CN101374947A - 具有脂肪酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有脂肪酶活性的多肽，并且在说明书中给出的测试条件下，所述多肽进一步具有至少0.8的RP和至少1.1的BR。

Description

具有脂肪酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

发明领域

本发明涉及具有脂肪酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。

发明背景

脂肪酶是有用的，例如，作为洗涤剂酶用于从衣物和其它纺织品去除脂质或脂肪沾污，作为用于面包和其它烘焙产品的生面团的添加剂。因此，源自细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)(同物异名疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa))的脂肪酶以商品名Lipolase

(Novo Nordisk A/S的产品)以洗涤剂用途出售。WO 0060063描述了细毛嗜热霉脂肪酶的变体，其在洗涤剂溶液中具有特别优良的初次洗涤性能(first-wash performance)。WO 9704079、WO9707202和WO 0032758也公开细毛嗜热霉脂肪酶的变体。WO 02062973公开具有C-末端延伸的细毛嗜热霉脂肪酶，其具有降低的形成气味(odor)的趋势。

发明概述

本发明涉及具有脂肪酶活性的分离的多肽，其选自下组:在说明书给出的测试条件下，具有至少0.8的平均相对性能(Relative Performance；RP)和至少1.1的效益风险(Benefit-Risk；BR)的脂肪酶。

本发明还涉及气味产生可能性降低的脂肪酶变体，和制备它们的方法。本发明特别涉及细毛嗜热霉脂肪酶的变体，其对长脂肪酸链具有偏好，而同时具有良好的相对性能。

在进一步的方面，本发明涉及包含编码所述多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸，包含所述多核苷酸的核酸构建体，包含所述核酸构建体的重组表达载体，和包含所述核酸构建体的重组宿主细胞。

本发明还涉及用于产生本发明的脂肪酶的方法。

序列表

SEQ ID NO:1显示编码源自细毛嗜热霉的脂肪酶的DNA序列。

SEQ ID NO:1显示源自细毛嗜热霉的脂肪酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:16显示图1中用于比对的序列。

SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18显示用于比对实例(alignment example)的序列。

定义

脂肪酶活性:术语“脂肪酶活性”在本文定义为羧酸酯水解酶活性，其在形成二酰甘油和羧酸酯的情况下，催化三酰甘油的水解。就本发明而言，根据“材料和方法”内的“脂肪酶活性”中描述的方法测定脂肪酶活性。将1单位的脂肪酶活性定义为在30℃，pH7，每分钟能够释放1.0微摩尔丁酸的酶量。

作为含有取代T231R+N233R的由SEQ ID NO:2的成熟多肽所示氨基酸序列组成的多肽的相对性能测量，本发明的多肽具有至少70％，如至少75％或80％或85％或90％，更优选至少95％，甚至更优选96％或97％，最优选98％或99％，并且最优选至少100％的脂肪酶活性。

分离的多肽:术语“分离的多肽”用于本文中指，如通过SDS-PAGE测定的，是至少20％纯，优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，最优选至少90％纯，并且甚至最优选至少95％纯的多肽。

基本上纯的多肽(substantially pure polypeptide):术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物按重量计含有至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然结合的(associated)的其它多肽材料。即，因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯。

本发明的多肽优选是基本上纯的形式。具体而言，优选所述多肽是“基本上(essentially)纯的形式”，即，所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然结合的其它多肽材料。这能够通过以下方法实现，例如，通过公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽。

在本文中，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”同义。

同一性:参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

就本发明而言，通过使用来自EMBOSS软件包(http://emboss.org)版本2.8.0的Needle程序来测定两个氨基酸序列之间的比对。Needle程序执行总体比对算法，其在Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中描述。使用的取代矩阵是BLOSUM62，缺口开启罚分(gap openingpenalty)是10，并且缺口延伸罚分(gap extension penalty)是0.5。

本发明的氨基酸序列(“发明序列”；例如SEQ ID NO:2的氨基酸1至269)和不同氨基酸序列(“外源序列”)之间的同一性程度如下计算:用两个序列比对中完全匹配的数目除以“发明序列”的长度或“外源序列”的长度中最短的一个。将结果表示为百分比同一性。

当“发明序列”和“外源序列”在重叠的相同位置中具有同一氨基酸残基(在下述比对实例中用“|”表示)，发生完全匹配。序列的长度是序列中氨基酸残基的数目(例如SEQ ID NO:2的长度是269)。

在以下比对实例中，重叠是序列A的氨基酸序列“HTWGER-NL”；或序列B的氨基酸序列“HGWGEDANL”。在本例中缺口用“-”表示。

比对实例

序列A:ACMSHTWGER-NL

          | |||  ||

序列B:    HGWGEDANLAMNPS

多肽片段:术语“多肽片段”在本文中定义为从SEQ ID NO:2的氨基末端和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽，或其同源序列；其中所述片段具有脂肪酶活性。

亚序列(subsequence):术语“亚序列”在本文中定义为从SEQ ID NO:1的5＇和/或3＇端缺失一个或多个核苷酸的核苷酸序列，或其同源序列；其中所述亚序列编码具有脂肪酶活性的多肽片段。

等位变体(allelic variant):术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

基本上纯的多核苷酸:术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指不含其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于适合于在遗传工程的蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸按重量计含有至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯的。本发明所述多核苷酸优选是基本上纯的形式。具体而言，优选在本文公开的多核苷酸是“基本上(essentially)纯的形式”，即，所述多核苷酸制备物基本上不含与其天然结合的其它多核苷酸材料。在本文中，术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”同义。所述多核苷酸可以是基因组来源、cDNA来源、RNA来源、半合成来源、合成来源的，或它们的任意组合。

cDNA:术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA没有任何内含子序列。

核酸构建体:术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(nototherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的片段。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence):术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有成分。各种调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

可操作地连接:术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。

编码序列:当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接详明其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始。编码序列可以是DNA、cDNA或重组核苷酸序列。

