JPH09275987A - コードされたアルカリリパーゼ遺伝子のdna断片、及びこの酵素出現をコントロールするdna断片 - Google Patents

コードされたアルカリリパーゼ遺伝子のdna断片、及びこの酵素出現をコントロールするdna断片

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JPH09275987A
JPH09275987A JP8119638A JP11963896A JPH09275987A JP H09275987 A JPH09275987 A JP H09275987A JP 8119638 A JP8119638 A JP 8119638A JP 11963896 A JP11963896 A JP 11963896A JP H09275987 A JPH09275987 A JP H09275987A
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dna fragment
alkaline lipase
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gene
dna
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JP8119638A
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Junfu Rin
林順富
Kenmei Kyu
邱建銘
Kosho So
荘光祥
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DAIDO KOFUN YUUGENKOUSHI
Tatung Co Ltd
Original Assignee
DAIDO KOFUN YUUGENKOUSHI
Tatung Co Ltd
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/16Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 コードされたアルカリリパーゼ遺伝子のDN
A断片、及びこの酵素出現をコントロールするDNA断
片を提供する。 【解決手段】 疑似性単細胞菌属F−111(Pseu
domonas Pseudoalcaligenes
F−111)のコードされたアルカリリパーゼ遺伝子
のDNA断片である。それは5´ターミナルコントロー
ル区、分泌信号配列を含むコードされたアルカリリパー
ゼ遺伝子DNA断片、及びこの酵素の出現をコントロー
ルするDNA断片である。またこのDNA断片の使用方
法をも示している。このDNA断片を用い、大腸菌中に
このアルカリリパーゼを出現させる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明はアルカリリパーゼの
製造方法に関するものである。この方法を用いた新型微
生物、及びこの方法を用いて製造された新型微生物のD
NA断片である。
【0002】
【従来の技術】リパーゼは一般生物体の重要な代謝酵素
で、脂肪を加水分解し、遊離脂肪酸を生産することがで
きる。ここ数年、リパーゼは脂肪を分解できるばかりで
なく、多くの多様な反応を行うことが次々と発見されて
いる。リパーゼは有機溶剤中ではさらに安定し、驚くべ
きは100℃以下で反応することができ、しかも多様な
反応を行うことができる。この多くの革命的な研究の発
展は製薬、油脂、香料、化学、農薬、食品等工業会の注
目を広く集めている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】アルカリリパーゼを住
宅用洗剤中に添加しようという試みは、また一つの応用
の方向である。住宅用洗剤中への酵素の添加について
は、早くからアルカリプロテアーゼの添加が行われてお
り、広く流行している。数年前セルラーゼを添加した商
品が衣料用洗剤革命を引き起こした。またアルカリリパ
ーゼ酵素を利用し衣服上の油汚れを除去し洗浄力を高め
た。これは、また一つの工業用途である。[Satsu
ki,T.,et al(1990)Bio.Indu
stry,7:501]
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明使用の菌株は疑似
性単細胞菌属F−111(PseudomonasPs
eudoalc−aligenes F−111)であ
る。その寄託番号はCCRC 910008(中華民国
食品工業発展研究所、微生物寄託センター)である。本
発明はコードされたアルカリリパーゼ遺伝子の塩基配
列、及びコードされたアルカリリパーゼ遺伝子の出現を
コントロールする塩基配列を含む疑似性単細胞菌属F−
111染色体のDNA断片の採取に関するものである。
本発明は、アルカリリパーゼを製造するために上述のD
NA断片を利用する方法に関するものである。
【0005】(a)疑似性単細胞菌属F−111から染
色体DNAを分離する。 (b)制限酵素Sau 3Aを用いて疑似性単細胞菌属
F−111の染色体DNAを部分消化し、コードされた
アルカリリパーゼ遺伝子配列、及びコードされたアルカ
