JPH07508416A - C.アンタルクチカのリパーゼ及びリパーゼ変異体 - Google Patents
C.アンタルクチカのリパーゼ及びリパーゼ変異体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
C,アンタルクチ力のリパーゼ及びリパーゼ変異体発明の分野
本発明は改良された特性を有する新規リパーゼ酵素変異体、前記変異体の発現に
ついてコードするDNA構築体、このDNA構築体由来の変異体を発現できる宿
主細胞、及び前記宿主細胞の培養によりかかる変異体を製造する方法に関する。
更に、本発明は組換えられた本質的に純粋なカンジダ アンタルクチ力(Can
dida antarctica)及びその変異体、並びに前記リパーゼ又はそ
の変異体をエンコードするDNA配列に関する。
発明の背景
微生物及び哺乳動物起源の広範囲にわたる様々なリパーゼが公知である。数多く
のこれらのリパーゼのアミノ酸配列が推定され、そしてその触媒的機能にとって
重要な構造及び機能要素に関して分析されている。例えば、Winklerら、
1990及びSchragら1991を参照のこと。リパーゼ酵素は脂質基質の
結合及び活性化に基づき、コンホメーション変化を受け、これはとりわけ、基質
に対する活性部位の暴露をもたらすことが見い出されている。このコンホメーシ
ョン変化は、酵素と基質との推定の相互作用と共に、とりわけBradyら19
90、 Brzozowskiら199+、 Derewendaら1992に
より述べられている。
数多くのリパーゼの構造の知識に基づき、組換DNA技術の利用によって改良さ
れた特性を存するリパーゼ変異体を構築することが可能となっている。即ち、W
o 92105249号は一定のリパーゼ変異体の構築体を開示しており、それ
においてはその脂質接触ゾーンが変更されており、異なる基質特異性を存する、
又は脂質基質に対するそのリパーゼの活性部位の向上した接近性を有する変異体
が供されている。その変更はアミノ酸置換による脂質接触ゾーンの静電荷、疎水
性又は表層コンホメーションの変化を包括する。
リパーゼのこの構造と機能との関係は上記した引用文献に記載の通り数多くの研
究の課題にされているが、その探求は主に基質結合及び活性化に基づくリパーゼ
の巨視的な特徴を焦点としており、基質結合及び触媒活性に事実上かかわるアミ
ノ酸の同定はあまり考察されていない。
発明の概要
数多くのリパーゼの構造及び活性の分析と組合せた配列整合により、本発明者は
驚くべきことに、リパーゼの重要な位置における一定のアミノ酸、特にトリプト
ファンの存在が、最適な触媒活性にとって重要であるようであることをこの度見
い出した。
従って、本発明の目的は、この重要な位置においてかかるアミノ酸残基を含んで
成らないリパーゼを(本明細書においてはこのリパーゼを親リパーゼと呼ぶ)、
その位置あるアミノ酸残基を高められた比活性を有する変異体をもたらしめるア
ミノ酸残基に置き換えることによって改良することにある。
より詳しくは、−の観点において、本発明は、このリパーゼ分子の主に疎水性の
長い結合ポケットに位置する活性セリンを含むトリプシン様触媒三つ組残基と、
加水分解の最中に脂質基質と相互作用し、このリパーゼ構造の脂質触媒ゾーンの
重要な位置に位置する、芳香族アミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基とを含んで
成る親リパーゼのリパーゼ変異体に関連し、ここでこのリパーゼ変異体において
前記アミノ酸残基はこの親リパーゼの比活性に比べて高められたそれをその変異
体に授けるために芳香族アミノ酸残基によって置換されている。
本明細書において、「トリプシン様」なる語は、この親リパーゼかその活性部位
においてトリプシンのそれに対応する触媒三つ組残基、即ち、アミノ酸Ser
、 His及びAsp 、 Glu 、 Asn又はGlnのいづれかを含んで
成ることを示唆している。
リパーゼはトリグリセリドを脂肪酸、グリセロール並びにジー及びモノグリセリ
ドへと分解する。このリパーゼ作用は基質の表層の存在下でのリパーゼの界面活
性化に依存する。活性化に基づき、リパーゼはそのコンホメーションを、その活
性部位のまわりの領域における界面疎水性か高まるように変化させる。リパーゼ
の界面活性化は例えばTilbeurghら(+993)により述べられている
。
研究したリパーゼは全て少な(とも−の表層ループ構造(蓋又はフラップとも呼
ぶ)を含んで成ることが認められ、これはリパーゼが不活性形態におけるときに
活性セリンを覆っている(かかるリパーゼの例はBradyら、1990により
述べられている)。リパーゼが活性化されたとき、そのループ構造はシフトして
活性部位残基を露出させ、強められた表層疎水性を存し、且つ加水分解の最中に
脂質基質と相互作用する活性部位Serを囲む表層をもたらしめる。本目的のた
め、この表層は「脂質接触ゾーン」と呼び、この表層内又はその構成部に位置す
る任意的にループ構造の形態におけるアミノ酸残基を含むことを意図している。
これらの残基は加水分解の最中の基質とのリパーゼ相互作用に関与し得、ここで
そのリパーゼは脂質表層との接触により活性化されたときに脂質相からトリグリ
セリドを加水分解する。
この脂質接触ゾーンは脂質基質に対する結合領域(いわゆる結合ポケット)を含
み、これは加水分解前に脂質基質が結合する脂質接触ゾーンの一部である。この
結合領域はいわゆる加水分解ポケットも含み、これは活性部位Serのまわりに
あり、そしてそこで脂質基質の加水分解が起こるものと信じられている。今日ま
で知られるリパーゼ全てにおいて、その接触ゾーンは、例えば適当なコンピュー
タープログラムにより作り出されるリパーゼの三次元構造から容易に認識される
。不活性及び活性化リパーゼそれぞれのコンホメーションを図1に示し、これを
以下で更に説明する。
本明細書において、リパーゼ分子の「重要な位置」はリパーゼ分子の脂質接触ゾ
ーンにおける位置であり、これは、脂質基質と相互作用し、且つ芳香族アミノ酸
残基とは異なるアミノ酸残基により古賀的に含まず、且つSeq ID No、
2に特定するアミノ酸配列を含んで成るC、アンタルクチカリパーゼA又はそ
の変異体に関連し、その変異体は
りリパーゼ活性を有し、
2 ) SEQ ID No、 2に示すアミノ酸配列を有するC、アンタルク
チ力リパーゼの少なくとも−のエピトープと反応性の抗体と反応し、及び/又は
、
3)C,アンタルクチ力リパーゼAをエンコードするSEQ ID No、 1
に示す全もしくは部分ヌクレオチド配列を基礎として調製されたオリゴヌクレオ
チドプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列によってエンコードされる
。
本発明のCアンタルクチ力リパーゼAは高い熱的安定性及び酸性11Hての活性
を含む数多くの所望の性質を有し、そして例えば下記の手順を利用することによ
り、組換DNA技術の利用を介して好適に製造されうる。従って、本発明のリパ
ーゼAは、WO88102775に記載の野生梨C,アンタルクチ力から精製し
たC、アンタルクチカリパーゼへより高い純度及び多い量で獲得されうる。
更に、本発明は、SEQ 10 No、 2に規定のアミノ酸配列を有するDN
A配列の改変体に関する。
バーゼAの変異体は「リパーゼA変異体」と呼んでいる。
本発明は上記のリパーゼ変異体をエンコードするDNA配列を又はCアンタルク
チカリパーゼAをエンコードするDNA配列を含んで成るDNA構築体、前記D
NA構築体を保有する組換発現ベクター、このDNA構築体又はこの発現ベクタ
ーで形質転換された細胞、並びにこのリパーゼ変異体の製造を誘発する条件下で
前記細胞を培養し、その後そのリパーゼ変異体をその培養物から回収することに
よってリパーゼ変異体を製造する方法にも関連する。
親リパーゼに比して高められた比活性を有する本発明のリパーゼ変異体はその親
リパーゼと同一の目的のために、好都合にはその高めの比活性に基づき、少ない
