JPH02283287A - アスペルギルス・ニゲルからのデオキシリボ核酸、組換え宿主微生物の製造法および機能的デオキシリボ核酸配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）からのデオキシリボ核酸の単離お
よび確認ならびに宿主微生物の場合にアスペルギルスに
由来するペクチナーゼを表現する方法に関する。

従来の技術 宿主微生物としてのアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）の場合に、例えばア
スペルギルス・ニゲルに由来する遺伝子を表現するため
の方法は、欧州特許出願公開第２３８０２３号明細書の
記載から公知である。この方法は、次の工程： ａ）遺伝子表現のためのＤＮＡ配列、形質転換細胞の選
択に適当なマーカー遺伝子ならびに表現すべき遺伝子で
あるＤＮＡ配列を含有する、宿主微生物としてのアスペ
ルギルス・オリザエのゲノム中に１回または数回組込む
ｔ；めの能力を有する組換えＤＮＡりａ−ン化ベクター
系を用意し； ｂ）使用されるマーカー遺伝子に関連して選択可能であ
るアスペルギルス・オリザエ宿主微生物を、（ａ）で用
意された組換えＤＮＡクローン化ベクター系を用いて形
質転換し： Ｃ）形質転換されたアスペルギルス・オリザエ宿主微生
物を適当な栄養媒体中で増殖することを包含する。

公知方法よれば、特にアスペルギルス・ニゲルのゲノム
ｌこ由来しうるグルカミラーゼ、α−アミラーゼ、リパ
ーゼおよびプロテインナーゼを製造することができる。

しかし、ペクチナーゼ、殊にＰＥ型およびｆ’Ｇ型を製
造するための方法を使用する場合には、期待しｔ；程の
収率の改善を達成されないことが確認された。

発明が解決しようとする課題および課題を解決するため
の手段 本発明の課題は、アスペルギルス・ニゲルからのペクチ
ナーゼをも有利に表現することができる！つの方法を見
い出すことである。そのためには、それぞれのペクチナ
ーゼに対してデオキシリボ核酸を単離し、確認し、かつ
１つの表現系を組換え微生物の形状でペクチナーゼの取
得のために開発することが必要である。窓列なことに、
このことは、本発明によれば、宿主微生物としてアスペ
ルギルス・ニゲルまたハアスペルギルス・アワモリ（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　Ａｗａｍｏｒｉ）種の糸状菌を
使用し、かつその上公知技術水準から知られた、例えば
特許請求の範囲に記載されたような作業方法を使用する
ことにより、上記公知方法を変更することによって変え
ることができる。

ペクチナーゼの群には、ペクチンエステラーゼ（ＰＥ）
、解離するかまたは解離しないポリガラクツロナーゼ（
ＰＧ）およびペクチンートランスエリミナーゼ（ＰＴＥ
）（これは、ペクチンリアーゼとも呼称される）が属す
る。有利には、ＰＥまたは特に解離するＰＧを製造する
ための本発明による方法が使用される。アスペルギルス
・ニゲル種の工業的に使用可能な糸状菌の中で、卓越し
たペクチナーゼ形成体は、公知であり、シＩ；がってこ
のペクチナーゼ形成体のゲノムは、本発明方法にとって
適当なものである。このゲノムの生産性の上昇は、殊に
ペクチナーゼ遺伝子を数回宿主微生物のゲノム中に挿入
する場合には、本発明方法によって達成することができ
る。

宿主微生物としては、アスペルギルス・ニゲル以外にア
スペルギルス・アワモリも適当である。本発明により遺
伝子修飾された糸状菌は、自体公知の方法で培地を設け
かつこの培地の濾液をペクチナーゼの生産のために後処
理することによって使用することができる。

実施例 例１：ボリガラクツロニダーゼ遺伝子の表現遺伝子供与
体としての菌株アスペルギルス・ニゲル　ＤＳＭ５５７
５を、コムギ糠４％、微粉砕しｊ；蕪葺の切片４％およ
び硫酸アンモニウム０．２％を有する３０Ｉ２の発酵基
中で２８°Ｃ１通気量ＩＶＶＭおよび撹拌速度６００　
ｒｐｍで９６時間培養した。

約３８００ドルトンの分子量および約５．５の等電点を
有する発酵の間に形成されたポリガラクンロニダーゼ（
ＰＧ）の蛋白質配列を基礎にＤＳＭ５５７５のｃＤＮＡ
バンク中の遺伝子を見い出すＩ；めのオリゴヌクレオチ
ドプローブを誘導するために、この酵素を培地上澄み液
から精製しｔ；。精製の間に、この酵素をレーム社（Ｒ
５ｈｍ）の１９８７年２月１２日付けＮ　ｏ　、Ｆ　Ｒ
−５−ＯｉＤの技術情報冊子に記載のポリガラクツロニ
ダーゼ（ｐｃ）単位の場合のこの酵素の活性度につき検
出し、ならびに２８０ｎｍの際のＵＶ吸収度につき検出
した。ポリガラクツロニダーゼ単位は、標準ペクチン溶
液の粘度を分析方法の標準的条件下にＱ／ｖ　ｓｐ＝　
０．００００１５だけ減少させる酵素活性度によって定
義される。

そのために、発酵上澄み液をセファデックスＧ２５コー
ス（■５ａｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５　Ｃｏａｒｓｅ）　（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）により脱塩した。１０ミリモル
の酢酸ナトリウム／酢酸塩緩衝液中でｐ　Ｈ４，０の際
に７ラクトゲル　ＴＳＫ　　ＣＭ−６５０（■Ｆｒａｃ
ｔｏｇｅｌ　ＴＳＫ　ＣＭ−６５０）　（Ｍｓｒｃｋ社
）を用いて陽イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｐ
Ｇを線状ＮａＣＱ勾配で約０．３モルで溶離した。

その上、ゲル濾過をセファクリル　５２００（■５ｅｐ
ｈａｃｒｙｌ　５２００）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に
より行ない、改めて上記の記載と同じ条件下ではあるが
ゲル物質としてのファルマシア　七ノＳ（■Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　Ｍｏｎｏ　Ｓ）を用いて行なう。最終的な精
製は、セファクリル　５２００　（■５ｅｐｈａｃｒｙ
＋　５２００）およびスベローゼ１２（■５ｕｐｅｒｏ
ｓｅ　１２）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）により再び２回
ゲル濾過することによって行なわれた。

精製した酵素から出発し、ブロムシアン、トリプシンお
よびブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼを用いる分解によって
ペプチドを調製し、そのアミノ酸配列をガス相シークエ
ネーター（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍ
ｏｄｅｌ　４７０　Ａ　）の使用下に測定しｔ；。この
場合、ペプチドのオンライン検出を１２０　　Ａ　　Ｈ
ＰＬＣを用いて行なった。ブロムシアン分解をグロス（
Ｅ、Ｇｒｏ１３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ　１１　、２３８〜２５５の記載により行ない
、ペプチドの分離をＨＰＬＣ逆相Ｃ４−カラム上でトリ
フルオロ酢酸／プロパツール／アセトニトリル勾配０．
１％中で実施しｔ；。

トリプシン分解およびブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼを用
いる分解をｐＨ７，８で重炭酸アンモニウム２０ミリモ
ル中で実施した。相応するペプチドを再び逆相ＨＰＬＣ
クロマトグラフィーによってＣＩ８カラムを用いて分離
した。天然の蛋白質のＮ末端配列を直接に測定した。こ
のＮ末端配列は、次のとおりであった： Ｇ　Ｉｙ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−
Ｔｈｒ−Ａ　１ａ−Ａ　Ｉａ−Ａ　１ａ−Ａ　１ａ−Ｌ
ｙｓ−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｙｓ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉ
ｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−＋　１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅ
ｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｇ　１ｕ−Ｖａ　１−Ｐ
ｒｏ−Ａ　ｌａ−ブロムシアン分解後に得られたペプチ
ド、ＣＮ７、の１つをオリゴヌクレオチドＥＲ１３の合
成のだめのオリジナルとして使用した。ペプチドＣＮ７
の場合のアミノ酸配列＋　１ｓ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　１ｎ−
Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇ　ｌｕは、このアミノ酸の僅かに退
化した遺伝子コードのためにオリゴヌクレオチドの誘導
に適当である。オリゴヌクレオチドＥＲ１３の場合にヌ
クレオチド配列を確定するために、アスペルギルス・ニ
ゲルからのグルフアミラーゼ遺伝子、ポエ／Ｌ／　（Ｅ
、Ｂｏｅｌ）他（１９８４）、ＥＭＢＯＪ、３．１０９
７〜１１０２、ならびにアスペルギルス・ニドウランス
（Ａ、ｎ１ｄｕｌａｎｓ）からのアセトアミダーゼ遺伝
子、コーリツク（Ｃ，Ｍ、Ｃｏｒｒｉｃｋ）他、（１９
８７）、Ｇｅｎｅ５３６３〜７１、の場合に最も頻繁に
使用されるコドンを基礎としていた。これら２つの遺伝
子の場合には、アスパラギン酸に対して明らかなコドン
優位性を測定することができなかったので、ＥＨ１１の
場合に２つの可能なコドンが使用された。