リリパーゼ遺伝子出現をコントロールする塩基配列のD
NA断片を得る。 (c)担体を得るため、大腸菌体中に出現するプラスミ
ド(例えばpGEM−3Zf(+1))に当該DNA断
片を移植する。 (d)当該出現した形質転換担体を大腸菌中に移植す
る。 (e)当該形質転換大腸菌を培養する。 (f)アルカリリパーゼを分離する。
【0006】
【発明の実施の形態】本発明は疑似性単細胞菌属F−1
11染色体のDNA断片からコードされたアルカリリパ
ーゼ遺伝子の塩基配列、及びコードされたアルカリリパ
ーゼ遺伝子出現をコントロールする塩基配列を得るもの
である。当該DNA断片の塩基配列は図1の通りであ
る。それが含むコードされたアルカリリパーゼ遺伝子の
塩基配列(LIP Aと命名)は図4乃至図5の通りで
あり、コードされたアルカリリパーゼ遺伝子出現をコン
トロールする塩基配列(LIP Bと命名)は図6乃至
図7の通りである。
【0007】(1)遺伝子クローニングの方法 本遺伝子クローニング実験の方法については、図9を参
照されたし。Pseudomonas Pseudoa
lcaligenes F−111の染色体DNAをS
au 3Aを用いて部分切断し、さらに大腸菌宿主中に
於いてpGEM−3Zf(+1)プラスミドを用いて散
弾式クローニングを行う。トリブチンリン(tribu
tyrin)寒天培地に於いて培養し、コードされたア
ルカリリパーゼ遺伝子の塩基配列を出現させることがで
きる形質転換株を選抜する
【0008】(2)遺伝子のクローニング このDNAの挿入に適したプラスミドは、大腸菌から得
られるpGEM−3Zf(+1)[Promega,
U.S.A.]、pBR322[Gene,2:95
(1977)]、pBR325[Gene,4:121
(1978)]、及びpUC13[Gene,19:2
59,(1982)]である。また宿主内に於いて複
製、及び維持可能なその他のあらゆるプラスミドも使用
可能である。このDNAをプラスミドに挿入する方法
は、例えばMiniatis,T.etal.,Mol
ecular Cloning,Cold Sprin
g Harbor Laboratory,第239ペ
ージ(1982)で述べられている。大腸菌を使用する
実例は、例えば大腸菌DH10B[Lorow,D.,
and Jessee,J.,(1990)FOCU
S,12:19]、HB101[J.Mol.Bio
l.,41,459(1969)]、K12,DH1
[Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.
A.,60,160(1968)]である。プラスミド
を用い宿主に形質転換を起こさせる方法は、例えばMi
niatis,T.et al.,Molecular
Cloning,Cold Spring Harb
or Laboratory、第239ページ(198
2)で述べられている塩化カルシウム法、或いは塩化カ
ルシウム/塩化ルビジウムを用いる方法がある。上述の
方法によりコードされたアルカリリパーゼDNAのPs
eudomonas Pseudoalcaligen
es F−111の遺伝子ライブラリーが得られる。必
要、或いは適当であれば、このクローニングを経たコー
ドされたアルカリリパーゼDNAは、引き続きpBR3
22、pUC12、pUC13、pUC18、pUC1
9のプラスミド内でクローニングを行うことができる。
【0009】(3)コードされたアルカリリパーゼ遺伝
子のスクリーニング 酵素活性を使用し、アルカリリパーゼ遺伝子の出現を直
接観察する。tributyrinを含む寒天培地(1
%tributyrin、1%Bacto trypt
one、0.5% イースト抽出物、0.5%塩化ナト
リウム、0.005% ampicillinをブレン
ダーで攪拌し均一に乳化させた)中に入れ、透明リング
を作る菌株得た。或いは疑似性単細胞菌属F−111
(Pseudomonas Pseudoalcali
genes F−111)が生み出すアルカリリパーゼ
のアミノ酸配列に基づき、化学合成したオリゴヌクレオ
タイド(oligonucleotide)を用いてコ
ロニー混成法を試みた。
【0010】(4)pCKH4プラスミド及びそのサブ
クローン体のアルカリリパーゼ遺伝子に対する出現 コードされたアルカリリパーゼ遺伝子のpCKH4プラ
スミドに於ける位置を知るため、脱離テスト、及び共形
質転換作用(cotransformation)を用
い、表1が示すように、このコードされたアルカリリパ
ーゼ遺伝子の出現にはもう一つのコントロールDNA断
片の協力が必要なことがわかった。この種の反相コント
ロール現象(trans−acting)は、多くのP
seudomonas属生産のアルカリリパーゼ[Ja
ne Gilbert,E.,(1993)Enzym
e Micrib.Technol.,15:634]
中に存在する。このコードされたアルカリリパーゼ遺伝
子の出現をコントロールする塩基配列は、およそ1.5
から2.9Kbpの間に位置する。
【0011】
【表1】 B:BamHI,C:CLaI,E:EcoRI,ER:EcoRV,H:HindIV,P:PstI, S:SphI,Sa:SacI,X:XbaI.
