BRPI0707199A2 - polipeptìdeo, polinucleotìdeo isolado, construção de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, e, método para a produção de polipeptìdeo - Google Patents

Abstract

POLIPEPTìDEO, POLINUCLEOTìDEO ISOLADO, CONSTRUçãO DE áCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSãO RECOMBINANTE, CéLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, E, MéTODO PARA A PRODUçãO DE POLIPEPTìDEO. A presente invenção diz respeito um polipeptídeo tendo atividade de lipase e que ainda tem um RP de pelo menos 0,8 e um BR de pelo menos 1,1 nas condições de teste dadas no relatório descritivo.

Description

"POLIPEPTIDEO, POLINUCLEOTIDEO ISOLADO, CONSTRUÇÃO DEÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE,CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, E, MÉTODO PARA APRODUÇÃO DE POLIPEPTIDEO"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos tendoatividade de lipase e polinucleotídeos que codificam os mesmos.FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

As lipases são úteis, por exemplo, como enzimas detergentespara remover lipídeos ou manchas de gordura de roupas e outros têxteis,como aditivos de massa para pão e outros produtos assados. Desta maneira, alipase derivada de Thermomyces lanuginosus (sinônimo Humicolalanuginosa, EP 258 068 e EP 305 216) é vendida para o uso detergente sob onome comercial Lipolase ® (produto da Novo Nordisk NS). O WO 0060063descreve variantes da lipase de T. lanuginosus com um desempenho deprimeira lavagem particularmente bom em uma solução detergente. O WO9704079, 9707202 e WO 0032758 também divulga variantes da lipase de T.lanuginosus. O WO 02062973 divulga lipase de T. lanuginosus com umaextensão de terminal C com tendência reduzida para a formação de odor.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isoladostendo atividade de lipase selecionada do grupo que consiste de lipases tendoum Desempenho Relativo Médio (RP) de pelo menos 0,8 e um RiscoBenefício (BR) de pelo menos 1,1 nas condições de teste dadas no relatóriodescritivo,

A presente invenção também diz respeito a variantes de lipasecom potencial reduzido para a degradação e a um método de prepará-los.Este, particularmente, diz respeito a variantes da lipase de Thermomyeesfanuginosus tendo uma preferência para cadeias longas de ácido graxoenquanto, ao mesmo tempo tendo um bom desempenho relativo.

Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a umpolinucleotídeo isolado que compreende uma seqüência de nucleotídeo quecodifica o polipeptídeo, uma construção de ácido nucleico que compreende opolinucleotídeo, um vetor de expressão recombinante que compreende aconcentração de ácido nucleico e uma célula hospedeira recombinante quecompreende a concentração de ácido nucleico.

A presente invenção também diz respeito a um método paraproduzir as lipases da invenção.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

A SEQ ID N°: 1 mostra a lipase que codifica a seqüência deDNA de Thermomyces lanoginosus.

A SEQ ID N°: 2 mostra uma seqüência de aminoácido de umalipase de Thermomyces lanoginosus,

A SEQ ID N°: 3 até a SEQ ID N0: 16 mostra as seqüênciaspara o alinhamento na figura 1

A SEQ ID N°: 17 e a SEQ ID N°: 18 mostram seqüênciasusadas para o exemplo de alinhamento.

DEFINIÇÕES

Atividade de lipase: O termo "atividade de lipase" é definidoneste como uma atividade de hidrolase de éster carboxílico que catalisa ahidrólise de triacilglicerol sob a formação de diacilglicerol e um carboxilato.Para os propósitos da presente invenção, atividade de lipase é determinada deacordo com o procedimento descrito em "Atividade de lipase" em "Materiaise métodos", Uma unidade da atividade de lipase é definida como a quantidadede enzima capaz de liberar 1,0 micro mol de ácido butírico por minuto a 30°C, pH 7.

Os polipeptídeos da presente invenção tem pelo menos 70%,tal como pelo menos 75% ou 80% ou 85% ou 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, ainda mais preferivelmente 96% ou 97%, mais preferivelmente98% ou 99%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 100% da atividade delipase medida como desempenho relativo do polipeptídeo que consiste daseqüência de aminoácido mostrado como o polipeptídeo maduro da SEQ IDN0:2, com as substituições T23IR + N233R.

Polipeptídeo isolado: O termo "polipeptídeo isolado" comousado neste refere-se a um polipeptídeo que é pelo menos 20% puro,preferivelmente pelo menos 40% puro, mais preferivelmente pelo menos 60%puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% puro, mais preferivelmentepelo menos 90% puro, e ainda mais preferivelmente pelo menos 95% puro,como determinado por SDS-PAGE.

Polipeptídeo substancialmente puro: O termo "polipeptídeosubstancialmente puro" indica neste uma preparação de polipeptídeo quecontém, como muito 10%, preferivelmente como muito 8%, maispreferivelmente como muito 6%, mais preferivelmente como muito 5%, maispreferivelmente como muito 4%, como muito 3%, ainda mais preferivelmentecomo muito 2%, mais preferivelmente como muito 1%, e ainda maispreferivelmente como muito 9,5% pelo peso do outro material de polipeptídeoque pelo qual é naturalmente associado. É, portanto, preferido que opolipeptídeo substancialmente puro é pelo menos 92% puro, preferivelmentepelo menos 94% puro, mais preferivelmente pelo menos 95% puro, maispreferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 96%puro, mais preferivelmente pelo menos 97% puro, mais preferivelmente pelomenos 98% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 99%, maispreferivelmente pelo menos 99,5% puro, e ainda mais preferivelmente 100%puro pelo peso do material de polipeptídeo total presente na preparação.

Os polipeptídeos da presente invenção são preferivelmente emuma forma pura substancialmente. Em particular, é preferido que ospolipeptídeos são em "forma pura essencialmente", isto é, que a preparaçãode polipeptídeo é essencialmente livre de outro material de polipeptídeo quepelo qual é naturalmente associado. Este pode ser realizado, por exemplo,pela preparação de polipeptídeo por meios de métodos recombinantes bemconhecidos ou por métodos de purificação clássica.

Em que, o termo "polipeptídeo substancialmente puro" ésinônimo com os termos "polipeptídeo isolado" e "polipeptídeo em formaisolada."

Identidade: A relação entre duas seqüências de aminoácido ouentre duas seqüências de nucleotídeos é descrito pelo parâmetro "identidade".

Para os propósitos da presente invenção, o alinhamento dasduas seqüências de aminoácido é determinada pelo uso do programa Needle apartir da embalagem EMBOSS (http://emboss.org) versão 2,8,0, Osimplementos do programa Needle o algoritmo de alinhamento global descritoem Needleman, S. S. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mai. Biol. 48, 443-453. Amatriz de substituição usada é BLOSUM62, a penalidade de abertura de fendaé 14, e a penalidade da extensão de fenda é 0,5.

O grau de identidade entre uma seqüência de aminoácido dapresente invenção ("seqüência da invenção"; por exemplo aminoácidos 1 a269 da SEQ ID N0:2) e uma seqüência de aminoácido diferente ("seqüênciaestranha") é calculada como o número de comparações exatas em umalinhamento de duas seqüências, dividida pelo comprimento da "seqüência dainvenção" ou o comprimento da "seqüência estranha", seja qual for a maiscurta. O resultado é expressado em identidade percentual.

Uma comparação exata ocorre quando a "seqüência dainvenção" e a "seqüência estranha" tem resíduos de aminoácidos idênticos nasmesmas posições da sobreposição (no exemplo de alinhamento abaixo este érepresentado por "1"). O comprimento da seqüência é o número de resíduos deaminoácido na seqüência (por exemplo o comprimento da SEQ ID N0:2 é269).No exemplo de alinhamento abaixo, a sobreposição é aseqüência de aminoácido "HTGER-NL" da seqüência A; ou uma seqüência deaminoácido "HGWGEDANL" da seqüência B. No exemplo uma fenda éindicada por "-".

Exemplo de alinhamento

<formula>formula see original document page 6</formula>

Fragmento de polipeptídeo: O termo "fragmento depolipeptídeo" é definido neste como um polipeptídeo tendo um ou maisaminoácidos anulados a partir do terminal amino e/ou carboxila da SEQ IDN°: 2 ou uma seqüência homóloga deste, em que o fragmento tem atividadede lipase.

Subseqüência: O termo "subseqüência" é definido neste comouma seqüência de nucleotídeo tendo um ou mais nucleotídeos anulados apartir da extremidade 5' e/ou 3' da SEQ ID N°: 1 ou uma seqüência homólogadeste, em que a subseqüência codifica um fragmento de polipeptídeo tendoatividade de lipase.

Variante alélica: O termo "variante alélica" indica nestequalquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmolocal cromossômico. A variação alélica origina-se naturalmente através damutação, e pode resultar em poliformismo sem populações. As mutações degene podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado)ou podem codificar polipeptídeos tendo seqüências de aminoácidos alterados.Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo que codifica poruma variante alélica de um gene.

PolinucIeotideo substancialmente puro: O termo"polinucleotídeo substancialmente puro" como usado neste refere-se a umapreparação de polinucleotídeo livre de outros nucleotídeos estranhos ou nãodesejados e em uma forma adequada para uso sem proteína projetadageneticamente por sistemas de produção. Desta maneira, um polinucleotídeosubstancialmente puro contém como muito 10%, preferivelmente como muito8%, mais preferivelmente como muito 5%, mais preferivelmente como muito5%, mais preferivelmente como muito 4%, mais preferivelmente como muito3%, ainda mais preferivelmente como muito 2%, mais preferivelmente comomuito 1%, e ainda mais preferivelmente como muito 0.5% pelo peso de outromaterial de polinucleotídeo que pelo qual é naturalmente associado. Umpolinucleotídeo substancialmente puro pode, entretanto, incluir ocorrêncianatural nas regiões não traduzidas 5' e 8', tais como promotores eterminadores. E preferido que o polinucleotídeo substancialmente puro é pelomenos 90% puro, preferivelmente pelo menos 92% puro, maispreferivelmente pelo menos 94% puro, mais preferivelmente pelo menos 95%puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelomenos 97% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 98% puro, maispreferivelmente pelo menos 99%, e ainda mais preferivelmente pelo menos99,5% puro pelo peso. Os polinucleotídeos da presente invenção sãopreferivelmente em uma forma pura substancialmente. Em particular, épreferido que os polinucleotídeos divulgados neste são em "forma puraessencialmente", isto é, que a preparação de polinucleotídeo é essencialmentelivre de outro material de polinucleotídeo que pelo qual é naturalmenteassociado. Em que, o termo "polinucleotídeo substancialmente puro" ésinônimo com os termos "polinucleotídeo isolado" e "polinucleotídeo emforma isolada." Os polinucleotídeos podem ser de origem sintética, semi-sintética, RNA, cDNA, genômico, ou quaisquer combinações destes.

cDNA: O termo "cDNA" é definido neste como uma moléculade DNA que pode ser preparada pela transcrição reversa a partir da moléculade mRNA, unida, madura obtida a partir de uma célula eucariótica. A falta deseqüências de íntron de cDNA que estão usualmente presentes no DNAgenômico correspondente. O transcrito de RNA primário, inicial é umprecursor ao mRNA que é processado através de uma série de etapas antesaparecidas como mRNA unido maduro. Estas etapas incluem a remoção dasseqüências de íntron por um processo denominado união. O cDNA derivadoda falta de mRNA, portanto, quaisquer seqüências de íntron.

Construção de ácido nucleico: O termo "construção de ácidonucleico" como usado neste refere-se a uma molécula de ácido nucleico,filamentada dupla ou simples, que é isolada a partir de um gene de ocorrêncianatural ou que é modificada por conter segmentos de ácidos nucleicos emuma maneira que não existiria de outra maneira natural. O termo construçãode ácido nucleico é sinônimo com o termo "cassete de expressão" quandouma concentração de ácido nucleico contém uma seqüência de controlerequerido para expressão de uma seqüência codificadora da presenteinvenção.

Seqüência de controle: O termo "seqüências de controle" édefinido neste por incluir todos os componentes, que são necessários ouvantajosos para a expressão de um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo da presente invenção. Cada seqüência de controle pode sernatural ou estranha à seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo.Tais seqüências de controle incluem, mas não são limitados a, um condutor,seqüência de poliadenilação, seqüência de propeptídeo, promotor, seqüênciade peptídeo de sinal, e terminador de transcrição. Em um mínimo, asseqüências de controle incluem um promotor, e sinais de interrupçãotranscripcional e tradução. As seqüências de controle podem ser fornecidascom ligadores para o propósito dos locais de restrição específico deintrodução facilitando a ligação das seqüências de controle com a regiãocodificadora da seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

Operacionalmente ligado: O termo "operacionalmenteligado" indica neste uma configuração em que a seqüência de controle écolocado em uma posição apropriada relativa á seqüência codificadora daseqüência de polinucleotídeo tal que a seqüência de controle direciona aexpressão da seqüência codificadora de um polipeptídeo.

Seqüência codificadora: Quando usado neste o termo"seqüência codificadora" significa uma seqüência de nucleotídeo, queespecifica diretamente a seqüência de aminoácido deste produto da proteína.Os limites da seqüência codificadora são geralmente determinados por umaestrutura de leitura aberta, que usualmente começam com o códon de partidaATG ou códons de partida alternativo tal como GTG e TTG. A seqüênciacodificadora pode uma seqüência de nucleotídeo recombinante ou DNA,cDNA.

Expressão: O termo "expressão" incluem qualquer etapa queenvolve na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitando a,transcripção, modificação pós-transcripcional, tradução, modificação de pós-tradução, e secreção.

Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" é definidoneste como uma molécula de DNA linear ou circular que compreende umpolinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção, e que éoperacionalmente ligado aos nucleotídeos adicionais que fornecem para estaexpressão.

Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira", como usadoem que, inclui qualquer tipo celular que é susceptível para transformação,transfecção, transdução, e outro com uma construção de ácido nucleico quecompreende um polinucleotídeo da presente invenção.

Modificação: O termo "modificação" significa neste qualquermodificação química do polipeptídeo que consiste do polipeptídeo maduro daSEQ ID N°: 2 bem como manipulação genética do DNA que codifica opolipeptídeo. A modificação(s) pode ser substituição (s), anulação (s) e/ouinserção (s) de aminoácido (s) bem como reposição (s) de cadeia secundáriade aminoácido (s).Variante artificial: Quando usado em que, o termo "varianteartificial" significa um polipeptídeo tendo atividade de lipase produzido porum organismo que expressa uma seqüência de nucleotídeo modificada daSEQ ID N°: 1. A seqüência de nucleotídeo modificada é obtida através daintervenção humana pela modificação da seqüência de nucleotídeo divulgadona SEQ ID N°: 1.

Desempenho relativo (RP): O termo desempenho relativoreflete o desempenho da variante de enzima comparada à enzima dereferência quando medida como a brilho da cor das amostras têxteis lavadascom a variante de enzima específica.

Fator de risco-benefício (BR): O fator de risco benefíciodescreve o desempenho da lavagem comparado ao risco de odor quando osubstrato é removido.

Convenções para designação de variantes:

Em variantes descritas de lipase de acordo com a invenção, aseguinte nomenclatura é usada para facilitar a referência:

Aminoácido original (s): posição (s): aminoácido substituído (s)

De acordo com esta nomenclatura, por exemplo a substituiçãode ácido glutâmico por glicina em posição 195 é mostrado como G195E. Aanulação da glicina na mesma posição é mostrado como G195*, e inserção deum resíduo de aminoácido adicional tal como lisina é mostrado comoG195GK.

Onde a lipase específica contém uma "anulação" emcomparação com outras lipases e uma inserção é feita em uma tal posição,esta é indicada como *36D por inserção de um ácido aspártico em posição 36.

Mutações múltiplas são separadas por sinais de adição, isto é:R170Y+G195E, representando mutações em posições 170 e 195 substituindotirosina e ácido glutâmico por arginina e glicina, respectivamente.O Χ231 indica o aminoácido em uma origem de polipeptídeocorrespondente à posição 231, quando aplicado o procedimento dealinhamento descrito. O X231R indica que o aminoácido é substituído por R.Para a SEQ ID N°: 2 X é T, e T231R deste modo indica uma substituição deT em posição 231 com R. Onde o aminoácido em uma posição (por exemplo231) pode ser substituído por um outro aminoácido selecionado a partir de umgrupo de aminoácidos, por exemplo o grupo que consiste de R e P e Y, esteserá indicado por X231 R/P/Y.