ＣＮ７のアミノ酸配列： ５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｉ　１ｅ−Ｓｅｒ−＾５ｐ−Ｔｙｒ−
ＧＩｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉ　１ｅ−ＧＩｎ−ＧＩｎ−
Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−ＧｌｙＬｙｓ ＥＨ１１の合成のために選択されたアミノ酸配列： ＋１ｅ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ可能
なコドン： ＲＮＡに対して補足的なオリゴヌクレオチドＥＲ１３の
配列： ３’　−ＴＡＧ−ＣＴＣ−ＧＴＣ−ＣＴ　６−ＡＴＧ−
ＣＴ−５’ｍＲＮＡを調製するために、菌株ＤＳＭ５５
７５を振盪フラスコ中でＰＧ誘発される条件下でコムギ
糠２％、微粉砕した蕪臀の切片２％および栄養媒体とし
ての硫酸アンモニウム０．１％と一緒に往復揺動装置上
で２８℃で９６時間培養した。得られたミセルを導出し
、かつ直接に液体窒素中で低温凍結した。

ＲＮＡの調製は、マニアチス（１：、％１Ｂ１ｉａｔｉ
ｓ）他（１９８２）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐａｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ、第１９６頁に記載のグアニジニウムイン
チオシアネート／Ｃ５ＣＱ方法により行なわれた。こう
して得られた全ＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ）−セルロー
スを用いるカラムクロマトグラフィーによってポリ（Ａ
）”−ｍＲＮＡの含量が増大した。ティラー（Ｊ、Ｍ、
Ｔａｌ。

ｒＸＩ　９７９　）　、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、４８　、６８１〜７１７゜ ｍＲＮＡから、グブラー（Ｕ、Ｇｕｂｌｅｒ）およびホ
フマン（Ｂ、Ｊ、Ｈｏｆｆｍａｎｎ）（１９８３）　、
Ｇ　ｅ　ｎｅ２５．２６３〜２６９の記載によりｃ　Ｄ
ＮＡを合成した。この場合には、ｍＲＮＡ約５μ９をＭ
−ＭＬＶ逆転写酵素６０　Ｕ　（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ　
ＧｍｂＨ１７５１４Ｅｇｇｅｎｓｔｅｌｎ、西ドイツ国
）を用イテー重ｊＪ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａに書き換えた。−
重鎖ｃ　ＤＮＡ４００　ｎｇからリボヌクレアーゼＨ０
，４Ｕ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ　Ｇｎ＋ｂＨ，７５１４Ｅ
ｇｇｅｎｓｔｅｉｎ、西ドイツ国）、エシェリキア・コ
リ（Ｅ　、ｃｏｌｉ）−Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩ　　
Ｉ　ＯＵ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉａ
ｓ　ＧｍｂＨｑ　６８００　）Ｊａｎｎｈａｉｍ、西ド
イツ国）およびエシェリキア・コリーＤＮＡ−リガーゼ
（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　ＧｍｂＨｓ
　Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ、西ドイツ国）の使用下に二重
鎖ｃＤＮＡ約４５０　ｎｇを取得することができた。緩
衝液の組成およびヌクレオチド濃度は、グブラー（Ｕ、
Ｇｕｂｌａｒ）およびホフマン（Ｂ、Ｊ、Ｈｏｒｉａｎ
ｎＸｌ　９８３　）　、Ｇ　ｅｎｅ２５．２６３〜２６
９の方法に相応する。

平らな末端の製造のために、ｃＤＮＡ末端をＴ４ポリメ
ラーゼ５　Ｕ　（Ｇ［ＢＣＯ−ＢＲＬ　ＧｍｂＨ，７５
１４Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ、西ドイツ国）およびデオキ
シヌクレオシドトリホスフェート５０μＭを用いてグブ
ラー（Ｕ、Ｇｕｂｌｅｒ）　（１９８７）　、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏ１ｏｇｙ第１５２巻、第３３
０頁〜第３３５頁の記載により充填した。ｃＤＮＡの分
子を９００ｂｐの長さを越えて増大させるために、ｃＤ
ＮＡをビオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ａ　５０　ｍカラムに
より大きさに応じて分離しｔ；。Ｉｋｂｐの長さを上廻
るｃＤＮＡ分子を含有する両分を捕集した。ｃＤＮＡを
ｄＧ分割したｐＵｃ９−ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
　ＬＫＢ　ＧｍｂＨ，７８００Ｆｒｅｉｂｕｒｇ。

西ドイツ国）に挿入するために、１ｋｂｐの長さを１廻
る二重鎖ｃＤＮＡ　　２０ｎｇをｄＣＴＰの１０４倍の
過剰量および末端転移酵素１４゜７　Ｕ　（ＧＩＢＣＯ
−ＢＲＬ　ＧｍｂＨ，７５１４Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ、
西ドイツ国）３７℃で７分間４０μａでの全容量でイン
キュベートし、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他、（
１９８２）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐａｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋｓ第２４１頁、かつこうして単独重合体ｄＣ基を備え
た。

このｃＤＮＡ５ｎ９をグブラー（Ｕ、Ｇｕｂｌｅｒ）お
よびホフマン（Ｂ、Ｊ、ＨｏｆｍａｎｎＸｌ　９８３　
）、Ｇｅｎｅ２５．２６３〜２６９の方法によりｐＵＣ
９ベクター中に挿入した。この組換えベクターの形質転
換は、適格なエシェリキア・コリＤＨ５ｒＴＭ細胞（Ｇ
ＩＢＣＯ−ＢＲＬ　ＧｍｂＨ，７５１４Ｅｇｇｅｎｓｔ
ｅｉｎ、西ドイツ国）中で製造元の記載により行なわれ
ｔ；。こうして組換えクローンを包含するｃＤＮＡバン
クは、アスペルギルス・ニゲルＤＳＭ　　５５７５によ
って得られた。

アスペルギルス・ニゲルｃＤＮＡバンクヲ（３２）Ｐ標
識したオリゴヌクレオチドＥＲ１３−緒にスクリーニン
グした。この場合、ハイブリッド形成は３７℃で行なわ
れ；それぞれ３７℃で３０分間６倍のＳＳＣ緩衝液の存
在下、次に２倍のＳＳＣ緩衝液の存在下、ＳＤＳ　１％
を有する２倍のＳＳＣ緩衝液の存在下、最後に００１倍
のＳＳＣ緩衝液の存在下で洗浄した。ニトロセルロース
フィルターのオートラジオグラフィー処理の後、３つの
強度にハイブリッド形成すれるエシェリキア・コリのク
ローンを確認することができ、そのプラズミドは、制限
分析および部分的ＤＮＡ配列決定の後に全部で３回の挿
入は同一であったことを示した。第１図には、制限分析
および形質転換細胞のＰＧ−ｃＤＮＡの配列決定図式が
表わされている。組換えプラズミドは、ｐＰＧｌと呼称
される。ＰＧ−ｃＤＮＡの完全なりＮＡ配列の配列決定
は、サンガー（Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ）他（１９７７）　、
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７４．
５４６３−５４６７の記載により母細胞配列プライマー
およびＰＧ−特異的配列プライマーを用いて行なわれた
。得られたｃＤＮＡ配列は、第１表に記載されている。

ｃＤＮＡから導出されたアミノ酸配列は、蛋白質の配列
決定により測定されたペプチド配列との最も著しい一致
を示した。

アスペルギルスの表現のために必要とされる隣接領域を
有する７アージークローンをＤＳＭ５５７５の染色体Ｄ
ＮＡから得るために、まず染色体ＤＮＡをハインズ（Ｍ
、Ｊ、Ｈｙｎｅｓ）他（１９８３）　、Ｍｏ１．　Ｃｅ
１１．Ｂｉｏｌ、　３．１４３０〜１４３９に記載の方
法により単離した。このためにミセル約１０９を液体窒
素の下で磨砕し、かつトリフ、−ＨＣｆｆ１１０ミリモ
ル、ｐＨ７，５、ＥＤＴＡ　ｌ　ミリモルおよびＳＤＳ
３％への取り込み後にフェノールで抽出した。ＤＮＡの
後処理をブロテイナーゼにおよびＲＮアーゼＡを用いる
処理によって行なった。得られた高分子量ＤＮＡを部分
的に５ａｕ３Ａで加水分解し、かつサッカロース密度勾
配遠心分離によって大きさに応じて分取した。１８〜２
２ｋｂの大きさのＤＮＡ分子をＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　／　
Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ加水分解し　ｆ二　Ｅ　　ＭＢ　　Ｌ
　　　３　−Ｄ　　Ｎ　　Ａ　　　（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ　　　ＧｍｂＨ，６９００Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｓ
西ドイツ国）中に挿入し、かつ試験管内に包装しＩ；。

包装抽出液を同様にストラタゲン社（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）から取り寄せた。

エシェリキア・コリ中の７アージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅＧｎ＋ｂＨ）の増殖後、組換えクローン約７００００
個を包括するファージバンクを設計することができた。

７アージーＤＮＡをハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−Ｎ　
−メンプラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、、Ｂｒａ
ｕｎｓｃｈｖｅｉｇ）上に施与した後にｐＰＧｌからの
（３２）Ｐ−標識された１、３−ｋｂｐ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ
−断片と一緒にスクリーニングした。この場合、ハイブ
リッド形成は、６５°Ｏで行なわれ；このフィルターを
それぞれ６５℃で３０分間宛２回ＳＳＣ緩衝液中で洗浄
し、次いで２回ＳＤＳ　１％を有するＳＳＣ緩衝液で洗
浄し、最後に０．１回Ｓｓｃ緩衝液で洗浄した。組換え
ＥＭＢＬ３−ファージ約７００００個から、多数のハイ
ブリッド形成りローンを得た。それらの中から、唯１つ
の再びハイブリッド形成【７た約６ｋｂの大きさのＨｉ
ｎｄｎｌ−７ラグメントをｐＵＣｌ　９に再クローン化
し、かつエシェリキア・コリＤ　Ｈ５ａに形質転換した
。表現するのに必要とされる隣接配列を有する染色体Ｐ
Ｇ遺伝子を含有する生じるプラズミドは、ｐＰＧ６７と
呼称された。エシェリキア・コリＤＨ５ａ　ｐＰＧ６７
をＤＳＭｉ：：Ｎ　ｏ　、５５５３で寄託した。ｐＰＧ
６７の制限図は、第２図に示されている。構造遺伝子な
らびにｐＰＧ６７からの隣接領域を含有するＤＮＡ配列
は、第２表に記載されている。

菌株アスペルギルス・ニゲル　ＤＳＭ５５７５、アスペ
ルギルス・アワモリ　ＤＳＭ５５７４およびアスペルギ
ルス・オリザエ　ＤＳＭ５５７３を次の試験報告により
形質転換した。

邪魔板を有するｌＱのエーレンマイヤーフラスコ中のツ
ァペクードックス（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ）一完全媒体
１００ｍＱ（酵母抽出液０．１％を有する０ｘｏｉｄ　
Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ媒体）にそれぞれ真菌類の菌株の
胞子約１０７を接種し、３７°Ｃで１６時間往復揺動装
置上で１分間１２０回の転向の周期でインキュベートし
た。ミセルを祇フィルターにより取得し、かつ２回ＭＰ
緩衝液（Ｍ９ＳＯ４１，２モル、Ｎ　ａ　Ｈ２Ｆ０４１
０ミリモル＋１）Ｈ５，８）で洗浄した。湿ったミセル
約５ｇを邪魔板を有しないｌｏＯｍｆｆのエーレンマイ
ヤーフラスコ中のＭＰ緩衝液１５ｍ１２に引き取った。

この懸濁液にノボザイム２３４（■Ｎｏｖｏｚｙｍ　２
３４）溶液６００μＱＣＭＰ緩衝液６ｍ４中１ｇ）およ
びβ−グルクロニダーゼ１００μＱ（Ｓｉｇｎ＋ａ）を
添加し、この配合物を５分間水中で冷却した。引続き、
牛血清アルブミン溶液３００μａ（ＭＰ緩衝液４ｍＱ中
０．２９）を添加した。ミセルの原形質伴侶は、３０°
Ｃで振盪板の直径１２．５ｍｍを有する水浴円形振盪装
置中で１００ｒｐｉｌで行なわれる。原形質体化時間は
、ＤＳＭ５５７５およびＤＳＭ５５７４の際に約３．５
〜４時間であり、ＤＳＭ５５７３の場合には、約１．５
〜２時間である。原形質伴侶の状態は、鏡検法で制御さ
れた。

原形質体懸濁液をＭＰ緩衝液で含浸したガラスウール−
フィルターを介して遠心分離小管中に与え、かつそれぞ
れ同容量のＵ緩衝液（ソルビトール６００ミリモル、ト
リス１００ミリモル／ＨＣＱ　１）Ｈ７，Ｏ）をその上
に入れた。２０°Ｃおよび２５０ｇで１０分間の遠心分
離の後、原形質体を２つの緩衝液の間の層から取り出し
た。次いで、得られた懸濁液を２つの容量の５Ｔｌｉｌ
衝液（ソルビトール１．２モル、トリス１０ミリモル／
ＨＣ（２ｐＨ７，５）と混合し、かつ２０°Ｃで１０分
間１５００９を遠心分離した。引続き、原形質体沈積物
をＳＴＣ緩衝液１０ｍＱ（ソルビトール１．２モル、ト
リス１０ミリモル／ＨＣｌ２　ｐＨ７，５、ＣａＣ（２
２１０ミリモル）中に引き取り、かつ再び２０°Ｃおよ
び１５００ｇで遠心分離した。この方法を繰返し、引続
きこの沈積物をＳＴＣ緩衝液１ｍ１２中に懸濁させｔ二
。

プラスミドｐＰＧ６７は形質転換すべきアスペルギルス
菌株に対する選択マーカーを有しないので、共形質転換
方法が使用された。そのために、アスペルギルス・ニゲ
ル　ＤＳＭ５５７５およびアスペルギルス・アワモリ　
ＤＳＭ５５７４には、これらの菌株の場合に表現可能な
ヒグロマイシン耐性遺伝子（ヒグロマイシンーホスホト
ランスフェラーゼ）を含有するプラスミドｐ　Ａ　Ｎ　
７−１　　（Ｐｕｎｔ他、Ｇｅｎｅ５６．１１７〜１２
４）が使用された。共形質転換配合物１つ当りそれぞれ
ｐＡＮ７−１　２０μ９および同量のｐＰＧ６７が使用
された。アスペルギルス・オリザエ　ＤＳＭ５５７３は
ヒグロマイシンＢに対して自然の耐性を有しているので
、この菌株は、プラスミドｐ　３　Ｓ　Ｒ２（Ｋｅｌｌ
ｙおよびＨｙｎａｓ、　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　４．
４７５〜４７９）と共形質転換され、この場合このプラ
スミドｐ３ＳＲ２は、唯一の窒素源としてのアセトアミ
ドを有する最小媒体上での有利な成長による形質転換細
胞の選択をアセトアミダーゼ遺伝子の表現によって可能
にする。共形質転換配合物の場合には、それぞれｐ３ｓ
Ｒ２０４０μｇおよび同量のｐＰＧ６７が使用された。

形質転換に使用されたＤＮＡをＴＥ緩衝液５０μα（ト
リス１０ミリモル／ＨｃＱｐＨ７，５ＥＤＴＡ　１ミリ
モル）中に引き取っｔ；。対照配合物は、それぞれＤＮ
ＡなしのＴＥ緩衝液５０μαを含有していたか、または
選択プラスミドｐＡＮ７−１もしくはｐ３ＳＲ２のみを
含有していｌ二。ＤＮＡ溶液もしくはＤＮＡなしのＴＥ
緩衝液２０μａをグロトプラステン懸濁液３００μＱに
添加し、かつ０℃で１０分間インキュベートした。ＤＮ
Ａ溶液もしくはＤＮＡなしの緩衝液の再度の添加および
ＰＥＧ溶液４００μＱ（Ｓｅｒｖａのポリエチレングリ
コール４０００　６０％、トリス１０５９モル／ＨＣ（
２ｐＨ７，５、ＣａＣｌ２２５０ミリモル）の添加の後
、２２°Ｃで５分間のインキュベートを行なった。引続
き、ＰＥＧ溶液６００μαを添加し、この配合物を２２
℃でさらに２０分間インキュベートした。

ヒグロマイシンＢの選択の場合には、配合物を７７ペク
ードツクス（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ）寒天１００ｍＱ　
（０ｘｏｉｄ寒天Ｎｏ、ｌ　　１％を有する０ｘｏｉｄ
）を、４５℃液状に保持された浸透安定剤としてのサッ
カロース１モルと一緒に加え、かつそれぞれ１０ｍ（２
の分量でベトリ皿に分配した。３７℃で１６時間のイン
キュベートの後、同じ寒天ではあるがサッカロースなし
の上層１０ｍＱのヒグロマイシンＢ　（Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ）の添加は、２００μｇ／ｍＱの濃度で行なわれ
た。３７°Ｃで２〜４日間さらにインキュベートを行な
った後、形質転換細胞は、明らかに背後での成長によっ
て寒天層中で取り除かれかつ対照配合物中には存在して
いない、寒天表面から突出しているカビのコロニーとし
て確認しかつ単離することができた。引続き、形質転換
細胞を２回ツァペクードックス（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ
）寒天上の１つのカビ通路上でヒグロマイシンＢ５０μ
ｇ／ｍＱを用いて精製した。出発菌株ＤＳＭ５５７５お
よびＤＳＭ５５７４は、この媒体上で成長しなかった。

この形質転換速度は、ＤＳＭ５５７５のｐＡＮ７−１　
１μｇ当り形質転換細胞約１０個でありかつＤｓＭ５５
７４のｐＡＮ７−Ｉ　　Ｎ１ｇ当り形質転換細胞約２０
ｆｆｌｌであった。