表达:术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体:术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞:如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。

修饰:术语“修饰”在本文的意思是，对由SEQ ID NO:2的成熟多肽组成的多肽的任何化学修饰，以及对编码这种多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及氨基酸侧链的置换。

人工变体:当用在本文时，术语“人工变体”的意思是具有脂肪酶活性的多肽，所述多肽由表达SEQ ID NO:1的修饰的核苷酸序列的生物产生。所述修饰的核苷酸序列通过人为干预(human intervention)，通过修饰公开于SEQID NO:1的核苷酸序列来获得。

相对性能(RP):术语相对性能反映的是，当作为以特定酶变体洗涤的纺织品样品的亮度来测量时，酶变体相较于参照酶的性能。

效益-风险因子(BR):效益-风险因子描述的是，相较于在去除底物时的气味风险的洗涤性能。

变体命名规则:

为了易于参考，在描述本发明的脂肪酶变体时，采用以下命名法:

原始氨基酸:位置:取代氨基酸

根据这种命名法，例如，在位置195中用谷氨酸取代甘氨酸表示为G195E。在相同的位置缺失甘氨酸表示为G195^*，而插入额外的氨基酸残基例如赖氨酸表示为G195GK。

与其它脂肪酶相比，当特定脂肪酶含有“缺失”并且在该位置进行插入的情况，就在位置36插入天冬氨酸而言，将这种情况表示为^*36D。

用加号分隔多个突变，即:R170Y+G195E，分别表示在位置170用酪氨酸取代精氨酸，和在位置195用谷氨酸取代甘氨酸。

当应用所述排列方法时，X231表示在亲本多肽中对应于位置231的氨基酸。X231R表示用R置换所述氨基酸。就SEQ ID NO:2而言，X是T，因此T231R表示用R取代位置231的T。当某个位置(例如231)中的氨基酸可以由选自一组氨基酸的另一个氨基酸取代的情况，例如由R和P和Y组成的组，将这种情况表示为X231R/P/Y。

在所有的情况下，采用IUPAC所承认的单字母或三字母的氨基酸缩写。

发明详述

具有脂肪酶活性的多肽

本发明涉及具有脂肪酶活性分离的多肽，其选自下组:在说明书中给出的测试条件下，具有至少0.8的RP和至少1.1的BR的脂肪酶。

在优选的实施方式中，脂肪酶具有至少0.9的RP，例如1.0或1.1。在更优选的实施方案中，脂肪酶具有至少1.2的RP，例如1.3或者甚至1.4。

在另一个优选的实施方式中，脂肪酶具有至少1.2的BR，例如1.3或者甚至1.4。在更优选的实施方式中，脂肪酶具有至少1.5的BR，例如1.6或者甚至1.7。

在进一步的方面中，本发明的脂肪酶在说明书中给出的测试条件下，进一步具有小于1，例如小于0.95的相对LU/A280。在优选的实施方式中，所述相对LU/A280小于0.90，例如小于0.85，或者甚至小于0.80。

在进一步的方面中，本发明涉及分离的多肽，其具有SEQ ID NO:2所包含的氨基酸序列或包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或其等位变体；并且所述分离的多肽进一步具有至少1.1的BR和至少0.8的RP。在另一个方面，本发明涉及分离的多肽，其具有SEQ ID NO:2的成熟部分所包含的氨基酸序列或包含SEQ ID NO:2的成熟部分的氨基酸序列，或其等位变体；并且所述分离的多肽进一步具有至少1.1的BR和至少0.8的RP。

在更进一步的方面，本发明涉及分离的多肽，其具有与SEQ ID NO:2的成熟多肽(即，成熟多肽)具有至少80％，例如至少85％或90％，或者至少95％，优选至少97％，最优选至少98％，并且甚至最优选至少99％的同一性程度的氨基酸序列，并且所述分离的多肽具有脂肪酶活性(下文中的“同源多肽”)。在优选的方面中，所述同源多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差十个氨基酸，相差九个氨基酸，相差八个氨基酸，相差七个氨基酸，相差六个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。

在进一步的方面，本发明涉及具有脂肪酶活性的分离的多肽，所述分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严紧性条件下，优选低严紧性条件下，更优选中严紧性条件下，更优选中-高严紧性条件下，甚至更优选高严紧性条件下，并且最优选非常高严紧性条件下，与以下杂交:(i)SEQ IDNO:1的核苷酸644-732，(ii)SEQ ID NO:1的核苷酸644-732中包含的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2dedition，Cold Spring Harbor，New York)。SEQ ID NO:1的亚序列含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。此外，所述亚序列可编码具有脂肪酶活性的多肽片段。

SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其亚序列，以及SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段，可以用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属和种的菌株鉴定和克隆编码具有脂肪酶活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以从中鉴定和分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，优选至少25，更优选至少35，并且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针是至少100个核苷酸长度。例如，所述核酸探针长度上可以是至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。甚至可以使用更长的探针，例如，长度是至少600个核苷酸，至少优选至少700个核苷酸，或更优选至少800个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。将这些探针包含于本发明中。

因而，可从由这些其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有脂肪酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术来分离来自这些其它生物的基因组DNA或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其亚序列同源的克隆或DNA，优选将所述载体材料用在Sounthern印迹中。

就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高严紧性条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列、它的互补链，或其亚序列。可使用X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在更进一步的方面，本发明涉及人工变体，所述人工变体包含保守取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:2或其成熟多肽，所述变体具有至少1.1的BR和至少0.8的RP。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；小缺失，通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，例如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内:碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath and R.L.Hill，1979，In，The Proteins，Academic Press，New York描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

除了20个基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。

可供选择的是，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham and Wells，1989，Science 244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，脂肪酶活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton et al.，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术:如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos et al.，1992，Science 255:306-312；Smith et al.，1992，J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver etal.，1992，FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的同一性也能够从与多肽同一性的分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。

