JP2587305B2 - リパーゼ発現用組換え体プラスミド及びリパーゼの製造法 - Google Patents
リパーゼ発現用組換え体プラスミド及びリパーゼの製造法Info
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- JP2587305B2 JP2587305B2 JP2055859A JP5585990A JP2587305B2 JP 2587305 B2 JP2587305 B2 JP 2587305B2 JP 2055859 A JP2055859 A JP 2055859A JP 5585990 A JP5585990 A JP 5585990A JP 2587305 B2 JP2587305 B2 JP 2587305B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はシュードモナス フラジ（Ｐseudomonas fra
giIFO 12049株由来のリパーゼ（以下単にリパーゼとい
う）の大腸菌における効率のよい発現を可能とする組換
え体プラスミド、該組換え体プラスミドによって形質転
換された大腸菌株、及びリパーゼの製造法に関する。
giIFO 12049株由来のリパーゼ（以下単にリパーゼとい
う）の大腸菌における効率のよい発現を可能とする組換
え体プラスミド、該組換え体プラスミドによって形質転
換された大腸菌株、及びリパーゼの製造法に関する。
詳しくは、外来遺伝子の大腸菌での発現を可能とする
発現ベクターに、リパーゼ遺伝子を遺伝子組換え技術を
用いて挿入して新たな組換え体プラスミドを構築するに
際し、大腸菌内で複製可能なマルチコピー型のベクター
及び、リパーゼ遺伝子発現のためのプロモーターに、大
腸菌トリプトフォオペロンのプロモターと大腸菌ラクト
ースオペロンの融合プロモーター（tacプロモーター）
を、用いることによって、より効率の良い大腸菌でのリ
パーゼの発現を可能とした組換え体プラスミド及び該プ
ラスミドによって形質転換された大腸菌株、更に、その
大腸菌株を用いることを特徴とするリパーゼの製造法に
関する。
発現ベクターに、リパーゼ遺伝子を遺伝子組換え技術を
用いて挿入して新たな組換え体プラスミドを構築するに
際し、大腸菌内で複製可能なマルチコピー型のベクター
及び、リパーゼ遺伝子発現のためのプロモーターに、大
腸菌トリプトフォオペロンのプロモターと大腸菌ラクト
ースオペロンの融合プロモーター（tacプロモーター）
を、用いることによって、より効率の良い大腸菌でのリ
パーゼの発現を可能とした組換え体プラスミド及び該プ
ラスミドによって形質転換された大腸菌株、更に、その
大腸菌株を用いることを特徴とするリパーゼの製造法に
関する。
［従来の技術とその問題点］ リパーゼは、脂質を加水分解する酵素として、油脂加
工、臨床診断薬、洗剤、消化薬などに使用されている
他、近年は化成品、特に光学活性化合物の製造法となる
エステルの加水分解、エステル合成あるいはエステル変
換を触媒する重要な酵素として注目されている。
工、臨床診断薬、洗剤、消化薬などに使用されている
他、近年は化成品、特に光学活性化合物の製造法となる
エステルの加水分解、エステル合成あるいはエステル変
換を触媒する重要な酵素として注目されている。
また、シュードモナス属細菌は、エステルの加水分
解、エステル合成、或は、エステル変換の触媒に有用な
リパーゼを生産することが知られている。（特開昭62−
166,898号）。
解、エステル合成、或は、エステル変換の触媒に有用な
リパーゼを生産することが知られている。（特開昭62−
166,898号）。
このシュードモナス属細菌の生産するリパーゼの特性
は、工業的利用には興味あるものであるが、その生産に
ついては、リパーゼ生産菌の染色体DNAに含まれる通常
１個の遺伝子の発現によってなされるため、該リパーゼ
の生産を飛躍的向上させることは困難であった。
は、工業的利用には興味あるものであるが、その生産に
ついては、リパーゼ生産菌の染色体DNAに含まれる通常
１個の遺伝子の発現によってなされるため、該リパーゼ
の生産を飛躍的向上させることは困難であった。
近年、組換えDNA技術の発達により遺伝子が単離さ
れ、高度活性を持つものへの誘導、或は、ヌクレオチド
配列を変換することが可能になって、商業上関心のある
タンパク質の創製が検討、或は実施されている。
れ、高度活性を持つものへの誘導、或は、ヌクレオチド
配列を変換することが可能になって、商業上関心のある
タンパク質の創製が検討、或は実施されている。
特に組換えDNA技術を用いて有用タンパク質の生産を
検討する場合、宿主種として大腸菌を用いれば、その物
質生産に関する諸因子等が理解されている点や、発現ベ
クターの開発、改良がなされている点で非常に有効であ
る。
検討する場合、宿主種として大腸菌を用いれば、その物
質生産に関する諸因子等が理解されている点や、発現ベ
クターの開発、改良がなされている点で非常に有効であ
る。
本発明者等は、組換えDNAの手法を用いて、シュード
モナス フラジ（Pseudomonas fragi）IFO 12049株よ
りリパーゼ遺伝子を単離し、その一次構造を決定し、大
腸菌を宿主としたリパーゼの発現の確認に成功した。
（特願昭63−187,684号）しかし、その発現量は少な
く、それゆえリパーゼの大腸菌における効率のよい発現
