JP2000512513A

JP2000512513A - フェニルアセテート異化酵素をコードする遺伝子の不活性化方法、該遺伝子を含むプラスミドおよびそれらにより形質転換された株

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Publication number: JP2000512513A
Application number: JP10545060A
Authority: JP
Inventors: カニョン，ホセマヌエルフェルナンデス; サイス，マルタロドリゲス; ガルシア，ブルーノディース; フェンテ，ホセルイスバッレード; アルバ，アレヤンドロビタレル; マルドナド，フランシスコサルト; ソト，ミゲルアンゲルペニャルバ; アセンシャオ，ホセマヌエルミンゴット
Original assignee: アンティビオティコス，ソシエダアノニマ
Priority date: 1997-04-18
Filing date: 1998-04-17
Publication date: 2000-09-26
Also published as: CA2258562A1; LT98186A; WO1998048019A1; LV12295B; CN1226932A; EE9800433A; ZA983216B; IL127367A0; SK170598A3; CZ417298A3; HUP0000853A2; ES2125195B1; AU6833398A; EP0922766A1; KR20000016739A; ES2125195A1; LV12295A; PL330464A1

Abstract

(57)【要約】フェニルアセテート異化酵素をコードする遺伝子の不活性化方法、前記遺伝子を含有するプラスミド、それらにより形質転換された株が提供される。前記方法は好ましくは、フェニルアセテート基質を目当てにペニシリン生合成酵素と競争する酵素をそれぞれコードする遺伝子である、Ａ．ニデュランスのphacA遺伝子とＰ．クリソゲナムのpahA遺伝子に適用される。これらの酵素の非発現は、前記抗生物質の収率が増加し、培養物の単位あたりのフェニルアセテート要求量が低くなるという、前記抗生物質の合成において有益な効果を有する。

Description

【発明の詳細な説明】フェニルアセテート異化酵素をコードする遺伝子の不活性化方法、該遺伝子を含むプラスミドおよびそれらにより形質転換された株発明の分野本発明は、糸状菌アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillusnidulans）およびペニシリウム・クリソゲナム（Penicilliumchrysogenum）から得られるフェニル酢酸２−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする新規ＤＮＡ化合物および組換えＤＮＡ分子の特徴づけに基づく。上記ＤＮＡ化合物によるペニシリン産生株の形質転換により、この抗生物質の生産を増加させることができる。従来技術ある種の糸状菌におけるベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）生合成の最終段階は、イソペニシリンＮからペニシリンＧへの変換から成る。これはイソペニシリンＮ中のＬ−アミノアジピン酸エステルの側鎖がフェニル酢酸の側鎖により置き換えられるというアシル転移反応を伴う。この反応を触媒する酵素（アシル− CoＡ：イソペニシリンＮアシルトランスフェラーゼ）は、補酵素Ａ（CoＡ）のチオエステルの形でそれの基質の１つとして活性フェニル酢酸を利用する。ペニシリンの工業生産に使われる真菌であるペニシリウム・クリソゲナム（Pe nicillium chrysogenum）と、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus ni dulans）はフェニルアセテートを合成することができない。従って、ペニシリンＧの生合成を促進するために、工業用Ｐ．クリソゲナム培養物に過剰のフェニルアセテートを添加しなければならない。このような過剰使用は、脂肪族鎖を有する望ましくない別のペニシリン類の生合成を防ぐ一方で、醗酵工程の最終原価を増大させる。ペニシリン産生培養物に添加されるフェニルアセテートの一部は代謝され得る。相当量の２−ヒドロキシフェニルアセテートがＰ．クリソゲナム醗酵物中に蓄積されることは十分に確立された事実である。この側鎖前駆体部分は明らかにペニシリンＧの生合成に寄与しない。アスペルギルス・ニデュランスもＰ．クリソゲナムも、同じ酵素過程を経て３つの前駆体アミノ酸からペニシリンを合成する。更に、Ｐ．クリソゲナムと同様にＡ．ニデュランスも、過剰量で出発化合物を培養物に添加した場合にフェニルアセテート画分を２−ヒドロキシフェニルアセテートに変換する。Ａ．ニデュランスもフェニルアセテートを２−ヒドロキシフェニルアセテートに変換するかたわら、この最終化合物を異化することができ、実際、フェニルアセテートを唯一の炭素源として利用することが可能である。Ａ．ニデュランスにおける異化過程は次のように要約される：フェニルアセテートのｏ−ヒドロキシル化がこの経路の第一段階である。第二のヒドロキシル化反応が２−ヒドロキシフェニルアセテートを２，５−ジヒドロキシフェニルアセテート（＝ホモゲンチジエート）に変換する。ホモゲンチジエートがフマリルアセトアセテートを経てフマレートとアセトアセテートに異化され、それらの生成物がクレブス回路に組み込まれる（Fernandez Canon y Penalv a,Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:9132-9136，1995参照）。フェニルアセテートを部分的にまたは完全に異化する前記糸状菌の能力は、ペニシリン産生にとって有害な性質である。この理由のため、この性質の完全なまたは部分的な排除が、ペニシリンＧ産生能力が改善された株をもたらすだろう。ペニシリン産生菌における伝統的変異誘発によるこの有害性質（すなわちフェニルアセテートを部分的または完全に異化する能力）の除去は、多数の株を使用した並外れた選別努力を要求する。いずれにせよ、前記変異誘発は、しばしば親株の有用な性質を排除しかねない二次変異を引き起こし、例えば独立栄養性変異または工業醗酵にとって重要である成長もしくは胞子形成の活力を低下させる変異を生じる。