CN105779417B - 一种新型的脂肪酶 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种具有脂肪酶活性的多肽，其包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或在上述序列中包含至少一个氨基酸取代、缺失或添加的序列。本申请还提供了编码所述多肽的多核苷酸、含有该多核苷酸的表达载体和宿主细胞，以及生产上述多肽的方法。此外，还涉及上述具有脂肪酶活性的多肽的用途。

Description

一种新型的脂肪酶

发明领域

本申请属于基因工程或酶工程领域，具体地，涉及具有脂肪酶活性的多肽、其编码核酸，以及包含所述编码核酸的表达载体和宿主细胞。本申请还涉及上述多肽的制备方法及其用途。

发明背景

脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯水解为甘油和游离脂肪酸，还可以催化其他酯类的水解和转酯化以及酯类的合成反应。此外，脂肪酶还表现出对底物的对映选择性。以上特性赋予了脂肪酶在食品油脂加工、洗涤剂、生物柴油、酯键化合物的合成和手性药物合成等工业的广泛应用(Abhishek Kumar Singh,MausumiMukhopadhyay.Overview of Fungal Lipase:A Review.2012,166(2):486-520)。

例如，在油脂加工方面，由于脂肪酶的引入，油脂水解可在常温常压下进行，因此不会使高度不饱和脂肪酸和生育酚等生物物质变性。在医疗方面，脂肪酶作为诊断工具，可预测疾病，如血清中脂肪酶可用于检测急性胰腺炎和胰腺损伤。脂肪酶在药物生产、减轻体重等方面也有应用。在生物柴油合成方面，酶法具有提取纯化工艺简单、设备投资少、耗能低、污染小等优点，日益引起人们的普遍关注，其中织物膜固定化的Novozym 435和假丝酵母(Candida sp.)99-125是生产生物柴油的常用酶。在洗涤工业方面，1988年，诺维信公司首先将含脂肪酶且能有效除去油污的洗涤剂推向市场，应用遗传工程开发出洗涤剂用脂肪酶更是现代生物技术大规模工业化最成功的应用之一。在纸浆和造纸工业，脂肪酶被用来除去纸浆中的“洽脂”，日本Nippon纸业研制了一种“洽脂”控制方法，即用Candida rugasa脂肪酶水解甘三酯，水解度达90％。

脂肪酶催化乳脂肪的水解，产生游离脂肪酸。脂肪酸可以包括短链(C₄-C₆脂肪酸，即丁酸、己酸)和中到长链(C₁₂-C₁₈)脂肪酸。随后游离脂肪酸可参与化学反应，例如香味化合物，如乙酸乙酯、β-酮酸、甲基酮、酯和内酯的形成。使用的脂肪酶可以影响乳酪中释放的游离脂肪酸的类型，例如，辛辣的、强烈的香味主要产生于释放短链脂肪酸(C₄-C₆)的脂肪酶，而中长链脂肪酸则会产生肥皂样的口味。许多研究致力于将脂肪酶改造为短链偏好型，以应用于乳酪制造。

发明概述

第一方面，本申请提供了具有脂肪酶活性的多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(a)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，以及

(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，其中由(b)获得的多肽变体仍保持脂肪酶活性。

在任选的实施方案中，上述多肽与异源多肽融合。

在一实施方案中，本申请的多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在优选的实施方案中，上述多肽由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。

第二方面，提供了编码第一方面的多肽的多核苷酸，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(a)核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或在上述序列中包含至少一个氨基酸取代、缺失或添加的序列；以及

(b)在严格条件下与a)中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

在一实施方案中，本发明的多核苷酸包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在优选的实施方案中，上述多核苷酸由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。

在一实施方案中，本申请的多核苷酸是通过人工合成产生的或是通过重组产生的。

第三方面，提供了表达载体，其包含至少一种上述的多核苷酸。

在某些实施方案中，本申请的表达载体还包含调节多核苷酸表达的调控序列，其中多核苷酸与调控序列可操作地连接。在优选的实施方案中，所述表达载体为pCold-TF。

第四方面，提供了包含本申请的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在优选的实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