アセトアミダーゼの選択の場合には、形質転換配合物を
ＳＴＣ緩衝液で１０ｍｆｆに満たし、かつ２０°Ｃおよ
び１５００ｇで１０分間遠心分離した。沈積物をＳＴＣ
緩衝液１ｍ１２中に再懸濁させ、引続き浸透安定剤とし
てのサッカロース１モルを有するアセトアミド最少寒天
９ｍ（２と、４５℃で混合した。この寒天を、背後での
成長を阻止するためにサッカロース１モルおよびＣ５Ｃ
（２１５ミリモルを存するアセトアミド最少寒天板上で
２ｍｆｆの分量に分配した。６〜１２日後に、形質転換
細胞を、明らかに背後の成長が取り除かれている強力に
成長するカビのコロニーとして確認しかつ単離すること
ができる。この形質転換細胞をＣ３ＣＱおよびサッカロ
ースなしのアセトアミド−最少寒天上の１つのカビ通路
上で２回精製した。アセトアミド−最少栄養培地の組成
は、ケリー（Ｋｓｌｌｙ）およびハインズ（Ｈｙｎｅｓ
）による場合（上記参照）に相当する。アスさルギルス
・オリザエ　ＤＳＭ５５７３の形質転換速度は、ｐ３Ｓ
Ｒ２１μｇ当り形質転換細胞約２．５個である。

形質転換試験および対照配合物からそのつど５０個の形
質転換細胞を振盪フラスコ中でＰＧ生産性について試験
した。この場合には、ミセル培養の場合と同じ条件をｍ
　ＲＮ　Ａ単離（上記参照）のために選択した。第３表
には、それぞれ最適の形質転換細胞１ｍ１２当りの単位
で培養上澄み液の場合に見い出されるＰＧ活性度が記載
されている。出発菌株がＰＧ生産性について少なくとも
２倍卓越しているクローン数で測定された共形質転換の
頻度が全部で３つの試験の場合に〉３０％であるので、
最適のクローンは、少なくとも１５個の形質転換細胞か
ら選択された。対照の配合物の場合には、形質転換細胞
は出発菌株の生産性を凌駕していないので、全部で５０
の菌株には記載した値が当てはまる。

振盪フラスコの場合に試験毎に記載した変動に基づいて
、値の範囲は記載されている。

それに応じて、最高の結果をアスペルギルスニゲルＤＳ
Ｍ　　５５７５（形質転換細胞ＮＯ６７）の場合に２４
０〜２７０ＰＧ単位／ｍＱで得た。アスペルギルス・ア
ワモリＤＳＭ５５７４の場合（形質転換細胞Ｎｏ、１２
）には、１２０〜１５０ＰＧ単位／　ｍ　Ｑで、２０〜
３０ＰＧ単位／ｍ１２を有するアスペルギルス・オリザ
より５Ｍ５５７３（形質転換細胞Ｎ　ｏ　、４　）の場
合よりも良好な結果が得られた。

次に、本発明を表につきさらに詳説する。

第１表には、アスペルギルスニゲルからのＰＧ−ｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列およびこれから導出されたアミノ
酸配列が１つの略名コードで示されている。明らかに解
釈できる出発コドンおよび停止コドンは省略されている
。天然蛋白質のＮ末端の端部（アミノ酸１〜３０）は特
徴付けられている。ペプチドＣＮ７は、矢印によって示
されている。その中で下線を引いたアミノ酸は、オリゴ
ヌクレオチドＥＲ１３の合成のためのオリジナルに使用
された。

第２表には、ブラズミドｐＰＧ６７からの染色体ＰＧ遺
伝子のヌクレオチド配列およびこれから導出されたアミ
ノ酸配列が１つの略名コードで示されている。天然ＰＧ
のＮ−末端配列は下線が引かれている。更に、イントロ
ンｌならびに出発コドンおよび停止コドンが示されてい
る。

第３表には、培地の上澄み液中で見い出されたＰＧ活性
度がそれぞれ最適の形質転換細胞１ｍＱ当りの単位で示
されている。

１つの略名コードの場合に、次のコドンが使用されてい
る： Ａ−アラニン、Ｃ−システィン、Ｄ−アスパラギン酸、
Ｅ−グルタミン酸、Ｆ−フェニルアラニンＧ−グリシン
、Ｈ−ヒスチジン、■−インロイシン、Ｋ−リシン、Ｌ
−ロイシン、Ｍ−メチオニン、Ｎ−アスパラギン、Ｐ−
プロリン、Ｑ−’／）レタミン、Ｒ−アルギニン、Ｓ−
セリン、Ｔ−トレオニン、■−バリン、Ｗ−トリプトフ
ァン、Ｙ−チロシン。

第３表 ！、アスペルギルス・ニゲル ＤＳＭ５５７５　（出発菌株）　　　　　　　　　　　
　　約２０〜３゜ＤＳＭ５５７５　　ｐＡＮ７−１（形
質転換細胞１〜５ｏ）約２０−３０２０−３０ＤＳ　　
ｐＡＮ７−１／ｐＰＧ６７（形質転換細胞Ｎｏ、７）　
　　　　　　　　　　　　約２４０−２７０２．７スベ
ルギルス・アワモリ ＤＳＭ５５７４　（出発菌株）＜ｌ。

ＤＳＭ５５７４　　ｐＡＮ７−１（形質転換細胞１〜５
ｏ）　　　　く１゜ＤＳＭ５５７４　　ｐＡＮ７−１／
ｐＰＧ６７（形質転換細胞Ｎｏ、１２）　　　　　　　
　　　　　約１２０−１５０３．７スベルギルス・オリ
ザよ り５Ｍ５５７３（出発菌株）＜１０ ＤＳＭ５５７３　　ｐ３ＳＲ２（形質転換細胞１〜５０
）　　　　　＜１０ＤＳＭ５５７４　　ｐ３ＳＲ２／ｐ
ＰＧ６７（形１ｊｌｔｉＪａ細胞Ｎ　ｏ　、　４　）　
　　　　　　　　　　　　　　約２０〜３０例２：ペク
チネステラーゼ（Ｐ　Ｅ）遺伝子の表現 菌株アスペルギルス中ニゲル　ＤＳＭ５５７５を、コム
ギ糠４％、微粉砕した蕪臂の切片４％およびｉｓアンモ
ニウム０．２％を有する３０Ｑの発酵基中で２８℃、通
気量ＩＶＶＭおよび撹拌速度６００　ｒｐｍで９６時間
培養した。

約４３０００ドルトンの分子量および約３゜６の等電点
を有する発酵の間に形成されたペクチネステラーゼ（Ｐ
　Ｅ）の蛋白質配列を基礎にＤＳＭ５５７５のｃ　ｒ）
ＮＡバンク中の遺伝子を見い出すためのオリゴヌクレオ
チドプローブを導出するために、この酵素を培地上澄み
液から精製した。精製の間に、この酵素をレーム社（Ｒ
Ｏｈｍ）の１９８７年２月１２日イ寸けＮｏ、ＦＲ−５
−０２−Ｄの技術情報冊子に記載のペクチネステラーゼ
（Ｐ　Ｅ）単位の場合のこの酵素の活性度につき検出し
、ならびに２８０ｎｍの際のＵＶ吸吸収−つき検出した
。この方法は、ペクチンの分解の際に遊離したＣ０ＯＨ
基を一定のｐＨ値の際にｎ　／　１０　Ｎ　ａ　ＯＨで
滴定することに基づく。１％の０ｂｉ−ペクチン溶液（
純粋なリンゴペクチン、褐色のバンド、高度にエステル
化された、０ｂｉｐｅｋＬｉｎ　ＡＧ、　Ｂ１５ｃｈｏ
ｆｓｚｅｌｌ／Ｓｅｈｗｅｉｚ）を使用した場合には、
分解曲線はｎ／１０　　ＮａＯＨ２，５ｍｆ２の使用量
になるまで直線である。０ｂｉ−ペクチンの使用の際の
ｐＨ値は、４゜５である。活性度は、国際単位で記載さ
れている。

発酵上澄み液をセファデックスＧ２５コース（■５ｅｐ
ｈａｄｅｘ　Ｇ２５　Ｃｏａｒｓｅ）　（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ社）により脱塩した。１０４９モルのトリス／１
−ｒｃＱＭ衝液中でｐＨ８，０の際に７ラクトゲル　Ｔ
ＳＫ　　ＤＥＡＥ−６５０（■Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　Ｔ
ＳＫ　ＤＥＡＥ６５０）　ＣＭｅｒｃｋ社）を用いて陰
イオン交換クロマト、グラフィーにより、ＰＥを線状Ｎ
ａＣＱ勾配で約０．３モルで溶離しＩ；。その上、ゲル
濾過をセファクリル　Ｓ　２００　ＨＲ（＠５ｅｐｈａ
ｃｒｙｌ　５２０ＯＨＲＸＰｈａｒｍａｃｉａ社）によ
り行ない、改めて陰イオン交換クロマトグラフィーを上
記の記載と同じ条件下ではあるが、ゲル物質としてのフ
ァルマシア　モノＱ（■Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｍｏｎｏ
　Ｑ）を用いて行なう。最終的な精製は、フェニル−セ
ファ０−ス　ＣＬ　　４　Ｂ　（Ｐｈｅｎｙｌ−５ｅｐ
ｈａｒｏｓｅ　ＣＬ４ＢＸＰｈａｒｍａｃｉａ社）によ
って行なわれた。