を可能とする宿主−発現用組換え体プラスミド系の選定
および開発が急務であった。
モナス フラジ（Pseudomonas fragi）IFO 12049株よ
りリパーゼ遺伝子を単離し、その一次構造を決定し、大
腸菌を宿主としたリパーゼの発現の確認に成功した。
（特願昭63−187,684号）しかし、その発現量は少な
く、それゆえリパーゼの大腸菌における効率のよい発現
を可能とする宿主−発現用組換え体プラスミド系の選定
および開発が急務であった。
本発明者等は、このような観点からリパーゼの大腸菌
における効率のよい発現のために、好適な発現ベクター
を開発する上で、リパーゼの発現と発現ベクターの菌内
におけるコピー数、即ち複製起点、及びプロモーターに
ついて着目し、検討した。
における効率のよい発現のために、好適な発現ベクター
を開発する上で、リパーゼの発現と発現ベクターの菌内
におけるコピー数、即ち複製起点、及びプロモーターに
ついて着目し、検討した。
その結果、発現ベクターの複製起点としてマルチコピ
ー型の、pUC系プラスミド由来のものを、プロモーター
にtacプロモーターをそれぞれ用いることにより、大腸
菌での効率の良いリパーゼの発現が実現できることを知
見し、該知見に基づいて、本発明が完成されるにいたっ
た。
ー型の、pUC系プラスミド由来のものを、プロモーター
にtacプロモーターをそれぞれ用いることにより、大腸
菌での効率の良いリパーゼの発現が実現できることを知
見し、該知見に基づいて、本発明が完成されるにいたっ
た。
以上の記述から明らかなように、本発明の目的は、組
換えDNA技術を用いた大腸菌でのリパーゼの発現におい
て、大腸菌でのより効率のよいリパーゼの発現を可能に
する組換え体プラスミド、該プラスミドによって形質転
換され、リパーゼの効率のよい生産に好適である大腸菌
株、及びこれらの大腸菌株の特有の特徴に従った最も効
率の良いリパーゼの製造方法を提供することにある。
換えDNA技術を用いた大腸菌でのリパーゼの発現におい
て、大腸菌でのより効率のよいリパーゼの発現を可能に
する組換え体プラスミド、該プラスミドによって形質転
換され、リパーゼの効率のよい生産に好適である大腸菌
株、及びこれらの大腸菌株の特有の特徴に従った最も効
率の良いリパーゼの製造方法を提供することにある。
［問題点を解決するための手段］ 本発明は、下記の構成を有する。
（１）ａ）大腸菌内で複製可能であるマルチコピー型の
pUC系ベクターと、 ｂ）大腸菌トリプトファンオペロンのプロモーターと大
腸菌ラクトースオペロンのプロモーターとの融合プロモ
ーター（tacプロモーター）と ｃ）該プロモーター支配下に、シュードモナスフラジ
（Pseudomonas fragi）IFO 12049株由来のリパーゼを
コードするDNA配列を有し、SD配列と開始コドン間の塩
基配列がAACAGAATTC若しくはAACAGAATTCCCCであること
を特徴とするリパーゼ発現用組換え体プラスミド。
pUC系ベクターと、 ｂ）大腸菌トリプトファンオペロンのプロモーターと大
腸菌ラクトースオペロンのプロモーターとの融合プロモ
ーター（tacプロモーター）と ｃ）該プロモーター支配下に、シュードモナスフラジ
（Pseudomonas fragi）IFO 12049株由来のリパーゼを
コードするDNA配列を有し、SD配列と開始コドン間の塩
基配列がAACAGAATTC若しくはAACAGAATTCCCCであること
を特徴とするリパーゼ発現用組換え体プラスミド。
（２）前記第（１）項に記載の組換え体プラスミドに形
質転換されてなる大腸菌株。
質転換されてなる大腸菌株。
（３）前記第（２）項に記載の大腸菌株を用いることを
特徴とするリパーゼの製造法。
特徴とするリパーゼの製造法。
以下、本発明の構成と効果につき説明する。
本発明の組換え体プラスミドに用いるベクターとして
は、宿主である大腸菌内で安定に保持され、マルチコピ
ー型の複製可能な、即ち、大腸菌内で有効に機能できる
プラスミド複製起点（複製オリジン）を有するDNA断片
を用いることができる。このベクターの複製起点として
は、pUC系プラスミド等のものを用いることができる。
は、宿主である大腸菌内で安定に保持され、マルチコピ
ー型の複製可能な、即ち、大腸菌内で有効に機能できる
プラスミド複製起点（複製オリジン）を有するDNA断片
を用いることができる。このベクターの複製起点として
は、pUC系プラスミド等のものを用いることができる。
また、これらベクターには、宿主菌に組換え体プラス
ミドを導入した際の選択マーカーとなる遺伝子、例えば
アンピシリンやカナマイシン耐性などを発現可能とする
各種遺伝子を含んでいると便利である。
ミドを導入した際の選択マーカーとなる遺伝子、例えば
アンピシリンやカナマイシン耐性などを発現可能とする
各種遺伝子を含んでいると便利である。
本発明の組換え体プラスミドに使用されるtacプロモ
ーターは、E.Amannらにより報告された方法［Gene,25,1
67（1983）］により、trpプロモーターとlacプロモータ
ーより構築することができる。
ーターは、E.Amannらにより報告された方法［Gene,25,1
67（1983）］により、trpプロモーターとlacプロモータ
ーより構築することができる。
また、例えばベクターpKK223−３（ファルマシア社
製）で例示されるようなtacプロモーターを有する適当
