１■当たり１〜１０単位
（発明が解決しようとする課！り 本発明は、アクレモニウム・クリソゲナム由来のデアセ
チルセファロスポリンＣアセチルトランスフェラーゼの
安定化および純化方法の開発に基づいて、デアセチルセ
ファロスポリンＣアセチルトランスフェラーゼ前駆体を
コードするｃＤＮＡ化合物を提供することを目的とする
。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは、引続く研究において、アクレモニウム・
クリソゲナムのｃＤＮＡライブラリーより、デアセチル
セファロスポリンＣアセチルトランスフェラーゼ前駆体
をコードする新規ｃＤＮＡ化合物を分離し、その塩基配
列を決定し、本発明を完成するに至った。
アクレモニウム・クリソゲナムのデアセチルセファロス
ポリンＣアセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列な
らびに該酵素をコードするｃＤＮＡの塩基配列に関する
報告は、今までなされておらず、今回初めて明らかにさ
れたものである。
本発明によれば、アクレモニウム・クリソゲナム由来で
あり、かつ、請求項１に示されるアミノ酸配列からなる
デアセチルセファロスポリンＣアセチルトランスフェラ
ーゼ前駆体をコードしている新規ｃＤＮＡ化合物が提供
される。請求項２に、本発明により取得されたデアセチ
ルセファ０スポリンＣアセチルトランスフエラーゼ前駆
体をコードしている特定のＤＮＡ配列を示した。
遺伝暗号には同義性が存在することが公知であり、上記
デアセチルセファロスポリンＣアセチルトランスフェラ
ーゼ前駆体は、複数個の異なるＤＮＡ配列によってコー
ドされ得る。そのような他のＤＮＡ配列も、本発明と同
一のアミノ酸残基をコードしているので、これらの配列
を有するＤＮＡもまた本発明に含まれる。
本発明のｃＤＮＡは、大略下記の工程によって遺戒する
ことができる。
（１）セファロスポリン生産能を有するアクレモニウム
・クリソゲナムから全ＲＮＡを抽出し、ｍ−ＲＮＡ画分
を濃縮する。
（２ン上記ｍ−ＲＮＡを鋳型として、１本鎖、続いて２
末鎖ｃＤＮＡを合威した後、適当なファージベクターに
組み込んで、アクレモニウム・クリソゲナムのｃＤＮＡ
ライブラリーを構築する。
（３）生化学的手法を用い、すでに本発明者らにより決
定されているデアセチルセファロスポリンＣアセチルト
ランスフェラーゼのアミノ酸配列の一部から推定される
遺伝子上の可能なりＮＡ塩基配列すべてを含むオリゴヌ
クレオチド混合物、またはコドン使用頻度を考慮するこ
とにより推定される塩基配列からなるオリゴヌクレオチ
ドを合威し、これをＤＮＡプローブと称する。
（４）　Ｄ　Ｎ　Ａ　７’　Ｏ−ブを３２　ｐ　チーｙ
　ヘ）Ｌ／　ＩＪ、前記（２）テ得られたｃＤＮＡライ
ブラリーとプラークハイブリダイゼーションを行わせ、
ＤＮＡプローブと相補性を示したプラークを選択分離す
る。
（５）選択したファージからＤＮＡを抽出し、ベクター
に組み込まれたｃＤＮＡの塩基配列を決定する。そして
、得られたＤＮＡ配列から翻訳されるアミノ酸配列と、
生化学的手法により解明されたデアセチルセファロスポ
リンＣアセチルトランスフェラーゼ構成サブユニットの
部分アミノ酸配列を比較照合し、得られたｃＤＮＡがデ
アセチルセファロスポリンＣアセチルトランスフェラー
ゼをコードしていることを確認する。
上記の工程中でＲＮＡ、、ＤＮＡの取り扱いに必要な一
般的な操作は、当業者間で通常行われているものであり
、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓらの実験操作書（Ｔ、Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ
ａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２）にしたがえば、容易に実