Em todos os casos, a letra simples IUPAC aceitada ouabreviação de aminoácido da letra tripla é utilizado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Polipeptídeos tendo atividade de lipase

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isoladostendo atividade de lipase selecionada do grupo que consiste de lipases tendoum RP de pelo menos 0,8 e um BR de pelo menos 1,1 nas condições de testedada na especificação.

Em uma forma de realização preferida a lipase tem um RP depelo menos 0,9, tal como 1,0 ouem uma forma de realização mais preferida alipase tem RP de pelo menos 1,2, tal como 1,3 ainda 1,4. Em uma outra formade realização a lipase tem um BR de pelo menos 1,2, tal como 1,3 ou ainda1,4.

Ainda em uma forma de realização mais preferida a lipase temum BR pelo menos 1,5, tal como 1,6 ou ainda 1,7.

Ainda em um aspecto a lipase da presente invenção ainda temum LU/A280 menor do que 1, tal como menor do que 0.95 nas condições deteste dado na especificação. Em uma forma de realização o LU/A280 relativoé menor do que 0,90, tal como menor do que 0,85 ou ainda menor do que0,80.

Ainda em um aspecto, a presente invenção relata polipeptídeosisolados tendo uma seqüência de aminoácido que é compreendido por ou quecompreende a SEQ ID N0:2, uma variante alélica deste, e que ainda tem BRde pelo menos 1,1 e RP de pelo menos 0,8. Em um outro aspecto, a presenteinvenção diz respeito a polipeptídeos isolados tendo uma seqüência deaminoácido que é compreendido por que compreende a parte madura da SEQID N0:2, uma variante alélica deste, e que ainda tem BR pelo menos 1,1 e RPde pelo menos 0,8.

Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção relatapolipeptídeos isolados tendo uma seqüência de aminoácido que tem um graude identidade ao polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2 (isto é, o polipeptídeomaduro) de pelo menos 80%, tal como pelo menos 85% ou 90%, ou pelomenos 95%, preferivelmente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelomenos 98%, ainda mais preferivelmente pelo menos 99%, que tem atividadede lipase (à seguir "polipeptídeos homólogos"). Em um aspecto preferido, ospolipeptídeos homólogos tem uma seqüência de aminoácido que difere-se pordez aminoácidos, por nove aminoácidos, por oito aminoácidos, por seteaminoácidos, por seis aminoácidos, preferivelmente por cinco aminoácidos,mais preferivelmente por quatro aminoácidos, ainda mais preferivelmente portrês aminoácidos, mais preferivelmente por dois aminoácidos, e ainda maispreferivelmente por um aminoácido a partir de polipeptídeos maduros da SEQID N°: 2.

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito apolipeptídeos isolados tendo atividade de lipase que são codificados pornucleotídeos que hidridizam sob condições de estringência muito baixas,preferivelmente condições de estringência baixa, mais preferivelmentecondições de estringência média, mais preferivelmente condições deestringência média-alta, ainda mais preferivelmente condições de estringênciaalta, e mais preferivelmente condições de estringência muito altas com (i)nucleotídeos 644 a 732 da SEQ ID N°: 1, (ii) a seqüência de cDNA contidasnos nucleotídeos 644 a 732 da SEQ ID N°: 1, (iii) a subseqüência de (i) ou(ii), ou (iv) um filamento complementar de (i), (ii), ou (iii) (J, Sambrook, E.F.Fritsch, e T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2oedição, Cold Spring Harbor, New York). A subseqüência da SEQ ID N°: 1contém pelo menos 100 nucleotídeos contínuos ou preferivelmente pelomenos 200 nucleotídeos contínuos. Além disso, a subseqüência pode codificarum fragmento de polipeptídeo que tem atividade de lipase.

A seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 1 ou umasubseqüência deste, bem como a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 2ou um fragmento deste, pode ser usado para designar uma sonda de ácidonucleico para identificar e clonar DNA que codifica polipeptídeos tendoatividade de lipase a partir de cepas de gêneros ou espécies diferentes deacordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondaspodem ser usadas para hibridização com o genômico ou cDNA de gênero ouespécie de interesse, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão, afim de identificar e isolar o gene correspondente deste. Tais sondas podem serconsideradas mais curtas do que as seqüências totais, mas serão pelo menos14, preferivelmente pelo menos 25, mais preferivelmente pelo menos 35, emais preferivelmente pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. É,entretanto, preferido que a sonda de ácido nucleico é pelo menos 100nucleotídeos em comprimento. Por exemplo, a sonda de ácido nucleico podeser pelo menos 200 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 300nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 400 nucleotídeos, ou maispreferivelmente pelo menos 500 nucleotídeos em comprimento. Ainda sondasmais longas podem ser usadas, por exemplo, sondas de ácido nucleico que sãopelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos preferivelmente pelo menos 700nucleotídeos, ou mais preferivelmente pelo menos 800 nucleotídeos emcomprimento. Tanto sondas de DNA quanto RNA podem ser usadas. Assondas são tipicamente rotuladas pela detecção do gene correspondente (porexemplo, com 32P, 3Ή, 35S, biotina, ou avidina). Tais sondas são abrangidaspela presente invenção.

Uma biblioteca genômica de DNA ou cDNA preparadas apartir de tais outros organismos podem, portanto, ser avaliadas pelo DNA quehibridizam com as sondas descritas acima e que codificam um polipeptídeotendo atividade de lipase. O DNA genômico ou outro a partir de tais outrosorganismos podem ser separados pela eletroforese em gel de agarose oupoliacrilamida, ou outras técnicas de separação. O DNA de bibliotecas ou oDNA separado pode ser transferido e imobilizado em nitrocelulose ou outromaterial carregador adequado. A fim de identificar um clone ou DNA queseja homólogo com a SEQ ID N0: 1 ou uma subseqüência deste, o materialcarregador é usado em um Southern blot.

Para os propósitos da presente invenção, a hidridização indicaque a seqüência de nucleotídeo hibridiza a ser rotulada por sonda de ácidonucleico correspondente à seqüência de nucleotídeo mostrado na SEQ ID N°:1, este filamento complementar, ou uma subseqüência deste, sob condições deestringência muito baixa ou muito alta. As moléculas pelo qual a sonda deácido nucleico hibridiza sob estas condições podem ser detectadas usandopelícula de raio X.

Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção dizrespeito a variantes artificiais que compreendem uma substituiçãoconservativa, anulação, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos da SEQ IDN°: 2 ou o polipeptídeo maduro deste, as ditas variantes tem um BR de pelomenos 1,1 e um RP de pelo menos 0,8. Preferivelmente, as mudanças deaminoácidos são de menor natureza, que é substituições de aminoácidosconservativos ou inserção que não significantemente afeta o dobramento e/ouatividade da proteína; anulações pequenas, tipicamente de um a cerca de 30aminoácidos; extensões de terminal amino ou carboxila pequenos, tal comoum resíduo de metionina de terminal amino; um peptídeo ligador pequeno deaté cerca de 20 a 25 resíduos; ou uma extensão pequena que facilitam apurificação pela carga de rede de mudança ou uma outra função, tal como umtrato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupode aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos(ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina easparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina),aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidospequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições deaminoácido que não geralmente alteram a atividade específica são conhecidosna técnica e são descritos, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, In,The Proteins, Academic Press, New York. As trocas de ocorrência maiscomum são Ala/Ser, Val/Ile. Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn,Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/11 e, Leu/Vai,Ala/Glu, e Asp/Gly.

Além disso os 20 aminoácidos padrão, aminoácidos nãopadrão (tal como 4-hidroxiprolina, 6-N metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico,isovalina, e alfa-metil serina) podem ser substituídos por resíduos deaminoácido de um polipeptídeo de tipo selvagem. Um número limitado deaminoácidos não conservativos, aminoácidos que não são codificados pelocódigo genético, e aminoácidos não naturais podem ser substituídos porresíduos de aminoácido. "Aminoácidos não naturais" foram modificados apósa síntese das proteínas, e/ou tiveram uma estrutura química em sua cadeiasecundária (s) diferente do que dos aminoácidos padrão. Os aminoácidos nãonaturais podem ser quimicamente sintetizados, e preferivelmente, sãocomercialmente disponíveis, e incluem ácido pepicólico, ácido carboxílicotiazolidina, desidroprolina, metilprolina 3 e 4, e 3,3-dimetilprolina.

Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma talnatureza que as propriedades físicos-químicas dos polipeptídeos são alteradas.Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidadetérmica do polipeptídeo, alterando a especificidade do substrato, mudando opH ótimo, e outros.

Aminoácidos essenciais na origem do polipeptídeo pode seridentificado de acordo com o procedimento conhecido na técnica, tal comomutagênese direcionada ao local ou mutagênese de varredura de alanina(Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085), Na técnica posterior,as mutações de alanina simples são introduzidas em todo o resíduo namolécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas por atividadesbiológicas (isto é, atividade de lipase) para identificar resíduos de aminoácidoque são críticos à atividade da molécula. Ver também, Hilton et al, 1996, J.Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interaçãobiológica também pode ser determinada por análise física da estrutura, comodeterminado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear,cristalografia, difração de elétron, ou rotulagem de fotoafinidade, emconjunção com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, porexemplo, de Vos et al, 1992, Science 255: 306-312; Smith at al, 1992, J Mot.Biel. 224: 899-904; Wlodaver at al, 1992, FEBS Lett 309:59-64. Asidentidades de aminoácidos essenciais também podem ser inferidas a partir deanálise de identidades com polipeptídeos que são relatados a um polipeptídeode acordo com a invenção.

Múltiplos ou simples as substituições de aminoácido podemser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese,recombinação, e/ou mistura, segue por um procedimento de avaliaçãorelevante, tal como aquele divulgado por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988,Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:2152-2156; WO 95117413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem serusados incluem PCR propenso ao erro, apresentação de fago (por exemplo,Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; Patente U.S. N0 5.223.409;WO 92/06204), e mutagênese direcionada por região (Derbyshire et al, 1986,Gene 46:145; Ner et al, 1988, DNA 7:127).

Os métodos de mutagênese/mistura podem ser combinadoscom rendimento alto, métodos de avaliação automatizado para detectaratividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados expressados por célulahospedeiras. (Moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeosativos podem ser recuperadas a partir de células hospedeiras e rapidamenteseqüenciada usando métodos padrão na técnica. Este métodos permitem adeterminação rápida da importância de resíduos de aminoácido individuaisem um polipeptídeo de interesse, e podem ser aplicados por polipeptídeos deestruturas não conhecidas.

O número total de substituições de aminoácido, anulações e/ouinserção de aminoácidos 1 a 291 da SEQ ID N°: 2 é 10, preferivelmente 9,mais preferivelmente 8, mais preferivelmente 7, mais preferivelmente comomuito 6, mais preferivelmente como muito 5, mais preferivelmente 4, aindamais preferivelmente 3, mais preferivelmente 2, e ainda mais preferivelmente1.

Identificação de regiões e substituições

As substituições cobertas pela presente aplicação podem seridentificadas como divulgado nesta seção.

As posições referidas na região I através da região IV abaixosão as posições dos resíduos de aminoácido na SEQ ID N0: 2. Para descobriras posições correspondentes (ou homólogos) em uma lipase diferente, oprocedimento descrito em "Homologia e alinhamento" é usado.Substituições na região I

A região I consiste de resíduos de aminoácidos adjacentes eResíduos El de terminal N. Nesta região é preferido substituir um aminoácidoda origem de lipase com um aminoácido positivo.

Os resíduos de aminoácidos correspondentes às posiçõesseguintes são compreendidos pela região I: 2 a 11 e 223 a 239. As posiçõesseguintes são de interesse particular: 4, 8, 11, 223, 229, 231, 233, 234, 236.

Em particular as substituições seguintes foram identificadas;X4V, X23 IRe X233R,

Em uma forma de realização preferida a lipase de variante tempelo menos 80%, tal como 85% ou 90%, tal como pelo menos 95% ou 98%ou 99% de identidade da SEQ ID N0:2.

Substituições na região II

A região II consiste de resíduos de aminoácido em contatocom abstrato em uma cadeia de acila secundária em uma parte de álcoolsecundário, nesta região é preferido por substituir um aminoácido a origem dalipase com um aminoácido mais positivo que um aminoácido menoshidrofóbico.

Os resíduos de aminoácido correspondentes às seguintesposições são compreendidos pela região II: 202 a 211 e 249 a 269, Asposições seguintes são de interesse particular: 202, 210, 211, 253, 254, 255,256.

Em particular as seguintes substituições foram identificadas:X202G, X255YN e X258K/R.

Em uma forma de realização preferida a lipase de variante tempelo menos 80%, tal como 85% ou 90%, tal como pelo menos 95% ou 98%ou 99%% de identidade da SEQ ID N0:2

Substituições na região III

A região III consiste de resíduos de aminoácidos que formam aestrutura flexível e deste modo permitem o substrato conseguir no local ativo.Nesta região é preferido substituir um aminoácido de uma origem de lipase aum aminoácido mais positivo ou um aminoácido menos hidrofóbico.

Os resíduos de aminoácidos correspondentes às posiçõesseguintes são compreendidos pela região III: 82 a 102. As posições seguintessão de interesse particular: 86, 87, 90, 91, 95, 96, 99. Em particular assubstituições seguintes foram identificadas; X86V e X90 A/R.

Em uma forma de realização preferida a lipase de variante tempelo menos 80%, tal como 85% ou 90%, tal como pelo menos 95% ou 98%ou 99% de identidade da SEQ ID N0:2

Substituições na região IV

A região IV consiste de resíduos de aminoácidos que ligam-seeletrostaticamente á superfície. Nesta região é preferido por substituir umaminoácido de um origem de lipase com um aminoácido positivo.

Os resíduos de aminoácido correspondente às posiçõesseguintes são compreendidos pela região IV: 27 e 54 a 62. As posiçõesseguintes são de interesse particular: 27, 56, 57, 58, 60.

Em particular as seguintes substituições foram identificadas:X27R, X58N/AG/T/P e X60V/S/G/N/R/K/A/L.

Em uma forma de realização preferida a lipase de variante tempelo menos 80%, tal como 85% ou 90%, tal como pelo menos 95% ou 98%ou 99% de identidade da SEQ ID N0:2Aminoácidos em outras posições

A origem da lipase pode opcionalmente compreender asubstituição de outros aminoácidos, particularmente menos do que 10 oumenos do que 5 de tais substituições. Exemplos são substituiçõescorrespondentes para uma ou mais das posições 24, 46, 74, 81, 83, 127, 131,137, 147, 150, 203, 206, 211, 263, 264, 265, 267 e 269 da SEQ ID N°: 2. Emuma forma de realização particular aqui é uma substituição em que pelomenos uma das posições correspondente à posição 81, 147, 150, 227 e 249.Em uma forma de realização preferida pelo menos uma substituição éselecionada do grupo que consiste de X81Q/E, X147M/Y, X150G, X227G eX249R/I/L.

Substituições adicionais podem, por exemplo, ser feitas deacordo com o princípio conhecido na técnica, por exemplo substituiçõesdescritas em WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079 eWO 97/07202.

HomoIogia e alinhamento

Para os propósitos da presente invenção, o grau de homologiapode ser adequadamente determinado por meios de programas de computadorconhecidos na técnica, tal como GAP fornecido na embalagem do programaGCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versão 8, agosto 1994,Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA53711) (Needleman, S.B. e Wunsch, C.D., (1970), Journal of MolecularBiology, 48, 443-45), usando GAP os seguintes ajustes para comparação deseqüência de polipeptídeo: Penalidade de criação de GAP de 3,0 e penalidadede extensão de GAP de 0,1.

Em uma presente invenção, posições correspondentes (ouhomólogo) nas seqüências de lipase de Absidia reflexa, Absidia corym befera,Rhizmucor miehei, Rhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillustubigensis, Fusarium oxysporum, Fusarium heterosporum, Aspergillus oryzea,Penicillium camembertii. Aspergillus foetidus, Aspergillus niger,Thermomyces lanoginosus (sinônimo: Humicola lanuginose) e Landerinapenisapora são definidos pelo alinhamento mostrado na Figura 1.