量で使用されうる。
従って、本発明は、洗剤酵素としての、消化酵素としての:エステル加水分解、
エステル合成もしくはエステル交換における本発明のリパーゼ変異体の利用;又
は例えば機械バルブを製造するためのプロセスにおける及び機械バルブを使用す
る製紙プロセスにおいて生ずるピッチの問題を解決するためのこのリパーゼ変異
体の利用に発明の詳細な開示
上記した通り、本発明は、最適触媒活性にとって、このリパーゼ分子の脂質接触
ゾーンに位置する一定の芳香族アミノ酸、特にトリプトファンの存在が重要であ
ることを見い出した。
芳香族アミノ酸残基、そして特にトリプトファン残基の存在の重要性は、脂質接
触ゾーンにおける重要な位置において、即ちEP体において、このトリプトファ
ン残基はフェニルアラニン、チロシン、ヒスデジ〉、イソロイノン、グルタミン
酸及びグリシンのそれぞれによって1換さねている。これらの突然変異体の比活
性は、野生梨リパーゼの100%から、フェニルアラニン突然変異体の約10%
、そしてグリシン突然変異体についての約2%にまで低下すること(上記の順で
)が見い出された。
何らの理論に拘束されるわけでもないか、この重要な位置、例えば活性セリンの
上部又はその近くに存在するアミノ酸残基は、a)リパーゼの活性化の際にリパ
ーゼと基質とから形成される四面体中間体の安定化及びb)不活性酵素における
活性セリンを覆う蓋領域の移動の活性化において関与しうるものと現状信じられ
ている。トリプトファンがこの位置に存在しているときに、上記のa)及びb)
に関係する最適性能が得られるものと考えられている。即ち、トリプトファンは
もっとも安定な四面体中間体の形成をもたらしめ(このことは、触媒作用が行わ
れるのに必要な活性化エネルギーの低下を意味する)、そして更に任意の触媒作
用が行われるのに必須の蓋の開放の活性化に関係するこの酵素の性能を高めるも
のと信じられている。
上記のa)に関連して、最良に活躍するリパーゼ変異体はその側鎖において不飽
和環系を含むことが認められている。最も大きい不飽和系はトリプトファンであ
り、次いでチロシン、フェニルアラニン、そしてヒスチジンである。これらの側
鎖はパイ電子系(「不飽和」)を存し、これは触媒作用におけるプロトン輸送に
とって重要であり得、それらは、四面体中間体を作り上げるための低めの活性化
エネルギーをもたらす(蓋の活性化及び開放を経て作り上げられたオキシアニオ
ンホールに至る活性部位ヒスチジン−セリンからのプロトン輸送が起こる場合)
。
上記の理論的な説明から、この重要な位置、例えば活性セリンの上部又はその近
くに存在する最適のアミノ酸はトリプトファンであろうことが理解される。とこ
ろで、親リパーゼがこの位置において芳香族アミノ酸残基を全く含まない又は側
鎖の中に不飽和環系を育しているアミノ酸残基を全く含まないものであるとき、
かかるアミノ酸をこの位置に置換せしめることが好都合でありうる。
従って、この親リパーゼが、その重要な位置において、側鎖の中に不飽和環系を
含んで成らないアミノ酸残基を有するとき、かかる不飽和環系を有するアミノ酸
残基、例えば芳香族アミノ酸(トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン又
はヒスチジン)をその重要な位置に置換せしめてよい。この親リパーゼの重要な
位置におけるアミノ酸残基かヒスチジンであるとき、それは好都合にはフェニル
アラニン、千ロジンそして最も好適にはトリプトファンによって置換せしめてよ
く、そのアミノ酸残基がチロシンであるとき、それは好都合にはフェニルアラニ
ン、そして最も好適にはトリプトファンによって置換せしめてよく、そしてその
アミノ酸残基がフェニルアラニンであるとき、それは好都合にはトリプトファン
によって置換せしめてよい。
いくつかのリパーゼにおけるこの重要な位置はその脂質接触ゾーンの中の全ての
位置であると考えられているが、この重要な位置は通常リパーゼ分子の結合ポケ
ットの中、そして好ましくはその加水分解ポケットの中に位置するであろう。は
とんどのリパーゼにとっては、この重要なアミノ酸残基は活性部位の上部又はそ
の近くに位置するものと信じられている。
この位置を占めているアミノ酸残基は、任意のリパーゼにおいて、l)課題のリ
パーゼのアミノ酸配列を、活性部位の上部もしくはその近くに位置するアミノ酸
残基が同定されている別のリパーゼのアミノ酸配列と整合させて、前記アミノ酸
残基の推定位置を同定する配列整合研究、及び/又は活性セリンの上部もしくは
近くのアミノ酸配列を同定するためのlN5IGHT (Biosym Tec
hnologies Inc、、 SanDiego、 USA)の如きの標準
ディスプレープログラムを利用する課題のリパーゼの三次構造の分析、によって
同定されつる。
より詳しくは、周知の技術に従ってリパーゼ対等物を表示するINs IGHT
の如きのコンピュータープログラムを基礎として、このリパーゼのとの部分か脂
質接触ゾーンを含んでいるかを指摘することは簡単である。1)もしリパーゼの
構造が不活性形態にあるとき、この脂質接触ゾーンは活性部位Serの側鎖の誘
導によって同定される。2)もしくはこの構造が活性形態にあるなら、他の残基
とは異なる色て全ての疎水性残基を着色することに基づく同定を更なる基準とす
ることかできうる。この構造のcpkモデルを作成するこの手順により、その脂
質接触ゾーンに特異的な疎水性表層が同定されうる。活性部位Serはこの分子
のこのより疎水性な部分の中に位置している。
いくつかのリパーゼにおいては、重要なアミノ酸残基は活性部位を覆っている表
層ループ構造の中に位置しているいか、又は結合ポケットもしくは加水分解ポケ
ットの如きの脂質接触ゾーンの表層の一部を構成することが認められているlも
しくは複数の表層ループ構造の中に位置している。
この重要な位置は通常1個のみのアミノ酸残基より成ると考えられるが、更に高
められた比活性を得るため、2個以上の残基を、好ましくは上記で説明した通り
トリプトファン残基で置換することが好都合でありうる。
本明細書に開示の改変により、重要な位置の中にトリプトファン残基を有さない
親リパーゼの比活性を2倍以上、例えば3倍以上、そして好ましくは4倍以上、
又は5,6もしくは7倍以上にさえも高めることが可能であると考えられる。
高められた基質特異性を有する本明細書で定義するリパーゼ変異体は様々な起源
の親リパーゼを基礎に調製されうるものと考えられている。即ち、この親リパー
ゼの微生物性リパーゼ又は哺乳動物性リパーゼでありうる。
のりパーゼAであるもの、好ましくはSEQ ID No、 2に示すアミノ酸
配列を存するもの、又は本明細書に定義するそのリパーゼA変異体である。この
C,アンタルクチカリパーゼへのリパーゼ変異体は好ましくはSEQ ID N
o、 2に示すアミノ酸配列を有し、それにおいては親リパーゼのフェニルアラ
ニン139はトリプトファン残基により置換されている。この変異体の構築及び
その性質の分析は実施例3゜5及び6に説明している。
本発明のリパーゼ変異体は、前述した通り、シュードモナス株、例えばPs、フ
ラギ(Ps、 fragi)の株に由来する親リパーゼを基礎に調製されつる。
活性セリンの上部又はその近くに位置するトリプトファンとは異なるアミノ酸残
基を有する適当なPs、フラギの例はAOYamaら、1988に記載されてい
る。本発明にかかわるリパーゼ変異体はSEQ 10 No、 3に示す前記リ
パーゼのアミノ酸配列におけるフェニルアラニン残基29をトリプトファン残基
によって置換することにより構築されうる。
本発明の親リパーゼの構築にとっての親リパーゼとして適当な菌類リパーゼの例
は、リゾプス(Rhizopus) 、特にR,デレマー(R。
delemar)又はR1二へウス(R,n1veus)に由来するものであり
、その後者のアミノ酸配列は例えばJP 64−80290の中で開示されてい
る。
この親リパーゼから本発明にかかわるリパーゼ変異体を構築するため、位置11