【0012】(5)コードされたアルカリリパーゼの塩
基配列の確定 dideoxy seguencing法[Sange
r,F.,Nicklen,S.,and Couls
on,A.R.,1979,Proc.Natl.Ac
ad.ScI.,74:5463.]により得られたD
NAは2910塩基ペア配列を示している。そしてこの
塩基配列は、公知のアルカリリパーゼのアミノ酸配列と
比較したところ、存在しているコードされたアルカリリ
パーゼ遺伝子は、完全にORF(open readi
ng frame)配列で、アミノ酸を組成する338
個のタンパク質に転換できるLip A(413から1
426bps)であることが実証された。タンパク質の
Nターミナル配列と控除分泌信号配列を比較したとこ
ろ、完全に成熟したアルカリリパーゼ配列はF−L−F
−G−S−Sで始まる290個のアミノ酸配列であるこ
とがわかった。またその計算された分子量は、30,8
26 Daltonで、実際にSDS−PAGEにより
測定した酵素分子量32,000 Daltonと近似
している。下記に示す実施例1で得られるコードされた
アルカリリパーゼのDNAは、本発明コードされたアル
カリリパーゼのDNA断片の典型的実例である。その制
限酵素による切断図は図8の通りである。
【0013】(6)コードされたアルカリリパーゼ遺伝
子出現をコントロールする塩基配列の確定 実施例3の形質転換株の酵素活性に対する結果により、
このコードされたアルカリリパーゼ遺伝子が出現するに
はもう一つのDNA断片の協力が必要であることがわか
った。実施例3(表1)によれば、このコードされたア
ルカリリパーゼ遺伝子の配列は1.52.9Kbpの間
である。またアルカリリパーゼ出現をコントロールする
遺伝子の塩基配列はLIP B(1469−2491
bp)で、340個のアミノ酸組成のタンパク質に転換
することができる。
【0014】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説
明する。 [実施例1] 疑似単細胞菌属F−111(Pseudomonas
Pseudoalcaligenes F−111)染
色体DNAの分離 Pseudomonas Pseudoalcalig
enesをLB液体培養地 400mlの11三角瓶中
に於いて37℃、24時間振とう培養し、次いで遠心分
離(4℃、6000rpm、30分)を行い細胞の沈殿
を得た。菌体を抽出し緩衝液( 36ml、TE、pH
8)に懸濁し、細胞を分散させた後、最終濃度1mg/
mlのタンパク溶菌酵素(prpteidin)に入れ
37℃で、ゆっくりと30分振とうした。その後、濃度
1%のSDSに入れ60℃で30分軽く回転混合し、同
体積のフェノール、及びクロロフォルム(体積比1:
1)に入れ60分ゆっくりと回転混合し、20分遠心分
離(9000rpm)し、水溶のDNAを抽出した。3
回この方法を繰り返した後、体積1/10の3M酢酸カ
リウム、及び体積2倍の冷却エタノールをDNAに加え
DNAを沈殿させた。次に遠心分離により沈殿したDN
Aを収集し、さらに70%のエタノールで洗浄し、真空
乾燥後、2mlの蒸留水に加えDNAを溶解させ、−2
0℃で保存した。
【0015】[実施例2] コードされたアルカリリパーゼ遺伝子のクローニング (A)遺伝子ライブラリーの整備 (a)制限リパーゼSau3AIを用いてPseudo
monas Pseudoalcaligenes F
−111の染色体DNAを部分消化する 実施例1で分離したPseudomonas Pseu
doalcaligenesF−111の染色体DNA
を33mM Tris−acetateを含む緩衝液
(pH7.9)、10mM酢酸マグネシウム、66mM
酢酸カリウム、0.5mM dithiothreit
ol、10ug染色体DNA、及び1.2単位活性のS
au3Aを総体積200ulの反応システム内で37℃