Para observar as posições homólogas nas seqüências de lipasenão mostradas no alinhamento, a seqüência de interesse é alinhada ásseqüências mostradas na Figura 1, A nova seqüência é alinhada aoalinhamento presente na Figura 1 por usar o alinhamento GAP á seqüênciamais homóloga observada no programa GAP. GAP é fornecido na embalagemdo programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versão 8,August. 1994, Genetics Computer Group, 675 Science Drive, Madison,Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. e Wunsch, C.D., (1970), Journalof Molecular Biology, 48, 443-45). Os ajustes seguintes são usados paracomparação da seqüência de polipeptídeo: penalidade de criação de GAP de3,0 e penalidade de extensão de GAP de 0,1.

Qualquer origem de lipase adequada pode ser usada. Em umaforma de realização preferida, a origem da lipase tem uma homologia de pelomenos 50% com a lipase de T. Ianuginosus (SEQ ID N°: 2), particularmentepelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelomenos 90%, mais do que 95%, ou 96%, ou 97% ou mais do que 98% ou 99%.

Em uma forma de realização particular a origem da lipase é idêntica à lipase Tlanuginosus (SEQ ID N0:2).

Fontes de polipeptídeos tendo atividade de lipase

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser obtido a partirde microorganismos de qualquer gênero. Para os propósitos da presenteinvenção, o termo "obtido a partir de" como usado neste em conexão comuma dada fonte deve significar que o polipeptídeo codificado por umaseqüência de nucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa em que aseqüência de nucleotídeo a partir da fonte foi inserida. Em um aspectopreferido, o polipeptídeo obtido a partir de uma dada fonte é secretadaextracelularmente.

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser umpolipeptídeo bacteriano, Por exemplo, o polipeptídeo pode ser umpolipeptídeo bacteriano de gram-positivo tal como polipeptídeo Bacillus, porexemplo, um Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillusbrevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus,Bacillus licheniformis, Bacillus megateriurn, Bacillus stearothermophilus,Bacillus subtilis, ou polipeptídeo Bacillus thuringiensis; ou um polipeptídeoStreptomyces, por exemplo, um polipeptídeo Streptomyces lividans ouStreptomyces murinus; ou um polipeptídeo bacteriano gram negativo, porexemplo, uma célula B ou um polipeptídeo Pseudomanas sp..

Um polipeptídeo da presente invenção também pode ser umpolipeptídeo fungico, e mais preferivelmente um polipeptídeo de levedura talcomo um polipeptídeo Candida, Kluyveromyces, Piehia, Saccharomyces,Schizosaceharomyees, ou Yarrowia; ou mais preferivelmente um polipeptídeofungico filamentoso tal como um polipeptídeo Aeremonium, Aspergillus,Aureobasidium, Cryptoeoeeus, Filobasidium, Fusarium, Humieola,Magnaporthe, Mueor, Myceliophthora, Neoeallimastix, Neurospora,Paeeilomyees, Penieillium, Piromyees, Sehizophyllum, Talaromyees,Thermoaseus, Thielavia, Tolypoeladium, ou Triehoderma

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeoSaccharomyees carlsbergensis, Saccharomyees cerevisiae, Saccharomycesdiastatieus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri,Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis tendo atividade delipase.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo Aspergillus aeuleatus, Aspergillus awamori, Aspergillusfumigates, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonieus, Aspergillus nidulans,Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus turbigensis, Fusariumbaetridioides, Fusarium eerealis, Fusarium crookwellense, Fusariumeulmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusariumheferosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusariumretieulatum, Fuserium roseum, Fusarium sambueinum, Fusariumsareoehroum, Fusarium sporatrichioides, Fusarium sulphureum, Fusariumtorulosum, Fuserium triehotheeioides, Fuserium venenatum, Humieolainsolens, Thermomyees lanoginosus (sinônimo: Humieola lanuginose), Mucormiehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penieilliumpurpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Triehodermalongibraehiatum, Triehoderma reesei, ou Trichoderma viride.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Thermomyees.Em um aspecto mais preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Thermomyces lanuginosus, por exemplo, o polipeptídeo daSEQ ID N°: 2 com mutações como divulgado na presente aplicação.

Será entendido que nas espécies mencionadas acima, ainvenção abranja tanto o estado perfeito quanto o imperfeito, e outrosequivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, com respeito a nomes deespécies pelo qual estes são conhecidos. Aqueles habilitados na técnicareconhecerão rapidamente a identidade dos equivalentes apropriados.

Cepas destas espécies são rapidamente acessíveis ao públicoem uma diversa coleção de cultura, tal como a American Type CultureCollection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen eZellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS),e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern RegionalResearch Center (NRRL).

Além disso, tais polipeptídeos podem ser identificados eobtidos a partir de outras fontes incluindo microorganismos isolados danatureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) usando as fontesmencionadas acima. As técnicas pata microorganismos de isolamento dehabitantes naturais são bem conhecidos na técnica. O polipeptídeo pode entãoser obtido similarmente pela avaliação de uma biblioteca de cDNA genômicode outros microorganismos. Cada uma seqüência de polinucleotídeo quecodifica um polipeptídeo foi detectada com a fonte (s), o polinucleotídeo podeacarretar clonados isolados pela técnica de utilização que são bem conhecidoàqueles de habilidade comum na técnica (ver, por exemplo, Sambrook aL,1989, supra).

Os polipeptídeos da presente invenção também incluempolipeptídeos fundidos ou polipeptídeos clivados de fusão em que outrospolipeptídeos é fundido no terminal N ou no terminal C do polipeptídeo oufragmento deste. Um polipeptídeo fundido é produzido pela fusão de umaseqüência de nucleotídeo (ou uma porção deste) codificando um outropolipeptídeo de uma seqüência de nucleotídeo (ou uma porção deste) dapresente invenção. As técnicas para a fusão de produção de polipeptídeos sãoconhecidos na técnica, e incluem ligação de seqüência codificada que codificaos polipeptídeos na mesma estrutura e que a expressão de polipeptídeofundido está sob controle do mesmo promotor (s) e terminador.

Polinucleotídeos

A presente invenção também diz respeito a um polinucleotídeoisolado tendo uma seqüência de nucleotídeo que codificam um polipeptídeoda presente invenção, A presente invenção também abrange seqüências denucleotídeo que codificam um polipeptídeo sendo uma variante de seqüênciade aminoácido da SEQ ID N°: 2 o polipeptídeo maduro deste, que difere dopolinucleotídeo codificador pela virtude da degeneração do código genético.

A presente invenção diz respeito às subseqüências da SEQ ID N0: 1 em queos fragmentos codificados da SEQ ID N0: 2 que tem atividade de lipase, dosditos fragmentos por intermédio de BR de pelo menos 1,1 e um RP de pelomenos 0,8.

As técnicas usadas para um polinucleotídeo clonado isoladoque codifica um polipeptídeo são conhecido na técnica e incluem isolamentoa partir do DNA genômico, a preparação a partir de cDNA uma combinaçãodeste. A clonagem dos polinucleotídeos da presente invenção a partir do DNAgenômico pode ser efetuado, por exemplo, usando a reação de cadeia depolimerase bem conhecida (PCR) ou avaliação de anticorpo de bibliotecas deexpressão para detectar fragmentos de DNA clonados com característicasestruturais divididas, Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide toMethods e Application, Academic Press, New York. Outros procedimentos deamplificação de ácido nucleico tal como reação de cadeia de ligase (LCD,ligado a transcrição ativada (LAS e amplificação baseada na seqüência denucleotídeo (NASBA) pode ser usada, os polinucleotídeos podem serclonados a partir de cepas de Thermomyces, ou um outro ou organismorelatados e desta maneira, por exemplo, pode ser uma variante de espéciealélica da região codificadora de polipeptídeo da seqüência de nucleotídeo.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeostendo seqüências de nucleotídeos que tem um grau de identidade à umaseqüência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 1 de pelomenos 60%, preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelomenos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmentepelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, maispreferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos95%, e mais preferivelmente pelo menos 97%, 98%, ou 99% de identidade,que codifica um polipeptídeo ativo tendo atividade de lipase e BR de pelomenos 1,1 e RP de pelo menos 0,8.

A modificação de uma seqüência de nucleotídeo que codificaum polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese depolipeptídeos substancialmente similar ao polipeptídeo. O termo"substancialmente similar " para o polipeptídeo refere-se a formas deocorrência não natural do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir-seem algumas maneiras projetadas a partir do polipeptídeo isolado a partir dafonte natural, por exemplo, variantes artificiais que diferem-se em atividadeespecífica, termoestabilidade, pH ótimo, ou outros, a seqüência de variantepode ser construída na base da seqüência de nucleotídeo apresentada comoum região codificadora de polipeptídeo da SEQ ID N°: 1, por exemplo, umasubseqüência deste, e/ou pela introdução de substituições de nucleotídeo quenão dão origem a uma outra seqüência de aminoácido do polipeptídeocodificado pela seqüência de nucleotídeo, mas que correspondem ao uso decódon do organismo hospedeiro pretendido para a produção da enzima, oupela introdução de substituições de nucleotídeos que podem dar origem a umaseqüência de aminoácido diferente. Para uma descrição geral de substituiçãode nucleotídeo, ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression andPurification 2: 95-107.

Será evidente aqueles habilitados na técnica que taissubstituições podem ser feitas fora das regiões críticas á função da molécula eainda resultarão em um polipeptídeo ativo. Resíduos de aminoácidosessenciais para a atividade do polipeptídeo codificado por um polinucleotídeoisolado da invenção, e portanto preferivelmente não submetido à substituição,pode ser identificado de acordo com o procedimento conhecido na técnica, talcomo mutagênese direcionada ao local ou mutagênese de varredura de alanina(ver, por exemplo, Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Natécnica posterior, as mutações são introduzidas em muitos resíduos demudança positivamente na molécula, e as moléculas mutantes resultantes sãotestadas para atividade de lipase para identificar resíduos de aminoácido quesão críticos à atividade da molécula. Os locais de interação de substrato-enzima também podem ser determinados pela análise de estrutura tri-dimensional como determinado por tais técnicas como análise de ressonânciamagnética nuclear, cristalografia ou rotulagem de fotoafinidade (ver, porexemplo, de Vos et al, 1992, Science 255: 388-312; Smith et al, 1992,Journal of Molecular Biology 224: 899-904: Wlodaver et al., 1992, FEESLetters 309: 59-64).

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeosisolados que codifica um polipeptídeo da presente invenção, que hibridiza sobcondições de estringência muito baixas, preferivelmente condições deestringência baixa, mais preferivelmente condições de estringência média,mais preferivelmente condições de estringência média-alta, ainda maispreferivelmente condições de estringência alta, e mais preferivelmentecondições de estringência muito altas com (i) da SEQ ID N°: 1, (ii) aseqüência de cDNA contida na SEQ ID N°: 1, (iii) um filamentocomplementar de (i) ou (ii); ou variantes alélicas e subseqüências destes(Sambrook at, 1989, supra), como definidos neste.

A presente invenção também relata polinucleotídeos isoladosobtidos por (a) hibridizando uma população de DNA sob condições deestringência muito baixa, baixa, média, média-alta, alta ou muito alta com (i)nucleotídeos da SEQ IDN°: 1 (ii) a seqüência de cDNA contida nosnucleotídeos da SEQ ID N°: 1, ou (iii) um filamento complementar de (i) ou(ii); e (b) isolamento de polinuclotídeo de hibridização, que codifica umpolipeptídeo tendo atividade de lipase.

Construções de Acido Nucleico

A presente invenção também diz respeito a construções deácido nucleico que compreende um polinucleotídeo isolado da presenteinvenção operacionalmente ligado a uma ou mais seqüências de controle quedirecionam a expressão da seqüência codificadora em uma célula hospedeiraadequada sob condições compatíveis com as seqüências de controle.

Um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo dapresente invenção pode ser manipulado em uma variedade de maneiras parafornecer a expressão do polipeptídeo. A manipulação da seqüência depolinucleotídeos antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ounecessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para a modificaçãode seqüências de polinucleotídeo utilizando-se métodos de DNArecombinantes são bem conhecidos na técnica.

A seqüência de controle pode ser uma seqüência de promotorapropriada, uma seqüência de nucleotídeo que é reconhecida por uma célulahospedeira para a expressão de um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo da presente invenção, a seqüência de promotor contémseqüências de controle transcripcionais que mediam a expressão dopolipeptídeo. O promotor pode ser qualquer seqüência de nucleotídeo quemostra atividade transcripcional na célula hospedeira de escolha incluindopromotores mutantes, truncados e híbridos e podem ser obtidos a partir degenes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogosou heterólogos à célula hospedeira.

Os exemplos de promotores adequados para direcionar atranscrição das concentrações de ácidos nucleicos da presente invenção,especialmente em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotoresobtidos do operon Iac de E. coli, gene de agarase de Streptomyces coelicolor(dagA), gene levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), gene de alfa-amilase deBacillus lieheniformis (amyL), gene de amilase maltogênica de Bacillusstearothermophilus (amyM), gene de alfa-amilase de Bacillusamyloliquefaeiens (amyQ), gene de penicilinase de Bacillus lieheniformis(penP), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, e gene de beta-lactamaseprocarióico (Villa-Kamaroff et al, 1978, Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac(DeBoer et al, 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA80: 21-25). Os promotores são descritos em "Useful proteins fromrecombinant bactéria" em Scientific American, 1980, 242: 74-94 e emSambrook et al., 1989, supra.

Os exemplos de promotores adequados para direcionar atranscrição da concentração de ácidos nucleicos da presente invenção em umacélula hospedeira fungica filamentosa são os promotores obtidos dos genespara a amilase TAKA de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica eRhizomueor miehei, alfa amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilaseestável ácida Aspergillus niger, glicoamilase Aspergillus niger ou Aspergillusawamori (glaA), lipase de Rhizomueor miehei, protease alcalina deAspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae,acetamidase de Aspergillus nidulans, amiloglicosidades de Fusariumvenenatum (WO 00156900), Fusarium venenaturn Daria (WO 00156900),Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), protease semelhante à tripsinade Fusarium oxisporum (WO 96100787), betaglucosidase de Triehodermareesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, endoglucanase I deTriehoderma reesei, endoglucanase II de Triehoderma reesei, endoglucanaseIII de Triehoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei,endoglucanase V de Triehoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei,xilanase II de Trichoderma reesei\ beta-xilosidase de Trichoderma reesei,bem como o promotor de NA2-tpi (um híbrido dos promotores do genes paraa alfa-amilase neutra de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase deAspergillus oryzae) e promotores mutantes, truncados e híbridos destes, emum hospedeiro de levedura, os promotres úteis são obtidos dos genes para aenolase de Saccharomyees eerevisiae (ENO-1), galactocinase deSaceharomyces eerevisiae (GALI), álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyees eerevisiae (ADH1, ADH2/GAP),triose fosfato isomerase de Saccharomyces eerevisiae (TPI), metalotionina deSaccharomyees eerevisiae (CUPl) e 3-fosfoglicerato cinase deSaccharomyees eerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeirasde levedura são descritos por Romanos et al, 1992, Yeast 8: 423-488.

A seqüência de controle também pode ser uma seqüênciaterminadora de transcrição adequada, uma seqüência reconhecida por umacélula hospedeira para terminar a transcrição. A seqüência terminadora éoperacionalmente ligada ao terminal 3' da seqüência de nucleotídeo quecodifica the polipeptídeo. Qualquer terminador que é funcional na célulahospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção.

Os terminadores preferidos para células hospedeiras fungicasfilamentosas são obtidas a partir dos genes para TAKA amilase de Aspergillusoryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase Aspergillusnidulans, alfa-glucosidase de Aspergillus niger e protease semelhante àtripsina de Fusarium oxisporum.

Terminadores preferidos para células hospedeiras de levedurasão obtidos dos genes para enolase de Saccharomyees eerevisiae. CitocromoC de Saccharomyces eerevisiae (CYCl) e gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase de Saccharomyees eerevisiae. Outros terminadores úteis paracélulas hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992,supra.