7にあるアラニン残基をトリプトファンの如きの芳香族アミノ酸残基に置き換え
る。R,ニベウスリパーゼ配列(SEQ IDNo、 5)とりシムコール ミ
ーへイリバーゼ配列(トリプトファン残基を含む) (SEQ ID No、
4)との配列整合を以下に示す。この整合から、Rニへウスリパーゼの重要な位
置が決定されつる。
ニベウス ロゴこyOズクより Sζズて乙にV力υζ1)ρIQ CREV
60配列 70 80 90 100 uo 120璽配列 130 140
150 160 170 x80Res/配列 四〇 200 210 220
230 240冒配列 250 260 270 280 290 コ0OR
es/本発明者は驚くべきことに、非膵臓系リパーゼ、例えば胃、舌又は肝臓リ
パーゼは、共通の特徴、即ち、リパーゼ分子の重要な位置、通常は活性セリンの
上部又は近くに位置しているものと同定されたアミノ酸かトリプトファンとは異
なっているという特徴を有することを見い出した。これはこの位置の中にトリプ
トファン残基を有することか一般的に見い出されている膵臓系リパーゼとは異な
る。従って、本明細書において、本発明のリパーゼ変異体の構築にとっての「親
リパーゼ」として非膵臓系補乳動物性リパーゼが好適に利用されつる。
従って、哺乳動物起源である本明細書に開示するリパーゼ変異体は胃、舌又は肝
臓起源の如きの非膵臓系の親リパーゼから好適に調製されうる。哺乳動物性リパ
ーゼはヒト、ラット、マウス、ブタ、イヌ又はその他の哺乳動物に由来しうる。
かがる哺乳動物性リパーゼの特定例には、A23045 (Dochertyら
、+985)として同定されている配列を有するラットの舌リパーゼ、A274
42 (Komaromyと5chotz。
1987)として同定されている配列を存するラットの肝臓リパーゼ、A335
53 (Dattaら、+988)として同定されている配列を有するヒト肝臓
リパーゼ、5O7145(Bodmerら、+987)として同定されているヒ
トの胃リパーゼ及びA37916 (Babaら、+991)として同定されて
いる配列を有するバイオ ソルト アクチベーテッド リパーゼ(BSAL:
Bio 5alt Activated Lipase)が含まれ、これらは全
て下記に示す配列整合分析において重要な位置に関して分析されている。この配
列整合研究に含まれている膵臓リパーゼはネズミの膵臓リパーゼA34671
(GrusbYら、1990) 、ブタの膵臓リパーゼAOO732(Caro
ら、+981) 、ヒトの膵臓リパーゼA34494 (Loweら、+989
)及び配列B24392を存するネコの膵臓リパーゼ(Mickelら、198
9)である。上記した各リパーゼのアミノ酸配列は上記の承認番号を存し、そし
て公共的に入手てきるデーターベースから入手できる。
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7442 DPAGFMFT17r 5PNERLS−、、、PDQAh’FV
D 2 GLSVGIK、QPZ−フラップ領域
上記した通り、本発明は、SEQ ID No、 2に示すアミノ酸配列を自1
)リパーゼ活性を有する、
2 ) SEQ ID No、 2に示すアミノ酸配列を有するC、アンタルク
デカリパーゼの少なくとち−のエピトープと反応性の抗体と反応する、に示す全
又は部分ヌクレオチド配列を基礎として調製されたオリゴヌクレオヂトブローブ
とハ・イブリダイズするヌクレオチド配列によってエンコードされる。
本明細書において、「変異体」なる語は、SEQ ID No、 2に示すアミ
ノ酸配列を有するC アンタルクデカリパーゼAに由来するリパーゼA変異体又
は天然の変異体を意味することを意図している。典型的には、この変異体は、天
然リパーゼAとは1もしくは複数個のアミノ酸残基によって相違し、その残基は
リパーゼのN末端もしくはC末端のいづれかもしくは両方で付加もしくは欠失さ
れているが、リパーゼのアミノ酸配列内の1もしくは複数の位置で挿入もしくは
欠失されているか、又はリパーゼのアミノ酸配列内もしくはいづれかもしくは両
方の末端で1もしくは複数個のアミノ酸で置換されているものであってよい。
更に、本発明の変異体は上記の1)〜3)の1又は複数の特徴的な性質を存する
。性質l)、即ち、この変異体の「リパーゼ活性」は任意の公知のリパーゼアッ
セイ、例えば下記の章の「方法」に記載しである標準のLUアッセイを利用して
決定されつる。
性質2)、即ち、本発明の変異体と、下記のSEQ ID No、 2に示すア
ミノ酸配列を有するC、アンタルクデカリパーゼAの少なくとも−のエピトープ
に対して発生させた又はそれと反応性の抗体との反応性は、例えば本発明のC,
アンタルクデカリパーゼAによるウサギの免疫による公知の方法で生産されたポ
リクローナル抗体によって決定されうる。この抗体反応性は当業界に公知のアッ
セイを利用して決定することができ、その例はウェスタンブロッティング又はラ
ジアル免疫拡散アッセイである。
調製されたオリゴヌクレオチドプローブを、標準のハイブリダイゼーション条件
のもとて実施するハイブリダイゼーション実験においてハイブリダイゼーション
プローブとして使用することにより調べることかてきうる。例えば、かかる条件
は、例えば5XのSSCの中での予i浸漬並びに20%のホルムアミド、5Xの
デンハーツ溶液、50mMのリン酸ナトリウム、pH6,8及び50μgの変性
音波処理済修生胸腺DNAの溶液の中での〜40°Cての1hにわたる予備ハイ
ブリダイゼーション、それに続<100μMのATPの補足された同一の溶液の
中での〜40°Cて18hにわたるハイブリダイゼーション、又は例えばSam
brOOkら、1989により述へられているその他の方法を含む特定の条件下
でのハイブリダイゼーションである。
オリゴヌクレオチドプローブを調製する基礎にするヌクレオチド配列はSEQ
ID No、 lに示すDNA配列であることが好都合である。
上記した通り、更なる観点において、本発明はSEQ [D No、 2に示す
アミノ酸配列を有するC、アンタルクデカリパーゼAをエンコードするDNA配
列又はC,アンタルクデカリパーゼAの変異体をエンコードする前記DNA配列
の改変体に関連し、この変異体は、1)リパーゼ活性を有する、
2) SEQ ID No、 2に示すアミノ酸配列を有するC、アンタルクデ
カリパーゼAの少なくとも−のエピトープと反応性の抗体と反応する、に示す全
又は部分ヌクレオチド配列を基礎にして調製したオリゴヌクレオチドプローブと
ハイブリダイズするヌクレオチド配列によってエンコードされる。
DNA配列の適当な改変の例は、別のエンコード化酵素のアミノ酸配列をもたら
しめないが、そのDNA配列を導入する宿主生物のコドン用法に対応しつるヌク
レオチド置換、又は別のアミノ酸配列をもたらしめるが、しかしながらその酵素
の上記の性質を損うことのないヌクレオチド置換である。可能な改変のその他の
例は、その配列の中への1又は複数個のヌクレオチドの挿入、その配列のいづれ
かの末端での1又は複数個のヌクレオチドの付加、及びその配列の末端もしくは
その中での1又は複数個のヌクレオチドの欠失である。
本発明のリパーゼ変異体の製造の方法
遺伝子への突然変異の導入のためのいくつかの方法が当業界に公知である。リパ
ーゼをエンコードするDNA配列のクローニングの簡車な説明の後に、リパーゼ
をエンコードする配列の中の特定の部位に突然変異を発生させるだめの方法を説
明する。
八をエンコードするDNA配列は当業界に公知の様々な方法により、課題のリパ
ーゼを産生ずる任意の細胞又は微生物から単離することができつる。まず、ゲノ
ムDNA及び/又はcDNAライブラリーを、研究すべきリパーゼを産生ずる生
物由来の染色体DNA又はメツセンジャーRNAを使用して構築すべきである。
次に、もしリパーゼのアミノ酸配列が公知であるなら、相同性のラベル化オリゴ
ヌクレオチドプローブを合成することができ、そしてそれを細菌DNAのゲノム
ライブラリー又は菌類cDNAライブラリーからリパーゼをエンコードするクロ