能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，继之以相关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson and Sauer，1988，Science 241:53-57；Bowieand Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman et al.，1991，Biochem.30:10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire et al.，1986，Gene 46:145；Ner et al.，1988，DNA 7:127)。

诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。

对SEQ ID NO:2的氨基酸1-291的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选至多5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。

区和取代的鉴定

可以按照本部分公开的内容来鉴定本申请涵盖的取代。

下文中的I区至IV区中所指的位置是SEQ ID NO:2中氨基酸残基的位置。为了在不同的脂肪酶中找到相应的(同源的)位置，使用在“同源性和比对”中描述的方法。

I区中的取代

I区由围绕N末端残基E1的氨基酸残基组成。在这个区中，优选用带更多正电(more positive)的氨基酸取代亲本脂肪酶的氨基酸。

I区包含对应于以下位置的氨基酸残基:2-11和223-239。以下位置是尤其感兴趣的:4、8、11、223、229、231、233、234、236。

具体而言，已经鉴定了以下取代:X4V、X231R和X233R。

在优选的实施方式中，变体脂肪酶与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如85％或90％，例如至少95％或98％或99％同一性。

II区中的取代

II区由在酰基链的一侧和醇部分的一侧与底物接触的氨基酸残基组成。在这个区中，优选用带更多正电的氨基酸或用疏水性较小的氨基酸来取代亲本脂肪酶的氨基酸。

II区包含对应于以下位置的氨基酸残基:202-211和249-269。以下位置是尤其感兴趣的:202、210、211、253、254、255、256。

具体而言，已经鉴定了以下取代:X202G、X255Y/V和X256K/R。

在优选的实施方式中，变体脂肪酶与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如85％或90％，例如至少95％或98％或99％同一性。

III区中的取代

III区由形成柔性结构(flexible structure)的氨基酸组成，因此允许底物进入活性部位。在这个区中，优选用带更多正电的氨基酸或疏水性较小的氨基酸取代亲本脂肪酶的氨基酸。

III区包含对应于以下位置的氨基酸残基:82-102。以下位置是尤其感兴趣的:86、87、90、91、95、96、99。

具体而言，已经鉴定了以下取代:X86V和X90A/R。

在优选的实施方式中，变体脂肪酶与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如85％或90％，例如至少95％或98％或99％同一性。

IV区中的取代

IV区由与表面以静电结合的氨基酸残基组成。在这个区中，优选用带更多正电的氨基酸取代亲本脂肪酶的氨基酸。

IV区包含对应于以下位置的氨基酸残基:27和54-62。以下位置是尤其感兴趣的:27、56、57、58、60。

具体而言，已经鉴定了以下取代:X27R、X58N/AG/T/P和X60V/S/G/N/R/K/A/L。

在优选的实施方式中，变体脂肪酶与SEQ ID NO:2具有至少80％，例如85％或90％，例如至少95％或98％或99％同一性。

其它位置上的氨基酸

亲本脂肪酶可以任选地包含其它氨基酸的取代，特别是少于10个或少于5个这样的取代。实例是相应于SEQ ID NO:2的以下一个或多个位置的取代:24、46、74、81、83、127、131、137、147、150、203、206、211、263、264、265、267和269。在具体的实施方式中，在相应于位置81、147、150、227和249的至少一个中存在取代。在优选的实施方式中，至少一个取代选自下组:X81Q/E、X147M/Y、X150G、X227G和X249R/I/L。

进一步的取代可以，例如，根据本领域已知的原理进行，例如WO92/05249、WO94/25577、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中描述的取代。

同源性和比对

就本发明而言，可以通过本领域已知的计算机程序的方法适当地测定同源性的程度，所述程序例如GCG程序包中提供的GAP(Program Manual for theWisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-45)，按照用于多肽序列比较的以下设定来使用GAP:GAP产生罚分(GAP creation penalty)为3.0，和GAP延伸罚分(GAP extension penalty)为0.1。

在本发明中，通过图1中所示的比对定义了在下列脂肪酶序列中相应的(或同源的)位置:曲柄犁头霉(Absidia reflexa)、Absidia corymbefera、曼赫根毛霉(Rhizmucor miehei)、德氏根霉(Rhizopus delemar)、黑曲霉(Aspergillusniger)、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、米曲霉(Aspergillus oryzea)、沙门柏干酪青霉(Penicilium camembertii)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、黑曲霉、细毛嗜热霉(同物异名:疏棉状腐质霉)和Landerina penisapora。

为了发现所述比对中未显示的脂肪酶序列中的同源位置，将感兴趣的序列与图1中显示的序列进行比对。通过使用GAP将新序列与GAP程序发现的最同源的序列进行比对，来将新序列排入图1中的现有比对。GAP在GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-45)中提供。使用以下设置用于多肽序列比较:GAP产生罚分为3.0，GAP延伸罚分为0.1。

可以使用任何合适的亲本脂肪酶。在优选的实施方式中，亲本脂肪酶与细毛嗜热霉脂肪酶(SEQ ID NO:2)具有至少50％的同源性，特别是至少55％，至少60％，至少75％，至少85％，至少90％，多于95％、96％、97％或多于98％或99％的同源性。在具体的实施方式中，亲本脂肪酶与细毛嗜热霉脂肪酶(SEQ ID NO:2)相同。

具有脂肪酶活性的多肽的来源

本发明的多肽可以获得自任意属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”的意思应为核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。

本发明的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，例如芽孢杆菌属(Bacillus)多肽，例如，嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽；或链霉菌属(Streptomyces)多肽，例如，浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，例如，大肠杆菌或假单胞菌属菌种多肽。

本发明的多肽还可以是真菌多肽，并且更优选是酵母多肽，例如念珠菌属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽；或更优选是丝状真菌多肽，例如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filobasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)多肽。

在优选的方面，所述多肽是具有脂肪酶活性的卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillus turbigensis)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、细毛嗜热霉(同物异名:疏棉状腐质霉)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是嗜热霉属多肽。