第五方面，提供了制备本申请的多肽的方法，其包括：

1)将上述多核苷酸克隆在表达载体上，

2)将表达载体转入合适的宿主细胞中，

3)在合适的培养基中，培养所述宿主细胞，

4)从所述宿主细胞或培养基中分离并纯化所述多肽。

在优选的实施方案中，提供了制备由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的多肽的方法，其包括：将编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列克隆在质粒表达载体中，以及将带有该多核苷酸序列的质粒表达载体转化至大肠杆菌进行诱导表达，然后从大肠杆菌中分离并纯化BM9多肽。

第六方面，提供了按照第五方面的方法制备的脂肪酶。

第七方面，提供了上述多肽、多核苷酸、表达载体或宿主细胞在制备脂肪酶中的用途。

第八方面，提供了上述多肽、脂肪酶、多核苷酸、表达载体或宿主细胞在制造食品中的应用。在优选的实施方案中，将本申请上述多肽、脂肪酶、多核苷酸、表达载体或宿主细胞应用于乳制品或面食的制造中。在一具体实施方案中，上述乳制品为乳酪。

第九方面，提供了利用上述多肽、脂肪酶、多核苷酸、表达载体或宿主细胞制造的食品。在优选的实施方案中，所述食品为乳制品或面食。

本申请的多肽具有中短链脂肪酸偏好性和/或以下的一种或多种特性：在酸性pH范围内具有较好的稳定性；以及具有良好的离子耐受性，如图6所示，添加多种离子都不影响BM9多肽的酶活力。

附图简要说明

图1显示了BM9多肽的凝胶电泳图。第1泳道为分子量标志物，第2泳道为BM9多肽。

图2显示了分别以4-硝基苯基丁酸酯(pNPB)、4-硝基苯基辛酸酯(pNPO)、4-硝基苯基月桂酸酯(pNPD)和4-硝基苯基棕榈酸酯(pNPP)作为底物时，BM9作为脂肪酶的催化水解活性。

图3显示了BM9在不同温度下的酶活力。

图4显示了BM9在不同pH下的酶活力。

图5显示了BM9在不同pH下的脂肪酶活性的稳定性。

图6显示了金属离子对BM9脂肪酶活力的影响。对照组是在反应体系中添加水，其余组在反应体系中分别添加的贮存液为ZnSO₄、MnCl₂、CoCl₂、CaCl₂、MgSO₄、CuSO₄、KCl、(NH4)₂SO₄、NaCl、NiSO4、FeCl₃、柠檬酸钠(C₆H₅Na₃O₇)和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)。

图7显示了表面活性剂对于BM9脂肪酶活力的影响。对照组在反应体系中添加水，其余组在反应体系中分别添加0.5％的阳离子表面活性CTAB、阴离子表面活性剂SDS、非离子表面活性剂Tween 80、AEO-9和Triton X-100。

序列简要说明

SEQ ID NO:1：脂肪酶BM9的氨基酸序列

MIVHGGGFMTQLDFDKGAVPLYVQIKMIIRDKILAREYAPGDSLPSEAQLQEMFHVSRITARQAIAQLESEGLVERARGKGTRVVYPKKIEEQLVGIKSFTNEMLERGIKPSTRYAHMSLVEADAHLSEIFGCAKKDPLYRLDRVRCADGEPIVYFISYFSKDRDLPLDDACYYDSMYALLDELKINKPVKTREIFKAVTANREVSEKLDIKPGDPLLIRERVSYDHEQKVLEYTVSYYLGERYSYTLELGGDSPSTPQ