なベクターから切り出してもよい。なお、このtacプロ
モーターは、SD［シャイン−ダルガルノ（Shine−Dalga
rno）］配列を含むことが望ましい。
製）で例示されるようなtacプロモーターを有する適当
なベクターから切り出してもよい。なお、このtacプロ
モーターは、SD［シャイン−ダルガルノ（Shine−Dalga
rno）］配列を含むことが望ましい。
更にこのtacプロモーターが、リパーゼ遺伝子の発現
に対して有効に機能するためには、tacプロモーターのS
D配列とリパーゼ遺伝子の翻訳開始コドンATG間の配列に
ついても考慮されなければならない。例えば、本発明者
等が、後述する実施例に示したような配列が望ましい。
に対して有効に機能するためには、tacプロモーターのS
D配列とリパーゼ遺伝子の翻訳開始コドンATG間の配列に
ついても考慮されなければならない。例えば、本発明者
等が、後述する実施例に示したような配列が望ましい。
本発明の組換え体プラスミドにおいて、tacプロモー
ターの下流側に組込むリパーゼ遺伝子をコードするDNA
配列としては、本発明者等によってシュードモナス フ
ラジ（Pseudomonas fragi）IFO 12049株から既にクロ
ーン化されている特願昭63−187,684号に記載されたも
のを利用でき、又、上記遺伝子と機能的に同等のものを
コードすDNA配列を有するものも勿論利用できる。
ターの下流側に組込むリパーゼ遺伝子をコードするDNA
配列としては、本発明者等によってシュードモナス フ
ラジ（Pseudomonas fragi）IFO 12049株から既にクロ
ーン化されている特願昭63−187,684号に記載されたも
のを利用でき、又、上記遺伝子と機能的に同等のものを
コードすDNA配列を有するものも勿論利用できる。
本発明の組換え体プラスミドにおいて、リパーゼ遺伝
子をコードするDNA配列の下流に位置するように組込むm
RNAのターミネーターとしては、大腸菌内で有効に機能
するものであればどのようなものでも利用できるが、rr
nB・trpA等の強力な活性を示すターミネーターを用いる
のが、tacプロモーターのような強力なプロモーター活
性をもつものとのバランスを取る上で望ましい。
子をコードするDNA配列の下流に位置するように組込むm
RNAのターミネーターとしては、大腸菌内で有効に機能
するものであればどのようなものでも利用できるが、rr
nB・trpA等の強力な活性を示すターミネーターを用いる
のが、tacプロモーターのような強力なプロモーター活
性をもつものとのバランスを取る上で望ましい。
以上のような、構成を有する本発明の組換え体プラス
ミドを宿主大腸菌に導入することによって該宿主大腸菌
でのより効率のよいリパーゼの発現が可能となる。
ミドを宿主大腸菌に導入することによって該宿主大腸菌
でのより効率のよいリパーゼの発現が可能となる。
リパーゼの発現は、ラクトースリプレッサー産生菌を
宿主菌に用いれば、ラクトースやisopropyl−β−Ｄ−t
hiogalactoside（IPTG）によって誘発することができ
る。
宿主菌に用いれば、ラクトースやisopropyl−β−Ｄ−t
hiogalactoside（IPTG）によって誘発することができ
る。
この菌の例として、JM109［Yanisch−Perron,C.,Viei
ra,J.and Messing,J.,Gene,33,103（1985）］,D1210［S
adler,S.J.,Tecklenburg,M.and Betz,J.L.,Gene,8,279
（1980）］等を利用することができる。
ra,J.and Messing,J.,Gene,33,103（1985）］,D1210［S
adler,S.J.,Tecklenburg,M.and Betz,J.L.,Gene,8,279
（1980）］等を利用することができる。
又、ラクトースリプレッサーを産生しない菌を宿主菌
として用いれば、IPTG等の誘導物質を使用しなくともリ
パーゼの発現を可能とすることができる。この菌の例と
してJM83［Messing,J.,Crea,R.and Seeburg,P.H.Nucl.A
cid.Res.,2,309（1981）］等を利用することができる。
として用いれば、IPTG等の誘導物質を使用しなくともリ
パーゼの発現を可能とすることができる。この菌の例と
してJM83［Messing,J.,Crea,R.and Seeburg,P.H.Nucl.A
cid.Res.,2,309（1981）］等を利用することができる。
いずれにしても、効率よくリパーゼを発現できるよう
に、宿主大腸菌の特有の特徴に従って、培養条件を決定
することができる。
に、宿主大腸菌の特有の特徴に従って、培養条件を決定
することができる。
このようにして、リパーゼが効率よく発現できるよう
な培養条件で調整された大腸菌試料は、ラウリル硫酸ナ
トリウム（SDS）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって、その構成成分をポリペプチドレベルにまで分離
される。
な培養条件で調整された大腸菌試料は、ラウリル硫酸ナ
トリウム（SDS）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって、その構成成分をポリペプチドレベルにまで分離