ーンを同定するのに利用することができる。他方、別の細菌又は菌類の株に由来
するリパーゼに対して相同性の配列を含むラベル化オリゴヌクレオチドプローブ
を、低緊縮のハイブリダイゼーション及び洗浄条件を利用してリパーゼをエンコ
ードするクローンを同定するプローブとして使用することができる。
リパーゼ産生クローンを同定するための更なる別の方法は、ゲノムDNAのフラ
グメントを発現ベクター、例えばプラスミドに挿入し、得られるゲノムDNAラ
イブラリーでリパーゼ陰性細菌を形質転換させ、次いてこの形質転換細菌をリパ
ーゼにとっての基質を含む寒天の上で平板培養することを含む。リパーゼ担持プ
ラスミドを含むその細菌は、分泌されたリパーゼによる基質の消化に基づき透明
な寒天の輪によって囲まれたコロニーを提供するであろう。
他方、この酵素をエンコードするDNA配列は樹立されている方法、例えばS、
L、 BeaucageとM、 H,Caruthers (1981)によ
り述べられているホスホアミジット法又はMatthesら(1984)により
述べられている方法によって合成的に調製されうる。ホスホアミジット法に従う
と、オリゴヌクレオチドを例えば自動DNA合成装置で合成し、精製し、アニー
ルし、リゲートし、そして適当なベクターの中にクローンする。
最後に、このDNA配列は、標準の技術に従い、合成、ゲノム又はcDNA起源
(適宜)のフラグメントをリゲートすることによって調製した混合型のゲノム及
び合成、混合型の合成及びcDNA又は合成型のゲノム及びcDNA起源であっ
てよく、それらフラグメントは全DNA配列の様々な部分に対応している。この
DNA配列は例えばUS 4.683.202又はR,K、 5aiki ら(
198B)に記載の特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR
)によっても調製されうる。
リパーゼをエンコードする配列の部位特異的突然変異誘発リパーゼをエンコード
するDNA配列が単離でき、そして突然変異のために所望される部位が同定でき
たら、合成オリゴヌクレオチドを利用して突然変異を導入することができつる。
これらのオリゴヌクレオチドは所望の突然変異部位にフランクするヌクレオチド
配列を含む、突然変異ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成中に挿入する。特
定の方法において、リパーゼをエンコードする配列を橋渡しするDNAの一本鎖
ギャップを、リパーゼ遺伝子を担持するベクターの中で作り上げる。次に、所望
の突然変異を抱える合成ヌクレオチドを一本@ DNAの相同性部分にアニール
する。次いで残りのギャップをDNAポリメラーゼI(フレノウフラグメント)
で補完し、そしてその構築体をT4リガーゼを用いてリゲートする。この方法の
特定の例はMorinagaら(1,984)に記載されている。米国特許第4
.760.025号は、カセットの微妙な変更を行うことによる複数の突然変異
をエンコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示しているが、しかしながらM
orinagaの方法によればより大きな様々な突然変異をいつでも一度に導入
することができ、その理由は様々な長さの複数のオリゴヌクレオチドを導入でき
るからである。
リパーゼをエンコードする配列への突然変異の導入の別の方法は、Nclson
とLong (1989)に記載されている。これは、PCR反応における−の
プライマーとして化学的に合成されたDNA illを利用することにより導入
した所望の突然変異を含むPCRフラグメントの3段階作成を包括している。P
CR作成フラグメントから、突然変異を担持するDNAフラグメントを制限エン
ドヌクレアーゼによる切断によって単離することができ、そして発現プラスミド
の中に再挿入することかできる。
リパーゼ変異体の発現
本発明に従い、C,アンタルクチ力リパーゼAをコードする配列又は上記の方法
もしくは当業界に知られる任意のその他の方法により製造された突然変異型リパ
ーゼをコードする配列は、酵素の形態において、プロモーター、オペレーター、
リポソーム結合部位、翻訳開始シグナル及び任意的にリプレッサー遺伝子もしく
は様々なアクチベーター遺伝子をエンコードするコントロール配列を典型的に含
んでいる発現ベクターを用いて発現させることができうる。発現されたタンパク
質の分泌を可能にするため、「シグナル配列」をエンコードするヌクレオチドを
リパーゼをコートする配列の前に挿入してよい。コントロール配列の誘発のもと
ての発現のため、本発明に従って処理すべき標的遺伝子は適切な読み取り枠の中
のコントロール配列に作動連結されている。プラスミドベクターの中に組込まれ
ることかでき、且つ突然変異リパーゼ遺伝子の転写を助けることのできるプロモ
ーター配列には、限定することなく、原核系β−ラクタマーゼプロモーター(V
illa−Kamaroffら(1978) ”)及びtacプロモーター(D
eBoerら、1983)が含まれる。更なる参考がrUsefulprote
ins from recombinant bacteriaJ (1980
)の中に見い出すこを、リパーゼA又は突然変異型のDNAを担持する発現ベク
ターによ題のDNA配列の前にあってよい。このシグナル配列は発現産物を細胞
壁まで輸送するのに働き、そこでその配列は分泌に基づきその産物から切り離さ
れる。本明細書で定義する「コントロール配列」なる語は、存在しているならシ
グナル配列を含むことを意図している。
本発明のリパーゼ又はリパーゼ変異体は宿主細胞として酵母細胞を用いることに
よっても製造されうる。適当な酵母宿主細胞の例に本発明のリパーゼA又はリパ
ーゼ変異体を製造する現状好適な方法において、宿主生物として糸状菌類を使用
する。この糸状菌類宿主生物は便宜上、組換タンパク質を製造するための宿主と
して今まリザの利用は例えばEP 238,023号に詳しく述べられている。
A又はリパーゼ突然変異体についてコードするDNA配列にプロモーターが先行
している。このプロモーターはアスペルギルスの中で強い転写活性を発揮し、且
つ細胞外又は細胞内タンパク質、例えばアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテ
アーゼ、リパーゼ、セルラーゼもしくは解糖酵素をエンコードする遺伝子に由来
しうる任意のDNA配列であってよい。
一ゼをエンコードする遺伝子に由来するものである。
揮するからである。TAKAアミラーゼプロモーターの配列はEP 238,0
23号より明らかとされている。
終止及びポリアデニル化配列はそのプロモーターと同じ起源に由来するものが適
当でありうる。
菌類宿主細胞を形質転換するために用いる技術はEP 238,023号に適切
に記載されている場合がある。
宿主細胞からのリパーゼA又はリパーゼ変異体の分泌を確実なものとするため、
リパーゼ変異体をエンコードするDNA配列には、天然のシグナル配列もしくは
その機能部分又はその細胞からタンパク質を分泌を担う合成配列か先行していて
よい。特に、このシグナル配列はアスペルギルス種のアミラーゼもしくはグルコ
アミラーゼをエンコードする遺伝子、リゾムコール ミーヘイのリパーゼもしく
はプロテアーゼをエンコードする遺伝子、又はヒュミコラのセルラーゼ、キシラ
ナーゼもしくはリパーゼをエンコードする遺伝子に由来しつる。このシグナル配
列は好ましくはA、オリザTAKAアミラーゼ、A、ニガー中性α−アミラーゼ
、A、ニガー酸安定性α−アミラーゼ又はA、ニガーグルコアミラーゼに由来す
る。
形質転換宿主細胞を培養するために用いた培地は、アスペルギル各細胞を培養す
るのに適当な任意の慣用の培地であってよい。この形質転換体は通常安定であり
、そして淘汰圧抜きで培養されつる。
しかしながら、もしその形質転換体が不安定であると認められたら、細胞の中に
導入する選択マーカーを選択のために使用してよい。