従って、フェニルアセテートを部分的にまたは完全に異化する能力を取り除くために、前記制限のない遺伝子操作技術を使用することが好ましい。特異的遺伝子操作を実施するための不可欠な要件は、ペニシリン産生菌の前記有害性質を媒介する遺伝子のクローニングと特徴付けである。発明の詳細な説明本発明の目的は、技術の現状に現存する上述した課題を解決することである。すなわちそれは、アスペルギルスおよびペニシリウムにおいてフェニルアセテートの第一酵素段階を触媒する酵素であるフェニル酢酸２−ヒドロキシラーゼ活性をコードする真菌遺伝子を特徴づけること、更には組換えＤＮＡ技術によってペニシリン産生菌のゲノム中に存在する前記遺伝子を排除するためにそれを使用することにある。本発明は、遺伝子操作により作製された菌株中でこの遺伝子を不活性化する方法を記載する。この株はフェニルアセテートを異化することができず、親株よりも高いレベルのペニシリンを産生する。加えて、この組換え株の最大ペニシリン産生には、親株により必要とされるよりも少量の過剰フェニルアセテートが必要である。上記ＤＮＡ化合物を使ったフェニルアセテート異化作用の不活性化は、ペニシリン産生の相当な改善をもたらす。本発明において使用する新規遺伝子を含む、Ａ．ニデュランス由来の1986塩基対（bp）のゲノムＤＮＡ断片の配列が配列番号１に示される。この遺伝子はphac A（phacはphenylacetateから）と命名され、フェニルアセテートをオルトヒドロキシル化する酵素をコードする（このオルトヒドロキシル化反応はＡ．ニデュランス中のフェニルアセテート異化過程の第一段階である）。完全なコード領域を包含する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンのヌクレオチド配列決定およびその後のそれらとゲノムＤＮＡ配列との整列は、この遺伝子の次のような特徴を明らかにした：・該遺伝子は518アミノ酸のポリペプチドをコードする。開始メチオニンは第8 2位のＡＴＧトリプレットコドンによりコードされ、そして終止コドン（ＴＡＧ）は第1810位に位置する。これらの位置は配列番号１に示されるヌクレオチド配列に該当する。・コード領域は長さ65，56およひ53ヌクレオチドの３つのイントロンにより中断される（配列番号１）。・ 518残基の推定ポリペプチドは配列番号１の対応するエキソンの下に３文字アミノ酸記号で示され、更に独立した形で配列番号２にも示される。推定タンパク質の分子量は58,495ｇ／モルである。ＮＣＢＩ（National Center for Biotec hnology Information；米国）の公開アクセスサーバーBLASTを使って、タンパク質配列のデータベース（例えばSwissProtおよびPIR）に関して、およびＤＮＡ配列のデータベース（例えばGenBankおよびEMBLデータベース）の概念的翻訳に関して、６通りの可能な読み枠において実施した検索は、アミノ酸配列がチトクロームP450群（ヘモチオール化タンパク質）のメンバーに類似していることを示した。それらのタンパク質は一般に酸化過程に関係する。実際、残基431〜439の配列は、ヘモチオール化タンパク質に特徴的である、ヘム基の結合に関与するアミノ酸システインを含むペプチドGly-X-Gly-X-X-X-Cys-X-Gly（Ｘは任意アミノ酸である）に該当する。この新規ＤＮＡ化合物（その構造は配列番号１に具体的に記載されており、これは天然の微生物から単離されたものである）は、自動ＤＮＡ合成装置を使って完全に合成することかできる。加えて、遺伝暗号の縮重性質のために、この新規ＤＮＡ化合物によりコードされるタンパク質は異なるＤＮＡ配列によってコードされてもよい。それらも本発明に含まれる。他方で、上述した新規ＤＮＡ化合物から誘導されるいずれの天然の遺伝的変異体も、それと等価であると見なされる。このような遺伝的変異体としては、進化の観点からＡ．ニデュランスとごく近縁である生物、例えばＰ．クリソゲナムの相同遺伝子が挙げられる。これらの相同遺伝子は、後述するように、Ａ．ニデュランスからのＤＮＡ化合物をハイブリダイゼーションプローブとして使って容易に同定することができる。Ａ．ニデュランスのphacA遺伝子は、別の真菌種のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーにおいてハイブリダイゼーションにより機能的相同遺伝子を検索するための分子プローブとして使用することができる。よって、例えば、本明細書は、Ｐ．クリソゲナムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための該遺伝子の使用を記載し、Ｐ．クリソゲナムの工業用株から単離できることを証明する。phacA遺伝子プローブとのハイブリダイゼーションによってＰ．クリソゲナムから単離された2558bpのゲノムＤＮＡ断片の配列は配列番号３に示される。Ａ．ニデュランスのphacAに相同であるＰ．クリソゲナム遺伝子をpahA（フェニルアセテートヒドロキシル化：phenylacetate hydroxylationから）と命名した。Ｐ．クリソゲナムのpahA遺伝子は、Ａ．ニデュランスのphacA遺伝子のタンパク質産物であるPha cAのアミノ酸配列と84％一致を示す、516アミノ酸のポリペプチドをコードする。Ｐ．クリソゲナムのpahA遺伝子の生産物の配列は配列番号４に示される。先に指摘したように、同様な手順によって別の種の真菌から単離することができる別の相同遺伝子と同様、Ｐ．クリソゲナムから単離されたこの新規ＤＮＡ化合物も本発明に含まれる。クローン化遺伝子を使って、逆向き遺伝学により機能不全（loss-of-function ）変異を作製することができる。このために、該真菌遺伝子の端が切り取られた変異体を担持しているエシェリキア・コリ（Escherichia coli）ベクターにおいて新規組換えＤＮＡ分子を作製することができ、その組換えＤＮＡ分子を使って形質転換により内因性遺伝子を不活性化することができる。例えば、この組換えプラスミドは、Ａ．ニデュランスのphacA遺伝子の５’領域に続いて、Ａ．ニデュランスのargB⁺遺伝子を含む3.2kb XbaI断片による289 bp NaeＩ−KpnＩ断片の置換を含んで成るphacA遺伝子のコード領域の変形を含有することができる（図１参照）。次いで、phacA遺伝子の３’領域が利用可能である。この変異型phacA 遺伝子の発現は、残基297のところで切り取られており、従って221個のカルボキシ末端残基を欠いているPhacAタンパク質をもたらす。