A seqüência de controle também pode ser uma seqüência líderadequada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para atradução pela célula hospedeira. A seqüência líder está operacionalmenteligada ao terminal 5 da seqüência e nucleotídeo que codifica o polipeptídeo.Qualquer seqüência líder que é funcional na célula hospedeira de escolhapode ser usada na presente invenção.

Os líderes preferidos para as células hospedeiras fungicasfilamentosas são obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzaee triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

Os líderes adequados para células hospedeiras de levedura sãoobtidos dos genes para a enolase de Saccharomyees eerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato cinase de Saccharomyees eerevisiae, fator alfa deSaccharomyces eerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase de Saccharomyees eerevisiae (ADH2/GAP).

A seqüência de controle também pode ser uma seqüência depoliadenilação, uma seqüência operacionalmente ligada ao terminal 3' daseqüência de nucleotídeo e que, quando transcrito, é reconhecido pela célulahospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mRNAtranscrito. Qualquer seqüência de poliadenilação que é funcional na célulahospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

As seqüências de poliadenilação preferidas para célulashospedeiras fungicas filamentosas são obtidos dos genes para TAKA amilasede Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintasede Aspergillus nidulans, protease semelhante à tripsina de Fusariumoxisporum e alfa-glucosidase de Aspergillus niger.As seqüências de poliadenilação úteis para células hospedeirasde levedura são descritas para Guo and Sherman, 1995, Molecular CellularBiology 15: 5983-5990.

A seqüência de controle também pode ser um regiãocodificadora de peptídeo sinalizador que codifica uma seqüência deaminoácido ligada ao terminal amino de um polipeptídeo e direciona opolipeptídeo codificado no caminho secretor celular. A extremidade 5' daseqüência codificadora da seqüência de nucleotídeo pode conter,inerentemente, a região codificadora de peptídeo sinalizador naturalmenteligada em estrutura de leitura de tradução com o segmento da regiãocodificadora que codifica o polipeptídeo secretado. Alternativamente, aextremidade 5' da seqüência codificadora pode conter uma regiãocodificadora de peptídeo que é estranha para a seqüência codificadora. Aregião codificadora de peptídeo sinalizador estranha pode ser requeridaquando a seqüência codificadora não contém, naturalmente a regiãocodificadora de peptídeo sinalizador. Alternativamente, a região codificadorade peptídeo sinalizador estranha pode simplesmente substituir a regiãocodificadora de peptídeo sinalizador natural a fim de intensificar a secreçãodo polipeptídeo. Entretanto, qualquer região codificadora de peptídeosinalizador que direciona o polipeptídeo expressado no caminho de secreçãode uma célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

As regiões codificadoras de peptídeo sinalizadoras eficazespara células hospedeiras bacterianas são as regiões codificadoras de peptídeosinalizadoras obtidas dos genes para amilase maltogênica de Bacillus NCIB11837, alfa-amilase de Bacillus stearathermophilus, subtilisina de Bacilluslieheniformis, betalactamase de Bacillus lieheniformis, proteases neutras deBacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), e prsA de Bacillus subtilis.Outros peptídeos sinalizadores são descritos por Simonen and Paiva, 1993,MicrobiologicalReviews 57: 109-137.As regiões codificadoras de peptídeo sinalizadoras eficazespara as células hospedeiras fúngicas filamentosas são as regiões codificadorasde peptídeo sinalizadoras obtidas dos genes para TAKA amilase deAspergillus oryzae, amilase neutra de Aspergillus niger, glicoamilase deAspergillus niger, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, celulase deHumicola insolens e lipase de Humicola lanuginosa.

Os peptídeos sinalizadores úteis para células hospedeiras delevedura são obtidos dos genes para o fator alfa de Saccharomyees eerevisiaee invertase de Saceharomyces eerevisiae. Outras regiões codificadoras depeptídeo sinalizadoras úteis são descritas por Romanos et ai., 1992, supra.

A seqüência de controle também pode ser uma regiãocodificadora de propeptídeo que codifica uma seqüência de aminoácidoposicionada no terminal amino de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultanteé conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio emalguns casos). Um pró-polipeptídeo é, no geral, inativo e pode ser convertidoa um polipeptídeo ativo maduro pela clivagem catalítica ou autocatalítica dopropeptídeo do pró-polipeptídeo. A região codificadora de propeptídeo podeser obtida dos genes para a protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE),protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), fator alfa de Saccharomyeeseerevisiae, proteinase aspártica de Rhizomueor miehei e lacase deMyceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Quando tanto os peptídeo sinalizador quanto as regiões depropeptídeo estão presentes no terminal amino de um polipeptídeo, a regiãode propeptídeo está posicionada seguinte ao terminal amino de umpolipeptídeo e a região de peptídeo sinalizador está posicionada próximo aoterminal amino da região de propeptídeo.

Também pode ser desejável adicionar seqüências reguladorasque permitam a regulação da expressão do polipeptídeo com relação aodesenvolvimento da célula hospedeira. Os exemplos de sistemas reguladoressão aqueles que causam a expressão do gene a ser ativado ou desativado emresposta a um estímulo químico ou físico, na presença de um compostoregulador. Os sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem ossistemas operadores Iac, tac e trp. Na levedura, o sistema ADH2 ou o sistemaGALl podem ser usados. Em fungos filamentosos, o promotor de TAKAalfa-amilase, promotor de glicoamilase de Aspergilus niger e promotor deglicoamilase de Aspergillus oryzae e o promotor de glicoamilase podem serusados como seqüências reguladoras. Outros exemplos de seqüênciasreguladoras são aquelas que permitem a amplificação do gene. Em sistemaseucarióticos, estes incluem o gene da diidrofolato redutase que é amplificadona presença de metotrexato e os genes de metalotioneina que são amplificadoscom metais pesados. Nestes casos, a seqüência de nucleotídeo que codifica opolipeptídeo deve ser operacionalmente ligado com a seqüência reguladora.

Vetores de Expressão

A presente invenção também diz respeito a vetores deexpressão recombinantes que compreendem um polinucleotídeo da presenteinvenção, um promotor e sinais de interrupção transcripcionais e de tradução.

Os vários ácidos nucleicos e seqüências de controle descritas acima podemser unidas juntas para a produção de uma expressão recombinante que podeincluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir a inserçãoou substituição da seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo emtais locais. Alternativamente, uma seqüência de nucleotídeo da presenteinvenção pode ser expressada inserindo-se a seqüência de nucleotídeo ou umaconstrução de ácido nucleico que compreende a seqüência em um vetorapropriado para a expressão. Na criação do vetor de expressão, a seqüênciacodificadora está localizada no vetor de modo que a seqüência codificadoraesteja ligada com as seqüências de controle apropriadas para a expressão.

O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor(por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientementesubmetido aos procedimentos de DNA recombinantes e podem realizar aexpressão da seqüência e nucleotídeo. A escolha do vetor depende,tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira em que ovetor deve ser introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos lineares oucirculares fechados.

O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, umvetor que existe como uma entidade extra-cromossômica, cuja replicação éindependente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo), umelemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomoartificial. O vetor pode conter quaisquer meios para garantir a auto-replicação.Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célulahospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossomo(s)em que este foi integrado. Além disso, um vetor ou plasmídeo simples ou doisou mais vetores ou plasmídeos que, juntos, contém o DNA total a serintroduzido no genoma da célula hospedeira ou um transposon pode serusado.

Os vetores da presente invenção, preferivelmente contém umou mais marcadores selecionáveis que permitem a seleção fácil de célulastransformadas. Um marcador selecionável é um gene do produto que forneceresistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia àauxotrofla e outros.

Um gene condicionalmente essencial pode funcionar como ummarcador selecionável não antibiótico. Os exemplos não limitantes demarcadores não antibióticos condicionalmente essenciais bacterianos são osgenes dal de Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis ou outros Bacilli, que sãoapenas essenciais quando a bactéria é cultivada na ausência de p-alanina.Também, os genes que codificam as enzimas envolvidas no movimento deUDP-galactose pode funcionar como marcadores essencialmente condicionaisem uma célula quando a célula está em desenvolvimento na presença degalactose ou desenvolvimento em um meio que origina a presença degalactose. Os exemplos não limitantes de tais genes são aqueles de B. subtilisou B. Iicheniformis que codifica a fosforilase dependente de UTP (EC2.7.7.10), uridililtransferase dependente de UDP (EC 2.7.7.12) ou UDP-galactose epimerase (EC 5.1.3.2). Também, um gene de xilose isomerase, talcomo xylA, de Bacilli pode ser usado como marcadores selecionáveis nodesenvolvimento de células em meio mínimo com xilose como a fonte únicade carbono. Os genes necessário para a utilização de gliconato, gntK e gntPtambém podem ser usados como marcadores selecionáveis nodesenvolvimento celular em meio mínimo com gluconato como a fonte únicade carbono. Outros exemplos de genes condicionalmente essenciais sãoconhecidos na técnica. Os marcadores selecionáveis antibióticos conferemresistência antibiótica a tais antibióticos como ampicilina, canamicina,clorafenicol, eritromicina, tetraciclina, neomicina, higromicina oumetotrexato.

Os marcadores adequados para células hospedeiras de levedurasão ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRPl e URA3. Os marcadoresselecionáveis para o uso em uma célula hospedeira füngica filamentosaincluem, mas não limitam-se a, amdS (acetamidase), argB (ornitinacarbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicinafosfotransferase), nick (nitrato redutase), pyrG (orotidino-5-fosfatodescarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase) e trpC (antranilato sintase),bem como os seus equivalentes. Preferidos para o uso em uma célula deAspergillus são os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillusoryzae e o gene bar de Streptomyces hygroseopicus,

Os vetores da presente invenção preferivelmente contém umelemento eu permite a integração do vetor no genoma da célula hospedeira oureplicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetorpode contar com a seqüência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeoou qualquer outro elemento do vetor para a integração no genoma pelarecombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor podeconter seqüências de nucleotídeo adicionais para direcionar a integração pelarecombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local precisonos cromossomos). Para aumentar a probabilidade de integração em um localpreciso, os elementos integracionais devem conter, preferivelmente umnúmero suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de base,preferivelmente de 400 a 10.000 pares de base e mais preferivelmente de 800a 10.000 pares de base, que tem um alto grau de identidade com a seqüênciaalvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinaçãohomóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer seqüência que éhomóloga com a seqüência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso,os elementos integracionais podem ser seqüências de nucleotídeo nãocodificadoras ou codificadoras. Por outro lado, o vetor pode ser integrado nogenoma da célula hospedeira pela recombinação homóloga.

Para a replicação autônoma, o vetor ainda pode compreenderuma origem de replicação que permite ao vetor replicar-se de maneiraautônoma na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode serqualquer replicador de plasmídeo que media a replicação autônoma quefunciona em uma célula. O termo "origem de replicação" ou ("replicador deplasmídeo" é definido neste como uma seqüência de nucleotídeo que permiteao plasmídeo ou vetor replicar-se in vivo.

Os exemplos de origens bacterianas de replicação são asorigens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 epACYC 184 permitindo a replicação em E. coli e pUBl 10, pE194, pTA1060 eρΑΜβ 1 que permite a replicação em Bacillus.

Os exemplos de origens de replicação para o uso em umacélula hospedeira de levedura são a origem de 2 mícrons de replicação, ARS1,ARS4, a combinação de ARSl e CEN3 e a combinação de ARS4 e CEN6.

Os exemplos de origens de replicação úteis em uma célulafüngica filamentosa são AMAI e ANSl (Gems et al., 1991, Gene 98:61-67;Cullen et al, 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883).

O isolamento do gene AMAI e a construção de plasmídeos ou vetores quecompreendem o gene podem ser realizados de acordo com os métodosdivulgados em WO 00/24883.

Mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presenteinvenção podem ser inseridas na célula hospedeira para aumentar a produçãodo produto de gene. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeopode ser obtido pela integração de pelo menos uma cópia adicional daseqüência no genoma da célula hospedeira ou pela inclusão de um genemarcador amplificável selecionável com o polinucleotídeo onde célulascontendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável e, desse modo,cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas cultivando-se ascélulas na presença do agente selecionável apropriado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritosacima para a construção dos vetores de expressão recombinantes da presenteinvenção são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica (ver, porexemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células Hospedeiras

A presente invenção também diz respeito a células hospedeirasrecombinantes, que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção,que são vantajosamente usadas na produção recombinante dos polipeptídeos.Um vetor que compreende um polinucleotídeo da presente invenção éintroduzido em uma célula hospedeira de modo que o vetor é mantido comoum integrante cromossômico ou como um vetor extra-cromossômico auto-replicante como descrito anteriormente. O termo "célula hospedeira" abrangequalquer progênie de uma célula precursora que não é idêntica à célulaprecursora devido às mutações que ocorrem durante a replicação. A escolhade uma célula hospedeira, até certo ponto, dependerá do gene que codifica opolipeptídeo e sua fonte.

A célula hospedeira pode ser um microorganismo unicelular,por exemplo, um procariota ou um microorganismo não celular, por exemplo,um eucariota.

Os microorganismos unicelulares úteis são células bacterianas,tais como bactérias de gram positivo que inclui, mas não limita-se a, umacélula de Bacillus, por exemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillusamyloliquefaeiens, Bacillus brevis, Bacillus circulam, Bacillus clausii,Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis,Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillusthuringiensis ou uma célula de Streptomyces, por exemplo, Streptomyceslividans e Streptomyces murinus ou bactérias de gram negativo, tais como E.coli e Pseudomonas sp. Em um aspecto preferido, a célula hospedeirabacteriana é uma célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillusstearothermophilus ou Bacillus subtitis. Em um outro aspecto preferido, acélula de Bacillus é um Bacillus alcalofílico.

A introdução de um vetor em uma célula hospedeira bacterianapode, por exemplo, ser realizada pela transformação de protoplasto (ver, porexemplo, Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando-se células competentes (ver, por exemplo, Young and Spizizin,1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 ou Dubnau and Davidoff-Abelson,1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), eletroporação (ver, porexemplo, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ouconjugação (ver, por exemplo, Koehler and Thorne, 1987, Journal ofBacteriology 169: 5771-5278).

A célula hospedeira também pode ser um eucariota, tal comouma célula de mamífero, inseto, vegetal ou fungica.Em um aspecto preferido, a célula hospedeira é uma célulafungica. "Fungos" como usado neste, inclui os filos Ascomycota,Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota (como definido porHawksworth et al., in, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8oedição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) bemcomo o Oomycota (como citado em Hawksworth et al., 1995, supra, página171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica éuma célula de levedura. "Levedura" como usado neste inclui leveduraascosporongenosa (Endomycetales), levedura basidiosporogenosa e leveduraque pertence aos Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Visto que a classificaçãoda levedura pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção,levedura deve ser definido como descrito em Biology and Activities of Yeast(Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, RA., ads, Sac. App.Bacterial. Symposium Series No, 9, 1980).

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira delevedura é uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Piehia,Saccharomyees, Schixosaccharomyces ou Yarrowia.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de leveduraé uma célula de Saccharomyees earlsbergensis, Saccharomyees eerevisiae,Saccharomyces diastatieus, Saccharomyees douglasii, Saccharomyeeskluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyees oviformis. Em umoutro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula deKluyveromyces laetis. Em um outro aspecto mais preferido, a célulahospedeira de levedura é uma célula de Yarrowia lipolytiea.

Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeirafungica é uma célula fungica filamentosa. Os "fungos filamentosos" incluemtodas as formas filamentosas da subdivisão Eumyeota e Oomyeota (comodefinido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são, nogeral, caracterizados por uma parede micelial composta de quitina, celulose,glucano, quitosano, manano e outros polissacarídeos complexos. Odesenvolvimento vegetativo ocorre pelo alongamento hifal e o catabolismo decarbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o desenvolvimentovegetativo pelas leveduras, tais como Saccharomyces eerevisiae ocorre pelaorigem de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode serfermentativo.