宿主細胞から分泌させた成熟リパーゼタンパク質は、遠心又は濾過により培地か
ら細胞を分離させる、次いで硫酸アンモニウムの如きの塩によってその培地のタ
ンパク質性成分を沈殿させる、それに続いてクロマトグラフィー手順、例えばイ
オン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を含む公知
の手順によって、培養培地から好適に回収することかできうる。
本発明のリパーゼ変異体は、向上した比活性を伴って、その親すバーセと同タイ
プの基質に対して活性であると考えられる。従って、本発明のリパーゼ変異体は
その親リパーゼと同一の目的のために作用であると考えられる。
従って、洗剤酵素として有用な親リパーゼから調製した本発明のリパーゼ変異体
は洗剤添加剤又は洗剤組成物中の活性成分として使用されうる。
本発明のリパーゼ変異体の別の考えられる用途は、例えば嚢胞性繊維症の処置に
おける消化酵素としてである。
本発明のリパーゼ変異体、特にC,アンタルクチカリバーゼの変異体の第三の用
途は、リパーゼ触媒化工程、例えばエステル加水分解、エステル合成及びエステ
ル交換における用途にある。これらの工程の中てのリパーゼの用途は、内容を引
用することで本明細書に組入れるWO88102775(Novo Nordi
sk A/S)に詳しく述べられている。
更に、C,アンタルクチ力は非特異的なリパーゼであるため、これは例えばマー
ガリンの製造におけるランダム化のために使用されつる。本発明のリパーゼ変異
体は、内容を引用することで本明細書に組入れるPCT/DK92100025
(Novo Nordisk A/S)に記載の通り、機械バルブについての
製造工程又は機械バルブを使用する製紙工程において生じるピッチの問題を解消
するために用いることができうる。
図面の簡単な説明
本発明を添付図面を参考に下記で説明し、ここで図1は、Wo 9210524
9に記載のHラヌギノーザリバーゼが不活性(閉じた)及び活性(開いた)形態
のそれぞれのときのそのリパーゼの脂質接触ゾーンの三次元構造を示している。
「白色」の残基は疎水性のアミノ酸(Ala、 Val、 Leu、Ice、
Pro、 Phe、 Trp、 Gly及びMet)を表わし、[黄色jの残基
は親水性のアミノ酸(Thr、 Ser。
Gln、 Asn、 Tyr及びCys)を表わし、「青色」の残基は正荷電ア
ミノ酸(Lys、 Arg及びHis)を表わし、そして「赤色」の残基は負荷
電アミノ酸(Glu及びAsp)を表わしている。
図2及び3は発現プラスミドpMT1229の構築のための図式を示している(
実施例1参照のこと)。
本発明を下記の実施例で更に説明するか、それらは本発明の範囲を限定すること
は意図しない。
材料
プラスミド及び微生物
pBoe 1777 (p777) (EP O,489,718に記載)p7
75 (ソ(7)構築はEP 0.238.023に記載)pIcI9H(Ma
rsh ら、Gene 32 (1984)、pp、481−485)pToc
90 (Wo 91/+7243に記載)アスペルギルス オリサ A1560
: IFO4177E コリMT172 (K12制限欠陥(7)E、:+す
MC1000誘導体)−膜力法
リパーゼ遺伝子の部位特異的インビトロ突然変異誘発リパーゼ遺伝子の中に突然
変異を導入するために、WO92105249に記載の3通りの異なる手法、即
ち、ZollerとSm1thのDNA、 Vol。
3、 No、 6.479−488 (+984)により述べられているオリゴ
ヌクレオチド部位特異的突然変異誘発、Ne1sonとLongのAnalyt
ical BiochemistrY。
180、147−151 (1989) i:記載(7) PCR法、及びいわ
ゆる「カセット突然変異誘発j技術(それにおいては、リパーゼをエンコードす
る領域の2つの制限部位の間のセグメントを、所望の突然変異を担持する合成り
NAフラグメントによって置換する)を利用してよい。後者の技術の利用を実施
例2に例示している。
リパーゼ比活性の決定
リパーゼの活性は、基質としてグリセリン トリブチレート(tribirat
)及び乳化剤としてアラビアゴムを用いてアッセイした。
ILtJ(IJハーゼ単位)ハ30″C,pH7,011分当り1μmolの滴
定可能な酪酸を遊離せしめる酵素の量である。リパーゼ活性はRadiomet
er滴定器VIT 90 (Radiometer、 Copenhagen)
を用いるpH−スタットによりアッセイした。このアッセイの更なる詳細は注量
に応じて入手できるNovo Analytical Methocl AF
9515に示している。
実施例
実施例1
年9月29日にDeutsche Sammlung von Mikroor
ganism (DSM)に寄託=DSM 3855)の染色体DNAを、凍結
細胞の石英による粉砕、それに続<Yeltonら(+984)に本質的に記載
の通りの抽出による開裂によって調製した。精製DNAをSau 3Aで部分的
に切り、そしてアガロースゲル電気泳動の後、3〜9kbの範囲におけるフラグ
メントを単離した。サイズ分別したSau 3AフラグメントをBamHI切断
した脱リン酸化プラスミドpBR322(New England Biola
bs)にリゲートさせた。
のインサートを含んでいた。
標準のコロニーハイブリダイゼーション技術Q111iatisら、1982)
を利用し、それらのコロニーを322−リン酸化オリゴヌクレオチドプローブN
OR440(SEQ 10 No、 7)でスクリーンした。NOI? 440
は成熟Cアンタルクチ力リバーゼAより決定されたN−末端を基礎とする縮重(
64) +7量体である(SEQ ID No、 2) 、低緊縮(41’C及
び6Xの5SC)ての洗浄の後に34のコロニーが陽性であることが認められた
。これらのコロニーからプラスミドを調製し、そしてBstNIによる制限処理
の後にササン分析した。サザン図のプローブはコロニーハイブリダイゼーション
(前述)のために用いたNOR440プローブ(SEQ ID No、 7)又
は321−ラベル化プローブNOR438(SEQ IDNo、 6)とした。
NOR438はオリゴヌクレオチド(推定量体Cguessmer ) )であ
り、13個の位置において、塩基は酵母及び糸状菌類に利用されているコドンを
基礎として選ばれている。
推定位置を表示
−のプラスミドpMTI076のみが、低緊縮(前述)においてNOR440に
及び若干高めの緊縮(55°C及びIXのS S C,)においてNOR438
にハイブリダイズするバンドを含んでいた。
pMTl、076を制限地図化し、そしてそのDNA配列をMaxam−Gil
ber法により決定した。解放読み取り枠を包括する配列をSEQ ID No
、 1に示す。解放読み取り枠は21個のアミノ酸の推定シグナル配列(van
Heineの法則に従う(von l1eijne、 G、 (1986)))
、そして更に成熟リパーゼのN−末端に先行する10個のアミノ酸のプロペプ
チドをエンコードする。このプロペプチドの最後の2個のアミノ酸はArgAr
g 、即ち、S、セレヒジェKEX−2型の酵素によるエンドタンパク質分解プ
ロセスのための典型的な切断部位である。このDNA配列によりエンコードされ
る成熟タンパク質のアミノ酸組成(位置32で開始)はCアンタルクチヵリバー
ゼへについて決定されたアミノ酸組成と一致する。下記の表を参照のこと:表
■
C,アンタルクチ力 リパーゼA (cALIP)のアミノ酸組成りNA配列よ
り推定 アミノ酸分析による(MC)図2及び3に示すいくつかの標準のプラス
ミド操作(Maniatisら、+982)を介し、Cアンタルクチカリバーゼ
への解放読み取り枠をルコアミラーゼ転写ターミネータ−との間に適正な配向て
置いた。
得られる発現プラスミドpMT+229をEP 305,216号に記載の通り
にΔ。
転換体を単離して増殖させ、そして培養土漬物をCアンタルクチカリバーゼへの
存在について分析した。
実施例2
ラスミドの構築