在更优选的方面，所述多肽是细毛嗜热霉多肽，例如，具有本发明公开的突变的SEQ ID NO:2的多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)两种，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如，无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员将轻易地识别适合的等同物的同一性。

这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够轻易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心，北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。

此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组文库或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook et al.，1989，见上文)。

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另一种多肽融合到所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。通过将编码另一种多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。

多核苷酸

本发明还涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸具有编码本发明的多肽的核苷酸序列。本发明还包含编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的变体多肽或其成熟多肽的核苷酸序列，由于遗传密码的简并性这种核苷酸序列不同于编码核苷酸序列。本发明还涉及SEQ ID NO:1的亚序列，其编码具有脂肪酶活性的SEQ ID NO:2的片段，所述片段具有至少1.1的BR和至少0.8的RP。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis et al.，1990，PCR:A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法，例如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从嗜热酶属的菌株，或从其它或相关的生物克隆多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。

本发明还涉及具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，并且最优选至少97％、98％或99％同一性的同一性程度，所述多核苷酸编码具有脂肪酶活性以及至少1.1的BR和至少0.8的RP的多肽。

修饰编码本发明的多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可能是必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQID NO:1的多肽编码区存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下的核苷酸取代来构建变体序列:所述取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的其它氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Fordetal.，1991，Protein Expression and Purification 2:95-107。

对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域公知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunninghamand Wells，1989，Science244:1081-1085)来鉴定。在后一技术中，将突变引入到分子中的每个正电残基处，并且测试所得突变分子的脂肪酶活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来测定(参见，例如，de Vos et al.，1992，Science 255:306-312；Smith et al.，1992，Journal of Molecular Biology 224:899-904；Wlodaver et al.，1992，FEBS Letters309:59-64)。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在非常低严紧条件下，优选低严紧条件，更优选中严紧条件，更优选中-高严紧条件，甚至更优选高严紧条件，并且最优选非常高的严紧条件下，与以下杂交:(i)SEQ ID NO:1的，(ii)SEQ ID NO:1中包含的cDNA序列，或(iii)(i)至(ii)的互补链；或它们的等位变体和亚序列(Sambrook et al.，1989，见上文)，如本文所定义的。

本发明还涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸通过以下方法获得:(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高严紧条件下，将DNA的群体与以下杂交:(i)核苷酸SEQ ID NO:1，(ii)SEQ ID NO:1的核苷酸中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有脂肪酶活性的多肽。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

调控序列可以是合适的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截断的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体转录(特别是在细菌宿主细胞中转录)的合适启动子的实例是从下述获得的启动子:大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff et al.，1978，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer et al.，1983，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 80:21-25)。另外的启动子在＂Useful proteinsfrom recombinant bacteria＂in Scientific American，1980，242:74-94中；和在Sambrook et al.，1989，见上文中有所描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子:米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截断的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下蛋白的基因获得:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos et al.，1992，Yeast8:423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，即由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得:酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanosetal.，1992，见上文描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得:酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo and Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15:5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端相联的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码区，其与编码分泌多肽的编码区片段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列异源的信号肽编码区。异源信号肽编码区在编码序列不天然地含有信号肽编码区时可能是必需的。或者，外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区可在本发明中使用。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信号肽编码区:芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草溶菌素(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen and Palva，1993，Microbiological Reviews 57:109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信号肽编码区:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶和疏棉状腐质霉脂肪酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码区由Romanos et al.，1992，见上文描述。

调控序列还可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化成成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码区。

当信号肽和前肽区二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽区置于紧接着(next to)多肽氨基末端，并且将信号肽区置于紧接着前肽区的氨基末端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而引起基因表达开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。上文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在合适的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与合适的表达调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择经转化的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

条件性必需基因(conditionally essential gene)可以作为非抗生素选择性标记发挥作用。细菌条件性必需非抗生素选择性标记的非限制性实例是来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或其它芽孢杆菌属(Bacilli)的dal基因，所述基因仅当在缺乏D-丙氨酸条件下培养细菌时是必需的。当将细胞在存在半乳糖的条件下培养或在引起半乳糖存在的培养基中培养时，编码UDP-半乳糖转换中涉及的酶的基因同样能够作为细胞中的条件性必需标记发挥功能。这些基因的非限定性实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的编码UTP依赖性磷酸化酶(EC 2.7.7.10)、UDP-葡萄糖依赖性尿苷酰转移酶(UDP-glucose-dependenturidylyltransferase)(EC 2.7.7.12)或UDP-半乳糖差向异构酶(EC 5.1.3.2)的那些基因。在木糖作为唯一碳源的基本培养基中培养的细胞中，木糖异构酶基因例如芽孢杆菌属的xylA同样能够用作选择性标记。在葡糖酸作为唯一碳源的基本培养基中培养的细胞中，对于利用葡糖酸必需的基因gntK和gntP也能够用作选择性标记。条件性必需基因的其它实例是本领域已知的。抗生素选择性标记赋予对抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、新霉素、潮霉素或氨甲喋呤的抗生素抗性。

对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等价物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应该优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems et al.，1991，Gene 98:61-67；Cullen et al.，1987，Nucleic Acids Research 15:9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得:将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或包括与可多核苷酸一起扩增的选择性标记基因，这样可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增的拷贝的细胞，并由此选择多核苷酸的额外拷贝。

用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook et al.，1989，见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸，将其有利地用于多肽的重组产生中。将包含本发明多核苷酸的载体引入宿主细胞中，从而将该载体保留作为染色体整合体(chromosomal integrant)或作为前述的自复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”包含亲本细胞的任何子代，其由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不相同。宿主细胞的选择将很大程度依赖于编码多肽的基因和它的来源。