施できる。使用される酵素、試薬類およびｃＤＮＡクロ
ーン化に用いるベクターＤＮＡもすべて市販の製品が用
いられ、特に断らないかぎり、製品で指定されている使
用条件にしたがえば、完全にそれらの目的を達成するこ
とができる。
上記（１）において、ＲＮＡ抽出源としてはアクレモニ
ウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０、より好適には
、高いセファロスポリンＣ生産能を有するアクレモニウ
ム・クリソゲナムＡＴＣＣ３６２２５、アクレモニウム
・クリソゲナムｌ５−５等の菌株が使用できる。
なお、アクレモニウム・クリソゲナムｌ５−５株は、平
底２年２月５日付で通商産業省工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第１１２３２号の寄託番号で寄託
されている。また、該菌からの全ＲＮＡ抽出は、例えば
、Ｂｏｅｌら（Ｂｏｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪｏ
ｕｒｎａｌ　（１９８４）　３．１０９７〜１１０２″
Ｊの方法に準じて実施することができる。上記（２）に
おけるｃＤＮＡの合或は、公知の方法（例えば、Ｇｕｂ
ｌｅｒ−Ｈｏｆｆｓ＋ａｎらの方法（Ｇｅｎｅ　（１９
８３）　２５．２６３　）　）にしたがって実施できる
。上記（３）において指定された塩基配列をもつオリゴ
ヌクレオチドの混合物の台底には、市販のＤＮＡ合或合
成用い、その操作手順にしたがって実施することができ
る。上記（５）におけるＤＮＡ塩基配列の決定法も、公
知であるジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、＋
　ｐｒＯｃ、　Ｎａｔｉ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
ＳＡ　（１９７７）　７３．５４６３）が用いられる。
（実施例） 以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明は、該
実施例によって限定されるものではない。
実施例に記載の略称ないし略号は、以下のとおりのもの
である。
ＣＭ培地ニジｇｔｌｔ２０ｇ／リン酸二水素カリウム０
．５ｇ／リン酸水素二カリウム０．５ｇ／塩化カリウム
０．５ｇ／硫酸マグネシウム（７水塩）０．５ｇ／硫酸
鉄（ｆｆ）（７水塩）０．０１ｇ／硝酸ナトリウム３ｇ
／イーストエキストラクト４ｇ／ペプトンｌｏｇを水１
１に溶解したもの。
ＣＭ固形培地：１．５％の寒天を含有するＣＭ培地。
ＧＡ培地ニブドウＩ！４０　ｇ／アスパラギン４ｇ１／
塩化カルシウム０．１ｇ／塩化ナトリウム００１ｇ／微
量金属溶液〔硫酸マグネシウム（７水塩）４ｇ／硫酸鉄
（ＩＩ）（７水塩）０．４ｇ／硫酸マンガン（４水塩）
０．１６ｇ／硫酸亜鉛（７水塩）０．４ｇ／無水硫酸銅
０．０４ｇを水１１に溶解したもの）２５ａｄ１０．１
Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，０）３０ｄを水１１に含
有する培地、６ＸＳＳＣ：０．９Ｍ塩化ナトリウム／９
０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ＸＳＳＰＥ：塩化ナト
リウム２１０　ｇ／ゾリン二水素ナトリウム（２水塩）
３１．２ｇ１０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡはエチレ
ンジアミン四酢酸）４０Ｉ１１を水ｌｌに溶解したもの
、５０×デンハルッ：フイコール５ｇ／ポリビニルピロ
リドン５ｇ／牛血清アルブミン５ｇを水５００ａｌｔに
溶解したもの。２０ＸＳＥＴ：３Ｍ塩化ナトリウム１０