246 bpのBamHI / Bs5)] IIフラグメントを、PCR反応
においてオリゴヌクレオチドブライマー3116及び3117を用い、pMT
1229のヌクレオチド配列を基礎としてインビトロで合成した。プライマー3
117はBs5HII制限部位と、星印で表示している135のpheコドン(
TTC)〜trpコドン(TGG)における突然変異とを含む。
才’J コヌ’y しtナトlライマー 3116 (F135W : 256
−276) (SEQ 1ONo、 8)
5’ −CAG AACGAG GCG GTG GCCGAC−3’tlJ:
l)りり、iチドブ−7イア −3117(F135W : 566−487)
(SEQ IDNo、 9)
5°−TTCTTG AGCGCG CGG ATG CCG TCG AGG
ATA GCCATG CCCTCTTCG TAG CCA GCG AT
G AAG GCG GCT TTC* CRAG CCT TCG TG−3
゜PCR反応は、下記の成分を混合し、そしてその混合物をIIYBAID(商
標)熱反応器の中でインキュベートすることにより実施した。
得られる310 bpのフラグメントを電気泳動後の2%のアガロースゲルから
単離し、そしてBam1l r及びBs5HII制限酵素で消化した。得られる
264 bpのBamHI / Bs5HIIフラグメントを同様に2%のアガ
ロースゲルから単離した。次にこのフラグメントを以下のものとリゲートさせた
。
pMTI229 BamHI /Xba I O,3kbpMTI229 Bs
5HII /Sph I 0.5 kbpMT1229 Sph r /Xba
I 5. OkbリゲートさせたDNAをE、コリ株MT172に形質転換さ
せた。適正なインサートを含む形質転換体を選び、そしてそのDNA配列を5e
quenas (IJnited 5tated Biochemical C
orporation)の利用により決定した。−の得られるプラスミド(pM
E−1178)はアミノ部位135における突然変異を含んでいた( pheは
trpに突然変異していた)。
pME1178を、選択マーカーとしてA ニドウランス由来のamds遺伝子
を含むpToc90と共に、A、オリザA1560株の中に、WO91/172
43に記載の手順を利用して同時形質転換させた。A、オリザ形質転換体を選択
プレート上で2回再単離し、そして安定な形質転換体は抗−カンジダリパーゼA
抗体を使用してロケット免疫電気泳動により特性化した。形質転換体(株MEA
65)により産生されたカンジダリパーゼAを比活性について更に分析した。
実施例3
カンジダ アンタルクチ力リバーゼAのF139W変異体を発現するプラスミド
の構築
246 bpのBamHI / Bs5tl IIフラグメントを、PCR反応
においてオリゴヌクレオチドブライマー3116及び3826を使用して、プラ
スミドpMTI229のヌクレオチド配列を基礎としてインビトロで合成した。
プライマー3826はBs5liI[制限部位と、星印で表示している139
pheコドン(TTC)〜trpコドン(TGG)における突然変異とを含む。
オリゴヌクレオチドブライマー3116は実施例2に示している。
オリゴヌクレオチドブライマー3826 (F139W : 566−487)
(SEQ IDNo、 10)
5’ −TTCTTG AGCGCG CGG ATG CCG TCG AG
G ATA GCCATG CCCTCTTCG TAG CCA GCG A
TC* C本AG GCG GCT TTG AAG CCT TCG TG−
3’PCR反応は実施例2記載の方法により実施した。310 bpのフラグメ
ントを、電気泳動後の2%のアガロースゲルから単離し、そしてBamHI及び
Bs5t(I[制限酵素により消化した。得られる264 bl)のBamHI
/Bs5HI[フラグメントを同様に2%のアガロースゲルから単離した。
次にこのフラグメントを下記のものとリゲートさせた;pMT1229 Bam
HI /χbaI 0.3kbpMT1229 Bs5HI[/Sph I 0
.5 kbpMTI229 Sph I /Xba I 5. Okbリゲート
したDNAをE、コリ株MT172に形質転換させた。適正なインサートを含む
形質転換体を選択し、そしてそのDNA配列を5equenas (Unite
d 5tated Biochemical Corporation)の利用
により決定した。−の得られるプラスミド(pME−1229)はアミノ部位1
39において突然変異を含んでいた( pheはtrpに突然変異していた)。
pME1229を、選択マーカーとしてA ニドウランス由来のamds遺伝子
を含むpToc90と共に、A、オリザA1560株に同時形質転換させた。A
6オリザ形質転換体を選択プレート上で2回再単離し、そして安定な形質転換体
(!、lEA 155)の酵素活性を実施例5に記載の通りに基質としてトリブ
チレンを使用することにより分析した。
実施例4
カンジダ アンタルクチ力リパーゼAのF135W/F139W変異体を発現す
るプラスミドの構築
246 bpのBamHI / Bs5HIIフラグメントを、PCR反応にお
いてオリゴヌクレオチドブライマー3116及び4224を使用して、インビト
ロで合成した。プライマー4224はBs5llI[制限部位と、星印で表示し
ている+35及び139のpheコドン(TTC)〜trpコドン(TGG)に
おける突然変異とを含む。
オリゴヌクレオチドブライマー3116は実施例2に示している。
オリゴヌクレオチドブライマー4224 (F135W : 566−487)
(SEQ IDNo、II)
5“−TTCTTG AGCGCG CGG ATG CCG TCG AGG
ATA GCCATG CCCTCTTCG TAG CCA GCG AT
C* (JAG GCG GCT TTC* (JAG CCT TCG TG
−3゜PCR反応は実施例2記載の方法により実施した。310 bpのフラグ
メントを、電気泳動後の2%のアガロースゲルから単離し、そしてBam1i
I及びBs5HI[制限酵素により消化した。得られる2641)pのBamH
I/Bs5HIIフラグメントを同様に2%のアガロースゲルから単離した。
次にこのフラグメントを下記のものとリゲートさせた:pMT1229 Bam
tl I /Xba I 0.3 kbpMT+229 8ssHI[/Sph
I O,5kbpMT1229 Sph I /Xba I 5.0 kbリ
ゲートしたDNAをE、コリ株MTI72に形質転換させた。適正なインサート
を含む形質転換体を選択し、そしてそのDNA配列を5equenas (Ll
nited 5tated Biochemical Corporation
)の利用により決定した。−の得られるプラスミド(pME−1230)はアミ
ノ部位135及び139において突然変異を含んでいた( pheはtrpに突
然変異していた)。
pME+230を、選択マーカーとしてA ニドウランス由来のamds遺伝子
を含むpToc90と共に、A、オリザA1560株に同時形質転換させた。A
オリサ形質転換体を選択プレート上で2回再単離し、そして安定な形質転換体
の酵素活性を実施例5に記載の通りに基質としてトリブチレンを使用することに
より分析した。
実施例5
Cアンタルクチ力リバーゼA変異体F139W及びF135W/F139Wの精
製、並びにその親好生型C,アンタルクチ力リバーゼAとの比活性の比較
実施例3,4及び1のそれぞれに記載の通りに製造したリパーゼ変異体及び親リ
パーゼを下記の4段標準精製手順を利用して精製した。
段階1.上記の実施例1及び3に記載の形質転換A オリザ細胞を培養すること
により得られるリパーゼ及びリパーゼ変異体のそれぞれを含む発酵培地を遠心し
、そしてその上清液をpH7に合わせた。
イオン強度は2mSiに合わせた。DEAE−3ephadex A−50(P
harmacia)ゲルを膨潤させ、そして25n+IJのトリス酢酸バッファ