精製した酵素から出発し、ブロムシアン、トリプシンお
よびブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼを用いる分解によって
ペプチドを調製し、そのアミノ酸配列をガス相シークエ
ネータ−（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍ
ｏｄｅ＋　４７０　Ａ　）の使用下に測定した。この場
合、ペプチドのオンライン検出を１２０　　Ａ　　ＨＰ
ＬＣを用いて行なった。ブロムシアン分解をグロス（Ｅ
、Ｇｒｏｌ’３Ｘｌ　９６７　）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１　ｌｓ　　２３８〜２５
５の記載により行ない、ペプチドの分離をＨＰＬＣ逆相
Ｃ４−カラム上でトリフルオロ酢酸／プロパツール／ア
セトニトリル勾配ｏ、ｉ％中で実施した。トリプシン分
解およびブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼを用いる分解をｐ
Ｈ７，８で重炭酸アンモニウム２０ミリモル中で実施し
た。相応するペプチドを再び逆相ＨＰＬＣクロマトグラ
フィーによってＣＩ８カラムを用いて分離した。天然の
蛋白質のＮ末端配列を直接に測定した。このＮ末端配列
は、次のとおりであつｌｓ　　二 Ａ　ｌ　ａ−Ｓｅｒ　−Ａ　ｒｇ−Ｍｅ　ｔ−Ｔｈｒ　
−Ａ　Ｉａ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｌａ−＋
　１　ｅ−Ｖａ　１−Ｖａ　ｌ　−Ａ　Ｉａ−Ｌｙｓ−
５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔ
ｈｒ−１１ａ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−次のＮ−末端
アミノ酸配列を有する、典型的な分解の後に得られたペ
プチド、Ｔ２−２１゜をオリゴヌクレオチドＰＥ３の合
成のためのすリジナルとして使用した： Ｔ　２−２１　：　Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−
Ａｓｐ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌａｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−抛 遺伝子プローグＰＥ３の補足的なヌクレオチド配列の合
成は、ボカージュ（Ｓ、Ｌ、Ｂｅａｕｃａｇｅ）および
カールサーズ（Ｍ、Ｈ，ＣａｒｕｔｈｅｒｓＸ　ｌ　９
８１　）　、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌａｔｔｅｒ
ｓ２２、ｌ　８５９−１８６２によって開発されｊ；燐
アミシト方法により行なわれ、かつＤＮＡ−シンテタイ
ザー（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　　３８０　ＡＤ　Ｎ　Ａ　　５ｙ
ｎＬｈｅｓｉｚｅｒ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）
を用いて行なわれた。コドンの選択は、アスペルギルス
・ニゲルからのグルコアミラーゼ遺伝子の公知のコドン
の優位性（Ｅ、Ｂｏｅｌ他、（１９８４）　ＥＭＢＯＪ
、３．１０９７〜１１０２）により行なわれた。ヌクレ
オチド配列は、Ｍｅｔ−Ｔｒｐのアミノ酸範囲から導出
された。相応して、遺伝子プローブＰＥ３の補足的なヌ
クレオチド配列が記載される。

Ｐ　Ｅ　３　：　３　’−ＴＡＣＴＧＧ　ＣＴＧ　ＣＡ
Ｇ　ＴＡＣＴＴＧ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＣＣＧ　ＡＣＣＴ
ＧＧ　ＣＴＣＡＣＣ−５’ｍＲＮＡを調製するために、
菌株ＤＳＭ５５７５を振撮フラスコ中でＰＥ誘発する条
件下で栄養媒体としてのコムギ糠２％、微粉砕した１４
１ｆの切片２％および硫酸アンモニウム０．１％と一緒
に往復揺動装置上で２８°Ｃで９６時間培養した。得ら
れたミセルを濾別し、かつ直接に液体窒素中で低温凍結
させた。

ＲＮＡの調製をチルウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）他、（
１９７９）　、ＢｉｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙｌ　８．５２
９４〜５２９つの方法により実施した。全ＲＮＡからの
ポリ（Ａ）“−ＲＮＡの単離は、オリゴ（ｄＴ）−セル
ロース親和性クロマトグラフィーによって行なわれた（
Ｈ，ＡｖｉｓおよびＰ、Ｌｅｄｅｒ（１９７２）　、Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪＳＡ、　６
９．１４０８−１４１２）：　ｃ　ＤＮＡ合成をグブラ
ー（Ｕ、Ｇｕｂｌｅｒ）およびホフマン（Ｂ、Ｊ、Ｈｏ
ｒｆｍａｎｎＸｌ　９８３　）　Ｇｐ、　ｎ　ｅ　２５
．２６３〜２６９、の方法により変更した。第１鎖の合
成のためには、５０μＱの反応容量でポリ（Ａ）”ＲＮ
　Ａ　ｌ　Ｏｐｇ、トリス−ＨＣ１２５０ミ’）　％ル
、Ｍｇ（，４２５ミリモルｐＨ８，３、ＫＣＱ７５ミリ
モル、ＤＴＴ１０ミリモルｄＮＴＰ１．Ｏミリモル（ｄ
ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰそれぞれ１゜０
ミリモル）、オリゴ１０μｙ　　（ｄ　Ｔ　１２−１８
）およびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素２０００　Ｕ　（Ｇｉｂ
ｃｏ−ＢＲＬ　ＧｍｂＨ７５１４Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ
、ＢＲＤ）を使用した。これを３７℃で６０分間インキ
ュベートした。引続き、フェノール化し、かつエタノー
ル沈澱を実施した。

第２鎖のためには、ＲＮ　Ａ／Ｄ　Ｎ　Ａハイブリッド
に１００μαの反応容量で次の成分を添加した：ＲＮア
ーゼＨ２Ｕ　（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ　ＧｍｂＨ，７５１
４Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ、ＢＲＤ）、エシェリキア・コ
リＤＮＡ−リガーゼｌ　Ｕ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ
　Ｂｉｏｌａｂｓ　ＧｍｂＨ１６２３１Ｓｃｈｗａｌｂ
ａｃｈ、ＢＲＤ）、ＤＮＡ−ポリメラーゼＩ　　２５　
Ｕ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｇｍ
ｂｌｌ、　　６　８　０　０　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｂ
ＲＤ）、　　ト　リ　ス　−ＨＣ４２０ミ　リ　モ　ル
　、　　ｐＨ７，５、ＫＣｌ２１００　　ミ　リ　モ　
ル、Ｍ　ｇＣ１２２５ミ　リ　モル、　　Ｎ　　Ａ　　
Ｄ　　２　５　　ｕ　　Ｍ、（Ｎ　　Ｈ４）２Ｓ０４１
００ミリモル、ＤＴＴ　ｌ　０５９モル；Ｂ５Ａ３μｇ
およびｄＮＴＰ６０マイクロモル（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ
、ｄＧＴＰ％ｄＴＴＰそれぞれ６０マイクロモル）。こ
の配合物を１４°Ｃで１時間インキユベートシ、かつ引
続き２０°Ｃで１時間インキュベートした。

０．６−１．７ｋｂの大きさのｃＤＮＡ断片をバイオゲ
ル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ａ　５０　（１００〜２００メツシ
ユ）のカラムクロマトグラフィーによって単離し、この
場合Ｓｍａ　Ｉで線状化し、かつ脱ポスホリル化された
ブラズミドｐＵｃ１８を挿入し、引続き適当なエシェリ
キア・コリＤＨ５α細胞（Ｄ、Ｈａｎａｈａｎ（１９８
５）　：　Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ（偏）Ｄ　Ｎ　Ａクロ
ーニング：　Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃ
ｈ第１巻、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　０ｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇ
ｌａｎｄ、第１０９頁〜第１３５頁）に形質転換した。

この方法でアスペルギルス・ニゲルＤＳＭ５５７５の約
１００００個のクローンを包括するｃＤＮＡバンクを得
た。

ｃＤＮＡクローンをニトロセルロースフィルター上に移
し、かつ（３２）Ｐ標識された遺伝子プローブＰＥ３を
用いて５０℃で１８時間ノ）イブリッド形成した。この
ハイブリッド形成に続いて、フィルターをそれぞれ６８
℃で３０分間ＳＳＣ緩衝液で２回、５ＤＳＯ，１％を有
するＳＳＣ緩衝液で２回およびＳＳＣ緩衝液で０゜２回
洗浄した。引続き、−７０℃で４８時間オートラジオグ
ラフィーを実施した。