宿主细胞可以是单细胞微生物，例如，原核生物，或非单细胞微生物，例如，真核生物。

有用的单细胞微生物是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌；或链霉菌属细胞，例如，浅青紫链霉菌和鼠灰链霉菌，或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌和假单胞菌属菌种。在优选的方面，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另外优选的方面，芽孢杆菌属细胞是嗜碱的芽孢杆菌属。

可通过如下方法实现将载体引入到细菌宿主细胞:例如原生质体转化(参见，例如，Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young and Spizizen，1961，Journal of Bacteriology81:823-829或Dubnau and Davidoff-Abelson，1971，Journal of MolecularBiology56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques 6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler and Thorne，1987，Journalof Bacteriology 169:5771-5278)。

宿主细胞还可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门:子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworthetal.，In，Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth et al.，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworthet al.，1995，见上)。

在更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，and Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。

在更加优选的方面，酵母宿主细胞是念珠菌属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。

在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另外最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另外最优选的方面，酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。

在另外更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth et al.，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

在甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、网孢菌属(Filobasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。

在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另外的最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)或镶片镰孢(Fusariumvenenatum)细胞。在另外最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiops is aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、Pleurotuseryngii、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、绒毛栓菌(Trametes villosa)、杂色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉或绿色木霉(Trichoderma viride)菌株细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238 023和Yelton et al.，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier et al.，1989，Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母:Becker and Guarente，In Abelson，J.N.and Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods inEnzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito et al.，1983，Journal of Bacteriology 153:163；和Hinnen et al.，1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75:1920。

产生方法

本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括:(a)在有益于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。优选地，所述细胞是曲霉属的细胞，并且更优选是米曲霉的细胞。

本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括:(a)在有益于产生多肽的条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括:(a)在有益于产生多肽的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变核苷酸序列，其在SEQ ID NO:1的成熟多肽编码区中具有至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码的多肽是SEQ ID NO:2的多肽所包含的脂肪酶或包含SEQ ID NO:2的多肽的脂肪酶，和(b)回收所述多肽。在优选的实施方案中，所述核苷酸序列编码的多肽是SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分所包含的脂肪酶或包含SEQID NO:2的多肽的成熟部分的脂肪酶，和(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公布的成分制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzyme assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。

所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，所述组合物富含这种多肽。术语“富含”表示将所述组合物的脂肪酶活性增加，例如，以至少1.1的富集因数(enrichment factor)增加。

所述组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶成分，例如，单成分组合物。或者，所述组合物可以包含多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。额外的酶可以通过例如属于以下属或种的微生物产生:曲霉属，优选棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，优选杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，优选特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，优选哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。

可以依照本领域内已知的方法制备多肽组合物，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以将包括于所述组合物中的多肽依照本领域内已知方法稳定。

以下提供的实施例是本发明多肽组合物的优选的用途。本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其它条件可以基于本领域内已知的方法确定。

洗涤剂应用

可以将本发明的酶添加至洗涤剂组合物，并且由此成为该洗涤剂组合物的成分。

可以将本发明的洗涤剂组合物配制为例如手洗或机洗的洗涤剂组合物，包括适于预处理沾污织物的洗衣添加剂组合物和添加了漂洗剂的织物柔软剂组合物，或将其配制为用于通常家庭硬表面清理操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗的洗碟(dishwashing)操作。

酶

在具体的方面，本发明提供洗涤剂添加剂，其包含本发明的酶。所述洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可以包含一种或多种其它酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶，和/或过氧化物酶。

选择的酶的性质通常应该与选择的洗涤剂相容(即最适pH，与其它酶和非酶成分的相容性等)，并且所述酶应该以有效量存在。

蛋白酶:

合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。微生物来源是优选的。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。所述蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草蛋白酶(subtilisin)，特别是源自芽孢杆菌属的那些，例如，枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(在WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如，猪或牛来源)和镰孢属蛋白酶，在WO 89/06270和WO 94/25583中描述。

有用的蛋白酶的实例是在WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中描述的变体，特别是在以下位置中的一个或多个具有取代的变体:27、36、57、68、76、87、97、101、104、106、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、245、252和274，和具有以下突变的其它变体中的变体:(K27R，V104Y，N123S，T124A)、(N76D，S103A，V104I)或(S101G，S103A，V104I，G159D，A232V，Q236H，Q245R，N248D，N252K)。

优选的商业上能够获得的蛋白酶包括Alcalase^TM、Savinase^TM、Primase^TM、Duralase^TM、Esperase^TM、Coronase^TM、Polarzyme^TM和Kannase^TM(NovozymesA/S)，Maxatase^TM、Maxacal^TM、Maxapem^TM、Properase^TM、Purafect^TM、PurafectPrime^TM、Purafect OxP^TM、FN2、FN3和FN4(Genencor International Inc.)。

脂肪酶:

脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括:源自腐质霉属(同物异名嗜热霉属)的脂肪酶，例如，如EP 258 068和EP 305 216中所述来自疏棉状腐质霉(同物异名细毛嗜热霉)，或如WO 96/13580中所述来自特异腐质霉；假单胞菌属脂肪酶，例如源自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌种菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO96/12012)；芽孢杆菌属脂肪酶，例如，源自枯草芽孢杆菌(Dartois et al.(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)。

其它实例是脂肪酶变体，例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的那些。

其它商业上能够获得的脂肪酶包括Lipolase^TM、Lipolase Ultra^TM和Lipex^TM(Novozymes A/S)。

优选的脂肪酶是本发明的脂肪酶。

淀粉酶:

合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌和真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌的特殊菌株获得的α-淀粉酶，在GB 1,296,839中有更详细的描述。

有用的淀粉酶的实例是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中描述的变体，特别在以下位置中的一个或多个具有取代的变体:15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。

商业上能够获得的淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、Stainzyme^TM、Stainzyme Ultra^TM、Fungamyl^TM和BAN^TM(Novozymes A/S)，Rapidase^TM和Purastar^TM(来自Genencor International Inc.)。

纤维素酶:

合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，产生自特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢的真菌纤维素酶，其公开于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259。