ーp117で平衡にした。その発酵上清液を焼結ガラスろう斗上のDEAE−3
ephadex A−50に通した。リパーゼ活性を含む溶出物を集め、そして
0.8Mの酢酸アンモニウムに合わせた。
段階2.適当なカラムにTSKゲルブチル−Toyopearl 650Cを充
填し、そして0.8Mの酢酸アンモニウムで平衡にした。リパーゼ活性を含む溶
出物をそのカラムに適用した。結合物質を水で溶離させた。
段階3:リパーゼ含有溶離液を次に高性能Q −5epharoseカラムに載
せた。リパーゼ活性物を溶出物として集めた。この方法により精製したリパーゼ
を280 nmて光学密度1に濃縮した。
リパーゼの純度を5DS−PAGEによりチェックし、約45kDの分子量を存
する一本のバンドが示された。リパーゼ活性は「−膜力法」の章に概略した方法
の利用により決定した。
親野生童リパーゼのリパーゼ活性は300 LU10D2.。であり、それt、
対してリパーゼ変異体FI39Wについては1200LU/ OD 、、。てあ
った。
挿入したトリプトファンについての補正抜きでのODt*。吸収に基づき、この
突然変異体の比活性は利用したアッセイでは少なくとも4倍高かった。リパーゼ
変異体F135W/F139Wのリパーゼ活性は1400LU10D、。であっ
た(2つの追加のトリプトファンについての補正抜き)。
実施例6
カンジダ アンタルクチカリバーゼA及びその突然変異体F139Wの熱安定性
C,アンタルクチ力リバーゼA及びC,アンタルクチカリパーゼム変異体の熱安
定性を、様々なpHにおいて示差走査熱量計(DSC)により調べた。この技術
を利用し、熱変性温度Tdを一定のプログラム率で酵素溶液を熱することにより
決定した。
より詳しくは、この調査のためにMicroCal Inc、由来の示差走査熱
量計MC−2Dを使用した。酵素溶液は50mMのバッファー溶液の中で調製し
た。下記の表を参照のこと。酵素濃度は0.6〜0.9 mg/mlの範囲にし
、そして各実験について約1.2mlの総容量を使用した。全てのサンプルを9
0°C/hrのスキャン速度で25°Cから90°Cまで熱した。
この分析から得られた結果を下記の表に示す:c;an+ リパーゼ A (W
T)
C,ant リパーゼ A 突然変異体(FI39W)0存在する酵素分子の約
半分が加熱中に熱変性した温度の熱安定性にとってのpl(最適性が異常に低く
、そして両酵素が1)H7より下で非常に熱安定性であることを示す。調べた範
囲内では、野生型及び突然変異体FI39Wの両者の熱安定性はpHが低まるほ
ど高まっていた。このことは、両リパーゼが比較的低いpH値での異常なほどの
高温での加水分解/合成に非常によく適するものとする。
本願における引用文献
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eringt(ydrolases : Evidence for a Co
mmon 5tructural Motif inTriacylglyce
ride Lipases and Esterases。
配列表
(1)−膜端fit :
(i)出願人:
(A)名 称: Novo N0RDISK A/5(B)通 リ: Nova
A11e
(C)市 : Bagsvaerd
(E)国 、デンマーク
(F)郵便番号: DK−2880
(G)を話番号: +4544448888(11)ファックス番号: +45
44493256(1)テレックス番号: 37304
(ii)発明の名称、リパーゼ変異体
(伍)配列の数=11
(iv)コンピューター読取形式
(A)媒体タイプ・フロッピーディスク(B)コンピューター: IBM PC
コンパチブル(C)作動システム: PC−DO5/MS−DOS(D)ソフト
ウェア、パテントイン リリース #1.O。
バージョン# 1.25 (EPO)
(2) SEQ [D No、 lについての情味・(i)配列の特徴:
(A)長 さ: 1389 塩基対
(B)タイプ:核 酸
(C)鎖の数;−重鎖
(D)トポロジー:直 鎖
(u)分子のタイプ、 DNA(ゲノム)(川l)ヒポセティカル、N0
(iii)アンチセンス No
(v)フラグメントのタイプ:内 部
(vi )生物起源:
(A)生 物:カンジダ アンタルクチ力(C)個別単離物: DSM 385
5(xl)配列についての情IR: SEQ ID No、 I :π−ζロ端
GCAJ■0:丁α込αη訊αAスα℃■α迅詰賞ゴα℃αスCπnスπDコ
1260α工酊α℃3x茫ワCユCαDゴσ乃工ω印品eeぢ訊工π;GCCA
AC日20αン工TTAG 1389
(2)SEQ 10 No、 2についての情報。
(i)配列の特徴
(A)長 さ 463アミノ酸
(B)タイプ アミノ酸
(C)鎖の数、−重鎖
(D)トポロジー 直 jJt
(11)分子のタイプ、タンパク質
(ii )ヒボセティカルニN0
(iii)アンチセンス、No
(V)フラグメントのタイプ N−末端(vi )生物起源
(△)生 物:カンジダ アンタルクチ力(C)個別単離物 DSM 3855
(Xl)配列についての情報 SEQ ID No、 2Ala Ala Va
l Igu Ala Ala Pro Ala Ala Glu Tnr 比り
判扁四Arg Aha工1e Gly Thr Phe Ala Lys Gl
y Gin ValIle Gln Sar Arg Lys Van Pr。
ThrAsp工1a Gly Asn Ala Asn Asn Ala Al
a Sar Phe Gin Leu Gin Tfr65 70 75 BC
)
9フエle Pro Ala Lys Pro Ala Ser Pro Pr
o Lys工1e Pha Ser Tyr G1nVaユ Tfr Glu
Asp Ala Thr ALa Lgu Asp Cys Ala pro
Sar Tyr ser 丁ンr115 120 Ll! 5
Lau ’Ihr Gly Leu Asp G知Pro Asn Lys V
al ’Ihr Ala Val Lau Asp ’Ih■
Pro Ile 工1e エユ” Gly Tr9 Ala Lau Gln
Gin Gly Tyr Tyr Val Val 5er145 150 1
55 ユ60
Gly P、et Ala工1e Lau psp cly工1e Arg A
la Lau Lys Asn Tyr Gln AsnLjIiIPrO5e
r Asp Ser Lys Val Ala Leu Glu Gly Ty
r Ser Gly Gly Ala+(is Ala Thr Val Tr
p Ala ’rhr Sar LaJ Ala Glu Sar T’fr
Ala Pro flu
Lau Asn工1eam Gly Ala Set His Gly Gly
Thr Pro Val Sar Ala Lys225 2コ0 235
240
Ala Gly Val Sar Gly ′LAu Ser Leu Ala
)Lis Pro Asp Met Glu Sar 1hhe
11e Pro Asp Glu工1a Val Pro Tyr Gin P
ro Ala Ala Thr Tyr Val Lys355 コロ0 35
5
(2) SEQ ID No、 3についての情報(i)配列の特徴。
(A)長 さ 277アミノ酸
(B)タイプ アミノ酸
(C)鎖の数・−重鎖
(D)l−ボロジー 直 鎖
(]」)分子のタイプ タンパク質
(m)ヒボセティカル、NO
(m)アンチセンス No
(V)フラグメントのタイプ 内 部
(V])生物起源
(A )生 物 ツユ−トモナス フラギ(Xl)配列についての情fa :
SEQ ID No、 3(2) SEQ ID No、 4についてのttJ
FI:(1)配列の特徴
(A、 )長 さ 269アミノ酸
(B)タイプ・アミノ酸
(C)鎖の数、−重鎖
(D)トポロン−直 鎖
(ii)分子のタイプ、タンパク質
(ii)ヒボセティカル、N0
(ii)アンチセンス、No
(v)フラグメントのタイプ:内 部
(vi )生物起源
(A)生 物 リゾムカー ミーヘイ