変異型タンパク質に欠けている前記221個の残基には、ヘム基の結合に関与しており且つこの種のタンパク質の活性に不可欠であるCys残基を含む上述のペプチドが含まれる。上述した領域を含む直鎖状ＤＮＡ断片は、標準技術により適当な制限酵素を使ってベクターの配列から分離し、次いで精製することができる。この直鎖状断片はＡ．ニデュランスのargB⁺株からアルギニン原栄養体への形質転換に用いることができる。この形質転換に使用するＤＮＡは自己複製に必要な配列を欠いているので、原栄養性形質転換体はゲノム中への該ＤＮＡ断片の組み込みの結果として生じる。argB⁺表現型をもたらすであろう可能な組み込み方法の１つは、図１に示されるような、直鎖状ＤＮＡ分子と真菌のゲノム中のphacA遺伝子座との間の二重異種交差（double intercrossing）によるものである。この二重異種交差現象は、試験管内で作製した端が切り取られた遺伝子による元のphacA遺伝子の置換を引き起こし、それがphacA機能の損失を引き起こす。この置換を有する（すなわち機能不全変異を有する）形質転換体は、それらのゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化しそしてプローブとして³²Ｐで放射能標識されたphacAまたはarg B遺伝子を使ってサザン法によるハイブリダイゼーションにより分析した時のそれらのハイブリダイゼーションパターンにより、同定することができる。こうして、別のタイプの形質転換体のハイブリダイゼーションパターンと遺伝子置換に相当するものとを容易に区別することができる。phacA遺伝子により提供される機能を欠いている形質換体は、更にアッセイするために標準技術を使って精製することができる。野性型株とは異なり、phacA遺伝子の機能を欠いているＡ．ニデュランス形質転換体は、唯一の炭素源としてのフェニルアセテート中では増殖することができない。しかしながら、それらは２−ヒドロキシフェニルアセテートまたは２，５ −ジヒドロキシフェニルアセテート中では増殖する。このことは、新規ＤＮＡ化合物（Ａ．ニデュランスの phacA遺伝子）が、Ａ．ニデュランスのフェニルアセテートの利用に不可欠な段階であるフェニルアセテートのオルトヒドロキシル化に必要な酵素活性をコードすることを示す。Ｐ．クリソゲナムは唯一の炭素源としてフェニルアセテートを利用しないが、先に示したように、PhacA酵素の相同体をコードする遺伝子を含有する。従って、新規ＤＮＡ化合物は、ペニシリン生合成に利用可能なフェニルアセテートの蓄積を減少させ得る側方代謝転換を除去する方法を提供する。Ｐ．クリソゲナムにおいて、記載のものと同様な方法論を用いて、本発明に係る新規Ｐ．クリソゲナムＤＮＡ化合物と、Ｐ．クリソゲナムに既に利用可能である形質転換マーカーのいずれか（例えばtrpC遺伝子）とを使って、pahA遺伝子を不活性化することができる。新規ＤＮＡ化合物のコード領域を中断させるために argB（Ａ．ニデュランス）またはtrpC（Ｐ．クリソゲナム）以外の形質転換マーカーを利用できることも理解されるであろう。そのようなマーカーとしては、他の独立栄養性マーカー（例えばpyrGまたはriboB）および抗生物質耐性遺伝子（例えば真菌にフレオマイシンまたはヒグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子）が挙げられる。本明細書中で使用するのと基本的に同じであるそういった方法も、本発明に含まれる。図２は、Ｐ．クリソゲナムのpahA遺伝子を変更するために用いることができる方法の１つを示す。この場合、不活性化構成物中では、Ｐ．クリソゲナムのgdh遺伝子（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素活性をコードする遺伝子）のプロモーターが抗生物質フレオマイシンに対する耐性を付与する細菌由来ble^R遺伝子の発現を調節するというキメラ遺伝子により、pahA遺伝子の内部領域が置換されている。不活性化構成物を含むプラスミドはpALP696と呼称される。従って、形質転換体は、フレオマイシンを含有する培地中で増殖する能力に基づいて選択することができる（Kolar，M.，Punt，P.J.，van del Hondel，C.A .M.J.J.およびSchwab，H.，Gene 62:127-134，1988）。加えて、別の方策を使って、クローニングされ特徴付けられた遺伝子中に逆向き遺伝学により機能不全変異を作製することができる。例えば、構造遺伝子の内部断片を担持している環状プラスミドを用いた形質転換は、形質転換体ＤＮＡの単一コピーの相同組み込み後に、該プラスミド中に含まれる遺伝子を適当に選択すれば、機能性を欠いている該遺伝子の２つの不完全コピーを生成する。逆向き遺伝学により所望の遺伝子中に機能不全変異を作製するためにこの方策または別の方策を使用する方法も、本発明に包含される。フェニルアセテートの修飾または異化に関与する酵素が除去（不活性化）されている真菌株は、改善されたペニシリン生産性を示す。それにもかかわらず、ペニシリン産生培地中で増殖するそれらの能力は、親株のものと区別できない。例えば、上述したphacA遺伝子置換を有する（すなわち、フェニル酢酸２−ヒドロキシラーゼ活性を欠いている）Ａ．ニデュランス形質転換体は、親株の３〜８倍のペニシリンを産生し、且つ添加されるフェニルアセテートの量にあまり依存しない（図３参照）。このように、0.125％(w/v)から0.0625％(w/v)へのフェニルアセテートの添加量の減少が野性型ではペニシリン収率の大幅な低下を引き起こすのに対して、phacA遺伝子の機能を欠いている形質転換体はどちらのフェニルアセテート濃度でも高レベルのペニシリンを産生する。最後に、本発明はphacA遺伝子およびそれの相同体だけに関するのではない。フェニル酢酸２−ヒドロキシラーゼ酵素はフェニル酢酸異化過程の第一段階を触媒しそしてＰ．クリソゲナム産生株は大量の２−ヒドロキシフェニルアセテートを分泌するから、本発明者らは該酵素をコードする遺伝子を使用しているのである。それらが一端特徴付けられれば、本明細書中に記載したのと同様な方法を使って、フェニルアセテート代謝に関係する別の遺伝子を不活性化することができる。この発明、すなわち逆向き遺伝学を使って個々のフェニルアセテート代謝遺伝子を不活性化することにより真菌生物からのペニシリン収率を改善することができるという発明は、それらの別の可能性も包含する。