される。
分離されたポリペプチドは、その後、適当な方法で染
色され視覚化される。本発明の組換え体プラスミドによ
る大腸菌におけるリパーゼの発現の確認は、リパーゼ遺
伝子の組込まれていないプラスミドを含む同一大腸菌調
整試料を対照として、SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動のパターンを比較することにより確認される。
色され視覚化される。本発明の組換え体プラスミドによ
る大腸菌におけるリパーゼの発現の確認は、リパーゼ遺
伝子の組込まれていないプラスミドを含む同一大腸菌調
整試料を対照として、SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動のパターンを比較することにより確認される。
又、大腸菌において発現したリパーゼ活性の評価は、
基質として乳化オリーブ油を用いリパーゼ作用により遊
離した脂肪酸を水酸化ナトリウム溶液で滴定することに
より定量する方法や、市販のリパーゼ活性測定キット類
等を用いて行なうことができる。
基質として乳化オリーブ油を用いリパーゼ作用により遊
離した脂肪酸を水酸化ナトリウム溶液で滴定することに
より定量する方法や、市販のリパーゼ活性測定キット類
等を用いて行なうことができる。
かくして、本発明によれば、シュードモナス属細菌由
来のリパーゼ遺伝子を、大腸菌においてより効率よく発
現させることが可能となり、工業的用途に利用可能なシ
ュードモナス属細菌由来のリパーゼと同一のリパーゼま
たは実質的に同じ特性を保持したその変種を提供するこ
とが可能になった。
来のリパーゼ遺伝子を、大腸菌においてより効率よく発
現させることが可能となり、工業的用途に利用可能なシ
ュードモナス属細菌由来のリパーゼと同一のリパーゼま
たは実質的に同じ特性を保持したその変種を提供するこ
とが可能になった。
以下、実施例をあげて本発明について詳細に説明する
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例］ 実施例 １ （プラスミドpTCE−lip・pTCS−lipの構築） （１）第１図の工程に従ったプラスミドpTC1の構築： まず、プラスミドpUC9［Vieira,J.and Messing,J.Gen
e 19 259（1982）,Yanisch−Perron,C.,Vieira,J.and M
essing,J.Gene 33 103（1985）］，を制限酵素 PvuII
・ScaI消化して得たDNA断片混合物から、複製起点（Or
i）を含むDNA断片を、又、プラスミドpKK223−３（ファ
ルマシア社製）を制限酵素ScaI・NruI消化して得たDNA
断片混合物からtacプロモーターを有するDNA断片をそれ
ぞれ周知の電気泳動法によって分離・回収した。
e 19 259（1982）,Yanisch−Perron,C.,Vieira,J.and M
essing,J.Gene 33 103（1985）］，を制限酵素 PvuII
・ScaI消化して得たDNA断片混合物から、複製起点（Or
i）を含むDNA断片を、又、プラスミドpKK223−３（ファ
ルマシア社製）を制限酵素ScaI・NruI消化して得たDNA
断片混合物からtacプロモーターを有するDNA断片をそれ
ぞれ周知の電気泳動法によって分離・回収した。
次にこのようにして得られた、２つのDNA断片を、T4D
NAリカーゼ存在下で反応させた後、得られた反応生成物
を大腸菌にHanahanの方法［Hanahan,D.J.Mol.Biol.,166
557（1983）］を用いて導入し、50ug/mlのアンピシリ
ンを含むLB培地プレート（１％バクトトリプトン・0.5
％酵母粉末・0.5％塩化ナトリウム・1.5％寒天pH7.2に
調整）にて培養した。
NAリカーゼ存在下で反応させた後、得られた反応生成物
を大腸菌にHanahanの方法［Hanahan,D.J.Mol.Biol.,166
557（1983）］を用いて導入し、50ug/mlのアンピシリ
ンを含むLB培地プレート（１％バクトトリプトン・0.5
％酵母粉末・0.5％塩化ナトリウム・1.5％寒天pH7.2に
調整）にて培養した。
培養後、プレート上に出現したアンピシリン耐性の各
コロニーのそれぞれから個々にプラスミドを抽出し、各
プラスミドの制限酵素地図を作製した、目的とする第１
図に示したような構成のプラスミドpTC1を有するコロニ
ーを同定し、更に該コロニーからプラスミドpTC1を単離
した。
コロニーのそれぞれから個々にプラスミドを抽出し、各
プラスミドの制限酵素地図を作製した、目的とする第１
図に示したような構成のプラスミドpTC1を有するコロニ
ーを同定し、更に該コロニーからプラスミドpTC1を単離
した。
（２）第２図の工程に示したプラスミドpTCE−lip,pTCS
−lipの構築： （２−１）pTCE−lipの構築 まず、特願昭63−187,684号に記載された本発明者ら
による方法に従って構築されたシュードモナス フラジ
（Pseudomonas fragi）IFO 12049株由来のリパーゼ遺
伝子を含むプラスミドpFL−２のリパーゼ遺伝子の５′
末端近傍に制限酵素NcoI部位を、部位特異的変異法［Mo
rinaga,Y.,Frances−chini,T.,Inouye,S.and Inouye,M.