Ainda, em um aspecto mais preferido, a célula hospedeirafungica filamentosa é uma célula de Aeremonium, Aspergillus,Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus,Cryptoeoeeus, Filobasidium, Fusarium, Humieola, Magnaporthe, Mueor,Myeeliophthora, Neoeallimastix, Neurospora, Paeeilomyees, Penieillium,Phaneroehaete, Phiebia, Piromyees, Pleurotus, Sehizophyllum, Talaromyees,Thermoaseus, Thielavia, Tolypoeladium, Trametes ou Triehoderma.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungicafilamentosa é uma célula Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus,Aspergillus faetidus, Aspergillus japonieus, Aspergillus nidulans, Aspergillusniger ou Aspergillus oryzae. Em um outro aspecto mais preferido, a célulahospedeira fungica filamentosa é uma célula de Fusarium baetridioides,Fusarium eerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorurn, Fusariumgraminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusariumnegundi, Fusarium oxisporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum,Fusarium sambueinum, Fusarium sarcoehroum, Fusarium sporotriehioides,Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusartum trichothecioides ouFusarium venenatum. Em um outro aspecto mais preferido, a célulahospedeira fungica filamentosa é um célula da cepa Bjerkanclera adusta,Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea,Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis nvufosa,Ceriporiopsis subrufa ou Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus,Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mereer miehei,Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penieillium purpurogenum,Phaneroehaate ehrysosporum, Phiebia rediata, Pleurotus eryngii, Thielaviaterrestris, Trametes villosa, Trametes versieolor, Triehoderma harzianum,Triehoderma koningii, Triehoderma longibraehiatum, Triehoderma reesei ouTriehoderma viride.

As células füngicas podem ser transformadas por um processoque envolve a formação de protoplasto, transformação dos protoplastos eregeneração da parede celular de uma maneira conhecida por si. Osprocedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras deAspergillus e Triehoderma são descritos na EP 238 023 and Yelton et al.,1984, Proeeedings of the National Aeademy of Sciences USA 81: 1470-1474.Os métodos adequados para a transformação das espécies Fusarium sãodescritos por Malardier et al, 1989, Gene 78: 147-156 e WO 96/80787. Alevedura pode ser transformada usando-se os procedimentos descritos porBecker and Guarente, In Abelson, J.N, and Simon, M.I., editores, Guide toYeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194,pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al, 1983, Journal ofBacteriology 153: 163 and Hinnen et al, 1978, Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75: 1920.

Método de Produção

A presente invenção também diz respeito métodos para aprodução de um polipeptídeo da presente invenção, que compreende (a)cultivar uma célula, que, em sua forma do tipo selvagem é capaz de produzircomo polipeptídeo, sob condições condutoras para a produção do polipeptídeoe (b) recuperar o polipeptídeo. Preferivelmente, a célula é do gêneroAspergillus e mais preferivelmente Aspergillus Oryzae.

A presente invenção também diz respeito a métodos para aprodução de um polipeptídeo da presente invenção, que compreende (a)cultivar uma célula hospedeira sob condições condutoras para a produção dopolipeptídeo e (b) recuperar o polipeptídeo.

A presente invenção também diz respeito métodos para aprodução de um polipeptídeo da presente invenção, que compreende (a)cultivar uma célula hospedeira sob condições condutoras para a produção dopolipeptídeo, em que a célula hospedeira compreende uma seqüência denucleotídeo mutante tendo pelo menos uma mutação na região codificadorade polipeptídeo madura da SEQ ID N°: 1, em que a seqüência de nucleotídeomutante codifica um polipeptídeo que é uma lipase compreendida por ou quecompreende o polipeptídeo da SEQ ID N°: 2 e (b) recuperar o polipeptídeo.

Em uma forma de realização preferida, a seqüência de nucleotídeo codificaum polipeptídeo que é uma lipase compreendida por ou que compreende aparte madura do polipeptídeo da SEQ ID N°: 2 e (b) recuperar o polipeptídeo.

Nos métodos de produção da presente invenção, as células sãocultivadas em um meio nutriente para a produção do polipeptídeo usando-seos métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode sercultivada pelo cultivo em frasco de agitação e fermentação em pequena escalaou em grande escala (incluindo as fermentações contínuas, batelada,alimentação-batelada ou estado sólido) em fermentadores laboratoriais ouindustriais realizado em meio adequado e sob condições que permitem que opolipeptídeo seja expressado e/ou isolado. O cultivo acontece em um meionutriente adequado que compreende fontes de carbono e de nitrogênio e saisinorgânicos, usando-se os procedimentos conhecidos na técnica. Os meiosadequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem serpreparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, emcatálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo forsecretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente apartir do meio. Se o polipeptídeo não for secretado, este pode ser liberado apartir de lisados celulares.Os polipeptídeos podem ser detectados usando-se métodosconhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estesmétodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, formaçãode produto de enzima ou desaparecimento de um substrato de enzima. Porexemplo, um ensaio de enzima pode ser usado para determinar a atividade dopolipeptídeo como descrito neste.

O polipeptídeo resultante pode ser recuperado usando-semétodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode serrecuperado a partir do meio nutriente pelos procedimentos de convenção queincluem, mas não limitam-se a, centrifugação, filtração, extração, secagempor pulverização, evaporação ou precipitação.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificadospor uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, que incluem, masnão limitam-se a, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade,hidrofóbico, cromatofocalização e exclusão de tamanho), procedimentoseletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidadediferencial (por exemplo, precipitador de sulfato de amônio SOS-PACE ouextração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson and LarsRyden, editor VCH Publishers, New York, 1989).

Composições

A presente invenção também diz respeito a composições quecompreendem um polipeptídeo da presente invenção. Preferivelmente, ascomposições são enriquecidas em um tal polipeptídeo. O termo "enriquecido"indica que a atividade de lipase da composição foi aumentada, por exemplo,com um fator de enriquecimento de 1,1.

A composição pode compreender um polipeptídeo da presenteinvenção como o componente enzimático principal, por exemplo, umacomposição de mono-componente. Alternativamente, a composição podecompreender atividades enzimáticas múltiplas, tais como umaaminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase,quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease,esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, haloperoxidase, invertase, lactase, lipase,manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase,fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminaseou xylanase. As enzimas adicionais podem ser produzidas, por exemplo, porum microorganismo que pertence ao gênero Aspergillus, preferivelmenteAspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigates,Aspergillus foeticius, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillusniger, ou Aspergillus oryzae; Fusarium, preferivelmente Fusariumbactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusariumculmorum, Fusarium grarninearum, Fusarium graminum, Fusariumheterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxisporum, Fusariumreticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusariumsarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium taruloseum, Fusariumtrichothecioides ou Fusarium venenatum; Humicola, preferivelmenteHumlcola insolens ou Humicola lanuginosa ou Trichoderma, preferivelmenteTrichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichodermalongibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

As composições de polipeptídeo podem ser preparadas deacordo com os métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de umlíquido ou de uma composição seca. Por exemplo, a composição depolipeptídeo pode estar na forma de um granulado ou de um microgranulado.O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordocom os métodos conhecidos na técnica.

Abaixo, são dados exemplos dos usos preferidos dascomposições de polipeptídeo da invenção. A dosagem da composição depolipeptídeo da invenção e outras condições sob as quais a composição éusada podem ser determinadas na base de métodos conhecidos na técnica.

APLICAÇÕES DETERGENTES

A enzima da invenção pode ser adicionada a e, desta maneira,tornar-se um componente de uma composição detergente.

A composição detergente da invenção pode ser, por exemplo,formulada como uma composição detergente para a lavagem manual ou emmáquina incluindo uma composição de aditivo de lavagem adequada para opré-tratamento de tecidos tingidos e um enxágüe adicionado com composiçãoamaciante de tecido ou ser formulada como uma composição detergente parao uso em operações de limpeza de superfícies duras domésticas gerais ou serformulada para as operações de lavagem de pratos manual ou em máquina.

Enzimas

Em um aspecto específico, a invenção fornece um aditivodetergente que compreende a enzima da invenção, o aditivo detergente bemcomo a composição detergente pode compreender uma ou mais outrasenzimas, tais como uma protease, uma lipase, uma cutinase, uma amilase,uma carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma manase, uma arabinase,uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, por exemplo, uma lacase e/ouuma peroxidase.

No geral, as propriedades das enzimas escolhidas devem sercompatíveis com o detergente selecionado, (isto é, pH ótimo, compatibilidadecom outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.) e as enzimasdevem estar presentes em quantidades efetivas.

Proteases:

As proteases adequadas incluem aquelas de animal, incluemaquelas de origem vegetal ou microbiana. A origem microbiana é preferida.Mutantes projetados quimicamente modificados ou de proteína estãoincluídos. A protease pode ser uma serina protease ou uma metalo protease,preferivelmente, uma protease microbiana alcalina ou uma proteasesemelhante à tripsina. Os exemplos de proteases alcalinas são as subtilisinas,especialmente aquelas derivadas de Bacillus, por exemplo, subtilisina Novo,subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168(descritas no WO 89/06279). Os exemplos de proteases semelhantes à tripsinasão tripsina (por exemplo, de origem porcina ou bovina) e a Fusariumprotease descrita no WO 89106270 e WO 94/25583.

Os exemplos de proteases úteis são os descritos no WO92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 e WO 98/34946, especialmente asvariantes com substituição em uma ou mais das seguintes posições: 236, 57,68, 76, 87, 97, 101, 104, 106, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224,235, 246, 262 e 274 e entre outras variantes com as seguintes mutações:(K27R„ V104Y, N123S, T124A), (N76D, S103A, V104I, G159D, A232V,Q236H, Q245R, N248D, N252K).

As enzimas de protease comercialmente disponíveis preferidasincluem Acalase™, Savinase™, Primase™, Duralase™, Esperase™,Coronase™, Polarzime™ e Kannase™ (Novozymes A/S), Maxatase™,Maxacal™, Maxapem™, Properase™, Purafect™, Purafect Prime™, PurafectOxP™, FH2, FN3 e FN4 (Genencor International Inc.).

Lipases:

As lipases incluem aquelas de origem bacteriana ou fungica.Os mutantes projetados quimicamente modificados ou de proteína. Osexemplos de tais lipases incluem lipases de Humicola(sinônimoThermomyces), por exemplo, de H. Ianugina (sinônimo T. lanuginosus) comodescrito no EP 258 068 e EP 305 216 ou de H. insolens como descrito no WO96/13580, uma Pseudomonas lipase, por exemplo, de P. alcaligenes ou P.pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 eWO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), uma lipase de Bacillus,por exemplo, de B. subtilis (Dartois at al. (1993), Biochemica at BiophysicaArta, 1131, 253-360), Β. stearothermophilus (JP 641744992) ou Β. pumilus(WO 91/16422),

Outros exemplos são variantes de lipase, tais como aquelesdescritos em WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202.

Outras enzimas de lipase comercialmente disponíveis incluemLipolase™, Lipolase Ultra™ e Lipex™ (Novozymes A/S).

As lipases preferidas são as lipases da presente invenção.

Amilases:

As amilases adequadas (a e/ou β) incluem aquelas de origembacteriana ou fóngica. Os mutantes projetados quimicamente modificados oude proteína estão incluídos. As amilases incluem, por exemplo, a-amilasesobtidas de Bacillus, por exemplo, uma cepa especial de B. licheniformis,descrita em mais detalhes na GB 1,296,839.

Os exemplos de amilases úteis são as variantes descritas noWO 94/02597, WO 94/18314, WO 96123873 e WO 97/43424, especialmente,as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições. 15,23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 155, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243,264, 304, 305, 391, 408 e 444.

As amilases comercialmente disponíveis são Duramyl™,Termamyl™, Stainzyme™, Stainzyme Ultra™, Fungamyl™ e ΒΑΝ™(Novozymes A/S), Papidase e Purastar™ (da Genencor International Inc.).

Celulases:

As celulases adequadas incluem aquelas de origem bacterianaou fungica. Os mutantes projetados quimicamente modificados ou de proteínaestão incluídos. As celulases adequadas incluem celulases dos gênerosBacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, porexemplo, as celulases fungicas produzidas a partir de Humicola insolens.Myceliophthora thermophila e Fusarium oxisporum divulgados no US4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 e WO 89/09259.

Especialmente, as celulases adequadas são as celulasesalcalinas ou neutras tendo benefícios de cuidado com a cor. Os exemplos detais celulases são as celulases descritas em EP O 495 257, EP O 531 372, WO96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Outros exemplos são as variantes decelulase, tais como aqueles derivados de WO 94/07998, EP O 531 315, US5,457,046, US 5,686,593, U8 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 ePCT/DK98/00299.

As celulases comercialmente disponíveis incluemRenozyme™, Celluzyme™ e Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™ eParadox HA™' (Genencor International Inc.) e KAC-500(B)™ (KaoCorporation).

Peroxidases/Oxidases:

As peroxidases/oxidases adequadas incluem aquelas de origemvegetal, bacteriana e fungica. Os mutantes projetados quimicamentemodificados ou de proteína estão incluídos. Os exemplos de peroxidases úteisincluem peroxidases de Coprinus, por exemplo, de C. cinereus e variantesdestes como descrito no WO 93/24618, WO 95/10602 e WO 98/15257.

As peroxidases comercialmente disponíveis incluemGuardzyme™ (Novozymes A/S).

Detergentes:

As enzimas detergentes podem ser incluídas em umacomposição detergente pela adição de aditivos separados contendo uma oumais enzimas ou pela adição de um aditivo combinado que compreende todasestas enzimas. Um aditivo detergente da invenção, isto é, um aditivo separadoou um aditivo combinado, pode ser formulado, por exemplo, como umgranulado, um líquido, uma pasta, etc. As formulações aditivas detergentespreferidas são granulados, em particular granulados não pulverizáveis,líquidos, em particular, líquidos estabilizados ou pastas.

Os granulados não pulverizáveis podem ser produzidos, porexemplo, como divulgado no US 4,106,991 e 4,661,452 e podem seropcionalmente revestidos pelos métodos conhecidos na técnica. Os exemplosde materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido de etileno)(polietileno glicol, PEG) com pesos molares médios de 1000 a 20000;nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoolgraxo etoxilado em que o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e emque existem de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidosgraxos e mono- e di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Os exemplos demateriais de revestimento formadores de película adequados para a aplicaçãode técnicas de leito de fluido são dados no GB 1483591. As preparações deenzima líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas pela adição de umpoliol, tal como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido lácticoou ácido bórico de acordo com os métodos estabelecidos. As enzimasprotegidas podem ser preparadas de acordo com o método divulgado no EP238,216.

A composição detergente da invenção pode estar em qualquerforma conveniente, por exemplo, uma barra, um tablete, um pó, um grânulo,uma pasta ou um líquido, um detergente líquido pode ser aquoso, tipicamente,contendo até 70% de água e 0 a 30% de solvente orgânico ou não aquoso.

A composição detergente compreende um ou mais tensoativos,que podem ser não iônicos, incluindo semi-polar e/ou aniônico e/ou catiônicoe/ou zwitteriônico. Os tensoativos estão, tipicamente presente em um nível de0% a 60% em peso.

Quando incluídos neste, os detergentes usualmente conterão decerca de 0% a cerca de 40% de um tensoativo não iônico, tal comoalquilbenzenossulfonato linear, alfa-olefinossulfonato, sulfato de alquila(sulfato de álcool graxo), etoxissulfato de álcool, alcanossulfonato secundário,éster metílico do ácido alfa-sulfa graxo, ácido alquil- ou alquenilsuccínico ousabão.

Quando incluído neste, o detergente usualmente conterá decerca de 0% a cerca de 40% de um tensoativo não iônico, tal como álcooletoxilado, nonilfenol etoxilado, alquilpoliglicosídeo, alquildimetilaminoóxido,monoetanolamida de ácido graxo etoxilado, monoetanolamida de ácido graxo,amida de ácido graxo de poliidroxialquila ou derivados de N-acil N-alquila deglucosamina ("glucamidas").

O detergente pode conter de 0 a 85% de um formadordetergente ou agente complexador, tal como zeólito, difosfato, trifosfato,fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácidoetilenodiaminotetraacético, ácido dietilenotriaminopentaacético, ácido alquil-ou alquenilsuccínico, silicato solúveis ou silicatos em camadas (por exemplo,SKS-6 da Hoechst).