(xl)配列についての情報: SEQ ID No、 4:L65 170
175
(2) SEQ 10 No、 5についての情報:(i)配列の特徴。
(A)長 さ・297アミノ酸
(B)タイプ、アミノ酸
(C)jffの数、−重鎖
(D)トポロジー:直 鎖
(i)分子のタイプ タンパク質
(iii)ヒポセティカル:N0
(ii)アンチセンス No
(v)フラグメントのタイプ・内 部
(vl)生物起源
(A)生 物 リゾプス 二へウス
(xi)配列についての情報 SEQ ID No、 5 :(2) SEQ
ID No、 6についての情報:(i)配列の特徴
(A)長 さ 44 塩基対
(B)タイプ 核 酸
(C)鎖の数ニー重鎖
(D)トポロジー二直 鎖
(ii)分子のタイプ DNA (合成)(ii)ヒボセティカル NO
(m)アンチセンス No
(v)フラグメントのタイプ:内 部
(xl)配列についての情報: SEQ [D No、 6 :GCTGCTC
TGCCTAACCCTTA CGAYGAYCCT TTCTACACCA
CCCC44(2) SEQ ID No、 7についての情報。
(1)配列の特徴・
(A)長 さ 17 塩基対
(B)タイプ:核 酸
(C)鎖の数ニー重鎖
(D)トポロジー 直 鎖
(u)分子のタイプ DNA(合成)
(iii)ヒポセティカル、N。
TTCTTGAGCG CGCGGATGCCGTCGAGGATA GCCA
TGCCCT CTTCGTAGCC50AGCGATCCAG ’GCGGC
TTTCCAGCCTTCGTG 80Uc19
フロントページの続き
(51) Int、 C1,b 識別記号 庁内整理番号C12P 7/64
7432−4B
C12S 3108
D 21 C91087199−3B
//(C12N 9/20
C12R1:69)
(C12N 1/19
C12R1:69)
(72)発明者 アイエルーミターニ ミチデンマーク国、デーコー−2950
ベズベーク、ゴーエンゲスレッテン 31
(72)発明者 ポルチ、キム
デンマーク国、テーコー−1808コペンハーゲン コー、クレルケガゼ 12
. 2.テーパー。
I
(72)発明者 クラウセン、イブ グロスデンマーク国、デーコー−34OO
ヒレレーズ、フユレステイエシ 6
(72)発明者 ハンセン、モーゲンス トリエルデンマーク国、デーコー−3
450リュンゲ、モセバン 9
Claims (23)
- 1.リパーゼ分子の主に疎水性の長い結合ポケットの中に位置する活性セリンを 含むトリプシン様触媒三つ組残基と、リパーゼ構造の脂質接触ゾーンの重要な位 置に位置しており、加水分解の最中に脂質基質と相互作用する、芳香族アミノ酸 とは異なるアミノ酸残基とを含んで成る親リパーゼのリパーゼ変異体であって、 前記アミノ酸残基が、この親リパーゼのそれに比して高い比活性をその変異体に 授ける芳香族アミノ酸残基によって置換されている、リパーゼ変異体。
- 2.前記重要な位置に挿入すべき芳香族アミノ酸が、トリプトファン、フェニル アラニン、チロシン及びヒスチジンより成る群から選ばれる、請求項1記載のリ パーゼ変異体。
- 3.芳香族アミノ酸残基とは異なる前記アミノ酸残基がフェニルアラニン残基で ある、請求項1又は2記載のリパーゼ変異体。
- 4.リパーゼの重要な位置に位置している前記アミノ酸残基がトリプトファンで なく、そして前記アミノ酸残基がトリプトファン残基により置換されている、請 求項1〜3のいづれか1項記載のリパーゼ変異体。
- 5.前記親リパーゼが微生物又は哺乳動物性リパーゼより選ばれる、先の請求項 のいづれか1項記載のリパーゼ変異体。
- 6.前記親リパーゼが酵母性リパーゼである、請求項5記載のリパーゼ変異体。
- 7.前記親リパーゼがカンジダアンタルクチカの株に由来する、請求項6記載の リパーゼ変異体。
- 8.前記親リパーゼがC.アンタルクチカのリパーゼAである、請求項7記載の リパーゼ変異体。
- 9.SEQ ID No.1に示すアミノ酸配列を有し、親リパーゼのフェニル アラニン139がトリプトファン残基により置換されているか、又は親リパーゼ のフェニルアラニン135及び139がトリブトファン残基により置換されてい る、請求項8記載のリパーゼ変異体。
- 10.前記親リパーゼが細菌性リパーゼである、請求項5記載のリパーゼ変異体 。
- 11.前記親リパーゼがシュードモナスの株に由来する、請求項10記載のリパ ーゼ変異体。
- 12.Ps.フラギの株に由来する、請求項11記載のリパーゼ変異体。
- 13.SEQ ID No.3に示すアミノ酸配列を有し、親リパーゼのフェニ ルアラニン29がトリプトファン残基により置換されている、請求項12記載の リパーゼ変異体。
- 14.前記親リパーゼが菌類性リパーゼ、ヒト性リパーゼ、ネズミ性リパーゼ、 ラット性リパーゼ又はネコ性リパーゼである、請求項5記載のリパーゼ変異体。
- 15.C.アンタルクチカ由来の他の物質を本質的に含まず、SEQID No .2に示すアミノ酸配列を含んで成るC.アンタルクチカリパーゼA、又は 1)リパーゼ活性を有する、 2)アミノ酸配列SEQ ID No.2を有するC.アンタルクチカリパーゼ Aの少なくとも一のエピトープと反応性の抗体と反応する、及び/もしくは 3)C.アンタルクチカリパーゼAをエンコードするSEQ ID No.1に 示す全もしくは部分ヌクレオチド配列を基礎として調製されたオリゴヌクレオチ ドとハイブリダイズするヌクレオチド配列によりエンコードされる、 前記リパーゼの変異体。
- 16.SEQ ID No.2に示すアミノ酸配列を有するC.アンタルクチカ リパーゼAをエンコードするDNA、又は1)リパーゼ活性を有する、 2)アミノ酸配列SEQ ID No.2を有するC.アンタルクチカリパーゼ Aの少なくとも一のエピトープと反応性の抗体と反応する、及び/もしくは 3)C.アンタルクチカリパーゼAをエンコードするSEQ ID No.1に 示す全もしくは部分ヌクレオチド配列を基礎として調製されたオリゴヌクレオチ ドとハイブリダイズするヌクレオチド配列によりエンコードされる、 C.アンタルクチカリパーゼAの変異体をエンコードする前記DNA配列の改変 体。
- 17.請求項1〜14のいづれか1項記載のリパーゼ変異体又は請求項15記載 のC.アンタルクチカリパーゼAをエンコードするDNA配列を含んで成るDN A構築体。
- 18.請求項17記載のDNA構築体を担持している組換発現ベクター。
- 19.請求項17記載のDNA構築体又は請求項18記載のベクターにより形質 転換された細胞。
- 20.例えばアスペルギルス属に属する菌類細胞、例えばA.ニガー、A.オリ ザもしくはA.ニドウランス;例えばサッカロマイシスの株に属する酵母細胞、 例えばS.セレビシエ、又はハンセヌラ属に由来するメチロトローフ酵母、例え ばH.ポリモファもしくはフィシア(Phichia)、例えばP.パストリス (P.pastoris);又は例えばバチルスの株に属する細菌細胞、例えば B.スブチリス、B.リシェニホルミスもしくはB.レンタス、又はエッシェリ ヒア(Escherichia)の株に属する細菌細胞、例えばE.コリである 、請求項19記載の細胞。
- 21.請求項1〜14のいづれか1項記載のリパーゼ変異体を製造する方法であ って、請求項19又は20記載の細胞を、このリパーゼ変異体の製造を誘発する 条件下で培養し、そしてそのリパーゼ変異体をその後この培養物から回収する方 法。
- 22.請求項1〜14のいづれか1項記載のリパーゼ変異体又は請求項15記載 のC.アンタルクチカリパーゼAもしくはその変異体の、エステル加水分解、エ ステル合成又はエステル交換における利用。
- 23.請求項1〜14のいづれか1項記載のリパーゼ変異体又は請求項15記載 のC.アンタルクチカリパーゼAもしくはその変異体の、機械パルプの製造のた めの工程又は機械パルプを使用する製紙工程における、ピッチの問題を解消する ため利用。
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