Biotechnology,2,636（1984）］により導入した。
−lipの構築： （２−１）pTCE−lipの構築 まず、特願昭63−187,684号に記載された本発明者ら
による方法に従って構築されたシュードモナス フラジ
（Pseudomonas fragi）IFO 12049株由来のリパーゼ遺
伝子を含むプラスミドpFL−２のリパーゼ遺伝子の５′
末端近傍に制限酵素NcoI部位を、部位特異的変異法［Mo
rinaga,Y.,Frances−chini,T.,Inouye,S.and Inouye,M.
Biotechnology,2,636（1984）］により導入した。
即ち、プラスミドpFL−２のリパーゼ翻訳開始点部分
のDNA配列に相補的な５′−CGTCCATGG*TCAATCT−３′
（＊は変異導入箇所）16merのオリゴヌクレオタイドを
用いて制限酵素NcoI部位を、リパーゼ翻訳開始直前に導
入した。
のDNA配列に相補的な５′−CGTCCATGG*TCAATCT−３′
（＊は変異導入箇所）16merのオリゴヌクレオタイドを
用いて制限酵素NcoI部位を、リパーゼ翻訳開始直前に導
入した。
このプラスミドを、制限酵素NcoI・ScaI消化し、その
後、リパーゼ遺伝子を含む1KbのDNA断片を電気泳動法に
より分離・回収し、更にklenow断片処理し平滑末端化し
た。
後、リパーゼ遺伝子を含む1KbのDNA断片を電気泳動法に
より分離・回収し、更にklenow断片処理し平滑末端化し
た。
これとは別に、前記実施例（１）項に示した方法で構
築されたプラスミドpTC1を、制限酵素EcoRI消化し、そ
の後klenow断片処理し平滑末端化した。このようにして
得られたプラスミドpTC1由来の平滑末端化されたDNA断
片と、先に得たリパーゼ遺伝子を含む1kbのDNA断片と
を、T4DNAリガーゼ存在下で反応させ第２図の構成プラ
スミドpTCE−lipを得た。
築されたプラスミドpTC1を、制限酵素EcoRI消化し、そ
の後klenow断片処理し平滑末端化した。このようにして
得られたプラスミドpTC1由来の平滑末端化されたDNA断
片と、先に得たリパーゼ遺伝子を含む1kbのDNA断片と
を、T4DNAリガーゼ存在下で反応させ第２図の構成プラ
スミドpTCE−lipを得た。
ここで目的のプラスミドを得たかどうかは、T4DNAリ
ガーゼを用いた反応で生成された反応生成物を大腸菌に
導入し、これをアンピシリン入りLB培地で培養し、出現
したアンピシリン耐性コロニーから、プラスミドを調整
しその制限酵素地図を製作することによって確認した。
ガーゼを用いた反応で生成された反応生成物を大腸菌に
導入し、これをアンピシリン入りLB培地で培養し、出現
したアンピシリン耐性コロニーから、プラスミドを調整
しその制限酵素地図を製作することによって確認した。
（２−２）プラスミドpTCS−lipの構築 前記２−１項で得たリパーゼ遺伝子翻訳開始点直前に
制限酵素NcoI部位を導入されたプラスミドを、制限酵素
NcoI,EcoRIで消化し、リパーゼ遺伝子を含む1.1kbDNA断
片を電気泳動法により分離回収した。
制限酵素NcoI部位を導入されたプラスミドを、制限酵素
NcoI,EcoRIで消化し、リパーゼ遺伝子を含む1.1kbDNA断
片を電気泳動法により分離回収した。
この1.1kbDNA断片とpTV118N（宝酒造社製）の制限酵
素NcoI・EcoRI消化3.1kbDNA断片とを、T4DNAリガーゼ存
在下で反応させ、第２図の構成プラスミドpNE118lipを
得た。
素NcoI・EcoRI消化3.1kbDNA断片とを、T4DNAリガーゼ存
在下で反応させ、第２図の構成プラスミドpNE118lipを
得た。
このプラスミドpNE118lipを、制限酵素NcoIで消化
し、klenow断片処理し平滑末端化した後、制限酵素Hind
IIIで消化し、リパーゼ遺伝子を含む1.2kbDNA断片を電
気泳動法により分離回収した。
し、klenow断片処理し平滑末端化した後、制限酵素Hind
IIIで消化し、リパーゼ遺伝子を含む1.2kbDNA断片を電
気泳動法により分離回収した。
この1.2kbDNA断片と、前記実施例（１）項で得たプラ
スミドpTC1を制限酵素SmaI Hind III消化して得た4.4kb
DNA断片とをT4DNAリガーゼ存在下で反応させ第２図の構
成プラスミドpTC S−lipを得た。
スミドpTC1を制限酵素SmaI Hind III消化して得た4.4kb
DNA断片とをT4DNAリガーゼ存在下で反応させ第２図の構
成プラスミドpTC S−lipを得た。
ここで目的のプラスミドが得られたかどうかはT4DNA
リガーゼを用いた反応で生成された反応生成物を大腸菌
に導入しこれをアンピシリン入りLB培地で培養し出現し
たアンピシリン耐性コロニーから、プラスミドを調製し
その制限酵素地図を製作することで確認した。
リガーゼを用いた反応で生成された反応生成物を大腸菌
に導入しこれをアンピシリン入りLB培地で培養し出現し
たアンピシリン耐性コロニーから、プラスミドを調製し
その制限酵素地図を製作することで確認した。
（３）プラスミドpTCE−lip,pTCS−lipのリパーゼ遺伝
子翻訳開始コドンATGとtacプロモーター由来のSD配列間
のDNA配列： 前記実施例（２）項で得たプラスミドpTCE−Lip及びp
TCS−lipのリパーゼ遺伝子翻訳開始コドンATGとtacプロ
モーター由来のSD配列間のDNA配列を確認するために、H
attoriらの方法［M.Hattori and Y.Sakaki,Anal Bioche
m.,152,232（1986）］により、M13シークエンシグキッ