実施例実施例１．Ａ．ニデュランスのphacA遺伝子のクローニングと特徴付け下記の段階を踏みながら、ｃＤＮＡライブラリーからの分別選択によりphacA 遺伝子に相当するｃＤＮＡクローンを単離した。ａ）真菌をフェニルアセテートの存在下で増殖させた時に優先的に発現される遺伝子の転写物に相当するｃＤＮＡ集団を得る段階（ＤＮＡライブラリーをスクリーニングする際に「プラス」プローブとして使用する）。 Fungal Genetics Stock Center collection（Department of Microbiology，M edical Center of the University of Kansas）から入手したＡ．ニデュランスA 26株を、KPO₄H₂ 13.6；(NH₄)₂SO₄2.0；MgSO₄・7H₂O 0.25およびFeSO₄・7H₂O 0 .0005（以上ｇ／ｌで）を含有し炭素源として0.3％(w/v)グルコースを含む適当に補足された最少培地中で、37℃にて培養した。培地中のグルコース濃度を分析することにより（酵素キットを使って）、グルコースが使い果たされる時点を決定した。これは通常、一定の攪拌下で18時間インキュベーション後であった。２時間後、培養物にフェニルアセテートを10mMの最終濃度に添加し、そして記載の遺伝子の発現を誘導するという目的で、１時間長く37℃で培養物を攪拌した。この時間量の後、菌糸を濾過により集め、水洗し、液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥し、そして全ＲＮＡを単離するのに使った。この全ＲＮＡ調製物を使ってオリゴ−ｄＴセルロースアフィニティークロマトグラフィーによりポリ（Ａ⁺）ｍＲＮＡを単離した。フェニルアセテートにより誘導された菌糸から単離した前記ｍＲＮＡ２μｇを鋳型として使い、そしてオリゴｄＴ（15マー）をプライマーとして使って、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（市販の）の存在下で、一本鎖ｃＤＮＡを調製した。反応物を 10mM Tris-HCl，pH8.8（25℃で），50mM KCl，0.1% Triton X-100，５mM MgCl₂ ，10mM各dNTPおよび0.5単位のRNasinを含有する緩衝液中で42℃にて１時間インキュベートした。第一鎖合成後、３M NaOH中で60℃にて１時間インキュベートすることにより鋳型ＲＮＡを除去した。中和（酢酸で）後、2.5容の無水エタノールを使って−80℃で２時間沈澱させ、遠心分離することにより一本鎖ＤＮＡを回収した。次いでSargent，T.D.，Methods Enzymol．152:423-432，1987により記載された手順を使って、グルコースが使い果たされた点で回収した菌糸から単離した30倍過剰のポリ（Ａ⁺）ＲＮＡを用いて、このｃＤＮＡを捕捉した。生成したｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子を68℃でのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより分離し、そして捨てた。残ったｃＤＮＡを、フェニルアセテートの不在下で培養した菌糸から回収した過剰のポリ（Ａ⁺）ＲＮＡを用いて同様にハイブリダイズせしめた。このｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子も再び記載した通りに捨て、そして最終的に得られる一本鎖ｃＤＮＡ集団（これはフェニルアセテートの存在下で優先的に発現される遺伝子の転写物を表す）を収集した。このｃＤＮＡを、〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰと過剰の残りの全ｄＮＴＰを使って、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片およびプライマーとしてのランダム配列ヘキサヌクレオチドの存在下で均一に標識した。得られた³²Ｐ標識ｃＤＮＡの集団（比活性＞10⁸cpm／mg）を、項目ｃ）に記載の通りに作製されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用した。ｂ）フェニルアセテートの不在下で転写される遺伝子に相当するｃＤＮＡプローブ（「マイナス」プローブ）を得る段階。項目ａ）に記載した通りに、ただし培地中のグルコースが使い果たされるまで培養し次いでフェニルアセテートの不在下で37℃で１時間長くインキュベートした菌糸から回収したｍＲＮＡを使って、一本鎖ｃＤＮＡを合成しそして³²Ｐで標識した。ｃ）唯一の炭素源として10mMフェニルアセテートの存在下で培養した菌糸から得られたｃＤＮＡを使った、λgt10ベクター中のｃＤＮＡライブラリーの作製段階。このｃＤＮＡライブラリーを作製するために、先に記載した通り第一鎖ｃＤＮＡ合成反応を実施した。得られたｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを、ＲＮアーゼＨを使ってＲＮＡ鎖中にランダム切断点を導入し、それを大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩによる開始点として使用することにより、二本鎖ｃＤＮＡに変換した。この平滑末端化ｃＤＮＡ調製物にEcoRI末端を付加するために、リン酸化した平滑末端とEcoRI突出末端を有する合成アダプターを前記二本鎖ｃＤＮＡと共にＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下でインキュベートした。次いでEcoRI末端のｃＤＮＡを精製し、そしてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとＡＴＰを使ってリン酸化した。リン酸化ｃＤＮＡをEcoRIで予め消化し脱リン酸しておいたλgt10ベクターのアームと混合し、この混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。市販のパッケージング用抽出物を使って組換えＤＮＡ分子を試験管内パッケージングした。ｃＤＮＡ挿入断片がｃＩ遺伝子（中にEcoRI部位が存在する）を不活性化している組換えファージを、大腸菌hfl株（F-，thi-1，thr-1，leuB6，lacY1 ，tonA21，supE44，hf1A150，[chr::Tn10]）中でそれらの溶菌表現型について選択した。