SEQ ID NO:2：脂肪酶BM9的核苷酸序列

ATGATAGTGCATGGAGGTGGCTTCATGACCCAGTTGGATTTTGATAAGGGGGCCGTCCCTTTATATGTTCAAATTAAAATGATTATTCGCGATAAAATTCTTGCGCGGGAGTATGCCCCCGGCGATTCCTTGCCGAGTGAGGCGCAGCTTCAGGAAATGTTTCACGTTTCCCGCATTACCGCTCGTCAGGCGATTGCCCAGTTGGAAAGCGAGGGGTTGGTAGAGCGCGCTCGCGGTAAAGGTACGCGAGTGGTCTATCCGAAAAAAATTGAAGAACAATTGGTCGGTATCAAAAGCTTTACCAATGAAATGTTGGAACGAGGAATCAAGCCGAGTACCCGATATGCGCATATGAGCTTGGTCGAGGCCGATGCTCATTTATCAGAAATATTCGGTTGTGCCAAAAAGGATCCGTTGTATCGGCTGGATCGGGTACGTTGTGCCGATGGAGAACCGATTGTCTATTTCATCAGCTATTTCTCCAAAGACCGTGACCTTCCGTTAGACGATGCATGCTATTACGACAGTATGTATGCGTTATTGGATGAATTGAAGATTAATAAGCCGGTCAAAACCCGTGAGATTTTCAAGGCGGTTACGGCCAATCGGGAAGTCAGTGAAAAATTGGATATCAAACCGGGCGATCCGCTGTTGATTCGGGAACGAGTTTCTTATGATCATGAACAAAAGGTATTGGAGTATACGGTGTCTTATTATTTGGGTGAGCGTTATTCTTATACGCTGGAATTGGGCGGAGATTCACCGTCAACACCACAA

具体实施方式

多肽

本申请提供了具有脂肪酶活性的多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(a)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，以及

(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，其中由(b)获得的多肽变体仍保持脂肪酶活性。

在一些实施方案中，上述氨基酸取代、缺失或添加的数目为1-30个，优选为1-20个，更优选为1-10个，其中获得的多肽变体基本上能保持脂肪酶活性。在优选的实施方案中，上述多肽变体与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在更优选的实施方案中，上述多肽变体与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4或5个氨基酸的取代、缺失或添加。

在一些实施方案中，本申请的多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在优选的实施方案中，上述多肽由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。

由此，本申请提供了一种脂肪酶，其包含本文公开的具有脂肪酶活性的多肽或其变体，或者由所述多肽或其变体组成。在本文中，由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的多肽被命名为脂肪酶BM9。

在任选的实施方案中，上述多肽与异源多肽融合，形成融合蛋白。

如本文所用的，术语“氨基酸”表示天然存在的和非天然存在的氨基酸以及氨基酸类似物和模拟物。天然存在的氨基酸包括蛋白生物合成中使用的20种(L)-氨基酸以及其他氨基酸，例如4-羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、高半胱氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸。非天然存在的氨基酸包括例如(D)-氨基酸、正亮氨酸、正缬氨酸、p-氟苯丙氨酸、乙基硫氨酸等，这些是本领域技术人员已知的。氨基酸类似物包括天然和非天然存在的氨基酸的修饰形式。这种修饰可以包括例如取代氨基酸上的化学基团和部分，或者氨基酸的衍生化。氨基酸模拟物包括例如表现出功能上类似性质的有机结构，所述性质例如氨基酸的电荷和电荷空间特性。例如，模拟精氨酸(Arg或R)的有机结构具有位于类似分子空间并且具有与天然存在的Arg氨基酸的侧链的e-氨基相同程度的移动性的正电荷部分。模拟物还包括约束结构以维持氨基酸或氨基酸官能团的最佳空间和电荷相互作用。本领域技术人员可以确定什么结构构成功能上等效的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。

在一些实施方案中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的变体与SEQ ID NO:1具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同源性。在优选的实施方案中，多肽变体与SEQ ID NO:1所示序列具有99％以上的同源性。

本文所述的“同源性”被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。

术语“多肽”和“蛋白”在本文可互换使用，指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成的和天然存在的类似物。因此，这些术语适用于天然存在的氨基酸聚合物及其天然存在的化学衍生物，以及其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸(诸如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物。此类衍生物包括例如翻译后修饰和降解产物，包括SEQ ID NO:1所示的多肽片段的磷酸化的、糖基化的、氧化的、异构化的和脱氨基化的变体。