で20分反応させる。続いてフェノールクロロフォルム
処理を行い、反応混合物からタンパク質を除去し、体積
2倍のエタノールを加え消化されたDNAを回収した。
【0016】(b)制限リパーゼBamHIを用いてp
GEM−3Zf(+)担体DNAを消化する pGEM−3Zf(+)担体DNA(Promega
U.S.A)とクロロフォルム10mM Tris−HC
I緩衝液(pH8.0)、5mM塩化マグネシウム、1
00mM塩化ナトリウム、1mMジチオトレイトル、1
ug染色体DNA、活性BamHIを体積20ulの反
応システム内に於いて37℃で2時間反応させ、フェノ
ールクロロフォルムにより処理し、タンパク質を除去し
た。続いて、体積2倍のエタノールを加え消化されたD
NAを回収した。
【0017】(c)連接及び形質転換 上述(a)により得られた染色体DNA500ngと、
上述(b)により得られたpGEM−3Zf(+)担体
DNA100ngを合わせ、66mMTris−HCI
を含む緩衝液(pH7.9)、5mM塩化マグネシウ
ム、1mM ジチオトレイトルdithiothrei
tol、1mM ATP、及び1単位の活性T4 DN
A ligaseを総体積20ulの反応システム内に
於いて4℃で1夜混合反応させた。続いて、Mande
l等の塩化カルシウムによる[Mandel,M.,a
nd Higa,A. 1970,J. Miol.,
53:159]処理後、DH 10 B大腸菌中に入
れ、X−gal及びampicillinを含むLB培
地に塗布し、白色菌斑の単一菌株を得た。最終的には約
200株の形質転換株を得た。
【0018】(B)コードされたアルカリリパーゼ遺伝
子のスクリーニング 上述の2000株余りの形質転換株をようじを用いてt
ributyrinを含む寒天培地(1%tribut
yrin、1%Bacto tryptone、0.5
% イースト抽出物、0.5%塩化ナトリウム、0.0
05% ampicillinをブレンダーで攪拌し均
一に乳化させた)中に移植しスクリーニングを行い、透
明リングを作る菌株得た。10株余りの活性を具えた形
質転換株を得た後、純化、クローニングを経て、その内
の一株にTIT−7形質転換株と命名した。図10のよ
うに、それはtributyrinスクリーニング寒天
培地上ではっきりした透明のリングを見せており、コー
ドされたアルカリリパーゼの遺伝子を含んでいる。
【0019】Birnboim等[Birnboim,
H.C.,and Doly,J.,1979,Nuc
lei AcidRes., 7:715.]による方
法を用い、TIT−7形質転換株のプラスミドDNAを
採取した。その結果、採取されたプラスミドDNAの寒
天培地上に出現したサイズは7.2 Kbpで、pGE
M−3Zf(+)担体DNAのサイズ3.2 Kbpを
除き、その内pGEM−3Zf(+)担体の染色体DN
Aに挿入されたサイズは4.0 Kbpで、そのサイズ
により、TIT−7形質転換株から得られたプラスミド
をpCKH4と命名した。
【0020】[実施例3] 形質転換株出現のコントロール このヌクレオタイド(nuncleotide)配列を
見極めるために、pCKH4プラスミドの配列表に基づ
き各断片のサブクローニングを行い、異なる制限の元で
リパーゼを処理後、10種の異なるサブクローン株を得
た。tributyrin培地に於ける生長を観察し酵
素活性を比較した所、結果は図1乃至図3のようであっ
た。pCKH−EE3.9プラスミドが活性を示す他
は、他のプラスミドには活性は見られなかった。その原
因は、この遺伝子が活性を示すには他のタンパク質の手
助けが必要であるためと推測される。他のサブクローン
プラスミドを混合しHB 10D宿主に加え共形質転換
を進めた時の、pCKH−PE2.7、及びpCKH−
XC1.7等のプラスミドの共形質転換の結果により、
このコントロール遺伝子は1.3Kbpの後に位置して
いるらしいことが示された。さらにpCKH−XC1.