こうして、合計10⁷個の組換えクローンが得られた。ｄ）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング段階。大腸菌C600hfl⁺株を使ってｃＤＮＡライブラリーをプラークにし、得られた溶菌プラークを二重反復試験においてニトロセルロースフィルターに移行せしめた。複製物の一方を「プラス」ｃＤＮＡプローブ〔ａ）に記載〕とハイブリダイズさせ、そしてもう一方の複製物を「マイナス」ｃＤＮＡブローブ〔ｂ）に記載〕とハイブリダイズさせた。「プラス」プローブとハイブリダイズするが「マイナス」プローブとはハイブリダイズしないクローンを選択し、精製した。ｅ） phacA遺伝子に相当するｃＤＮＡの同定段階。エンドヌクレアーゼNot Ｉでの消化により、EcoRIアダプター中に含まれるNo t Ｉ開裂部位を使って、ベクターからｃＤＮＡ挿入断片を切り出した。選択されたクローンの挿入断片を、Not Ｉで消化したpBluescript SK(+)プラスミド中にサブクローニングし、次いで標準手順によりそれを配列決定した。ｃＤＮＡ挿入断片の配列を６つの可能な読み枠で翻訳し、そしてBLAST演算法を使って公開アクセスＤＮＡ配列データベースGenBankおよびEMBLの６つの読み枠での概念的翻訳とまたはタンパク質配列データベースSwissProtおよびPIRと比較した。ｃＤＮＡ挿入断片の配列のうちの１つは、終止コドンにより中断されない広範囲の転写解読枠を生じた。推定アミノ酸配列は、酸化反応に一般に関係するチトクロームP450群のタンパク質のアミノ酸配列との有意な一致を示した。下記に示すように（実施例３参照）、転写解読枠はフェニル酢酸２−ヒドロキシラーゼをコードする。このｃＤＮＡ挿入断片を使ってハイブリダイゼーションにより、この遺伝子に相当する新規ｃＤＮＡクローンを得た。これらのクローンを両鎖について配列決定した。得られたヌクレオチド配列は、518アミノ酸のポリペプチドをコードする（配列番号２）、長さ1554bpの完全な転写解読枠（翻訳終止コドンを含まない）を示した。この配列とチトクロームｃタンパク質ファミリ一のメンバーとの同一性は、この推定タンパク質がこのファミリーの新規メンバーを表すことを明白に立証する。ｆ） phacA遺伝子のクローニング段階。 λEMBL4中に作製したＡ．ニデュランスゲノムＤＮＡライブラリーを、ほぼ完全な転写物に相当する³²Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを使ってスクリーニングした。陽性クローンを精製し、それらの導入断片を制限酵素での消化と上記プローブとのハイブリダイゼーションにより特徴づけた。こうして、長さ2.4kbと1.9kbの２つの連続したBamHI断片のハイブリダイゼーション領域をマッピングした。図４は前記断片を含有するゲノム領域の制限地図を示す。前記BamHI断片をpBluescri pt SK(+)中にサブクローニングした。2.4kb BamHI断片を含む組換えプラスミドをpBS-FG4Aと命名し、一方1.9kb BamHI断片を含む組換えプラスミドをpBS-FG4B と命名した。実施例２．Ａ．ニデュランスのphacA遺伝子の機能的相同体である、Ｐ．クリソゲナムのpahA遺伝子のクローニングと特徴づけａ）Ｐ．クリソゲナムのpahA遺伝子のヌクレオチド配列のクローニングと配列決定 λEMBL4のBamHI部位の中にクローニングした部分的Sau3A断片を使って作製した、Ｐ．クリソゲナムWisconsin 54-1255のゲノムＤＮＡライブラリーを、phacA遺伝子のほぼ全長のｃＤＮＡから成る〔³²Ｐ〕放射性標識プローブを使ってスクリーニングした。約12,000個のクローンを標準技術によってセルロースフィルターに移行せしめた。次いでそれらを50％ホルムアミド、５×デンハーツ溶液、５×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、50μｇ/mlの音波処理済ニシン精子一本鎖ＤＮＡおよび50ngの標識プローブを含有する緩衝液中で37℃で 24時間ハイブリダイズせしめた。ハイブリダイズしたフィルターを0.2×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ中で37℃で最終洗浄した。この方法により10個のクローンが精製され、それらのＤＮＡを単離した。前記クローンの挿入断片を、制限酵素での消化と上記プローブとのハイブリダイゼーションにより特徴づけた。ハイブリダイゼーション領域は2.55kb XhoI断片中に位置し、その制限地図を図５に示す。このＤＮＡ断片をプラスミドpBluescript SK(+)中にサブクローニングし、pALP520 と称するプラスミドを得た。pahA遺伝子を含むXhoI断片（図５）のヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド法〔Sanger，F.，Nicklen，S．およびCoulson，A .R．（1977）Proc.Natl．Acad．Sci．U.S.A．74，5463-5467〕により決定した。ｂ）ペニシリン産生条件下での精製ＲＮＡからのＰ．クリソゲナムｃＤＮＡライブラリーの作製。pahA遺伝子に相当するｃＤＮＡの特徴づけ。ペニシリンＧ産生条件下で増殖させたＰ．クリソゲナムの工業用株の醗酵培養物から、100，124および148時間のインキュベーション後に菌糸を収集し、そしてその菌糸からポリ（Ａ）Quick mRNA精製キット(Stratagene)を使ってポリ（Ａ⁺ ）ｍＲＮＡを得た。得られたこのポリ（Ａ⁺）ｍＲＮＡを鋳型として使って、Za p-cDNA合成キット(Stratagene)を使って製造業者の指示に従ってｃＤＮＡライブラリーを作製した。二本鎖ｃＤＮＡを、転写物の５’領域がEcoRI 部位の側にくるように、ファージベクターλZAPのEcoRI制限部位とXhoI制限部位の間に挿入した。Giga-pack II Goldパッケージング用抽出物(Stratagene)を使ってｃＤＮＡライブラリーをパッケージングし、約10⁶個の独立したクローンを得た。このｃＤＮＡライブラリーを、プローブとしてpahA遺伝子内部の1174bp EcoRV 断片（図５）を使って、標準技術〔Sambrook，J.,Fritsch,E.F.およびManiatis ，T．