．４Ｍトリス（ｐＨ７，８）／２０ｍＭ　　ＥＤＴＡｏ
なお、本実施例中マニアナイスの実験書として記載され
ている文献は、下記の底置を示す。
Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　
Ｍａｎｕａｌ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２） 実施例１　本発明遺伝子の製造 ■アクレモニウム・クリソゲナムの培養ＣＭ固形培地上
で３０℃、５日間生育させたアクレモニウム・クリソゲ
ナムｌ５−５の菌糸体を、０Ｍ培地５０ａｄ！に接種し
、３０℃で３日間培養した。
該菌液を５００ｄのＧＡ培地に接種して、３０”Ｃでさ
らに２０時間培養した。
■ｍ−ＲＮＡの抽出 上記■で得られた菌液を吸引濾過して集めた菌糸体（湿
重量〜１０ｇ）を、液体窒素中で凍結させ、乳鉢と乳棒
を用いてすりつぶした。得られた粉末を、１００ｍＭ酢
酸ナトリウム、２．５ｍＭＥＤＴＡ、４５％ＳＤＳ　（
ＳＤＳはト′テシル硫酸ナトリウム）からなる溶液３ｏ
−に懸濁した後、等量のフェノール・クロロホルム・イ
ソアミルアルコール（５０：　５０　：　１）溶液によ
る抽出を行い、１００００ｒ、ｐ、ｖａ−２０分間の遠
心後に水層を回収した。該液をさらニ３００００ｒ、ｐ
、ｍ、テ４０分間遠心して不溶物を除去した。かくして
得た上澄２５Ｉ１１１に１０ｇの塩化セシウムを加え溶
解した後、超遠心分離管中にあらかじめ分注した５、７
Ｍ塩化セシウム、０．ＩＭ　　ＥＤＴＡからなる溶液７
−上に重層し、ベンクマンＳＷ２８型ローターを用いて
、２００００ｒ、ｐ、ｍ、２５°Ｃ１７時間の遠心を行
い、全ＲＮＡを沈澱として回収した。ＲＮＡの沈澱を９
５％エタノールで洗浄乾燥後、ｌｉｄの水に溶解し、ク
ロロホルム・ブタノール（４：ｌ）で除タンパクした後
、エタノール沈澱により回収した。得られたＲＮＡを１
ｍＭ　　ＥＤＴＡ。
０．１％ＳＤＳ、０．５Ｍ塩化リチウムを含む１０ｍＭ
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し、６８℃で３
分間インキュベートした後、急冷し、オリゴα丁セルロ
ースのカラムにかけた。吸着したポリＡを有するｍ−Ｒ
ＮＡを１ｍＭ　　ＥＤＴＡ。
０．１％ＳＤＳを含む１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液で溶出
し、エタノール沈澱により回収した。以上の操作により
、８０μｇのｍ−ＲＮＡが得られた。
■ｃＤＮＡライブラリーの作製 ｃＤＮＡ合ｄシステム（アマジャム社）を用い、そのプ
ロトコールにしたがって、上記■で得たｍＲＮＡ　（４
μｇ）から１本１ｉ［ＤＮＡ、次いで、２末鎖ｃＤＮＡ
を合成した。得られた２本ｕ４ｃ　ＤＮＡの内部に存在
するＥｃｏＲＩ部位のメチル化、ＥｃｏＲＩリンカ−の
ＤＮＡ末端への付加、ＥｃｏＲＩによる切断、ゲル濾過
による遊離リンカ−の除去等の操作を、ｃＤＮＡ−クロ
ーニングシステム−λＧＴＩＯ（アマジャム社販）を用
い、そのプロトコールにしたがって行い、末端にＥｃｏ
Ｒ１部位を有する２末鎖ｃＤＮＡ約２００ｎｇを得た。
次いで、該ＤＤＮＡ１００ｎと、ＥｃｏＲＩで消化後、
アルカリフォスファターゼで５°　リン酸基を除去した
λ−ｇｔ１０ＤＮＡ（ストラテジーン社［５ＴＲＡＴＡ
ＧＥＸＥ］）１μｇとをＴ４リガーゼを用いて連結せし
め、ギガパック・ゴールド（ストラテジーン社販のパッ
ケージングエキストラフト）を用いて、ラムダファージ
粒子内へ封入した。このようにして得た組換えファージ
懸濁液を適当に希釈し、Ｅ、ＣｏＣｏ１１Ｎ　１４に感
染させ、出現するプラーク数を計測した。その結果、こ
の懸濁液は、約２Ｘ１０’個の組換ファージを含有する
ことが判明した。このファージ液をアクレモニウム・ク
リソゲナムのｃＤＮＡライブラリーと称し、４℃に保存