在优选的实施方案中，BM9多肽变体的序列是在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中包含一个或几个保守性氨基酸取代的序列，其中经取代后的序列仍保持脂肪酶催化活性。

被称为“保守氨基酸取代”的某些氨基酸取代能够在蛋白质中频繁出现，但不改变该蛋白质的构象或功能，这是蛋白质化学中已建立的法则。

本发明中的保守氨基酸取代包括但不限于用甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)中的任一个取代这些脂肪族氨基酸的任何另外一个；用丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，反之亦然；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；用赖氨酸(K)取代精氨酸(R)，反之亦然；用苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)取代这些芳香族氨基酸中的任何另外一个；以及用甲硫氨酸(M)取代半胱氨酸(C)，反之亦然。其他的取代也可以被视为是保守性的，这取决于特定氨基酸环境和它在蛋白三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)经常可以互换，如同丙氨酸(A)和缬氨酸(V)可以互换。相对疏水的甲硫氨酸(M)可以经常与亮氨酸和异亮氨酸互换，以及有时与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)经常在以下位置互换：其中氨基酸残基的重要特征是其电荷，以及这两种氨基酸残基的不同pK并不明显。在特定的环境下，仍有其他一些变化可以视为“保守性”的(参见，例如，BIOCHEMISTRY at pp.13-15,2^nd ed.Lubert Stryered.(Stanford University)；Henikoff et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA(1992)89:10915-10919；Lei et al.,J.Biol.Chem.(1995)270(20):11882-11886)。

以下，将氨基酸残基按可取代的残基分类举例，但可取代的氨基酸残基不限于以下记载的残基：

A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基甘氨酸及环己基丙氨酸；

B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸及2-氨基辛二酸；

C组：天冬酰胺及谷氨酰胺；

D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸即2,3-二氨基丙酸；

E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸及4-羟基脯氨酸；

F组：丝氨酸、苏氨酸及高丝氨酸；

G组：苯丙氨酸及酪氨酸。

例如，本申请发明人发现，位于BM9多肽N端前132位氨基酸中的一个或多个发生保守性取代基本上不影响脂肪酶活性。

在其他具体的实施方案中，BM9多肽的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然具有BM9的脂肪酶活性。

在另外的实施方案中，还可以在BM9多肽的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的BM9变体仍具有脂肪酶催化活性。

此外，还可以在BM9多肽的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的多肽基本上保持BM9的脂肪酶活性。

在某些实施方案中，本发明的多肽，例如BM9多肽或其变体与异源多肽融合。在一些实施方案中，BM9融合蛋白基本上保持BM9的脂肪酶活性。在某些实施方案中，异源多肽与BM9多肽的N端连接。在某些实施方案中，异源多肽与BM9多肽的C端连接。在这些实施方案中，异源多肽可以选自纯化标签(例如可以包括但不限于：GST、MBP)、表位标签(例如可以包括但不限于：Myc、FLAG)、靶向序列、信号肽等。

在具体实施方案中，融合蛋白包含BM9多肽和标签，所述标签与BM9多肽的C-末端或N-末端结合，通常为肽标签。所述标签通常是能够用于分离和纯化所述融合蛋白的肽或氨基酸序列。因此，所述标签能够与一个或多个配体结合，例如，诸如色谱支持体或高亲和力磁珠的亲和基质的一个或多个配体。所述标签的实例是能够以高亲和力与镍(Ni²⁺)柱或钴(Co²⁺)柱结合的组氨酸标签(His-标签或HT)，例如包含6个组氨酸残基(His6或H6)的标签。其他用于分离或纯化融合蛋白的示例性标签包括Arg-标签，FLAG-标签，Strep-标签等。

多核苷酸

本申请提供了编码上述多肽的多核苷酸，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(a)核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或在上述序列中包含至少一个氨基酸取代、缺失或添加的序列；以及

(b)在严格条件下与a)中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

在某些具体的实施方案中，本发明的多核苷酸编码BM9多肽及其功能等同变体。在一实施方案中，本发明的多核苷酸与编码BM9及其功能等同变体的多核苷酸具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸包含与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，本发明的多核苷酸包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