O detergente pode compreender um ou mais polímeros. Osexemplos são carboximetilcelulose, poli(vinilpirrolidona), poli(etileno glicol),poli(álcool vinílico), poli(vinilpiridino-N-óxido), poli(vinilimidazol),policarboxilatos, tais como poliacrilatos, copolímeros de ácidomaléico/acrílico e copolímeros de metacrilato de laurila/ácido acrílico.

O detergente pode conter um sistema alvejante que podecompreender uma fonte de H2O2, tal como perborato ou percarbonato quepode ser combinado com um ativador alvejante formador por perácido, talcomo tetraacetiletilenodiamino ou nonanoil-oxibenzenossulfonato.Alternativamente, o sistema alvejante pode compreender peroxiácidos, porexemplo, do tipo amida, imida ou sulfona.

As enzimas da composição detergente da invenção podem serestabilizadas usando-se agentes estabilizadores convencionais, por exemplo,um poliol, tal como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool deaçúcar, ácido láctico, ácido bórico ou um derivado de ácido bórico, porexemplo, um éster de borato aromático ou um derivado de ácido fenilborônico, tal como ácido 4-formilfenil borônico e a composição pode serformulada como descrito, por exemplo, no WO 921/9709 e WO 92/19708.

O detergente também pode conter outros ingredientesdetergentes convencionais, tais como, por exemplo, condicionadores detecido, tais como argilas, intensificadores de espuma, supressores de espumas,agentes anti-corrosão, agentes de suspensão de sujeira, agentes anti-redeposição de mancha, pigmentos, bactericidas, clareadores óticos,hidrótropos, inibidores de mancha ou perfumes.

No presente, é abrangido que nas composições detergentesqualquer enzima, em particular a enzima da invenção, pode ser adicionada emuma quantidade correspondente de 0,001 a 100 mg de proteína de enzima porlitro de líquido de lavagem, tal como 0,01 a 50 mg ou 0,03 a 30 mg,preferivelmente 0,05 a 5 mg de proteína de enzima por litro de líquido delavagem, em particular de 0,1 a 1 mg de proteína de enzima por litro delíquido de lavagem.

A enzima da invenção pode ser adicionalmente incorporadanas formulações de detergente divulgadas no WO 97107202, WO 04/041979,WO 04/074419, que é incorporado neste como referência.

Usos

A presente invenção também está direcionada aos métodospara o uso de polipeptídeos tendo atividade de lipase.

As variantes da invenção podem ser usadas em aplicaçõesconhecidas por analogia com a técnica anterior, por exemplo:

Uma variante com atividade de lipase pode ser usada naindústria de polpa e de papel, para remover piche ou para remover tinta depapel usado. WO 9213130, WO 9207138, JP 2160984 A, EP 374700.

Uma variante com fosfolipase e/ou galactoatividade de lipasepode ser usada na preparação de massa, pão e tortas, por exemplo, paraaumentar a estabilidade da massa e propriedades de manuseio de massa oupara melhorar a elasticidade do pão ou da torta, WO 94/04035, WO 00/32758.

Uma variante com atividade de fosfolipase pode ser usada emum processo para reduzir o teor de fosfolipídeo em um óleo comestível. US5,264,367 (Metallgesellschaft, Rohm); K. Dahike & H. Buchold, INFORM, 6(12), 1284-91 (1995); H. Buchold, Fat Sei. Technol, 95 (8), 300-304 (1993);JP-A 2-153997 (Showa Sangyo) ou EP 654,527 (Metallgesellachaft, Rohm).

Uma variante com atividade de lisofosfolipase pode ser usadapara melhorar a filtrabilidade de uma solução aquosa ou pasta de origem decarboidrato, por exemplo, amida hidrolisada, especialmente, um amido detrigo hidrolisado, EP 219,269.

Uma variante com atividade de fosfolipase pode ser usada paraa preparação de liso-fosfolipídeo, por exemplo, liso-lecitina (EP 870840, JP-A10-42884, JP-A 4-135456 ou JP-A 2-49593) para a produção de maionese(EP 628256, EP 398666 ou EP 319064).

Uma variante com atividade de fosfolipase também pode serusada no processamento de produtos alimentícios diários e outros, porexemplo, como descrito no EP 567,662 (Nestlé), EP 426,211 (Unilever), EP166.284 (Nestlé), JP-A 57-189638 (Yakult) ou US 4,119,564 (Unilever).

Uma variante com atividade de fosfolipase pode ser usada naindústria do couro. GB 2233665, EP 505920.

Uma variante com atividade de lipase pode ser usada pararemover matéria graxa contendo ésteres hidrofóbicos (por exemplo,triglicerídeos) durante o acabamento de têxteis. WO 93113256.

A presente invenção ainda é descrita pelos seguintes exemplosque não devem ser construídos como limitantes do escopo da invenção.EXEMPLOS

Os produtos químicos usados como tampões e substratosforam produtos comerciais pelo menos de grau reagente.Meios e Soluções

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Materiais

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Exemplo 1

Produção de enzima

Um plasmídeo contendo o gene que codifica a lipase éconstruído e transformado em uma célula hospedeira adequada usando-semétodos padrão da técnica.

A fermentação é realizada como uma fermentação por bateladaalimentada usando-se uma temperatura média constante de 34° C em umvolume inicial de 1,2 litro. O pH inicial do meio é ajustado a 3,5. Uma vezque o pH aumentou a 7,0 este valor é mantido através da adição de 10% deH3P04. O nível de oxigênio dissolvido no meio é controlado variando-se ataxa de agitação e usando-se uma taxa de aeração fixa de 1,0 litro de ar porlitro de meio por minuto. A taxa de adição de alimentação é mantida em umnível constante durante a fase de batelada de alimentação total.

O meio de batelada contém xarope de maltose como a fonte decarbono, uréia e extrato de levedura como a fonte de nitrogênio e uma misturade metais e sais traço. A alimentação adicionada de maneira contínua durantea fase de batelada de alimentação contém xarope de maltose visto que oextrato de levedura e uréia é adicionado a fim de garantir um fornecimentosuficiente de nitrogênio.

A purificação da lipase pode ser realizada pelo uso de métodospadrão conhecidos na técnica, por exemplo, pela filtração do sobrenadante defermentação e cromatografia hidrofóbica e cromatografia trocadora de íon,por exemplo, como descrito no EP 0 851 913 EP5 Exemplo 3.

Exemplo 2

AMSA - Ensaio de Tensão Mecânica Automatizado - para o cálculo de RP

As enzimas variantes do presente pedido são testados usando-se o Ensaio de Tensão Mecânica Automatizado (AMSA). com o teste AMSAo desempenho de lavagem de uma grande quantidade de soluções de enzima-detergente de volume pequeno pode ser examinado. A placa AMSA têmdiversas fendas para as soluções de teste e uma tampa que comprimefirmemente a amostra de tecido a ser lavada contra todas as aberturas defenda. Durante o período de lavagem, a placa, as soluções de teste, os têxteis ea tampa são vigorosamente agitados para colocar a solução de teste emcontato com o têxtil e aplicar tensão mecânica. Para a descrição adicional ver,WO 02/42740 especialmente o parágrafo "Formas de realização de métodoespeciais" nas páginas 23-24. Os recipientes que contém a solução de teste dedetergente, consistem de orifícios cilíndricos (6 mm de diâmetro, 10 mm deprofundidade) em uma placa metálica. O tecido tingido (material de teste) estána parte superior das placas metálicas e é usado como uma tampa e sela osrecipientes. Uma outra placa metálica está no topo do tecido tingido paraevitar qualquer derramamento de cada recipiente. As duas placas metálicasjuntas com o tecido tingido são submetidos à vibração para cima e para baixoem uma freqüência de 30 Hz com uma amplitude de 2 mm.

O ensaio é conduzido sob as condições experimentaisespecificadas abaixo:Tabela 1

<table>table see original document page 55</column></row><table>

As amostras turméricas creme foram preparadas misturando-se5 g de turmérico (Santa Maria, Denmark) com 100 g de creme (38% degordura, Aria, Denmark} a 50° C, a mistura foi deixada nesta temperatura porcerca de 20 minutos e filtrada (50° C) para remover quaisquer partículas nãodissolvidas. A mistura é esfriada a 20 ° C e amostras de algodão tecidas,EMPA221, foram imersas na mistura creme-turmérica e posteriormentedeixadas secar em temperatura ambiente durante a noite e congeladas até ouso. A preparação de amostras creme-turméricas é divulgada na patente WO2006/125437.

O desempenho da amostra variante é medido como a claridadeda cor das amostras têxteis lavadas com aquela enzima variante específica. Aclaridade também pode ser expressada como a intensidade da luz refletida apartir da amostra têxtil quando iluminada com luz branca. Quando o têxtil étingido, a intensidade da luz refletida é menor, do que aquela de um têxtillimpo.

Portanto, a intensidade da luz refletida pode ser usada paramedir o desempenho de lavagem de uma enzima variante.

As medições de cor são feitas com um scanner de leito planoprofissional (PFU DL2400pro), que é usado para capturar uma imagem dasamostras de tecido lavadas. As varreduras são feitas com uma resolução de200 dpi e com uma profundidade de cor de saída de 24 bits. A fim deconseguir resultados precisos, o scanner é freqüentemente calibrado com umaalvo IT8 refletivo Kodak.

Para extrair um valor quanto à intensidade de luz a partir dasimagens escaneadas, uma aplicação de software projetado especial é usada(Novozymes Color Vector Analyzer). O programa recupera os valores depixel de 24 bits a partir da imagem e os converte em valores para vermelho,verde e azul (RGB). O valor de intensidade (Int) é calculado pela adição dosvalores RGB junto como vetores e então tomando-se o comprimento do vetorresultante:

<formula>formula see original document page 56</formula>

O desempenho de lavagem (P) das variantes é calculado deacordo com a fórmula abaixo:

P = Int(v) - Int(r)

onde

Int(v) é o valor de intensidade de luz da superfície têxtil lavada com enzima eInt(r) é o valor de intensidade de luz da superfície têxtil lavada sem a enzima.

Um registro de desempenho relativo é dado como o resultadoda lavagem AMSA de acordo com a definição:

Os registros de desempenho relativo (RP) são somados aosdesempenhos (P) das variantes de enzima testadas contra a enzima dereferência:

RP = P(enzima de teste)/P(enzima de referência).

RPavg indica o desempenho médio relativo em comparaçãocom a enzima de referência em todas as três concentrações de enzima (0,125,0,25, 0,5, 1,0 mgep/1)

RPavg = avg(RP(0,125), RP(0,25) RP(0,5), RP(I5O))Uma variante é considerada apresentar desempenho delavagem melhorado, se esta tiver desempenho melhor do que a referência.

No contexto da presente invenção, a enzima de referência é aparte madura da SEQ ID N0:2 com as substituições T23IR + N233R.

Exemplo 3

GC - Cromatografia a Gás - para o cálculo do fator de risco

A liberação de ácido butírico das amostras lavadas com lipaseforam medidas pela Cromatografia Gasosa de Micro Extração de Fase Sólida(SPME-GC) usando-se o seguinte método. Quatro pedaços têxteis (5 mm dediâmetro), lavados na solução especificada na Tabela 1 contendo 1 mg/l delipase, foram transferidos a um frasco de Cromatografia Gasosa (GC). Asamostras foram analisadas em um Varian 3800 GC equipado com uma colunaStabilwax- DA w/integra-Guard (30 m, 0,32 mm de ID e 0,25 micro-m df) euma fibra Carboxen PDMS SPME (75 micro-m). Cada amostra foi pré-incubada por 10 minutos a 40° C seguido por 20 minutos de amostragem coma fibra de SPME no espaço superior sobre os pedaços têxteis. A amostra foisubseqüentemente injetada na coluna (temperatura do injetor = 250° C). Fluxoda coluna = 2 ml de Hélio/min. Gradiente de temperatura do forno de coluna:0 min = 40° C, 2 min = 40° C, 22 min = 240° C, 32 min = 240° C. O ácidobutírico foi detectado pela detecção FID e a quantidade de ácido butírico foicalculada com base em uma curva padrão de ácido butírico.

O Odor do Desempenho de Risco, R, de uma variante de lipaseestá entre a quantidade de ácido butírico da amostra de tecido lavada com avariante de lipase e a quantidade de ácido butírico de uma amostra lavadacom a parte madura da lipase da SEQ ID N°: 2, após ambos os valores seremcorrigidos para a quantidade de ácido butírico liberado a partir de umaamostra de tecido não lavada com lipase. O risco (R) das variantes é calculadode acordo com a fórmula abaixo:

Odor = medido em micro g de ácido butírico desenvolvido em1 mg de proteína de enzima /1 corrigido para o branco

AlfaenzIma de teste— Odorenzjma (je teste — BrancoAlfaenzJma de referência OdorenzJma de referência — BranCOR AlfaenzJma Je teste/Alfaenzjma de referência

Uma variante é considerada apresentar odor reduzido emcomparação com a referência, se o fator R for menor do que 1,

Exemplo 4

Atividade (LU) com relação à absorbância em 280 nm

A atividade de uma lipase com relação à absorbância em 280nm é determinada pelo seguinte ensaio:LU/A280:

Um substrato para lipase é preparado pela emulsificação detributirina (tributirato de glicerina) usando-se goma arábica comoemulsificador. A hidrólise de tributirina a 30° C em pH 7 ou 9 e seguido emum experimento de titulação de pH-stat. Uma unidade de atividade de lipase(1 LU) iguala a quantidade de enzima capaz de liberar 1 micro mol deácido/min em pH 7.

A absorbância da lipase purificada em 280 nm é medido(A280) e a razão LU/A280 é calculada. O LU/A280 relativo é calculado comoo LU/A280 da variante dividida pelo LU/A280 de uma enzima de referência.No contexto da presente invenção, a enzima de referência é a parte madura daSEQ ID N0:2 com as mutações T23IR e N233R.

Exemplo 5

BR - Risco Benefício

O fator de Risco Benefício que descreve o desempenho emcomparação com o risco reduzido para o cheiro do odor é definido destamaneira como:BR — RPAvg/R

Uma variante é considerada apresentar desempenho delavagem melhorado e odor reduzido, se o fator BR for maior do que 1.

Aplicando-se os método acima, os seguintes resultados foramobtidos:

Tabela 2

<table>table see original document page 59</column></row><table>

A lipase de referência e as variantes 7 e 8 na Tabela 2 sãodescritos no WO 2000/060063.

A invenção descrita e reivindicada neste não deve ser limitadaem escopo pelos aspectos específicos divulgados neste, visto que estesaspectos são pretendidos como ilustrações de diversos aspectos da invenção,quaisquer aspectos equivalentes são pretendidos estarem dentro do escopodesta invenção. De fato, várias modificações, da invenção além daquelasmostradas e descritas neste, tornar-se-ão evidentes para aqueles habilitados natécnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também sãopretendidas estarem dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso deconflito, a presente divulgação incluindo as definições controlarão.