した。
■ＤＮＡプローブの作製 本発明者らは、先に、アクレモニウム・クリソゲナムよ
りセファロスポリンＣ合成酵素を精製し、該酵素が分子
量の異なる２種のサブユニット（以下、分子量の大きい
ものをサブユニット１、小さいものをサブユニット２と
称する）から成ることを解明し、両サブユニットのＮ末
端アミノ酸配列を、下式ｌ（サブユニット１の配列）お
よび下式２（サブユニット２の配列）に示すとおり決定
した。
式１　：　Ｌｅｕ−Ｘ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓ　−１１
ｅ−Ａｌａ−＾ｒｇ−１１ｅ−ＳｅｒＬｅｕ−Ｐｈｅ−
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−１
１ｅＬｅｕ−Ａｒｇ 式２　：　Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−
Ｈｉｓ−Ａｒｇ−紅辷■と上式１中下線を施したアミノ
酸配列から推定される遺伝子上の可能なりＮＡ塩基配列
をすべて含むオリゴヌクレオチド混合物を合成し、ＬＮ
Ｉと称した。ＬＮＩはｍ−ＲＮＡと相補的なりＮＡ鎖に
対応する、１４ｍｅｒ、４８種のオリゴヌクレオチド混
合物で、次の配列を有する ５’　ＧＣ（ＧＡＴ）ＡＴ　（ＧＡ）ＴＣ（ＴＣ）ＴＧ
　（ＧＡＴＣ）ＧＣ３” 括弧内の塩基は、塩基の混合物を用いた場所を示す。
次いで、上式２中下線を施したアミノ酸配列から推定さ
れる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、Ｓ
ＮＩと称した。ＳＮＩはアクレモニウム・クリソゲナム
のコドン使用頻度を考慮することにより推定、設計され
た５９＋ｎｅｔの特異的オリゴヌクレオチドで、次の配
列を有している。
５’　　ＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＴＣＧＡＧＣ；Ｃ
ＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＣＴＣＣＧＣＴＡＣＣＡＧ
ＧＣＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＧＣ３゜なお、上記ＬＮｉ　
ＳＮＩの合成は、いずれもアプライド・バイオシステム
（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）社のＤＮＡシ
ンセサイザー・モデル３８０−Ａを用いて行った。上記
のごとく得られたＬＮＩ、ＳＮＩを各々マニアナイスの
実装置に記載された方法にしたがって、Ｔ４ペリヌクレ
オチドキナーゼとγ−”Ｐ−ＡＴＰを用いてラベルし、
以下に述べるハイブリダイゼーション実験に使用した。
以下、上記のごとくラベルされたプローブをｉｚｐ−Ｌ
ＮＩ、”Ｐ−３ＮＩと称する。
■ハイブリダイゼーションによるスクリーニング ■で得られたファージ液の一部をＥ、Ｃｏ１１　ＮＭ５
１４に感染させ、４枚のプレート上に計１．６×１０４
個のプラークを形成させた。これらのプラークを、ベン
トンらの方法（Ｂｅｎｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅ
ｎｃｅ　（１９７７）　１９６．１８０−１８２）にし
たがってニトロセルロースフィルターに転写し、アルカ
リ変性、中和処理を行い、ＤＮＡを固定した。
上記■で得たプローブ！”Ｐ−３ＮＩとハイブリダイゼ
ーションさせた。ハイブリダイゼーションは、３０％ホ
ルムアミド、５×デンハルツ、５×５ＳＰＥ、０．１％
ＳＤＳ、　５Ｘ１０’　ｃｐｓ／ａｆｆｉの”Ｐ−３Ｎ
Ｉを含有する溶液を用いて、４２℃で１４時間行った。
続いて、フィルターを０．１％のＳＤＳを含む１ｘｓｓ
ｃ溶液中、室温で１５分ずつ２回洗浄し、さらに、０．