(1989)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版，Cold Spring H arbor Laboratory Press,New York〕により、スクリーニングした。こうして、1 2個の陽性組換えクローン（＃１〜＃12と命名）が単離され、最大のサイズ（約1 600bp)を有する挿入断片を特徴づけのために選択した。このクローンの完全なヌクレオチド配列を決定すると、それは58,112ダルトン（Da）の分子量を有し且つＡ．ニデュランスのphacA遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列と84％一致する1548bpの転写解読枠（ＯＲＦ）を含むことかわかった。それと相同のＡ．ニデュランス遺伝子の場合と同様に、データベースの調査はPahAタンパク質とP450タンパク質ファミリーのメンバーとの間にかなりの同一性を示した。 PahAタンパク質は、このタイプのタンパク質の特徴である配列Gly-X-Gly-X-X-X- Cys-X-Gly（残基430〜438、配列番号４）を含む（「発明の詳細な説明」の項目を参照のこと）。これらの結果から、Ｐ．クリソゲナムのpahA遺伝子が、Ａ．ニデュランスのphacA遺伝子の相同体であると結論づけられる。実施例３．逆向き遺伝学によるＡ．ニデュランスのphacA遺伝子の不活性化Ａ．ニデュランスのphacA遺伝子の野性型対立遺伝子を、おそらくその機能に不可欠であろうコード領域の一部（配列番号１の残基298〜392）がargB⁺遺伝子により置換されているために抑制されている対立遺伝子変異体により置き換えた。この遺伝子操作はコドン297のところでphacA遺伝子の端を切り取り、無効（null）変異型対立遺伝子を生成する。更に、pBS-FG4B（図４）から1.7kb KpnI-EcoRI断片を精製し、そして前記２酵素で消化したpUC18中にサブクローニングして、プラスミドpUCBを得た。次いでp BS-FG4A（図４）から1.9kb NaeI断片を精製し、そしてSmaIで消化したpBluescri pt SK(+)中にクローニングした。不完全なphacA遺伝子のコード鎖（NaeI部位で始まる）がベクター中のβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子と同じ方向で存在するプラスミドを選択した。このプラスミドをpBSAと命名した。pBSAからXb aI−HindIII ＤＮＡ断片を精製し、そしてXbaI−HindIIIで消化しておいたpUCB 中に挿入して、プラスミドpUCA-Bを得た。最後に、Ａ．ニデュランスのargB⁺遺伝子を含有する3.2kb ＤＮＡ断片をpUCA-Bの唯一のXbaI部位のところに挿入して、pPhacA::argB゛を与えた。pUC18のlacZプロモーターから出発して、pPhacA::a rgBは、phacA遺伝子の５’領域の0.94kb断片、続いてそれのゲノム配列の最初の 297コドン、argB遺伝子を含む3.2kb断片、コドン393〜518に相当するphacA遺伝子のゲノム配列、およびphacA遺伝子の３’領域の1.2kb断片を含んで成る。これらの領域を全て含有する直鎖状断片は、該プラスミドからBcoRI消化により精製することができる（図６）。同様に、この直鎖状EcoRI断片を使ってそして上記図解に要約した手順を使用して、形質転換により、phacA遺伝子中に破壊−欠失変異を含むＡ．ニデュランス株を作製することができる。このために、Ａ．ニデュランスbiA1，methG1，ar gB2の株のプロトプラストを、Tilburn，J.，Scazzocchio，C.，Taylor，G.G.，Z abicky-Zissman，J.H.，Lockington，R.A．およびDavis，R.W．(1983) Gene 26:205-211のプロトコルに従って、２μｇの前記ＤＮＡ断片を用いて形質転換せしめた。得られた形質転換体を適当な選択培地を使ってアルギニン原栄養性について選択し、次いでそれらを精製した。一連の形質転換体に相当する菌糸からＤＮＡを単離し、PstIで消化し、そして特異的phacAおよびargB遺伝子プローブを使ってサザンハイブリダイゼーション法により分析した。多数の形質転換体が、図１に示されるような二重異種交差がうまくいったために得られると期待されるハイブリダイゼーションパターンを示した。例えば、プローブとしてphac A遺伝子の0.9kb PstI断片（図４）を使った時、受容体株の個々の0.9kb PstIハイブリダイゼーションバンドが、図１に示される組み込み型を示す形質転換体中では3.8kbバンドにより置き換えられていることが観察された。このバンドはarg Bプローブともハイブリダイズした。これらの形質転換体のうちの２つを更なる特徴づけのために選択し、ΔphacA #1およびΔphacA #2と命名した。これらの形質転換体株は、唯一の炭素源としてフェニルアラニン、２−ヒドロキシフェニルアセテートまたは２，５−ジヒドロキシフェニルアセテートを有する培地中で増殖する能力を有したが、それと対比して、それらは唯一の炭素源としてフェニルアセテートを有する培地中では増殖しなかった。このことは、Ａ．ニデュランスのphacA遺伝子によりコードされるチトクロームP450酵素（および拡大解釈すれば、Ｐ．クリソゲナムのphacA遺伝子によりコードされるもの）が、フェニルアセテートを２−ヒドロキシフェニルアセテートにヒドロキシル化する活性を有し、この活性がＡ．ニデュランスにおけるフェニルアセテート利用経路の第一段階（「従来技術」を参照のこと）を触媒するという結論を支持する。表現型の上ではΔphacA #2株と区別できないＡ．ニデュランスΔphacA #1株を、1996年６月19 日にCECT（Spanish Collection of Type Cultures，University of Vakencia，Research Building,Burjasot Cam pus，46100，Valencia）に、Ａ．ニデュランスbiA1veA1 methG1 argB2 phacA:: ［pPhacA::argB⁺］として、受託番号CECT 20195のもとに寄託した。不活性化されたpahA遺伝子を有するＰ．クリソゲナム形質転換体を得ることは、当業者にとって非常に容易である。それは単に、形質転換体CECT 20195中に存在するＡ．ニデュランスのphacA遺伝子とのハイブリダイゼーションにより、あるいはまた配列番号１に基づいた合成オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより、Ｐ．