ド（宝酒造社）を用い塩基配列の決定を行なった。
子翻訳開始コドンATGとtacプロモーター由来のSD配列間
のDNA配列： 前記実施例（２）項で得たプラスミドpTCE−Lip及びp
TCS−lipのリパーゼ遺伝子翻訳開始コドンATGとtacプロ
モーター由来のSD配列間のDNA配列を確認するために、H
attoriらの方法［M.Hattori and Y.Sakaki,Anal Bioche
m.,152,232（1986）］により、M13シークエンシグキッ
ド（宝酒造社）を用い塩基配列の決定を行なった。
結果を第３図に示す。
実施例２（リパーゼの大腸菌における発現） 前記実施例１で得られたリパーゼ発現プラスミドpTCE
−lip、pTCS−lipをそれぞれ大腸菌JM109（lacIq産生
菌）［Yanisch−Peron,C.,Vieira,J.and Messing,J.,Ge
ne,33103（1985）］に導入し、50μg/mlのアンピリシン
を含むLB培地で37℃一晩振とう培養した。
−lip、pTCS−lipをそれぞれ大腸菌JM109（lacIq産生
菌）［Yanisch−Peron,C.,Vieira,J.and Messing,J.,Ge
ne,33103（1985）］に導入し、50μg/mlのアンピリシン
を含むLB培地で37℃一晩振とう培養した。
この培養液100μｌを、新たに5mlの50μg/mlのアンピ
リシンを含むLB培地に接種し、再び37℃で振とう培養し
た。接種より２時間後、終濃度が0.6mMとなるようにIPT
Gを加え、更に、37℃で振とう培養を続け、３時間後培
養液1mlを遠心分離し、大腸菌菌体を集めた。
リシンを含むLB培地に接種し、再び37℃で振とう培養し
た。接種より２時間後、終濃度が0.6mMとなるようにIPT
Gを加え、更に、37℃で振とう培養を続け、３時間後培
養液1mlを遠心分離し、大腸菌菌体を集めた。
この菌体に、500μｌの20mM Tris−HC1（pH8.0）緩衝
液を加え懸濁し、超音波発生装置（ブランソン社、SONI
FIRE250型）を用い菌体破壊を行なった。
液を加え懸濁し、超音波発生装置（ブランソン社、SONI
FIRE250型）を用い菌体破壊を行なった。
得られた菌体破壊試料の一部に対し、等量のサンプル
緩衝液（10％グリセロール、５％２−メルカプトエタノ
ール、2.3％ SDS.0.0625MTris−Hcl pH6.8）と混合し５
分間煮沸し、SDS−15％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を、Laemmliらの方法［U.k.Laemmli,Nature,227,680
（1970）］に準じて行なった。電気泳動終了後、ゲル中
のポリペプチドをクーマシーブルー溶液で染色した。
緩衝液（10％グリセロール、５％２−メルカプトエタノ
ール、2.3％ SDS.0.0625MTris−Hcl pH6.8）と混合し５
分間煮沸し、SDS−15％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を、Laemmliらの方法［U.k.Laemmli,Nature,227,680
（1970）］に準じて行なった。電気泳動終了後、ゲル中
のポリペプチドをクーマシーブルー溶液で染色した。
この際JM109（pTC1）株及びIPTGによる誘導生産を行
なわなかったJM109（pTC E−lip）株、JM109（pTC S−l
ip）株を同様に対照試料として調整し電気泳動を行なっ
た。対照試料との泳動パターンの比較から、JM109（pTC
E−lip）株及びJM109（pTC S−lip）株においてIPTGで
誘導されるリパーゼ遺伝子由来のポリペプチドの発現の
確認を行なった。
なわなかったJM109（pTC E−lip）株、JM109（pTC S−l
ip）株を同様に対照試料として調整し電気泳動を行なっ
た。対照試料との泳動パターンの比較から、JM109（pTC
E−lip）株及びJM109（pTC S−lip）株においてIPTGで
誘導されるリパーゼ遺伝子由来のポリペプチドの発現の
確認を行なった。
実施例３（リパーゼ活性の評価） 大日本製薬社の市販品であるリパーゼキットＳを用い
てリパーゼ活性の評価を行なった。原理的には、三酪酸
ジメルカプロールがリパーゼにより水解し、シメルカプ
ロールが生成して、その生成したジメルカプロールが5,
5′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）と定量的に反
応して黄色の５−チオ−２ニトロ安息香酸を生ずること
によるものである。
てリパーゼ活性の評価を行なった。原理的には、三酪酸
ジメルカプロールがリパーゼにより水解し、シメルカプ
ロールが生成して、その生成したジメルカプロールが5,
5′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）と定量的に反
応して黄色の５−チオ−２ニトロ安息香酸を生ずること
によるものである。
即ち、試験管に発色液1ml,試料50μｌ、エステラーゼ
阻害剤20μｌを入れ混和した。混和後、各試験管を恒温
槽に入れ30℃で５分間放置した。次に基質液100μｌを
加え、混和後直ちに30℃で30分間遮光下でインベキュー
トした。
阻害剤20μｌを入れ混和した。混和後、各試験管を恒温
槽に入れ30℃で５分間放置した。次に基質液100μｌを
加え、混和後直ちに30℃で30分間遮光下でインベキュー
トした。
インベキューション終了後、反応停止液2.0ml加え、
混和し、遮光下においた。純水を対照として、１時間以