１％のＳＤＳを含む０．２ＸＳＳＣ溶液中、５０°Ｃで
２０分間洗浄した。
次いで、インテンシファイヤースクリーンを用いて、−
８０℃で２２時間オートラジオグラフィーを行った。そ
の結果、１０個の陽性スポットが見出された。このうち
４個の陽性スポットに相応する寒天領域より、ファージ
を抽出し、再度上記の工程にしたがってプラークハイブ
リダイゼーションを行い、４種の純化ファージクローン
を得た。
かくして得られたファージクローン４種より、グロスバ
ーガー記載の方法（Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒら、　Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９
８７）　５＋　６７３７）にしたがってλＤＮＡを抽出
し、それぞれλＣＣ３Ｉ、２゜３．４と称した。
次いで、これらλＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断して、アガ
ロースゲル電気泳動を行った後、上記プローブ、”Ｐ−
３Ｎ１および３２Ｐ−ＬＮＩを用イテサザンハイプリダ
イゼーション〔方法については文献：　５ｏｕｔｈｅｒ
ｎら、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９７５）　９８．５０３−５１７）
を行った。その結果、すべてのクローン（λＣＣ３１〜
４）中のｃＤＮＡインサート（ＥｃｏＲＩで切り出され
るｃＤＮＡ断片）は、プローブＳＮＩのみでなく、ＬＮ
Ｉとも強くハイブリダイズすることが判明した。この事
実は、該ｃＤＮＡがデアセチルセファロスポリンＣアセ
チルトランスフェラーゼを構成する２種のサブユニット
をコードしている、すなわち、同−ｍ−ＲＮＡ上にサブ
ユニット１およびサブユニット２をコードする情報が存
在していることを強く示唆した。
なお、”Ｐ−３ＮＩを用いてのハイブリダイゼーション
およびフィルターの洗浄は、上述のプラークハイブリダ
イゼーションと同様に行い、３２ｐ−ＬＮｌを用いる場
合は、６ｘＳＥＴ、５Ｘデンハルツ、０．１％ＳＤＳ、
１０’〜１０　’　ｃｐｓ’／１１１の”Ｐ−ＬＮＩを
含む溶液を用いて、３５°Ｃで６時間のハイブリダイゼ
ーションを行い、６ＸＳＳＣ溶液中、室温で３分間、さ
らに同溶液中、４０°Ｃで３分間フィルターを洗浄した
後、オートラジオグラフィーを行った。
■ｃＤＮＡ断片のサブクローニングおよび部分制限酵素
切断地図の作成 上記λＣＣ３１をＥｃｏＲＩで切断後、アガロースゲル
電気泳動を行って、ＳＮＩおよびＬＮＩとハイブリダイ
ズした１、２５ｋｂのｃＤＮＡ断片を調製し、ｐｕｃ１
９のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。かくして
得られたプラスミドの１つをＰＣＣ３Ｉと称し、種々の
制限酵素で切断した後、アガロースゲル電気泳動による
解析を行った。その結果、第１図で示される１、２５ｋ
ｂのｃＤＮＡインサートの部分制限酵素切断地図が得ら
れた。
以上の実験において、アガロースゲルからのＤＮＡ断片
の調製は、シーンクリーン（ＧＥＮＥ　−ＣＬＥＡＮ　
ＴＨ，フナコシ社販）を用いて、その添付プロトコール
にしたがって行った。また、ＤＮＡ断片のプロスミドへ
のサブクローニング、プラスミドとＤＮＡ断片の連結、
大腸菌のトランスフォーメーション等、ならびにサブク
ローニングの結果得られたプラスくドの調製、解析等の
基本操作は、すべてマニアナイスの実装置に記載された
方法に準じて行った。
■ｃＤＮＡの塩基配列決定 前記１．２５ｋｂのｃＤＮＡ断片の全ＤＮＡ塩基配列を
、サンガー等の方法に基づき決定した。塩基配列の具体
的実験手技は、タカラのシーフェンシングキット（宝酒
造販）を用いて、その添付プロトコールにしたがって行