クリソゲナムのpahA遺伝子を単離することを必要とするだけである。続いてプラスミドpALfleo7〔1997年２月20日に受託番号CECT 4849としてCECTに寄託された〕を使って、本願の図７に示す通りにプラスミドpALP696を作製することができる。実施例４．phacA遺伝子の機能を不活性化しそしてペニシリン収率を増加させるための実験 phacA遺伝子によりコードされるフェニル酢酸２−ヒドロキシラーゼ活性を除去することによって改善されたペニシリン収率が得られるかどうかを突き止めるために、phacA⁺と比較しながらΔphacA株により産生されるペニシリンのレベルを測定する実験を行った。主要炭素源として2.5％(w/v)ラクトースと2.5％(w/v) コーンスティープ固形物を含み、指示したような異なる量のフェニル酢酸ナトリウム（w/vで）を有する最少培地の入ったフラスコ中での醗酵により、両株を比較した。どの場合でも培養物に同数の生存可能な分生子柄（２×10⁶／ml）を接種し、軌道攪拌しながら（250rpm）37℃でインキュベートした。様々な時点で試料を採取し、ミラクロスを通して濾過し、上清を使ってバイオアッセイにより生産されたペニシリンを測定した。バイオアッセイ用に、OD⁶⁰⁰＝６まで増殖させたミクロコッカス・ルテウス（M icrococcus luteus）培養物１mlを50℃のAntibiotic No.1培地（Difco）１ｌと混合した。この混合物を13.6cmのペトリ皿に注いだ（65ml／皿）。培養物からの上清に相当する100μｌ試料（10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.8中に適当に希釈したもの）を直径８mmのウエルの中に配置した。該プレートを４℃で２時間インキュベートし、次いで37℃で更に22時間インキュベートした。この後、試料中に存在するペニシリンによって引き起こされる細菌の増殖阻止帯の直径を測定し、そして種々の量のペニシリンＧカリウムを使って作成した検量線と比較することにより、抗生物質の量を概算した。図３は、産生培地中0.125％のフェニルアセテートを使って24時間後に、対照株phacA⁺において最大レベルのペニシリンが得られたことを示す。この時点で達成された収量は1.8μｇ/mlペニシリンであった。フェニルアセテート濃度を減少させると、この株によって生産されるペニシリンの最大レベルが1.1μｇ/mlに減少した。図３はまた、顕著な対比として、ΔphacA株の培養物におけるペニシリンの最大レベルが5.6μｇ/mlに達し、すなわち、それの親株のものの3.1倍のレベルに達したことも示す。更に、phacA遺伝子の不活性化の結果として、このペニシリン産生の増加が0.0625％への初期フェニルアセテート濃度の減少により影響されなかったことを示す。図１に示されるような逆向き遺伝学技術によって実施したフェニル酢酸２−ヒドロキシラーゼ活性をコードするphacA遺伝子の破壊−欠失変異が、Ａ．ニデュランスによるペニシリン産生に次のような少なくとも２つの利点を与えると結論づけられる：（i）ペニシリンレベルが相当増大すること；および(ii)ペニシリン産生がフェニルアセテートの外部供給にあまり依存しないこと。図面の説明図１：相同組換えによりＡ．ニデュランスのphacA遺伝子中に破壊−欠失変異を作製するために用いる方策。推定上の異種交差は太字の大きなクロス（Ｘ）により示される。図２：相同組換えによりＰ．クリソゲナムのpahA遺伝子中に破壊−欠失変異を作製するために用いる方策。推定上の異種交差は太字の大きなクロス（Ｘ）により示される。図３：野性型株（phacA⁺）と比較したＡ．ニデュランスのphacA::argB形質転換体株のペニシリン収率。横座標：経過時間（ｈ）；縦座標：ペニシリン収率（ μｇ/ml）。実線：フェニルアセテート濃度0.125％；破線：フェニルアセテート濃度0.0625％。図４：pFG4AとpFG4Bを作製するためにサブクローニングした断片を示す、Ａ．ニデュランスのphacA遺伝子を含むゲノム領域の制限地図。黒い領域は３つのイントロンである。図５：pALP520を作製するためにサブクローニングした2.55kb XhoI断片を示す、Ｐ．クリソゲナムのpahA遺伝子を含むゲノム領域の制限地図。黒い領域は３つのイントロンである。図６：pPhacA::argB⁺不活性化構成物の制限地図と関連する特徴。黒い領域はp hacA遺伝子を含む配列決定領域である。白い領域はphacA遺伝子の前後の隣接領域である。斜線領域はargB⁺領域である。図７：pALP696不活性化構成物の制限地図と関連する特徴。黒い領域はpahA遺伝子を含む配列決定領域（1745bp）である。白い領域はpahA遺伝子の前後の隣接領域（4143bp）である。斜線領域はフレオマイシン耐性領域である、ble^R遺伝子（2048bp）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:82） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ディースガルシア，ブルーノスペイン国，エー―24192 レオン，トロバホデルセレセド，７，カレジェネラリシモフランコ (72)発明者バッレードフェンテ，ホセルイススペイン国，エー―24006 レオン，15― セグンドベー，カレモイセースデレオン (72)発明者ビタレルアルバ，アレヤンドロスペイン国，エー―24001 レオン，３, カレカルメン (72)発明者サルトマルドナド，フランシスコスペイン国，エー―28023 マドリード, プラドデソモサグァス，33―セグンドセー，カレデルアブレゴ (72)発明者ペニャルバソト，ミゲルアンゲルスペイン国，エー―28036 マドリード, ８―アー，アベニーダデブルゴス (72)発明者ミンゴットアセンシャオ，ホセマヌエルスペイン国，エー―28036 マドリード, ８―アー，アベニーダデブルゴス

Claims