内に412mmの吸光度を測定した。ブランクとの吸光度差
が0.001を示した場合を1BALB単位と定義する。
混和し、遮光下においた。純水を対照として、１時間以
内に412mmの吸光度を測定した。ブランクとの吸光度差
が0.001を示した場合を1BALB単位と定義する。
測定試料は、実施例２の方法で得た0.6M IPTG誘導
後、３時間培養したものの超音波処理、上清（12000r.
p.m X 15min.,日立社HIMACCR15B）を用いた。
後、３時間培養したものの超音波処理、上清（12000r.
p.m X 15min.,日立社HIMACCR15B）を用いた。
JM109（pTC E−lip）株・JM109（pTC S−lip）株（以
上、本願発明）JM109（pFL−２）株（特願昭63−187684
号）におけるリパーゼ活性は、それぞれ培養液1mlあた
り220 BALB単位、360 BALB単位、130 BALB単位であっ
た。
上、本願発明）JM109（pFL−２）株（特願昭63−187684
号）におけるリパーゼ活性は、それぞれ培養液1mlあた
り220 BALB単位、360 BALB単位、130 BALB単位であっ
た。
なお、以上の実施例における制限酵素、T4DNAリガー
ゼ、klenow断片を用いたプラスミドやDNA断片の処理及
び菌体からのプラスミドの調整は、特に指定されている
以外は通常用いられる方法によって行なった。制限酵素
類は日本ジーン社T4DNAリガーゼ、klenow断片は、宝酒
造社のものを用いた。
ゼ、klenow断片を用いたプラスミドやDNA断片の処理及
び菌体からのプラスミドの調整は、特に指定されている
以外は通常用いられる方法によって行なった。制限酵素
類は日本ジーン社T4DNAリガーゼ、klenow断片は、宝酒
造社のものを用いた。
【図面の簡単な説明】 第１図は、プラスミドpTC1の、第２図は、プラスミドpT
CE−lip及びpTCS−lipの構築工程を具体的に示した図で
ある。 第３図は、プラスミドpTCE−lip及びプラスミドpTCS−l
ipにおける、SD配列とリパーゼ翻訳開始コドンATG間のD
NA配列を示したものである。
CE−lip及びpTCS−lipの構築工程を具体的に示した図で
ある。 第３図は、プラスミドpTCE−lip及びプラスミドpTCS−l
ipにおける、SD配列とリパーゼ翻訳開始コドンATG間のD
NA配列を示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 吉田 尚之 千葉県市原市村上1750番地 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．141〔１〕（1986) Ｐ．185−190 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｏｄ．Ｓｃ ｉ．〔80〕（1983）Ｐ．21−25 Ｇｅｎｅ〔19〕（1982）Ｐ．259
Claims (3)
- 【請求項１】ａ）大腸菌内で複製可能であるマルチコピ
ー型のpUC系ベクターと、 ｂ）大腸菌トリプトファンオペロンのプロモーターと大
腸菌ラクトースオペロンのプロモーターとの融合プロモ
ーター（tacプロモーター）と ｃ）該プロモーター支配下に、シュードモナスフラジ
（Pseudomonas fragi）IFO 12049株由来のリパーゼをコ
ードするDNA配列を有し、SD配列と開始コドン間の塩基
配列がAACAGAATTC若しくはAACAGAATTCCCCであることを
特徴とするリパーゼ発現用組換え体プラスミド。 - 【請求項２】特許請求の範囲第（１）項に記載の組換え
体プラスミドに形質転換されてなる大腸菌株。 - 【請求項３】特許請求の範囲第（２）項に記載の大腸菌
株を用いることを特徴とするリパーゼの製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2055859A JP2587305B2 (ja) | 1990-03-07 | 1990-03-07 | リパーゼ発現用組換え体プラスミド及びリパーゼの製造法 |
| DK91101675T DK0451452T3 (da) | 1990-03-07 | 1991-02-07 | Rekombinant plasmid til lipaseekspression og fremgangsmåde til fremstilling af en lipase |
| DE1991615325 DE69115325T2 (de) | 1990-03-07 | 1991-02-07 | Rekombinantes Plasmid für die Expression von Lipase und Verfahren zur Herstellung von Lipase |
| EP19910101675 EP0451452B1 (en) | 1990-03-07 | 1991-02-07 | A recombinant plasmid for lipase expression and a process for producing a lipase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2055859A JP2587305B2 (ja) | 1990-03-07 | 1990-03-07 | リパーゼ発現用組換え体プラスミド及びリパーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03259085A JPH03259085A (ja) | 1991-11-19 |