7、及びpCKH−CSa2.3プラスミドの共形質転
換の結果により、このコントロール遺伝子は1.7Kb
pの前に位置しているらしいことが示された。さらにp
CKH−XC1.7、及びpCKH−HER2.5プラ
スミドの共形質転換の結果により、このコントロール遺
伝子は1.5Kbpの後に位置しているらしいことが示
された。さらにpCKH−SS2.2、及びpCKH−
XC1.7プラスミドの共形質転換の結果により、この
コントロール遺伝子は2.9Kbpの後に位置している
らしいことが示された。
【0021】[実施例4] コードされたアルカリリパーゼ遺伝子の塩基配列の確定 pCKH4のサブクローン株はdideoxy seg
uencing法[Sanger,F.,Nickle
n,S.,and Coulson,A.R.,197
9,Proc.Natl. Acad. Sci.,7
4:5463.]により、DNAを抽出しDNA挿入部
分の配列を確定した。全長4000個のヌクレオタイド
(nuncleotide)中、2個のORFがそれぞ
れ413と1429bp(LIP A)間、及び146
9と2491bp(LIP B)間に位置するのを含む
2910個のヌクレオタイド(nuncleotid
e)の配列が確定された。さらにこの2個のORFの距
離はわずか41塩基ペアのみで、EcoRV制限酵素の
切断位置(GATATC)は、この塩基配列5´ターミ
ナルの部分アミノ酸配列に位置しており、純化アルカリ
リパーゼNターミナルの20個前のアミノ酸配列:Ph
e−Leu−Phe−Gly−Ser−Ser−Asn
−Tyr−Thr−Lys−Thr−Lys−Thr−
Gln−Tyr−Pro−Ile−Val−Leu−T
hr−Arg−Glyと一致する。完成したLIP A
の遺伝子のそのイニシエイターは、(1)TAATTG
GTCACTTTTCAGCC[Deretic
V.,et al(1988)Bio/Technol
ogy 7:1249.]、及びShine−Dalg
arno配列のような5´ターミナルコントロール配
列、(2)48個のアミノ酸のペプチド[V. Hei
jne,G.V.,(1986)Nucleic Ac
ids Res., 14:4683.]である分泌信
号配列、(3)構造遺伝子を含んでいる。このコードを
含むアルカリリパーゼのDNA配列もまた、リパーゼの
共通の活性センターG−H−S−H−G[Winkle
r,F.K.,etal,(1990)Nature,
343:771]を含んでいる。
【0022】これらの特性に基づき、このコードされた
アルカリリパーゼ遺伝子はこのLIP A中に位置する
と考えられる。コードされたアルカリリパーゼ遺伝子の
完成した配列(413から1426bpsまで)は分泌
信号配列を差し引き後、290個のアミノ酸組成のタン
パク質に置き換えることができる。実際の分子量のサイ
ズは30、826で、SDS−PAGEで測定したサイ
ズ32,000に近似している。
【0023】[実施例5] コードされたアルカリリパーゼ遺伝子の出現をコントロ
ールする塩基配列の確定 (表1)このコードされたアルカリリパーゼ遺伝子の塩
基配列は、1.5から2.9Kbpまでの間に位置す
る。この区域は別のLIP B(1469−2491)
があり、コードされたアルカリリパーゼ遺伝子(ORF
1)との距離はわずか61塩基ペアのみである。この
出現をコントロールする遺伝子とコードされたアルカリ
リパーゼ遺伝子は相互に関連しており、同様なイニシエ
イターとShine−Dalgarno配列を共用して
いる。この出現をコントロールする遺伝子の塩基配列と
公知の Pseudomonas属の塩基配列[Jan
eGilbert,E.,(1993)Enzyme
Micrib.Technol.,15:634]とを
比較したところ、相似性がないため、これは新型のコン
トロール配列と考えられる。
【0024】[実施例6] 大腸菌形質転換株(TIT−7)を用いアルカリリパー
ゼを生産する 実施例2で得られた大腸菌形質転換株(TIT−7)
を、竹製のようじを用いアンピシリン(50ug/m
l)を含む10ml LB培地に植え付け、37℃で1
8時間振とう培養した。さらに0.5mlの培養物をア
ンピシリン(50ug/ml)を含む50ml LB培
地に植え付け、37℃で5時間振とう培養し、0.5m
l0.1M IPTG(イソプロピル βチオガラクト
ース グルコピラオサイド(最終濃度1mM))を加え
た。その後5時間培養を続け、細胞(10,000rp
m,20分)を収集し、20mlのTris−HC1緩
衝液(50mM,PH8.5)に懸濁し、超音波で20
分処理した後、遠心分離(10,000rpm,20
分)で細胞破裂物を除去し、上清から公知の方法でアル
カリリパーゼ活性を測定した。図11が示しているのは
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。その
内(1、2はTITクローン株、3は大腸菌宿主、4は
純化されたアルカリリパーゼ、5は分子量の標示)であ