全部で３８個の強力にハイブリッド形成するエシェリキ
ア・コリークローンを確認し、そのプラズミドをさらに
特性決定するために高速調製法（Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏ
ｉｍおよびＪ、Ｄｏｌｙ（１９７９）、　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、７．１５１３〜１５２３）に
より単離した。プラズミドーＤＮＡをＥＣｏＲＩおよび
ＨｉｎｄＩ［［で加水分解し、断片を電気泳動法により
分離し、かつ引続きサザンーハイブリッド形成を遺伝子
プローブＰＥ３を用いて実施した。サザンープロット分
析法に基づき、０．６−１．２ｋｂのｃＤＮＡ挿入断片
を有する４個のクローンを選択し、かつ二重鎮状に配列
した。配列をサンガー（Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ）他（１９７
７）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ７４．５４６３〜５４６７の方法によりは母細胞配列
プライマーおよびＰＥ特異的プライマーの使用下に実施
した。４個のクローンの最も長いクローンの中、完全な
ヌクレオチド配列およびこれから誘導されるアミノ酸配
列は、第４表に記載されている。開いた読みラスターは
、９９３個のヌクレオチドを包含し、かつ３３１個のア
ミノ酸もしくは３１４個のアミノ酸のために蛋白質配列
から得られたＮ末端との一致によりコード化する。ブラ
ズミドは、ｐ８９８の表記を有する（第３図）。ｃＤＮ
Ａから誘導されたアミノ酸配列は、位置７２．２７５．
２８９．２９０および２９２で５個のアミノ酸にまで蛋
白質配列から定められたペプチド配列と一致する。残り
の３個のクローンは、６００〜１１００１’Ｐｉｌのヌ
クレオチドの長さを有し、かつ完全にクローンｐＢ９８
のＤＮＡ配列と一致する。

表現のためにアスペルギルスの場合に６要とされる隣接
範囲を有するファージ−クローンをＤＳＭ５５７５の染
色体ＤＮＡから得るために差出たり染色体ＤＮＡをＮ、
Ｊ、Ｈｙｎｅｓ他、（１９８３）　、Ｍｏ１．Ｃｅ１１
．Ｂｉｏｌ、３．　１４３０−１４３９の方法により単
離した。このｌ；めに、ミセル約１０ｇを液体窒素雰囲
気下で磨砕し、かっトリ　　ス　−　ＨＣｌ２１０　　
　ミ　　リ　　モ　ル　、　　　ｐＨ７，５、ＥＤＴＡ
１ミリモルおよび５ＤＳ３％中に入れた後にフェノール
で抽出した。ＤＮＡの後精製は、プロティナーゼにおよ
びＲＮアーゼＡを用いる処理によって行なわれた。得ら
れた高分子量ＤＮＡを部分的に５ａｕ３Ａで加水分解し
、かつサッカロースの密度勾配−遠心分離によって大き
さに応じて分別した。大きさ１８〜２２ｋｂのＤＮＡ分
子をＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　／　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ加水分解
し　ｌ：ＥＭＢＬＥ　　　３−ＤＮＡ　　　（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ　　　ＧｍｂＨ。

６９００　　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＢＲＤ）中で挿入
し、かつ試験管内に包装した。包装抽出液をＳｔｒａｔ
ａｇｅｎｅＧｍｂＨ，６９００Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、
ＢＲＤの上記製品によって販売されている。エシェリキ
ア・コリＰ　２３９２　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｇｍ
ｂＨ，６９００Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＢＲＤ）中で７
アージを増殖させるために、約７００００個の組換えク
ローンを包含するファージバンクを使用することができ
た。

プラークハイブリッド形成のための放射性プローブとし
て、ｃ　ＤＮＡ−クローンの１．２−に１）ｐ−ｐ：（
□ＲＩ／ＨｉｎｄＩＩ［−断片を使用した０ハイブリツ
ド形成は、６５℃で行なわれ：このフィルターをそのつ
と６８℃で３０分間ＳＳＣ緩衝液で２回、次いで５ＤＳ
Ｏ，１％を有するＳＳＣ緩衝液で２回、最後にＳＳＣ緩
衝液で０．１回洗浄した。ハイブリッド形成および数回
の個別化の後、１０個の陽性のクローンを確認すること
ができた。

クローン３５の７アージーＤＮＡを調製し、かつＨｉｎ
ｄｌＩ［と−緒に加水分解した。このＤＮＡは、サザン
ーハイブリッド形成の後にプラスの信号を約６．０ｋｂ
ｐで有した。Ｈｉｎｄ■断片をＬＭＰ−アガロースゲル
電気泳動を用いて単離し、ｐＵｃ１８に再クローン化し
、かつエシェリキア・コリＤＨ５ａに形質転換した。表
現に必要とされる隣接配列を有する完全な染色体ＰＥ遺
伝子を含有する生じるプラスミドは、ｐＰＥ８９と呼称
された。ｐＰＥ８９の制限酵素切断地図は、第４図に示
されている。ｐＰＥ８９からの構造ならびに隣接範囲を
有するＤＮＡ配列は、第５表に示されている。エシェリ
キア・コリｏＨ５ｐＰＥ８９をＤＳＭＪ：寄託番号５５
５４で寄託した。

アスペルギルス・ニゲルＤＳＭ５５７５．７スペルギル
ス・アワモリＤＳＭ５５７４およびアスペルギルス・オ
リザよりＳＭ５５７３に関する形質転換の試験報告。

邪魔板を有するｌＱのエーレンマイヤーフラスコ中のチ
ャペック−ドックス−完全媒体（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ
−Ｋｏｍｐｌｅｔｔ−Ｍｅｄｉｕｍ）　ｌ　００　ｍ　
Ｑをそれぞれの真菌類の菌株の胞子約１０７個を接種し
、毎分１２０回の転向の頻度を有する往復揺動装置上で
３７°Ｃで１６時間インキュベートした。ミセルを紙フ
ィルター上で取得し、かつ２回ＭＰ緩衝液（Ｍｇ５０４
１．２モル、ＮａＨ２ＰＯ４１０ミリモル、ｐＨ５，８
）で洗浄した。湿ったミセル約５ｇを邪魔板なしのｌｏ
Ｏｍ（２の工−レンマイヤーフラスコ中でＭＰ緩衝液１
５ｍ１２中に入れた。この懸濁液にノボジム２３４（［
Ｆ］Ｎｏｖｏｚｙｍ２３４　）溶液６００　μＱ（Ｍｐ
緩衝液６ｍＱ中１ｇ）およびβ−グルクロニダーゼ１０
０μＱ　（Ｓｉｇｍａ）を添加し、この配合物を５分間
氷冷却した。引続き、牛血清アルブミン溶液３００　ｐ
　Ｑ　（Ｍ　Ｐ緩衝液ｄｍＱ中０．２ｇ）を添加した。

ミセルの原形質体形成は、振盪板の直径１２．５ｍｍを
有する水浴円形振盪装置中で１０Ｑ　ｒｐｍで３０６０
で行なわれる。原形質体形成時間は、ＤＳＭ５５７５お
よびＤＳＭ５５７４の場合に約３．５〜４時間であり、
かつＤＳＭ５５７３の場合には、約１．５〜２時間であ
る。

原形質体形成の状態を鏡検法で制御した。原形質体形成
液をＭＰ緩衝液で含浸したガラスウール−フィルターを
介して遠心分離小管中に与えかつそれぞれ同量のυ−緩
衝液（ソルビトール　６　０　０　　ミ　　リ　　モ　
ル　、　　　ト　　リ　　ス　／ＨＣｌ２１　　０　　
０　　　ミ　　リモル、ｐＨ７，０）で覆ツタ。２０’
０おＪ：び２５００ｇで１０分間の遠心分離の後、原形
質体を２つの緩衝液の間の層から取り出した。次に得ら
れた懸濁液を２つの容量の５ＴｌｓｙＲ液（ソルビトー
ル１．２モル、トリス／ＨＣｆｆｌ　Ｏミリモル、ｐＨ
７，５）と混合し、かつ２０　’Ｏおよび１５００９で
１０分間遠心分離した。引続き、原形質体形成物をＳＴ
Ｃ緩衝液１０ｍｆｆ（ソルビトール１．２モル、トリス
／ＨＣ（１１０ミリモル、ｐ　Ｈ７，５、ＣａＣｄ２１
０ミリモル）中に入れ、かつ再び２０°Ｃおよび１５０
０ｇで遠心分離した。この方法を繰返し、引続き、沈降
物をＳＴＣ緩衝液中に再懸濁させた。

プラスミドｐＰＥ８９は形質転換すべきアスペルギルス
菌株に対して選択マーカーを有しないので、共形質転換
の方法が使用された。このタメ、アスペルギルス・ニゲ
ルＤＳＭ５５７５およびアスペルギルス・アワモリＤＳ
Ｍ５５７４のためには、この菌株において表現可能なヒ
グロマイシン耐性遺伝子（ヒグロマイシンーホスホ転移
酵素）を含有するプラスミドｐＡＮ７１　　（Ｐｕｎｔ
他、Ｇｅｎｅ５６．１１７〜１２４）を使用した。共形
質転換配合物１つあたりそれぞれｐＡＮ７−１２０μ９
および同量のｐＰＥ８９を使用した。アスペルギルス・
オリザより５Ｍ５５７３はヒグロマイシンＢに対して天
然の耐性を有するので、この菌株は、プラスミドｐ３Ｓ
　Ｒ２（Ｋｅｌｌｙｊ５よびＨｙｎｅｓ、ＥＭＢＯＪｏ
ｕｒｎａ１４．４７５〜４７９）と−緒に共形質転換さ
れ、形質転換細胞の１つの選択は、アセトアミダーゼ遺
伝子の表現による１つの窒素源としてのアセトアミドを
有する最小媒体に対して成長の優先を可能にする。共形
質転換配合物の場合には、それぞれｐ３ＳＲ２４０μ９
および同量のｐＰＥ８９を使用した。