| JP2587305B2 true JP2587305B2 (ja) | 1997-03-05 |
Family
ID=13010790
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2055859A Expired - Lifetime JP2587305B2 (ja) | 1990-03-07 | 1990-03-07 | リパーゼ発現用組換え体プラスミド及びリパーゼの製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0451452B1 (ja) |
| JP (1) | JP2587305B2 (ja) |
| DE (1) | DE69115325T2 (ja) |
| DK (1) | DK0451452T3 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0687A (ja) * | 1992-06-17 | 1994-01-11 | Chisso Corp | リパ−ゼ活性を有すタンパク質をコ−ドする遺伝子及びその製造法 |
| DK88892D0 (da) * | 1992-07-06 | 1992-07-06 | Novo Nordisk As | Forbindelse |
| US5534427A (en) * | 1992-07-31 | 1996-07-09 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Pseudomonas fluorescens lipase |
| AT399886B (de) * | 1992-07-31 | 1995-08-25 | Helmut Dipl Ing Dr Schwab | Esterase aus pseudomonas marginata |
| WO2012177655A2 (en) * | 2011-06-24 | 2012-12-27 | Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Methods and systems for tracking bioremediation processes |
| RU2507261C1 (ru) * | 2012-06-04 | 2014-02-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет" (НГУ) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pYP2, КОДИРУЮЩАЯ ФЕРМЕНТАТИВНО-АКТИВНУЮ ЧАСТЬ ПОЛИПЕПТИДА ЛИПАЗЫ, БЕЛКА ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОГО ТРАКТА ПЧЕЛИНОЙ ОГНЕВКИ |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60221091A (ja) * | 1983-12-21 | 1985-11-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 新規プロモ−タ− |
| ES2035043T3 (es) * | 1986-03-12 | 1993-04-16 | Imcera Group Inc. | Vectores de expresion hibridos, su construccion y usos. |
| DE3887656T2 (de) * | 1987-12-03 | 1994-06-16 | Chisso Corp | Lipasegen. |
-
1990
- 1990-03-07 JP JP2055859A patent/JP2587305B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-02-07 DK DK91101675T patent/DK0451452T3/da active
- 1991-02-07 EP EP19910101675 patent/EP0451452B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-07 DE DE1991615325 patent/DE69115325T2/de not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４１〔１〕（１９８６）Ｐ．１８５−１９０ |
| Ｇｅｎｅ〔１９〕（１９８２）Ｐ．２５９ |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｏｄ．Ｓｃｉ．〔８０〕（１９８３）Ｐ．２１−２５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69115325T2 (de) | 1996-05-30 |
| DK0451452T3 (da) | 1996-01-22 |
| EP0451452A1 (en) | 1991-10-16 |
| EP0451452B1 (en) | 1995-12-13 |
| DE69115325D1 (de) | 1996-01-25 |
| JPH03259085A (ja) | 1991-11-19 |
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