る。TITクローン株が生産する分子量は約32000
ダルトンで、また定形外のタンパク質色帯はDH10B
宿主が形成できないものである。よってこれにより実証
された。
【0025】
【配列表1】 配列番号:lipA 配列の長さ:1016bp 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Pseudomonas Pseudoalcaligenes F-111 株名:CCRC 910008 配列の特徴 特徴を表す記号:pCKH4 存在位置: 特徴を決定した方法:Sanger dideoxy法 備考:CCRC 91008 中華民国食品工業発展研究所微生物寄託番号第9100
8号 配列 GGATTCATCCTGACAATATCCGGATGCCAGAGCGCACGAC TAATTGGTCACTTTTCAGCCGCCT A Putative promoter GGTCAACCCCGCTGAACCCTGCGCCGCGCCTTCAATTCATCACC AGGC CTGACT Putative S-D sequence -48 -40 5' ATG CTC CCG GAC AGC CTC TGT GAT GCA GTC AGA GAC ACA ACA ACA ATA AAA CCG M L P D S L C D A V R D T T T I K P Signal peptide (413 bp.) -30 -20 CAC AAG GAC TCG CAT TAT GCG CAA CAA GAC TCG CGT CTC GCT CCG CCT CGG GCT H K D S H Y A Q Q D S R L A P P R A -10 -1 1 GGC CAC TAC GCT GGG CAT CAG CAC CCA GCC CAG GCC TTC CTG TTC GGC TCC TCG G H Y A G H Q H P A Q A F L F G S S 563 bp. Mature alkaline lipase 10 20 AAC TAC ACC AAG ACC CAG TAC CCG ATC GTC CTG ACC CGC GGC ATG CTC GGC TTC N Y T K T Q Y P I V L T R G M L G F 30 40 GAC AGC CTG CTT GGG GTC GAC TAC TGG TAC GGC ATT CCC TCA GCC CAG CGT AAA D S L L G V D Y W Y G I P S A Q R K 50 60 GAC GGC GCC ACC GTC TAC TTC ACC GAA GTC AGC CAG CTC GAC ACC TCC GAA GCC D G A T V Y F T E V S Q L D T S E A 70 CGG GGT GAG CAA CTG CTG ACC CAG GTC GAG GAA ATC GTC GCC ATC AGC GGC AAA R G E Q L L T Q V E E I V A I S G K 80 90 CCC AAG GTC AAT CTG TTC GGC CAC AGC CAT GGC GGG CCT ACC ATC CGC TAC GTT P K V N L F G H S H G G P T I R Y V Active site 100 110 GCC GCC GTG GCC CCG GAT CTG GTC GCC TCG GTC ACC AGC ATT GGC GCG CCG CAC A A V A P D L V A S V T S I G A P H 120 130 AAG GGT TCG GCC GCC GCC GAC TTC ATC CGC CAG GTG CCG GAA GGA TCG GCC AGC K G S A A A D F I R Q V P E G S A S 140 150 GAA GCG ATT CTG GCC GGG ATC GTC AAT GGT CTG GGT GCG CTG ATC AAC TTC CTC E A I L A G I V N G L G A L I N F L 160 TCC GGC AGC AGT TCG GAC ACC CCA CAG AAC TCG TTG GGC ACG CTG GAG TCG CTG S G S S S D T P Q N S L G T L E S L 170 180 AAC TCC GAA GGC GCC GCA CGG TTC AAC GCC CGC TTC CCC CAA GGT GTG CCG ACC N S E G A A R F N A R F P Q G V P T 190 200 AGC GCC TGC GGC GAG GGT GAT TAC GTA GTC AAT GGC GTG CGC TAT TAC TCC TGG S A C G E G D Y V V N G V R Y Y S W 210 220 AGC GGC ACC AGC CCG CTG ACC AAC