Várias referências são citadas neste, cujas divulgações sãoincorporadas neste por referência em sua totalidade.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Novozymes A/S

Novozymes North America, Inc.Vind, JesperBorch, KimMikkelsen, Mikael

<120> Polipeptideos tendo atividade de lipase<130> 10927.204-W0<160> 18<170> PatentIn versão 3.4<210> 1<211> 873<212> DNA<213> Thermomyces lanuginosus<220> <221> CDS<222> (1)··(873)<220> <221> sig peptídeo<222> (1)··(51)<220> <221> pró-pep<222> (52)..(66)<220> <221> mat peptideo<222> (67) .. ()<4 00> 1

4896144192240288336384432480528576

atg agg age tcc ctt gtg ctg ttc ttt gtc tet gcg tgg acg gcc ttgMet Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu

-20 -15 -10

gcc agt cct att cgt cga gag gtc tcg cag gat ctg ttt aac cag ttcAla Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe

-5 -11 5 10

aat ctc ttt gea cag tat tet gea gcc gea tac tgc gga aaa aac aatAsn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn

15 20 25

gat gcc cca gct ggt aca aac att acg tgc acg gga aat gcc tgc cccAsp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro

30 35 40

gag gta gag aag gcg gat gea acg ttt ctc tac tcg ttt gaa gac tetGlu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser

45 50 55

gga gtg ggc gat gtc acc ggc ttc ctt gct ctc gac aac acg aac aaaGly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys

60 65 70

ttg ate gtc ctc tet ttc cgt ggc tet cgt tcc ata gag aac tgg ateLeu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile75 80 85 90

ggg aat ctt aac ttc gac ttg aaa gaa ata aat gac att tgc tcc ggcGly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly

95 100 105

tgc agg gga cat gac ggc ttc act tcg tcc tgg agg tet gta gcc gatCys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp

110 115 120

acg tta agg cag aag gtg gag gat gct gtg agg gag cat ccc gac tatThr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr

125 130 135

cgc gtg gtg ttt acc gga cat age ttg ggt ggt gea ttg gea act gttArg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val

140 145 150

gcc gga gea gac ctg cgt gga aat ggg tat gat ate gac gtg ttt tcaAla Gly Ala155

tat ggc gccTyr Gly Ala

gta cag accVal Gln Thr

gtc cct agaVal Pro Arg205

gag tac tggGlu Tyr Trp220ate gtg aagIle Val Lys235

aac att ccgAsn Ile Pro

aca tgt cttThr Cys Leu

<210> 2

<211> 291

<212> PRT

<213> Thermomyces lanuginosus

<4 00> 2

Met Arg Ser -20 Ser Leu Val Leu Phe -15 Phe Val Ser Ala Trp -10 Thr Ala LeuAla Ser -5 Pro Ile Arg Arg -1 Glu 1 Val Ser Gln Asp 5 Leu Phe Asn Gln Phe 10Asn Leu Phe Ala Gln 15 Tyr Ser Ala Ala Ala 20 Tyr Cys Gly Lys Asn 25 AsnAsp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro 30 35 40 Glu Val Glu 45 Lys Ala Asp Ala Thr 50 Phe Leu Tyr Ser Phe 55 Glu Asp SerGly Val 60 Gly Asp Val Thr Gly 65 Phe Leu Ala Leu Asp 70 Asn Thr Asn LysLeu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile75 80 85 90Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly 95 100 105 Cys Arg Gly His 110 Asp Gly Phe Thr Ser 115 Ser Trp Arg Ser Val 120 Ala AspThr Leu Arg 125 Gln Lys Val Glu Asp 130 Ala Val Arg Glu His 135 Pro Asp TyrArg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val 140 145 150 Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser155 160 165 170Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr 175 180 185 Val Gln Thr Gly 190 Gly Thr Leu Tyr Arg 195 Ile Thr His Thr Asn 200 Asp IleVal Pro Arg 205 Leu Pro Pro Arg Glu 210 Phe Gly Tyr Ser His 215 Ser Ser ProGlu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp 220 225 230 Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro235 240 245 250Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly

Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr 160 ccc cga gtc gga aac agg gctPro Arg Val Gly Asn Arg Ala 175 180ggc gga aca ctc tac cgc attGly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile190 195 ctc ccg ccg cgc gaa ttc ggtLeu Pro Pro Arg Glu Phe Gly 210 ate aaa tet gga acc ctt gtcIle Lys Ser Gly Thr Leu Val 225 ata gaa ggc ate gat gcc accIle Glu Gly Ile Asp Ala Thr 240 gat ate cct gcg cac cta tggAsp Ile Pro Ala His Leu Trp 255 260

Asp Ile Asp Val Phe Ser165 170

ttt gea gaa ttc ctg acc 624

Phe Ala Glu Phe Leu Thr185

acc cac acc aat gat att 672

Thr His Thr Asn Asp Ile200

tac age cat tet age cca 720

Tyr Ser His Ser Ser Pro215

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Pro Val Thr Arg Asn Asp230

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Gly Gly Asn Asn Gln Pro245 250

tac ttc ggg tta att ggg 864

Tyr Phe Gly Leu Ile Gly265

873255 260 265

Thr Cys Leu

<210> 3<211> 265<212> PRT

<213> Absidia reflexa<400> 3

Ser Ser Ser Ser Thr Gln Asp Tyr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Glu Ile1 5 10 15

Lys Ala His Thr Phe Tyr Thr Ala Leu Ser Ala Asn Ala Tyr Cys Arg

20 25 30

Thr Val Ile Pro Gly Gly Arg Trp Ser Cys Pro His Cys Gly Val Ala

35 40 45

Ser Asn Leu Gln Ile Thr Lys Thr Phe Ser Thr Leu Ile Thr Asp Thr

50 55 60

Asn Val Leu Val Ala Val Gly Glu Lys Glu Lys Thr Ile Tyr Val Val65 70 75 80

Phe Arg Gly Thr Ser Ser Ile Arg Asn Ala Ile Ala Asp Ile Val Phe

85 90 95

Val Pro Val Asn Tyr Pro Pro Val Asn Gly Ala Lys Val His Lys Gly

100 105 110

Phe Leu Asp Ser Tyr Asn Glu Val Gln Asp Lys Leu Val Ala Glu Val

115 120 125

Lys Ala Gln Leu Asp Arg His Pro Gly Tyr Lys Ile Val Val Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Val Leu Ser Ala Leu Asp Leu Tyr145 150 155 160

His His Gly His Ala Asn Ile Glu Ile Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg

165 170 175

Ile Gly Thr Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Ile Gly Thr Lys Ile Pro

180 185 190

Tyr Gln Arg Leu Val His Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro

195 200 205

Gly Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Phe Trp Ile Met Lys

210 215 220

Asp Ser Ser Leu Arg Val Cys Pro Asn Gly Ile Glu Thr Asp Asn Cys225 230 235 240

Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Ile Asp His Leu Ser Tyr

245 250 255

Leu Asp Met Asn Thr Gly Leu Cys Leu260 265

<210> 4<211> 264<212> PRT

<213> Absidia corymbifera<4 00> 4

Ser Ser Ser Thr Gln Asp Tyr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Glu Ile Lys15 10 15

Ala His Thr Phe Tyr Thr Ala Leu Ser Ala Asn Ala Tyr Cys Arg Thr

20 25 30

Val Ile Pro Gly Gly Gln Trp Ser Cys Pro His Cys Asp Val Ala Pro

35 40 45

Asn Leu Asn Ile Thr Lys Thr Phe Thr Thr Leu Ile Thr Asp Thr Asn

50 55 60

Val Leu Val Ala Val Gly Glu Asn Glu Lys Thr Ile Tyr Val Val Phe65 70 75 80

Arg Gly Thr Ser Ser Ile Arg Asn Ala Ile Ala Asp Ile Val Phe Val

85 90 95

Pro Val Asn Tyr Pro Pro Val Asn Gly Ala Lys Val His Lys Gly Phe

100 105 110

Leu Asp Ser Tyr Asn Glu Val Gln Asp Lys Leu Val Ala Glu Val Lys115 120 125Ala Gln Leu Asp Arg His Pro Gly Tyr Lys Ile Val Val Thr Gly His130 135 140 Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Val Leu Ser Ala Leu Asp Leu Tyr His145 150 155 160His Gly His Asp Asn Ile Glu Ile Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Ile 165 170 175 Gly Thr Pro Glu Phe Ala Asn Tyr Val Ile Gly Thr Lys Ile Pro Tyr 180 185 190 Gln Arg Leu Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro Gly 195 200 205 Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Phe Trp Ile Met Lys Asp210 215 220 Ser Ser Leu Arg Val Cys Pro Asn Gly Ile Glu Thr Asp Asn Cys Ser225 230 235 240Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Ile Asp His Leu Ser Tyr Leu 245 250 255 Asp Met Asn Thr Gly Leu Cys Leu 260 <210> 5 <211> 269 <212> PRT <213> Rhizomucor miehei <400> 5 Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu1 5 10 15 Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val 20 25 30 Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp 35 40 45 Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala50 55 60 Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg65 70 75 80Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro 85 90 95 Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu 100 105 110 Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu Asp 115 120 125 Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser130 135 140 Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Asp Leu Tyr Gln Arg145 150 155 160Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln 165 170 175 Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly 180 185 190 Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu 195 200 205 Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile210 215 220 Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu225 230 235 240Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp 245 250 255 His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys Thr 260 265 <210> 6 <211> 271 <212> PRT <213> Rhizopus oryzae <4 00> 6 Ser Ala Ser Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile1 5 10 15

Gln Glu Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg

20 25 30

Ser Val Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys Val Gln Cys Gln Lys Trp

35 40 45

Val Pro Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr Ser Leu Leu Ser Asp

50 55 60

Thr Asn Gly Tyr Val Leu Arg Ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu65 70 75 80

Val Phe Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val

85 90 95

Phe Asn Phe Ser Asp Tyr Lys Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala

100 105 110

Gly Phe Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val

115 120 125

Val Gln Glu Gln Leu Thr Ala His Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr

130 135 140

Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu145 150 155 160

Tyr Gln Arg Glu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr

165 170 175

Val Gly Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Glu

180 185 190

Ser Thr Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val

195 200 205

Pro His Val Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu

210 215 220

Ser Trp Ile Lys Ser Gly Thr Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser Glu225 230 235 240

Ile Glu Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Ile

245 250 255

Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu260 265 270

<210> 7<211> 267<212> PRT

<213> Aspergillus niger<4 00> 7

Thr Ala Gly His Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gln Gly Ile Ser Glu Asp15 10 15

Leu Tyr Ser Arg Leu Val Glu Met Ala Thr Ile Ser Gln Ala Ala Tyr

20 25 30

Ala Asp Leu Cys Asn Ile Pro Ser Thr Ile Ile Lys Gly Glu Lys Ile

35 40 45

Tyr Asn Ser Gln Thr Asp Ile Asn Gly Trp Ile Leu Arg Asp Asp Ser

50 55 60

Ser Lys Glu Ile Ile Thr Val Phe Arg Gly Thr Gly Ser Asp Thr Asn65 70 75 80

Leu Gln Leu Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Pro Phe Asp Thr Leu Pro

85 90 95

Gln Cys Asn Gly Cys Glu Val His Gly Gly Tyr Tyr Ile Gly Trp Val

100 105 110

Ser Val Gln Asp Gln Val Glu Ser Leu Val Lys Gln Gln Val Ser Gln

115 120 125

Tyr Pro Asp Tyr Ala Leu Thr Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ser

130 135 140

Leu Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gln Leu Ser Ala Thr Tyr Asp Asn Ile145 150 155 160

Arg Leu Tyr Thr Phe Gly Glu Pro Arg Ser Gly Asn Gln Ala Phe Ala

165 170 175

Ser Tyr Met Asn Asp Ala Phe Gln Ala Ser Ser Pro Asp Thr Thr Gln

180 185 190

Tyr Phe Arg Val Thr His Ala Asn Asp Gly Ile Pro Asn Leu Pro Pro195 200 6 205 Val Glu Gln Gly Tyr Ala His Gly Gly Val Glu Tyr Trp Ser Val Asp 210 215 220 Pro Tyr Ser Ala Gln Asn Thr Phe Val Cys Thr Gly Asp Glu Val Gln225 230 235 240Cys Cys Glu Ala Gln Gly Gly Gln Gly Val Asn Asn Ala His Thr Thr 245 250 255 Tyr Phe Gly Met Thr Ser Gly Ala Cys Thr Trp 260 265 <210> 8 <211> 266 <212> PRT <213> Aspergillus tubingensis <400> 8 Thr Ala Gly His Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gln Gly Ile Ser Glu Asp1 5 10 15 Leu Tyr Ser Arg Leu Val Glu Met Ala Thr Ile Ser Gln Ala Ala Tyr 20 25 30 Ala Asp Leu Cys Asn Ile Pro Ser Thr Ile Ile Lys Gly Glu Lys Ile 35 40 45 Tyr Asn Ser Gln Thr Asp Ile Asn Gly Trp Ile Leu Arg Asp Asp Ser 50 55 60 Ser Lys Glu Ile Ile Thr Val Phe Arg Gly Thr Gly Ser Asp Thr Asn65 70 75 80Leu Gln Leu Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Thr Pro Phe Asp Thr Leu Pro 85 90 95 Gln Cys Asn Ser Cys Glu Val His Gly Gly Tyr Tyr Ile Gly Trp Ile 100 105 110 Ser Val Gln Asp Gln Val Glu Ser Leu Val Gln Gln Gln Val Ser Gln 115 120 125 Phe Pro Asp Tyr Ala Leu Thr Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ser 130 135 140 Leu Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gln Leu Ser Ala Thr Tyr Asp Asn Ile145 150 155 160Arg Leu Tyr Thr Phe Gly Glu Pro Arg Ser Asn Gln Ala Phe Ala Ser 165 170 175 Tyr Met Asn Asp Ala Phe Gln Ala Ser Ser Pro Asp Thr Thr Gln Tyr 180 185 190 Phe Arg Val Thr His Ala Asn Asp Gly Ile Pro Asn Leu Pro Pro Ala 195 200 205 Asp Glu Gly Tyr Ala His Gly Val Val Glu Tyr Trp Ser Val Asp Pro 210 215 220 Tyr Ser Ala Gln Asn Thr Phe Val Cys Thr Gly Asp Glu Val Gln Cys225 230 235 240Cys Glu Ala Gln Gly Gly Gln Gly Val Asn Asn Ala His Thr Thr Tyr 245 250 255 Phe Gly Met Thr Ser Gly His Cys Thr Trp 260 265 <210> 9 <211> 276 <212> PRT <213> Fusarium oxysporum <400> 9 Ala Val Gly Val Thr Thr Thr Asp Phe Ser Asn Phe Lys Phe Tyr Ile1 5 10 15 Gln His Gly Ala Ala Ala Tyr Cys Asn Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ser 20 25 30 Lys Ile Thr Cys Ser Asn Asn Gly Cys Pro Thr Val Gln Gly Asn Gly 35 40 45 Ala Thr Ile Val Thr Ser Phe Val Gly Ser Lys Thr Gly Ile Gly Gly 50 55 60 Tyr Val Ala Thr Asp Ser Ala Arg Lys Glu Ile Val Val Ser Phe Arg65 70 75 80Gly Ser Ile Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn Leu Asp Phe Gly Gln 85 90 95 Glu Asp Cys Ser Leu Val Ser Gly Cys Gly Val His Ser Gly Phe Gln 100 105 110 Arg Ala Trp Asn Glu Ile Ser Ser Gln Ala Thr Ala Ala Val Ala Ser 115 120 125 Ala Arg Lys Ala Asn Pro Ser Phe Asn Val Ile Ser Thr Gly His Ser 130 135 140 Leu Gly Gly Ala Val Ala Val Leu Ala Ala Ala Asn Leu Arg Val Gly145 150 155 160Gly Thr Pro Val Asp Ile Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn 165 170 175 Ala Gln Leu Ser Ala Phe Val Ser Asn Gln Ala Gly Gly Glu Tyr Arg 180 185 190 Val Thr His Ala Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Leu Ile Phe 195 200 205 Gly Tyr Arg His Thr Thr Pro Glu Phe Trp Leu Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Asp Lys Val Asp Tyr Thr Ile Ser Asp Val Lys Val Cys Glu Gly Ala 225 230 235 240Ala Asn Leu Gly Cys Asn Gly Gly Thr Leu Gly Leu Asp Ile Ala Ala 245 250 255 His Leu His Tyr Phe Gln Ala Thr Asp Ala Cys Asn Ala Gly Gly Phe 260 265 270 Ser Trp Arg Arg 275 <210> 10 <211> 273 <212> PRT <213> Fusarium ι heterosporum <4 00> 10 Thr Val Thr Thr Gln Asp Leu Ser Asn Phe Arg Phe Tyr Leu Gln His1 5 10 15 Ala Asp Ala Ala Tyr Cys Asn Phe Asn Thr Ala Val Gly Lys Pro Val 20 25 30 His Cys Ser Ala Gly Asn Cys Pro Asp Ile Glu Lys Asp Ala Ala Ile 35 40 45 Val Val Gly Ser Val Val Gly Thr Lys Thr Gly Ile Gly Ala Tyr Val 50 55 60 Ala Thr Asp Asn Ala Arg Lys Glu Ile Val Val Ser Val Arg Gly Ser65 70 75 80Ile Asn Val Arg Asn Trp Ile Thr Asn Phe Asn Phe Gly Gln Lys Thr 85 90 95 Cys Asp Leu Val Ala Gly Cys Gly Val His Thr Gly Phe Leu Asp Ala 100 105 110 Trp Glu Glu Val Ala Ala Asn Val Lys Ala Ala Val Ser Ala Ala Lys 115 120 125 Thr Ala Asn Pro Thr Phe Lys Phe Val Val Thr Gly His Ser Leu Gly 130 135 140 Gly Ala Val Ala Thr Ile Ala Ala Ala Tyr Leu Arg Lys Asp Gly Phe145 150 155 160Pro Phe Asp Leu Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn Asp Phe 165 170 175 Phe Ala Asn Phe Val Thr Gln Gln Thr Gly Ala Glu Tyr Arg Val Thr 180 185 190 His Gly Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Ile Val Phe Gly Tyr 195 200 205 Arg His Thr Ser Pro Glu Tyr Trp Leu Asn Gly Gly Pro Leu Asp Lys 210 215 220 Asp Tyr Thr Val Thr Glu Ile Lys Val Cys Glu Gly Ile Ala Asn Val225 230 235 240Met Cys Asn Gly Gly Thr Ile Gly Leu Asp Ile Leu Ala His Ile Thr 245 250 255Tyr Phe Gln Ser Met 260 Arg <210> 11 <211> 278 <212> PRT <213> Aspergillus <4 00> 11 Asp Ile Pro Thr Thr1 5Ala Ala Ala Thr Tyr 20 Lys Leu Asn Cys Ser 35 Ser Thr Val Lys Leu 50 Gly Phe Val Ala Val65 Arg Gly Ser Tyr Ser 85Gln Thr Asp Pro Gly 100 Trp Thr Ala Trp Lys 115 Glu Leu Lys Pro Glu 130 Ser Leu Gly Ala Ala145 Lys Asn Tyr Asp Ala 165Asn Lys Pro Leu Ala 180 Phe Thr His Asn Asp 195 Gly Tyr Val His Ile 210 Thr Thr Val Thr Asp225 Phe Lys Gly Asn Thr 245Phe His Ser His Val 260 Pro Gly Leu Pro Leu 275 <210> 12 <211> 278 <212> PRT <213> Peni cillium <4 00> 12 Asp Val Ser Thr Ser1 5Ala Ala Ala Ser Tyr 20 Lys Leu Ser Cys Ser 35 Ala Thr Val Ser Tyr 50 Gly Tyr Ile Ala Val65 Arg Gly Ser Tyr Ser 85His Thr Asn Pro Gly