形質転換に使用されたＤＮＡをＴＥ緩衝液５０μＣの容
量（トリス／）（Ｃｆｆｌ　Ｏミリモル、ｐＨ７，５、
ＥＤＴＡＩミリモル）中に入れた。

対照配合物は、それぞれＤＮＡなしのＴＥ緩衝液５０μ
Ｑを含有するかまたは選択プラスミドｐＡＮ７−１また
はｐ３ＳＲ２を含有していたＤＮＡ溶液またはＤＮＡな
しのＴＥ緩衝液２０μＱを原形質体感濁液３００μＱに
与え、がっ０℃で１０分間インキュベートした。Ｄ　Ｎ
　Ａ溶液またはＤＮＡなしのＴＥ溶液２５μＱの再度の
添加およびＰＥＧ溶液４００　ｉｔ　Ｑ　（Ｓｅｒｖａ
のポリエチレングリコール４０００　６０％、トリス／
ＨＣｌ２１０ミリモル、ｐＨ７，５、ＣａＣｌ２２）の
添加の後、２２℃で５分間のインキュベージ３ンを行な
った。　引続き、ＰＥＧ溶液６００μａを添加し、配合
物を２２°Ｃでさらに２０分間インキュベートした。

ヒグロマイシンＢの選択の場合には、配合物をチャペッ
ク−ドックス−寒天１００ｍ（＋（オキソイド寒天Ｎｏ
、１　１％を有するオキソイド）中に、４５℃で液状を
保持する浸透安定剤どしてのサッカａ−２１モルと一緒
に与え、がっそれぞれｌｏｍＱの分量でベトリ皿中に分
配した。３７“Ｃで１６時間のインキュベーションの後
、ヒグロマイシンＢ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の添加
は同量ではあるがサッカロースなしの上層１０ｍＱ中で
２００μｇ／ｍＱの濃度で行なわれた。

３７°Ｃで後形成してから２〜４日後に、形質転換細胞
は、明らかに寒天層中での背後の成長が際立ちかつ対照
配合物の場合には存在しなかった、寒天表面から突出す
るカビのコロニーとして確認することができ、かつ単離
することができた。引続き、形質転換細胞を２回ツァペ
クードンクス（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ）寒天上の１つの
カビ通路上でヒグロマイシン８５０μｇ／ｍＱを用いて
精製した。出発菌株ＤＳＭ５５７５およびＤＳＭ５５７
４は、この媒体上で成長しなかった。

コノ形質転換速度は、ＤＳＭ５５７５のｐＡＮ７−１１
μρ当り形質転換細胞約１０個でありかつＤ　Ｓ　Ｍ　
５５７４のｐＡＮ７−１　１μｇ当り形質転換細胞約２
０個であった。

アセトアミダーゼの選択の場合には、形質転換配合物を
ＳＴＣ緩衝液で１０ｍ（＋に満だ、し、かつ２０℃およ
びｌ　５００９で１０分間遠心分離した。沈積物をＳＴ
Ｃ緩衝緩衝液１中Ｑ中懸濁させ、引続き浸透安定剤とし
てのサッカロース１モルを有するアセトアミド最少寒天
９ｍ＋２と、４５℃で混合した。この寒天を、背後での
成長を阻止するためにサッカロース１モルおよびＣ５Ｃ
（２１５ミリモルを有するアセトアミド最少寒天板上に
２ｍＱの分量で分配した。６〜１２日後に、形質転換細
胞を、明らかに背後の成長が際立つ強力に成長するカビ
のコロニーとして確認しかつ単離することができる。こ
の形質転換細胞をＣ５Ｃ（＋およびサッカロースなしの
アセトアミド−最少寒天上の１つのカビ通路上で２回精
製した。アセトアミド−最少栄養培地の組成は、ケリー
（Ｋｅｌｌｙ）およびハインズ（Ｈｙｎｅｓ）による場
合（上記参照）に相当する。アスペルギルス・オリザよ
り３Ｍ５５７３の形質転換速度は、ｐ３ＳＲ２１μｇ嘉
り形質転換速度約２．５＠であった。

形質転換試験および対照配合物からそのつど５０個の形
質転換細胞を振盪フラスコ中でＰＥ生産性について試験
した。この場合には、ミセル培養の場合と同じ条件をｍ
ＲＮＡ単離（上記参照）のために選択した。第６表には
、それぞれ最適の形質転換細胞１ｍ４当りの単位で培養
上澄み液の場合に見い出されるＰＥ活性度が記載されて
いる。出発菌株がＰＥ生産性について少なくとも２倍卓
越しているクローン数で測定された共形質転換の頻度が
全部で３つの試験の場合に〉３０％であるので、最適の
クローンは、少なくとも１５個の形質転換細胞から選択
された。対照の配合物の場合には、形質転換細胞は出発
菌株の生産性を凌駕していないので、全部で５０の菌株
には記載した値が当てはまる。

振盪フラスコの場合に試験毎に記載した変動に基づいて
、値の範囲は記載されている。

それに応じて、最高の結果をアスペルギルス；ゲルＤＳ
Ｍ　　５５７５（形質転換細胞Ｎ。

、９）の場合に５．５〜６．５ＰＥ単位／ｍＱで得た。

アスペルギルス・アワモリＤＳＭ５５７４の場合（形質
転換細胞Ｎｏ、ｉ７）には、２．５〜３．ＯＰＥ単位／
ｒｎ（２ｆ、０．８〜１．ＯＰＥ単位／　ｍ　Ｑを有す
るアスペルギルス・オリザより５Ｍ５５７３（形質転換
細胞Ｎｏ、４２）の場合よりも良好な結果が得られた。

次に、本発明を表につきさらに詳説する。

第４表には、アスペルギルス・ニゲルがらのＰＥ−ｃＤ
ＮＡのヌクレオチド配列およびこれから導出されたアミ
ノ酸配列が１つの暗色コードで示されている。開いた読
みラスターの出発コドンおよび停止コドンならびに天然
の蛋白質のＮ末端（アミノ酸１〜２６）およびＰＷ３遺
伝子プローブが示されている。

第５表には、ブラズミドｐＰＥ８９からの染色体ＰＥ遺
伝子のヌクレオチド配列およびこれから導出されたアミ
ノ酸配列が１つの暗色コードで示されている。イントロ
ン１〜６ならびに停止コドンが示されている。

第６表には、培地の上澄み液中で見い出されたＰＥ活性
度がそれぞれ′ｌＩｋ適の形質転換細胞１ｍＱ当りの単
位で示されている。

微生物ＤＳＭ５５５３（エシェリキア・コリＤＨ５αｐ
ＰＧ６７）、ＤＳＭ５５５４　（ニジｘ　ｊｌ　キ７　
・’：２すＤＨ５αｐＰＥ８９）、ＤＳＭ５５７３　（
アスペルギルス・オリザエＲＨ３０＋　１）　、ＤＳＭ
５５７４　（アスペルギルス・アワモリＲＨ３６３０’
）およびＤＳＭ５５７５　（アスペルギルス・ニゲルＲ
Ｈ５３４４）をブダペスト条約の規定に基づき１９８９
年９月２９日のＤ　Ｓ　Ｍ　（Ｄｅｕｔ、ｓｃｈｅＳａ
ｍｍｌｕｎｇｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｒ＋ｉｓｍｅ
ｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨ，Ｍ
ａｓｃｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ　ｌｂ、Ｄ−３３００Ｂｒ
ａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託した。

第４表：アスペルギルス・ニゲルからのペクチンエステ
ラーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびこれから誘導
されたアミノ酸配列。開いた読みラスターの出発コドン
および停止コドンは中断されている。

第５表：アスペルギルス・ニゲルからの染色体ペクチン
エステラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列およびこれから
誘導されｔ；アミノ酸配列第６表 ＰＨ単位／ｍＱ ｌ。