った。また、配列決定のストラテジーは、第１図の部分
制限酵素地図の下に示した。このようにして決定された
ＤＮＡ塩基配列を第２図（ａ）、　（ｂ）に示す。
本ＤＮＡ配列には、３４番目に始まる開始コドン（ＡＴ
Ｇ）から１１９１番で終わる終始コドン（ＴＧＡ）まで
、３８５個のア短ノ酸をコードしうるオープンリーディ
ングフレームが存在した。
該オーブンリーディングフレームから翻訳したアミノ酸
配列を、第２図の塩基配列の下に示した。
該アミノ酸配列中、１３番目のＬｅｕから３２番目のＬ
ｅｕまでのアミノ酸配列は、生化学的手法により決定し
たデアセチルセファロスポリンＣアセチルトランスフェ
ラーゼを構成するサブユニット１のアミノ基末端アミノ
酸配列と、その２番目の未同定アミノ酸を除き完全に一
致した。さらに、該アミノ酸配列中、２６０番目のＡｓ
ｐから２８６番目のＡｌａまでのアミノ酸配列は、サブ
ユニット２のアミノ基末端アごノ酸配列と完全に一致し
た。
また１３番目のＬｅｕから２５９番目のＴｈｒまでの配
列からなるタンパク質、および２６０番目のＡｓｐから
３８５番目のＮｅｔまでの配列からなるタンパク質の分
子量は、その構成ア５ノ酸の分子量から計算すると２７
６００および１３８９４となり、ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により測定されたサブユニット１およ
びサブユニット２の分子量とよく一致した。
以上の事実から、本発明により得られたｃＤＮＡは、デ
アセチルセファロスポリンＣアセチルトランスフェラー
ゼ前駆体をコードしていることが明らかとなった。
（発明の効果） 本発明ｃＤＮＡをアクレモニウム・クリソゲナム用の発
現ベクターに連結し、アクレモニウム・クリソゲナムに
導入することにより、デアセチルセファロスポリンＣア
セチルトランスフェラーゼの細胞内レベルを上昇させ、
セファロスポリンＣ生産能の向上を計ることが可能とな
る。また、本発明ｃＤＮＡをＤＮＡプローブとして用い
ることにより、デアセチルセファロスポリンＣアセチル
トランスフェラーゼ遺伝子の発現調節等を分子レベルで
解析することが可能となる。さらに、本発明ｃＤＮＡは
、デアセチルセファロスポリンＣアセチルトランスフェ
ラーゼおよびその前駆体の大量生産をもたらすことがで
きる。
列を示す。生化学的手法により決定されている該酵素の
サブユニット１およびサブユニット２のＮ末端アミノ酸
配列の領域を、図中、下線の、下線■でそれぞれ示しで
ある。
（ばか１名）
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明によりクローン化されたデアセチルセ
ファロスポリンＣアセチルトランスフェラーゼ前駆体を
含むｃＤＮＡ領域ならびに該領域の塩基配列決定のため
に用いた制限酵素と、塩基配列決定のストラテジーを示
す。第２図（ａ）、　（ｂ）は、本発明による特定のｃ
ＤＮＡの塩基配列およびデアセチルセファロスポリンＣ
アセチルトランスフェラーゼ前駆体の塩基配列に相当す
るアミノ酸配トーー： １００ｂｐ

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）アクレモニウム・クリソゲナム由来のデアセチル
    セファロスポリンＣアセチルトランスフェラーゼ前駆体
    をコードするｃＤＮＡ化合物。
  2. （２）下式で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質
    をコードしている請求項１に記載のｃＤＮＡ化合物。 【遺伝子配列があります。】
  3. （３）下式の塩基配列で示される請求項１および２記載
    のｃＤＮＡ化合物。 【遺伝子配列があります。】
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