Ala Thr Cys Ala Pro Ile265

oryzae

Gln Leu Glu Asp Phe Lys 10 Cys Pro Asn Asn Tyr Val 25 Val Gly Asn 4 0 Cys Pro AspSer Phe Ser Asp Asp Thr 55 Asp Asn Thr Asn Lys Ala70 75Ile Arg Asn Trp Val Thr 90 Leu Cys Asp Gly Cys Lys 105 Val Val Arg Asp Arg Ile 120 His Ser Asp Tyr Lys Ile 135 Ile Ala Ser Leu Ala Ala150 155Ile Leu Tyr Ala Tyr Ala 170 Glu Phe Ile Thr Asn Gln 185 Asp Pro Val Pro Lys Leu 200 Ser Pro Glu Tyr Tyr Ile 215 Asn Gln Val Thr Val Leu230 235Gly Thr Ser Gly Gly Leu 250 Trp Tyr Phe Ile His Ala 265 Arg

cameraberti

Glu Leu Asp Gln Phe Glu10

Tyr Glu Ala Asp Tyr Thr25

Lys Gly Asn Cys Pro Glu40

Asp Phe Ser Asp Ser Thr55

Asp His Thr Asn Ser Ala70 75

Val Arg Asn Trp Val Ala90

Leu Cys Asp Gly Cys Leu

Ala Ile Pro Trp Lys270

Phe Trp Val Gln Tyr15

Ala Lys Asp Gly Glu30

Val Glu Ala Ala Gly45

Ile Thr Asp Thr Ala60

Ile Val Val Ala Phe80

Asp Ala Thr Phe Pro95

Ala Glu Leu Gly Phe110

Ile Lys Thr Leu Asp125

Val Val Val Gly His140

Ala Asp Leu Arg Thr160

Ala Pro Arg Val Ala175

Gly Asn Asn Tyr Arg190

Pro Leu Leu Thr Met205

Thr Ala Pro Asp Asn220

Asp Gly Tyr Val Asn240

Pro Asp Leu Leu Ala255

Asp Ala Cys Lys Gly270

Phe Trp Val Gln Tyr15

Ala Gln Val Gly Asp30

Val Glu Ala Thr Gly45

Ile Thr Asp Thr Ala60

Val Val Leu Ala Phe80

Asp Ala Thr Phe Val95

Ala Glu Leu Gly Phe100 105 110

Trp Ser Ser Trp Lys Leu Val Arg Asp Asp Ile Ile Lys Glu Leu Lys 115 120 125 Glu Val Val Ala Gln Asn Pro Asn Tyr Glu Leu Val Val Val Gly His 130 135 140 Ser Leu Gly Ala Ala Val Ala Thr Leu Ala Ala Thr Asp Leu Arg Gly145 150 155 160Lys Gly Tyr Pro Ser Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Ala Ser Pro Arg Val 165 170 175 Gly Asn Ala Ala Leu Ala Lys Tyr Ile Thr Ala Gln Gly Asn Asn Phe 180 185 190 Arg Phe Thr His Thr Asn Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Leu Leu Ser 195 200 205 Met Gly Tyr Val His Val Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Pro Asn 210 215 220 Asn Ala Thr Val Ser Thr Ser Asp Ile Lys Val Ile Asp Gly Asp Val225 230 235 240Ser Phe Asp Gly Asn Thr Gly Thr Gly Leu Pro Leu Leu Thr Asp Phe 245 250 255 Glu Ala His Ile Trp Tyr Phe Val Gln Val Asp Ala Gly Lys Gly Pro 260 265 270 Gly Leu Pro Phe Lys Arg 275 <210> 13 <211> 270 <212> PRT <213> Aspergillus foetidus <4 00> 13 Ser Val Ser Thr Ser Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ala Gln Trp1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ser Asn Asn Ile Asp Ser Lys Asp Ser Asn 20 25 30 Leu Thr Cys Thr Ala Asn Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Thr 35 40 45 Thr Met Leu Leu Glu Phe Asp Leu Thr Asn Asp Phe Gly Gly Thr Ala 50 55 60 Gly Phe Leu Ala Ala Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe65 70 75 80Arg Gly Ser Ser Thr Ile Glu Asn Trp Ile Ala Asn Leu Asp Phe Ile 85 90 95 Leu Glu Asp Asn Asp Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly 100 105 110 Phe Trp Lys Ala Trp Glu Ser Ala Ala Asp Glu Leu Thr Ser Lys Ile 115 120 125 Lys Ser Ala Met Ser Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly 130 135 140 His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg145 150 155 160Asn Asp Gly Tyr Ser Val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Ile 165 170 175 Gly Asn Tyr Ala Leu Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala 180 185 190 Asn Phe Arg Val Thr His Leu Asn Asp Ile Val Pro Arg Val Pro Pro 195 200 205 Met Asp Phe Gly Phe Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser 210 215 220 Gly Asn Gly Ala Ser Val Thr Ala Ser Asp Ile Glu Val Ile Glu Gly225 230 235 240Ile Asn Ser Thr Ala Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Ser Val Leu 245 250 255 Ala His Leu Trp Tyr Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu Leu 260 265 270 <210> 14<211> 270<212> PRT

<213> Aspergillus niger <4 00> 14 Ser Val Ser Thr Ser Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ser Gln Trp1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala 20 Tyr Cys Ser Asn Asn 25 Ile Asp Ser Asp Asp 30 Ser AsnVal Thr Cys 35 Thr Ala Asp Ala Cys 40 Pro Ser Val Glu Glu 45 Ala Ser ThrLys Met 50 Leu Leu Glu Phe Asp 55 Leu Thr Asn Asn Phe 60 Gly Gly Thr AlaGly Phe Leu Ala Ala Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe65 70 75 80Arg Gly Ser Ser Thr 85 Ile Lys Asn Trp Ile 90 Ala Asp Leu Asp Phe 95 IleLeu Gln Asp Asn 100 Asp Asp Leu Cys Thr 105 Gly Cys Lys Val His 110 Thr GlyPhe Trp Lys 115 Ala Trp Glu Ala Ala 120 Ala Asp Asn Leu Thr 125 Ser Lys IleLys Ser 130 Ala Met Ser Thr Tyr 135 Ser Gly Tyr Thr Leu 140 Tyr Phe Thr GlyHis Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg145 150 155 160Asn Asp Gly Tyr Ser 165 Val Glu Leu Tyr Thr 170 Tyr Gly Cys Pro Arg 175 ValGly Asn Tyr Ala Leu Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala 180 185 190 Asn Phe Pro 195 Val Thr His Leu Asn 200 Asp Ile Val Pro Arg 205 Val Pro ProMet Asp 210 Phe Gly Phe Ser Gln 215 Pro Ser Pro Glu Tyr 220 Trp Ile Thr SerGly Thr Gly Ala Ser Val Thr Ala Ser Asp Ile Glu Leu Ile Glu Gly225 230 235 240Ile Asn Ser Thr Ala 245 Gly Asn Ala Gly Glu 250 Ala Thr Val Asp Val 255 LeuAla His Leu Trp 260 Tyr Phe Phe Ala Ile 265 Ser Glu Cys Leu Leu 270

<210> 15

<211> 269

<212> PRT

<213> Aspergillus oryzae

<400> 15

Asp Val Ser Ser Ser Leu Leu Asn Asn Leu Asp Leu Phe Ala Gln Tyr1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala 20 Tyr Cys Asp Glu Asn 25 Leu Asn Ser Thr Gly 30 Thr LysLeu Thr Cys 35 Ser Val Gly Asn Cys 40 Pro Leu Val Glu Ala 45 Ala Ser ThrGln Ser Leu Asp Glu Phe Asn Glu Ser Ser Ser Tyr Gly Asn Pro Ala 50 55 60 Gly Tyr Leu Ala Ala Asp Glu Thr Asn Lys Leu Leu Val Leu Ser Phe65 70 75 80Arg Gly Ser Ala Asp 85 Leu Ala Asn Trp Val 90 Ala Asn Leu Asn Phe 95 GlyLeu Glu Asp Ala 100 Ser Asp Leu Cys Ser 105 Gly Cys Glu Val His 110 Ser GlyPhe Trp Lys 115 Ala Trp Ser Glu Ile 120 Ala Asp Thr Ile Thr 125 Ser Lys ValGlu Ser Ala Leu Ser Asp His Ser Asp Tyr Ser Leu Val Leu Thr Gly 130 135 140 His Ser Tyr Gly Ala Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Thr Ala Leu Arg145 150 155 160Asn Ser Gly His Ser Val Glu Leu Tyr Asn Tyr Gly Gln Pro Arg Leu

165 170 175

Gly Asn Glu Ala Leu Ala Thr Tyr Ile Thr Asp Gln Asn Lys Gly Gly

180 185 190

Asn Tyr Arg Val Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Lys Leu Pro Pro

195 200 205

Thr Leu Leu Gly Tyr His His Phe Ser Pro Glu Tyr Tyr Ile Ser Ser

210 215 220

Ala Asp Glu Ala Thr Val Thr Thr Thr Asp Val Thr Glu Val Thr Gly225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asp Gly Thr Asp Gly Thr Ser Ile Asp

245 250 255

Ala His Arg Trp Tyr Phe Ile Tyr Ile Ser Glu Cys Ser260 265

<210> 16<211> 251<212> PRT

<213> Landerina penisapora<4 00> 16

Pro Gln Asp Ala Tyr Thr Ala Ser His Ala Asp Leu Val Lys Tyr Ala15 10 15

Thr Tyr Ala Gly Leu Ala Tyr Gln Thr Thr Asp Ala Trp Pro Ala Ser

20 25 30

Arg Thr Val Pro Lys Asp Thr Thr Leu Ile Ser Ser Phe Asp His Thr

35 40 45

Leu Lys Gly Ser Ser Gly Tyr Ile Ala Phe Asn Glu Pro Cys Lys Glu

50 55 60

Ile Ile Val Ala Tyr Arg Gly Thr Asp Ser Leu Ile Asp Trp Leu Thr65 70 75 80

Asn Leu Asn Phe Asp Lys Thr Ala Trp Pro Ala Asn Ile Ser Asn Ser

85 90 95

Leu Val His Glu Gly Phe Leu Asn Ala Tyr Leu Val Ser Met Gln Gln

100 105 110

Val Gln Glu Ala Val Asp Ser Leu Leu Ala Lys Cys Pro Asp Ala Thr

115 120 125

Ile Ser Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Cys Ile Ser

130 135 140

Met Val Asp Thr Ala Gln Arg His Arg Gly Ile Lys Met Gln Met Phe145 150 155 160

Thr Tyr Gly Gln Pro Arg Thr Gly Asn Gln Ala Phe Ala Glu Tyr Val

165 170 175

Glu Asn Leu Gly His Pro Val Phe Arg Val Val Tyr Arg His Asp Ile

180 185 190

Val Pro Arg Met Pro Pro Met Asp Leu Gly Phe Gln His His Gly Gln

195 200 205

Glu Val Trp Tyr Glu Gly Asp Glu Asn Ile Lys Phe Cys Lys Gly Glu

210 215 220

Gly Glu Asn Leu Thr Cys Glu Leu Gly Val Pro Phe Ser Glu Leu Asn225 230 235 240

Ala Lys Asp His Ser Glu Tyr Pro Gly Met His245 250

<210> 17<211> 12<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Seqüência usada para exemplo de alinhamento<4 00> 17

Ala Cys Met Ser His Thr Trp Gly Glu Arg Asn Leu15 10

<210> 18<211> 14<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Seqüência usada para exemplo de alinhamento<400> 18

His Gly Trp Gly Glu Asp Ala Asn Leu Ala Met Asn Pro Ser1 5 10

Claims (17)

1. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que tem atividadede lipase e que ainda tem um Desempenho Relativo Médio (RPavg) de pelomenos 0,8 e um Risco Benefício (BR) de pelo menos 1,1 nas condições deteste dadas no relatório descritivo.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que ainda tem um LU/A280 relativo menor do que 1,00 nascondições de teste dadas no relatório descritivo.

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que é um polipeptídeo bacteriano.

4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que é um polipeptídeo fungico.

5. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que é um polipeptídeo de Thermomyces.

6. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que é um polipeptídeo de Thermomyces lanuginosus.

7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que é um variante de uma lipase compreendida pelo polipeptídeoda SEQ ID N°: 2

8. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que é um variante de uma lipase compreendida pela parte madurado polipeptídeo da SEQ ID N°: 2.

9. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que é uma variante de uma lipase que compreende o polipeptídeoda SEQ ID N°: 2

10. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é uma variante de uma lipase que compreendea parte madura do polipeptídeo da SEQ ID N°: 2.

11. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é codificado por um polinucleotídeo quehibridiza-se sob, pelo menos, condições de estringência alta com nucleotídeos-644 a 732 da SEQ ID N°: 1 ou um filamento complementar a este.

12. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de quecompreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo comodefinido em qualquer uma das reivindicações.

13. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato deque compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 12operacionalmente ligado a uma ou mais seqüências de controle quedirecionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

14. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fatode que compreende a concentração de ácido nucleico corno definido nareivindicação 13.

15. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato deque compreende a construção de ácido nucleico como definida nareivindicação 14.

16. Método para a produção de polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de quecompreendea) cultivar uma célula, que, em sua forma do tipo selvagem écapaz de produzir o polipeptídeo, sob condições condutoras para a produçãodo polipeptídeo eb) recuperar o polipeptídeo.

17. Método para a produção de polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de quecompreendea) cultivar uma célula hospedeira que compreende umaconstrução de ácido nucleico que compreende uma seqüência de nucleotídeoque codifica o polipeptídeo sob condições condutoras para a produção dopolipeptídeo eb) recuperar o polipeptídeo.