アスペルギルス・ニゲル ＤＳＭ５５７５　（出発菌株）　　　　　　　　　　　
約０．１〜０，２ＤＳＭ５５７５ｐＡＮ７−１　（形質
転換細胞１５０）約０，１〜０．２ＤＳＭ５５７５ｐＡ
Ｎ７−１／ｐＰＥ８９（形質転換細胞Ｎｏ、９）　　　
　　　　　　　　　　　約５．５〜６．５２゜ アスペルギルス・アワモリ ＤＳＭ５５７４　（出発菌株） ＤＳＭ５５７４ｐＡＮ７−１　（形質転換細胞ｌ−５０
）ＤＳＭ５５７１−５０）ＤＳ／ｐＰＥ８９（形質転換
細胞Ｎｏ、１７） ＜０．１ ＜０．１ 約２．５〜３．０ ３゜ アスペルギルス・オリザよ り５Ｍ５５７３（出発菌株） ＤＳＭ５５７３ｐ３ＳＲ２（形質転換細胞１−５０）Ｄ
ＳＭ５５１−５０）ＤＳ／ｐＰＥ８９（形質転換細胞Ｎ
ｏ、４２） ＜０．１ ＜ｏ、ｉ 約０．８〜１．０

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＰＧ−ｃＤＮＡの制限酵素切断地図および配
列図を示し、この場合矢印は、配列方向を表わし、かつ
配列は、母細胞プライマーおよびＰＧ特異的ブンイマー
を用いて実施され第２図は、ブラズミドｐＰＧ６７中に
隣接範囲を有する染色体ＰＧ遺伝子の制限酵素切断地図
を示し； 第３ｒ１！ｉは、ペクチンエステラーゼｃ　−Ｄ　Ｎ　
Ａの制限酵素切断地図および配列図を示し、この場合配
列は、母細胞プライマーおよびＰＥ特異的プライマーを
用いて実施され； 第４図は、グラズミドｐＰＥ８９中に隣接範囲を有する
染色体ＰＥ遺伝子の制限酵素切断地図を示し、この場合
矢印は、二重鎖に配列された範囲および相応して配列方
向を表わし、かつ配列は、母細胞プライマーおよびＰＥ
特異的プライマーを用いて実施された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヌクレオチド配列がポリガラクツロニダーゼまたは
   ペクチネスチラーゼのコードを有するアスペルギルス・
   ニゲルからのデオキシリボ核酸。 ２、アスペルギルス・ニゲルからのポリガラクツロニダ
   ーゼをコード化し、かつ次のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 またはそれから誘導された、比較可能な性質を有するポ
   リガラクツロニダーゼをコード化するヌクレオチド配列
   を有する、請求項１記載のデオキシリボ核酸。 ３、アスペルギルスニゲルからのペクチネスチラーゼを
   コード化し、次のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 またはそれから誘導された、比較可能な性質を有するペ
   クチネスチラーゼをコード化するヌクレオチド配列を有
   する、請求項１記載のデオキシリボ核酸。 ４、アスペルギルス・ニゲルＤＳＭ５５７５に由来する
   、請求項１、２または３に記載のデオキシリボ核酸。 ５、アスペルギルス・ニゲルＤＳＭ５５７５からのポリ
   ガラクツロニダーゼまたは比較可能な性質を有するポリ
   ガラクツロニダーゼをコード化する、請求項２記載のデ
   オキシリボ核酸。 ６、アスペルギルス・ニゲルＤＳＭ５５７５からのペク
   チネステラーゼまたは比較可能な性質を有するペクチネ
   ステラーゼをコード化する、請求項３記載のデオキシリ
   ボ核酸。 ７、解離したポリガラクツロニダーゼをコード化する、
   請求項１、２、４または５のいずれか１項に記載のデオ
   キシリボ核酸。 ８、アスペルギルスに由来するポリガラクツロニダーゼ
   遺伝子またはペクチネステラーゼ遺伝子で形質転換され
   ている組換え宿主微生物を、ポリガラクツロニダーゼ遺
   伝子もしくはペクチネステラーゼ遺伝子ならびに表現の
   ためにアスペルギルス中で必要とされる隣接デオキシリ
   ボヌクレオチド配列を含有する組換えベクターをクーロ
   ン化し、かつ組換えベクターを宿主微生物に形質転換す
   ることによって製造する方法において、ポリガラクツロ
   ニダーゼ遺伝子またはペクチネステラーゼ遺伝子として
   アスペルギルス・ニゲルからのデオキシリボ核酸を使用
   し、宿主微生物としてアスペルギルス・ニゲルまたはア
   スペルギルス・アワモリの糸状菌を使用することを特徴
   とする、組換え宿主微生物の製造法。 ９、次の工程： （ａ）アスペルギルス・ニゲルをポリガラクツロニダー
   ゼまたはペクチネステラーゼの誘導条件下に培養し、 （ｂ）ポリガラクツロニダーゼまたはペクチネステラー
   ゼを精製し、蛋白質を部分的に配列し、 （ｃ）メッセンジャーリボ核酸を（ａ）で培養した細胞
   から単離し、 （ｄ）コピー−デオキシリボ核酸バンクを（ｃ）からの
   リボ核酸から用意し、 （ｅ）（ｂ）からの蛋白質配列から誘導されたオリゴデ
   オキシリボヌクレオチドプローブを製造し、 （ｆ）ポリガラクツロニダーゼ遺伝子またはペクチネス
   テラーゼ遺伝子を含有するコピーデオキシリボ核酸をハ
   イブリッド形成プローブとしての（ｅ）からのオリゴデ
   オキシリボヌクレオチドプローブの使用下にクローン化
   し、（ｇ）（ａ）で使用したアスペルギルス菌株の染色
   体デオキシリボ核酸を含有する遺伝子バンクを用意し、 （ｈ）染色体ポリガラクツロニダーゼ遺伝子またはペク
   チネステラーゼ遺伝子ならびに表現のためにアスペルギ
   ルスで必要とされる隣接デオキシリボヌクレオチド配列
   を含有する（ｇ）による遺伝子バンクからの組換えベク
   ターを、ハイブリッド形成プローブとしての（ｆ）から
   のコピー−デオキシリボ核酸の使用下にクローン化し、 （ｉ）ポリガラクツロニダーゼ遺伝子またはペクチネス
   テラーゼ遺伝子ならびに表現のためにアスペルギルスで
   必要とされる隣接デオキシリボヌクレオチド配列を１つ
   のプラスミドに再クローン化し、 （ｋ）アスペルギルス・ニゲル宿主微生物またはアスペ
   ルギルス・アワモリ宿主微生物を（ｉ）による組換えベ
   クターを用いて共形質転換し、かつ宿主微生物の場合に
   表現可能な選択マーカーを含有する第２のプラスミドを
   共形質転換し （ｌ）ポリガラクツロニダーゼまたはペクチネステラー
   ゼの生産性が（ａ）で使用したアスペルギルス・ニゲル
   の場合よりも高い、（ｋ）からの共形質転換された菌株
   を選択することを実施する、請求項８記載の方法。 １０、デオキシリボ核酸がアスペルギルス・ニゲルから
   のポリガラクツロニダーゼをコード化しかつ次のヌクレ
   オチド配列： 【遺伝子配列があります】 またはそれから誘導された、比較可能な性質を有するポ
   リガラクツロニダーゼをコード化するヌクレオチド配列
   を有する、請求項８または９に記載の方法。 １１、デオキシリボ核酸がアスペルギルス・ニゲルから
   のペクチネステラーゼをコード化しかつ次のヌクレオチ
   ド配列： 【遺伝子配列があります】 またはそれから誘導された、比較可能な性質を有するペ
   クチネステラーゼをコード化するヌクレオチド配列を有
   する、請求項８または９に記載の方法。 １２、デオキシリボ核酸がアスペルギルス・ニゲルＤＳ
   Ｍ５５７５に由来する、請求項８ 、９、１０または１１のいずれか１項に記載の方法。 １３、デオキシリボ核酸がアスペルギルス・ニゲルＤＳ
   Ｍ５５７５からのポリガラクツロニ ダーゼをコード化する、請求項１２記載の方法。 １４、デオキシリボ核酸がアスペルギルス・ニゲルＤＳ
   Ｍ５５７５からのペクチネステラー ゼをコード化する、請求項１２記載の方法。 １５、宿主微生物として糸状菌の菌株アスペルギルス・
   ニゲルＤＳＭ５５７５またはアスペ ルギルス・アワモリ５５７４を使用する、 請求項８から１４までのいずれか１項に記載の方法。 １６、ペクチナーゼ遺伝子を数回宿主微生物のゲノム中
   に挿入する、請求項８から１５までのいずれか１項に記
   載の方法。 １７、解離したポリガラクツロニダーゼをコード化する
   デオキシリボ核酸を使用する、請求項８、９、１０、１
   ２、１３、１５または１６のいずれか１項に記載の方法
   。 １８、ポリガラクツロニダーゼまたはペクチネステラー
   ゼを製造する方法において、請求項８から１７までのい
   ずれか１項の記載により得られた組換え宿主微生物を適
   当な栄養媒体中で増殖させ、ポリガラクツロニダーゼま
   たはペクチネステラーゼを自体公知の方法で単離するこ
   とを特徴とする、ポリガラクツロニダーゼまたはペクチ
   ネステラーゼの製造法。 １９、解離したポリガラクツロニダーゼを得る、請求項
   １８記載の方法。 ２０、次のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 または 【遺伝子配列があります】 を有するアスペルギルスの場合のポリペプチドを表現す
   るのに適当な機能的デオキシリボ核酸配列。