特别合适的纤维素酶是碱性或中性纤维素酶，其具有保护颜色的效益(colour care benefits)。这种纤维素酶的实例是在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是纤维素酶变体，例如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些。

商业上能够获得的纤维素酶包括Renozyme^TM、Celluzyme^TM和Carezyme^TM(Novozymes A/S)，Clazinase^TM和Puradax HA^TM(Genencor International Inc.)，以及KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶:

合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中描述的那些。

商业上能够获得的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(Novozymes A/S)。

洗涤剂

通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂，可将洗涤剂酶包括在洗涤剂组合物中。可将本发明的洗涤剂添加剂，即单独的添加剂或组合的添加剂，配制成例如，颗粒、液体、浆等。优选的洗涤剂添加剂剂型是颗粒，特别是无粉尘(non-dusting)颗粒，液体，特别是稳定的液体，或浆。

例如，可以如US4,106,991和4,661,452中所公开的产生无粉尘颗粒，并且可以任选地通过本领域已知的方法包覆。蜡制包覆材料(waxy coating material)的实例是具有1000至20000的平均摩尔量的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个的环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单酸甘油酯和甘油二酯和甘油三酯。适合于流化床技术应用的成膜包覆材料的实例提供于GB 1483591。例如，可根据已经建立的方法通过添加多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定液体酶制剂。可以根据公开于EP 238,216中的方法来制备保护酶(protected enzyme)。

本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如，条、片剂、粉剂、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是含水的，通常含有多至70％的水和0-30％的有机溶剂，或非水的(non-aqueous)。

洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其可以是非离子的，包括半极性的和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性离子的。所述表面活性剂通常以按重量计0％至60％的水平存在。

当包括于本文中时，所述洗涤剂将通常含有大约0％至大约40％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸酯(olefinsulfonate)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸盐(alcohol ethoxysulfate)、仲链烷磺酸盐(secondary alkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸或肥皂(soap)。

当包括在本文中时，洗涤剂将通常含有大约0％至大约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)、烷基二甲基氧化胺(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(ethoxylated fatty acid monoethanolamide)、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamide)”)。

洗涤剂可以含有0-65％的洗涤剂增效剂或复合剂例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐(phosphonate)、碳酸盐(carbonate)、柠檬酸盐、氮川三乙酸(nitrilotriacetic acid)、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶硅酸盐或分层硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。

洗涤剂可包含一种或多种聚合物。实例是羧甲基纤维素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯(polycarboxylates)例如聚丙烯酸酯(polyacrylates)、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可以含有漂白体系，其可以包含H₂O₂源例如过硼酸盐或过碳酸盐，其可以与形成过酸的漂白激活剂例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)组合。或者，漂白体系可以包含例如，酰胺、二酰亚胺(imide)或砜类型的过氧酸。

本发明的洗涤剂组合物的酶可以使用常规稳定剂来稳定，例如，多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如，芳香硼酸酯，或苯基硼酸(phenyl boronic acid)衍生物例如4-甲酰苯基硼酸(4-formylphenylboronic acid)，并且可以例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制所述组合物。

洗涤剂还可以含有其它常规洗涤剂成分，例如，织物整理剂(fabricconditioner)包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、防污再沉积剂、染料、杀菌剂、光亮剂(optical brightener)、水溶助剂(hydrotrope)、晦暗抑制剂(tarnish inhibitors)或香料。

目前期望的是，在洗涤剂组合物中的任何酶，特别是本发明的酶，可以按相当于每升洗涤液0.001-100mg酶蛋白，例如0.01-50mg或0.03-30mg酶蛋白，优选每升洗涤液0.05-5mg酶蛋白，特别是每升洗涤液0.1-1mg酶蛋白的量添加。

本发明的酶可以额外地并入公开于WO 97/07202、WO 04/041979、WO04/074419的洗涤剂配制物，将这些文献作为参考文献并入本文。

用途

本发明还针对使用具有脂肪酶活性的多肽的方法。

可以根据现有技术类推将本发明的变体用于已知的脂肪分解酶应用中，例如:

可以将具有脂肪酶活性的变体用于纸浆和造纸工业中，以从使用过的纸去除树脂(pitch)或去除墨水。WO 9213130、WO 9207138、JP 2160984 A、EP374700。

可以将具有磷脂酶和/或半乳糖脂肪酶活性的变体用于制备生面团、面包和蛋糕，例如，用于增加生面团稳定性和生面团的操作性质，或者用于改进面包或蛋糕的弹性(elasticity)。WO 94/04035、WO 00/32758。

可以将具有磷脂酶活性的变体用于减少食用油中磷脂含量的方法。US5,264,367(Metallgesellschaft，

)；K.Dahlke & H.Buchold，INFORM，6(12)，1284-91(1995)；H.Buchold，Fat Sci.Technol.，95(8)，300-304(1993)；JP-A2-153997(Showa Sangyo)；或EP 654,527(Metallgesellschaft，

)。

可以将具有溶血磷脂酶活性的变体用于改进碳水化合物来源的浆料或水溶液的滤过性，例如淀粉水解产物，特别是小麦淀粉水解产物的滤过性。EP219,269。

可以将具有磷脂酶活性的变体用来制备溶血磷脂，例如用于生产蛋黄酱(EP 628256、EP 398666或EP 319064)的溶血卵磷脂(EP 870840、JP-A 10-42884、JP-A 4-135456或JP-A 2-49593)。

还可以将具有磷脂酶活性的变体用于乳制品和其它食品的加工中，例如，如EP 567,662(Nestlé)、EP 426,211(Unilever)、EP 166,284(Nestlé)、JP-A57-189638(Yakult)或US 4,119,564(Unilever)中所述。