ATA CTC GAC CCT TCC GAC CTG CTG CTC GGC S G T S P L T N I L D P S D L L L G 230 240 GCC ACC TCC CTG CCA TTC GGT TTC GAG GCC AAC GAT GGT CTG GTC GGA CGC TGC A T S L P F G F E A N D G L V G R C 250 AGC TCC CGG CTG GGT ATG GTG ATC CGC GAC AAC TAC CGG ATG AAC CAC CTG GAT S S R L G M V I R D N Y R M N H L D 260 270 GAG GTG AAT CAG ACC TTC GGG CTG ACC AGC ATA TTC GAG ACC AGC CCG GTA TCG E V N Q T F G L T S I F E T S P V S 280 290 GTC TAT CGC CAG CAA GCC AAT CGC CTG AAG AAC GCC GGG CTC TGA 3' V Y R Q Q A N R L K N A G L * 1427 bp.
【0026】
【配列表2】 配列番号:lipB 配列の長さ:1023bp 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Pseudomonas Pseudoalcaligenes F-111 株名:CCRC 910008 配列の特徴 特徴を表す記号:pCKH4 存在位置: 特徴を決定した方法:Sanger dide法 備考:CCRC 91008 中華民国食品工業発展研究所微生物寄託番号第9100
8号 配列 ATCGCCTGAAGAACGCCGGGCTC TGA AATAGGCTCCACAACCAGACAGGGCTGGCCTCAGG GGCC Alkaline lipase (lip A) stop codon 1 10 5' ATG CAC AGG TAC CGA TAT CGA CAT GAA GCC GCT GAT TTA TCT GCC GTT GC T ACT M H R Y R Y R H E A A D L S A V A T 1469 bp. 20 30 CGG CCT CGG CTG CTC GGC TGG CAC CTG AGC ACA CCG ACA CCC AGC CCC TC C GCG R P R L L G W H L S T P T P S P S A 40 50 CCC ACA TCA ACG CCG CTA CAA GCC GGC AGT GAA CAA CCC GCC ACA ACT CC T GTG P T S T P L Q A G S E Q P A T T P V 60 70 AGT CTG ACC CGT CCG ACC ACG CGC AGC ACC GAC CAG CAC CTG CCC GCC TC A CTG S L T R P T T R S T D Q H L P A S L 80 90 CGC GAT ACC GAC ATC GAT GGT CAA CTG GAA GTC GAC GCC CAG GGC AAT CT G GTG R D T D I D G Q L E V D A Q G N L V 100 ATT ACC GAC CAA CTG CGT CAC CTG TTC GAT TAT TTC TTC AGC ACC GTC GG C GAA I T D Q L R H L F D Y F F S T V G E 110 120 CAG TCG TTC GAG CAG GCC AGC AGC GCT ATC CGT GAC TAT CTG GCC AGC CA G CTG Q S F E Q A S S A I R D Y L A S Q L 130 140 CGT GAC GCG GCT CTG GCT CAG GCC CTG GAT CTT CTG GAT CGC TAT ATC GA C TAC R D A A L A Q A L D L L D R Y I D Y 150 160 AAA ACT GAG CTG GTG GAG CTG GAG CGA CGC TTC CCG ATG GTG ACC GAA CT G GAC K T E L V E L E R R F P M V T E L D 170 180 GGC CTG CGC GCC CGC GAA GAT GCC GTA CAA CGC CTG CGC GCC AGT CTG TT C AAC G L R A R E D A V Q R L R A S L F N 190 GCG CAG GAG CAC GCC GCC TTC TTC GCC AGC GAA GAG GTC TAT AAC CAG TT C ACT A Q E H A A F F A S E E V Y N Q F T 200 210 CTT GAG CGT CTG GCG ATA CTG CAC GAT CCG TCG CTG GAT