【特許請求の範囲】 1. 微生物中のフェニルアセテート異化酵素をコードし且つフェニルアセテート化合物を目当てにペニシリン生合成酵素と競争する酵素をコードする遺伝子を不活性化する方法であって、少なくとも１つの外因性ＤＮＡ化合物と不活性化しようとする前記遺伝子の配列の少なくとも一部分との間の相同組換えにより組み込み型形質転換を行うことを含んで成る方法。 2. 前記形質転換用ＤＮＡ化合物が、不活性化すべき前記遺伝子の少なくとも１つの発現性断片を含有する環状分子である、請求項１に記載の方法。 3. 前記形質転換用ＤＮＡ化合物が、不活性化すべき前記遺伝子の配列中に含まれない少なくとも１つのＤＮＡ断片を含有し、且つそのコード配列を中断する少なくとも１つの形質転換マーカーを含有する直鎖状分子である、請求項１に記載の方法。 4. 前記形質転換用ＤＮＡ化合物が、前記遺伝子の表現型機能の損失をもたらす、無認識または無欠失の変異、好ましくはフレームシフト変異を有する不活性化すべき前記遺伝子の配列のコピーを完全にまたは部分的に含有する、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。 5. 遺伝子を不活性化する形質転換の対象である前記微生物がペニシリンＧまたはＶを産生することができる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。 6. ペニシリンＧまたはＶを産生する前記微生物が真菌である、請求項５に記載の方法。 7. 形質転換される前記微生物がアスペルギルス・ニデュランスである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。 8. 形質転換される前記微生物がペニシリウム・クリソゲナムである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。 9. 使用する形質転換用ＤＮＡ化合物を、ベクター、好ましくはプラスミドpP hacA::argB中に完全にまたは部分的に含めることができる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。 10．使用する形質転換用ＤＮＡ化合物を、ベクター、好ましくはプラスミドpA LP696中に完全にまたは部分的に含めることができる、請求項１〜６および８のいずれか一項に記載の方法。 11．不活性化される前記遺伝子が、配列番号１、それの変異型遺伝子配列および／または相同遺伝子により表される、請求項１〜７および９のいずれか一項に記載の方法。 12．不活性化される前記遺伝子が、配列番号２により表されるポリペプチドまたはP450フェニル酢酸２−ヒドロキシラーゼ活性を示す類似の配列をコードする、請求項11に記載の方法。 13．不活性化される前記遺伝子が、配列番号３、それの変異型遺伝子配列および／または相同遺伝子により表される、請求項１〜６，８および10のいずれか一項に記載の方法。 14．不活性化される前記遺伝子が配列番号４により表されるポリペプチドまたはP450フェニル酢酸２−ヒドロキシラーゼ活性を示す類似配列をコードする、請求項13に記載の方法。 15．フェニルアセテート異化酵素をコードする遺伝子であって相同組換えによる組み込み後に内因性遺伝子を不活性化する少なくとも１つの遺伝子の先端切除配列、不完全配列または不活性配列を含んで成る少なくとも１つの外因性ＤＮＡ化合物を含有する、Ａ．ニデュランスの形質転換株およびそれから誘導される変異体。 16．不活性化される前記遺伝子が、フェニルアセテートのヒドロキシル化を媒介する酵素をコードする、請求項15に記載のＡ．ニデュランスの形質転換株。 17．不活性化される前記遺伝子が、配列とその隣接領域が配列番号１に記載されているphacA、それの変異型遺伝子配列および相同遺伝子である、請求項15または16に記載のＡ．ニデュランスの形質転換株。 18．不活性化される前記遺伝子が、phacAに相同であり、Ａ．ニデュランスとは異なる起源のものであり、且つそれとＡ．ニデュランスのphacA遺伝子のＤＮＡ配列との相同性がＡ．ニデュランスの内因性遺伝子座との相同組換えを媒介するのに十分なものである、請求項17に記載のＡ．ニデュランスの形質転換株。 19．不活性化される前記遺伝子が、配列番号２のタンパク質配列により表されるポリペプチドまたはP450フェニル酢酸２−ヒドロキシラーゼ活性を示す類似の配列をコードする、請求項15〜18のいずれか一項に記載のＡ．ニデュランスの形質転換株。 20．Ａ．ニデュランスCECT 20195の純培養株、それの変異体および／または形質転換誘導体から成ることを特徴とする、請求項15〜19のいずれか一項に記載の形質転換株。 21．図６の制限地図に示されるようなＡ．ニデュランスのphacA遺伝子を不活性化するプラスミドであって、Ａ．ニデュランスのargB遺伝子を含む3.2kb断片の挿入によって不活性化されたＡ．ニデュランスのphacA遺伝子を含む6.8kb Eco RI挿入断片を含有するプラスミドpUC18を含んで成る、ブラスミドpPhacA::argB 。 22．フェニルアセテート異化酵素をコードする遺伝子であって相同組換えによる組み込み後に内因性遺伝子を不活性化する遺伝子、の先端切除配列、不完全配列または不活性配列を含んで成るＤＮＡ化合物を含有する、ペニシリウム・クリソゲナムの形質転換株およびそれから誘導される変異体。 23．不活性化される前記遺伝子がフェニルアセテートのヒドロキシル化を媒介する酵素をコードする、請求項22に記載のＰ．クリソゲナムの形質転換株。 24．前記遺伝子が、その配列とその隣接領域の配列が配列番号３に記載されているpahA、それの変異型遺伝子配列および／または相同遺伝子である、請求項22 または23に記載のＰ．クリソゲナムの形質転換株。 25．不活性化される前記遺伝子が、配列番号４のタンパク質配列により表されるポリペプチドまたは明確なP450フェニル酢酸２−ヒドロキシラーゼ活性を示す類似配列をコードする、請求項22〜24のいずれか一項に記載のＰ．クリソゲナムの形質転換株。 26．前記遺伝子がＡ．ニデュランスのphacAであるか、またはＰクリソゲナムとは異なる源から単離された任意の別の相同ＤＮＡ化合物であって且つそれとＰ．クリソゲナムのpahAのＤＮＡ配列との相同性がＰ．クリソゲナムの内因性遺伝子座との相同組換えを媒介するのに十分であるものである、請求項24に記載のＰ．クリソゲナムの形質転換株。 27．図７の制限地図に示されるようなＰ．クリソゲナムのpahA遺伝子を不活性化するプラスミドpALP696であって、Ｐ．クリソゲナムのgdhプロモーターの調節下で発現されるＳ．ヒンダスタヌスのble^R遺伝子を含む2.0kb断片の挿入によって不活性化されたＰ．クリソゲナムのpahA遺伝子を含む7.9kb SalI挿入断片を担持しているプラスミドpBC KS+から成る、プラスミドpALP696。