可以将具有磷脂酶活性的变体使用在皮革工业中。GB 2233665、EP505920。

可以在整理织物期间将具有脂肪酶活性的变体用于去除含有疏水酯(例如甘油三酯)的脂肪物质。WO 93/13256。

通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

实施例

用作缓冲剂和底物的化学品是至少试剂等级的商业产品。

培养基和溶液

产品          商品名称

LAS:          Surfac PS

沸石A         Wessalith P

材料

产品          供应商

EMPA221       EMPA St.Gallen，Lerchfeldstrasse 5，CH-9014 St.Gallen，Switzerland

实施例1

酶的产生

使用本领域的标准方法构建含有编码脂肪酶的基因的质粒，并且转化至合适的宿主细胞中。

使用温度为34℃的恒定培养基和1.2升的起始体积，按照补料分批发酵来进行发酵。将培养基的初始pH设为6.5。一旦pH增加至7.0，通过添加10％H₃PO₄来保持该值。通过改变搅拌速率和使用1.0升空气每升培养基每分钟的固定通气速率来控制培养基中的溶解氧水平。在整个补料分批阶段过程中，将补料添加速率保持在恒定水平。

分批培养基含有麦芽糖糖浆作为碳源，尿素和酵母提取物作为氮源，以及痕量金属和盐的混合物。在补料分批阶段期间连续添加的补料含有麦芽糖糖浆作为碳源，而添加酵母提取物和尿素以确保氮的充足供应。

可以通过使用本领域已知的标准方法来进行脂肪酶的纯化，例如通过过滤发酵上清，继之以疏水层析和离子交换层析，例如如EP 0 851 913 EP，实施例3中所述。

实施例2

AMSA-自动化机械应力试验-用于计算RP

使用自动机械应力试验(Automatic Mechanical Stress Assay；AMSA)测试本申请的酶变体。使用AMSA测试，能够检查大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA平板具有用于测试溶液的多个槽(slot)，和将待洗涤的纺织品样品相对于所有槽的开口(slot opening)压紧的盖。在洗涤时间中，剧烈摇动平板、测试溶液、纺织品和盖以使测试溶液与纺织品接触并且施以机械应力。进一步的描述参见WO 02/42740，特别是第23-24页的段落“特殊方法实施方式”。含有洗涤剂测试溶液的容器由金属平板中的圆柱形孔洞(直径6mm，深10mm)组成。沾污的织物(测试材料)放置在金属平板顶部，并将沾污的织物用作盖子密封在所述容器上。另一个金属平板放置在沾污织物的顶部以避免从各个容器中的任何溢出。以2mm振幅和30Hz的频率将两块金属平板连同沾污织物上下振动。

在下文指定的实验条件下进行所述试验:

 

测试溶液	0.5g/l LAS0.52g/l Na2CO31.07g/l 沸石A0.52g/l 柠檬酸钠(Na3Citrate)
		测试溶液体积	160微升
pH	不予改变(as is)(≈9.9)
		洗涤时间	20分钟
温度	30℃
		水硬度	15°dHCa2+/Mg2+/NaHCO3比例:4:1:7.5
测试溶液中的酶浓度	0.125，0.25，0.50，1.0mg ep/l
		干燥	洗涤性能:在洗涤之后，立即在自来水中冲洗纺织品片，并且在85C风干5分钟气味:洗涤之后，立即在自来水中冲洗纺织品片，并且在室温(20℃)干燥2小时
测试材料	如下所述的奶油姜黄(cream turmeric)样品(使用EMPA221作为棉布纺织品)

表1

通过将5g姜黄(Santa Maria，Denmark)与100g奶油(38％脂肪，Arla，Denmark)在50℃混合来制备奶油-姜黄样品，将所述混合物在该温度保持大约20分钟，并且过滤(50℃)以去除任何未溶解的颗粒。将混合物冷却至20℃，并且将编织的棉布样品EMPA221浸入所述奶油-姜黄混合物，之后允许其在室温干燥过夜，并且冷冻直到使用。奶油-姜黄样品的制备在专利WO2006/125437中公开。

将酶变体的性能作为用特定酶变体洗涤的纺织品样品的颜色亮度来测量。也可以将亮度表示为当用白光照射时，从纺织品样品反射的光的强度。当纺织品被沾污时，反射光的强度与清洁纺织品的反射光强度相比较低。因此，能够使用反射光的强度来测量酶变体的洗涤性能。

使用专业平板扫描仪(PFU DL2400pro)进行颜色测量，使用该扫描仪来捕捉经洗涤纺织品样品的图像。使用200dpi的分辨率和24比特(bit)的输出色深度来进行扫描。为了获得精确的结果，经常性地使用Kodak反射IT8指标校准扫描仪。

为了从扫描的图像提取光强度的值，使用特殊设计的软件应用程序(Novozymes Color Vector Analyzer)。该程序从所述图像恢复24比特像素值，并且将它们转化为红、绿和蓝的值(RGB)。通过将RGB值加在一起作为矢量，再取所得矢量的长度来计算强度值(Int):

$\mathrm{Int}=\sqrt{r^2+g^2+b^2}$

根据下式计算变体的洗涤性能(P):

P＝Int(v)-Int(r)

其中

Int(v)是用酶洗涤的纺织品表面的光强度值，和

Int(r)是不用酶洗涤的纺织品表面的光强度值。

根据以下定义，给出相对性能评分作为AMSA洗涤的结果:

相对性能评分(RP)概括了测试酶变体的性能(P)相对于参照酶:

RP＝P(测试酶)/P(参照酶)

RPavg表示在全部三种酶浓度(0.125、0.25、0.5、1.0mg ep/l)时，与参照酶相比的平均相对性能。

RPavg＝avg(RP(0.125)，RP(0.25)RP(0.5)，RP(1.0))