CCG CAG ACA CA G GCC L E R L A I L H D P S L D P Q T Q A 220 230 GAA CGG ATT GAA CGG CTG CGC GAA GGG CTG CCC GAC GAG TTG CAA CAA TT G CTG E R I E R L R E G L P D E L Q Q L L 240 250 GTA CCG CAA TTG CAC CTG ACC CTG CGC CAC GAC CCA GCA GTT GCT GAC CA A GGT V P Q L H L T L R H D P A V A D Q G 260 270 GCC GAG CCG GAA CAG CTA CGC CAG TTG CGC CTG AAC CTG TTC GGG CCT CA G GCA A E P E Q L R Q L R L N L F G P Q A 280 ACC GAG CGG CTG GAA CGG CTG GAC CGC CAA CGC AGC GAA TGG GAT CAG CG C CTT T E R L E R L D R Q R S E W D Q R L 290 300 GAG CGG TTC AAT CGC GAA CGT CAG GCG ATC ATC AGC CAG CCG GGC GCG TG G ACA E R F N R E R Q A I I S Q P G A W T 310 320 GCG ACA AGC AGG CCG CGA TTG AGG CCT GCT GCA CGA GCA GTT CAG CGA GC A CGA A T S R P R L R P A A R A V Q R A R 330 340 GCG CTC AGG GTC AAT AGC CTG TTG GAA CTC GAT AGC CGC GCC GAA CGC TA G 3' A L R V N S L L E L D S R A E R * 24 91 bp.
【図面の簡単な説明】
【図1】疑似性単細胞菌属F−111染色体のDNA断
片の塩基配列を示している。
【図2】図1の続きである。
【図3】図2の続きである。
【図4】コードされたアルカリリパーゼ遺伝子の塩基配
列(LIP Aと命名)を示している。
【図5】図4の続きである。
【図6】コードされたアルカリリパーゼ遺伝子の出現を
コントロールする塩基配列(LIP Bと命名)を示し
ている。
【図7】図6の続きである。
【図8】コードされたアルカリリパーゼ遺伝子断片の制
限酵素による切断位置を示している。
【図9】プラスミドpCHK4作出のフローチャートを
示している。
【図10】TIT−7クローン株のトリブチリン(tr
ibutyrin)スクリーニング培地に於ける出現の
状況を示している。
【図11】TIT−7クローン株が生産したアルカリリ
パーゼのSDSポリアクリルアミドゲルに於ける電気泳
動分析図を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 //(C12N 15/09 ZNA C12R 1:38) (C12N 9/20 C12R 1:19)

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 コードされたアルカリリパーゼ遺伝子の
    配列、及びコードされたアルカリリパーゼ遺伝子の出現
    をコントロールする一種のDNA断片である。
  2. 【請求項2】 請求項1記載の疑似性単細胞菌属(Ps
    eudomonasPseudoalcaligene
    s)F−111から得られたDNA断片である。
  3. 【請求項3】 以下を含むアルカリリパーゼの製造方
    法。 (a)疑似性単細胞菌属(Pseudomonas P
    seudoalcaligenes)F−111から染
    色体DNAを分離した。 (b)制限酵素Sau 3Aを用いて疑似性単細胞菌属
    (Pseudomonas Pseudoalcali
    genes)F−111の染色体DNAを部分消化し、
    コードされたアルカリリパーゼ遺伝子配列、及びコード
    されたアルカリリパーゼ遺伝子出現をコントロールする
    塩基配列のDNA断片を得た。 (c)担体を得るため、当該DNA断片を大腸菌体中に
    出現することができるプラスミドに移植した。 (d)当該形質転換担体を大腸菌中に移植した。 (e)当該形質転換大腸菌を培養した。 (f)アルカリリパーゼを分離した。
  4. 【請求項4】 請求項3記載の大腸菌中に出現するプラ
    スミドは、PGEM−3Zf(1+1)である。
JP8119638A 1996-02-26 1996-04-17 コードされたアルカリリパーゼ遺伝子のdna断片、及びこの酵素出現をコントロールするdna断片 Pending JPH09275987A (ja)

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