如果变体表现优于参照，则认为变体呈现出改进的洗涤性能。

在本发明的上下文中，参照酶是具有取代T231R+N233R的SEQ ID NO:2的成熟部分。

实施例3

GC-气相层析-用于计算风险因子

使用以下方法通过Solid Phase Micro Extraction Gas Chromatography(SPME-GC)测量来自经脂肪酶洗涤的样品的丁酸释放。将在含有1mg/L脂肪酶的表1中指定溶液中洗涤的四个纺织品片(直径5mm)转移至气相层析(GC)瓶。在装备有Stabilwax-DA w/Integra-Guard柱(30m，0.32mm ID和0.25微米df)和Carboxen PDMS SPME纤维(75微米)的Varian3800GC上分析样品。将各个样品在40℃预温育10分钟，接着用SPME纤维在纺织品片之上的顶部空间(head space)进行20分钟采样。继而将样品注射到柱上(注射器温度＝250℃)。柱流速＝2ml氦/分钟。柱加热炉温度梯度:0分钟＝40℃，2分钟＝40℃，22分钟＝240℃，32分钟＝240℃。由FID检测法检测出丁酸，并且基于丁酸标准曲线来计算丁酸量。

脂肪酶变体的风险性能气味(Risk Performance Odour)R是:经脂肪酶变体洗涤的样品释放的丁酸量和使用SEQ ID NO:2的脂肪酶成熟部分洗涤的样品释放的丁酸量之间的比例，在计算比例之前将这两个值根据无脂肪酶洗涤的样品释放的丁酸量进行修正。根据下式计算变体的风险(R):

气味＝以相对于空白校正的在1mg酶蛋白/升产生的微克丁酸测量

Alpha_测试酶＝气味_测试酶-空白

Alpha_参照酶＝气味_参照酶-空白

R＝Alpha_测试酶/Alpha_参照酶

如果R因子小于1，则认为变体与参照相比表现出减少的气味。

实施例4

相对于280nm吸光度的活性(LU)

通过以下试验来测定相对于280nm吸光度的脂肪酶活性:

LU/A280:

通过使用阿拉伯胶作为乳化剂乳化三丁酸甘油酯(甘油三丁酸酯)来制备用于脂肪酶的底物。在pH7或9在30℃水解三丁酸甘油酯，之后进行pH恒定的滴定实验。1单位的脂肪酶活性(1LU)等于在pH7能够释放1微摩尔丁酸/分钟的酶量。

测量纯化的脂肪酶在280nm的吸光度(A280)，并且计算比例LU/A280。用变体的LU/A280除以参照酶的LU/A280来计算相对LU/A280。在本发明的上下文中，参照酶是具有突变T231R和N233R的SEQ ID NO:2的成熟部分。

实施例5

BR-效益风险

效益风险因子描述的是与减少的气味风险相比的性能，因此将效益风险定义为:

BR＝RP_avg/R

如果BR因子高于1，则认为变体显示出改进的洗涤性能和减少的气味。

应用以上方法获得了以下结果:

 

变体	在SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分中的突变	RP	BR	LU/A280
					1	I202G+T231R+N233R	0.84	1.41	未测定
2	I86V+L227G+T231R+N233R+P256K	1.08	1.52	1700
					3	Q4V+S58N+V60S+T231R+N233R	0.87	1.73	1950
4	S58N+V60S+I90R+T231R，N233R	1.06	1.27	2250
					5	I255Y+T231R+N233R	1.19	1.17	3600
6	I90A+T231R+N233R+I255V	1.13	1.14	2700
					参照	T231R+N233R	1.00	1.00	3650
7	G91A+E99K+T231R+N233R+Q249R+270H+271T+272P+273S+274S+275G+276R+277G+278G+279H+280R	0.43	未测定	850
					8	G91A+E99K+T231R，N233R+Q249R+270H+271T+272P+273S+274S+275G+276R+277G+278G	0.13	未测定	500

表2

表2中的参照脂肪酶和变体7和8在WO 2000/060063中描述。

本文所描述和要求保护的本发明其范围不限于本文公开的具体方面，因为这些方面旨在说明本发明的几个方面。任何等同的方面意欲在本发明的范围之内。实际上，根据前文的描述，除本文显示和描述的内容之外对本发明的各种修饰对于本领域技术人员将是显而易见的。这些修饰也意欲落入所附权利要求的范围之内。如有冲突，以包括定义的本公开为准。

本文引用了多篇参考文件，通过引用以它们的完整形式并入这些参考文件的内容。

Claims (17)

1.一种具有脂肪酶活性的多肽，所述多肽在说明书中给出的测试条件下进一步具有至少0.8的平均相对性能(RPavg)和至少1.1的效益风险(BR)。

2.权利要求1的多肽，所述多肽在说明书中给出的测试条件下进一步具有小于1.00的相对LU/A280。

3.权利要求1的多肽，所述多肽是细菌多肽。

4.权利要求1的多肽，所述多肽是真菌多肽。

5.权利要求4的多肽，所述多肽是嗜热霉属多肽。

6.权利要求5的多肽，所述多肽是细毛嗜热霉多肽。

7.权利要求1的多肽，所述多肽是SEQ ID NO:2的多肽所包含的脂肪酶的变体。

8.权利要求1的多肽，所述多肽是SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分所包含的脂肪酶的变体。

9.权利要求1的多肽，所述多肽是包含SEQ ID NO:2的多肽的脂肪酶的变体。

10.权利要求1的多肽，所述多肽是包含SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分的脂肪酶的变体。

11.权利要求1的多肽，所述多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严紧性条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸644至732或其互补链杂交。

12.分离的多核苷酸，其包含编码前述权利要求中任一项的多肽的核苷酸序列。

13.核酸构建体，其包含权利要求12的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个指导多肽在表达宿主中产生的调控序列可操作地连接。

14.重组表达载体，其包含权利要求13的核酸构建体。

15.重组宿主细胞，其包含权利要求14的核酸构建体。

16.用于产生权利要求1-12中任一项的多肽的方法，包括:

(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和

(b)回收所述多肽。

17.用于产生权利要求1-12中任一项的多肽的方法，包括:

(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和

(b)回收所述多肽。

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