在优选的实施方案中，本发明的多核苷酸由与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的核苷酸序列组成。在更优选的实施方案中，本发明的多核苷酸由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。

本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸”指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA，包括单链和双链形式的DNA。该术语通常指至少10个碱基长度的核苷酸多聚形式，所述核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸包含与编码BM9多肽及其功能等同变体的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列，或者由与编码BM9多肽及其功能等同变体的核苷酸序列特异性杂交且编码与BM9多肽在功能上等同的多肽的核苷酸序列组成。

本领域技术人员可以常规选择DNA杂交的严格条件。通常较长的探针需要较高的温度，以便进行适当的退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常取决于当互补链处于低于其解链温度的环境时变性DNA的重退火能力。探针与可杂交序列之间同源性程度越高，所能采用的相对温度越高。于是，较高的相对温度往往使反应条件更严格，而在较低的温度下，则严格度较低。关于杂交反应严格条件的详细描述，可参阅Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology,Wiley Interscience Publishers,(1995)。

在某些实施方案中，DNA杂交采用的严格条件包括：1)洗涤时采用低离子强度和高温，例如50℃下的0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；2)杂交时采用甲酰胺等变性剂，例如42℃下50％(v/v)甲酰胺加0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚二烯吡咯烷酮/pH6.5的50mM磷酸钠缓冲液以及750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠；或(3)在42℃下过夜杂交，杂交溶液含50％甲酰胺，5x SSC(0.75M氯化钠，0.075M朽1檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5xDenhardt’s溶液、超声波处理的鲑鱼精子DNA(50.mu.g/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，然后在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中于42℃洗涤10分钟，再以含有EDTA的0.1x SSC于55℃进行高严格度洗涤。中等严格条件可按Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,NewYork：Cold Spring Harbor Press,1989中的描述加以确定。中等严格条件包括采用严格度低于以上描述的洗涤溶液和杂交条件(如温度、离子强度和SDS百分比)。例如，中等严格条件包括用至少约16％v/v到至少约30％v/v的甲酰胺和至少约0.5M到至少约0.9M的盐在42℃杂交，以及用至少约0.1M到至少约0.2M盐在55℃洗涤。中等严格条件还可以包括用1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)、7％SDS在65℃杂交，以及用(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 47.2)、5％SDS在60-65℃洗涤。专业人员将会根据探针长度等因素调节温度、离子强度等。杂交核酸时的严格度取决于核酸分子长度和互补程度，以及其它本领域内众所周知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性越大，则含有这些序列的核酸杂合体的Tm越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)以下列顺序递减：RNA:RNA、DNA:RNA,DNA:DNA。优选地，可杂交核酸的最低长度至少约为12个核苷酸，优选至少约为16个、更优选至少约为24个、最优选至少约为36个核苷酸。

本发明的多核苷酸可以与其他DNA序列组合，所述其他DNA序列例如启动子、聚腺苷化信号、其他限制性酶切位点、多克隆位点、其他编码节段等，使得它们的总长度可以显著不同。因此考虑可以利用几乎任意长度的多核苷酸片段；总长度优选地受预期重组DNA方案中制备和使用的便利性的限制。

可以利用本领域内已知的和可获得的多种成熟技术中的任何一种来制备、操控和/或表达多核苷酸及其融合物。例如，编码本发明的多肽或其变体的多核苷酸序列可以用于重组DNA分子中以指导多肽在适当的宿主细胞中表达。由于遗传密码子固有的简并性，编码基本上相同或在功能上等同的氨基酸序列的其他DNA序列也可以用于本发明中，并且这些序列可以用于克隆和表达给定的多肽。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸通过人工合成产生，例如直接的化学合成或酶合成。在可选的实施方案中，上述多核苷酸通过重组技术产生。

在某些实施方案中，可以通过常规方法优选如双脱氧链终止法(Sanger etal.PNAS,1977,74:5463-5467)测定所获得的多核苷酸的序列。这类多核苷酸序列测定也可用购买的测序试剂盒来完成。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。

表达载体

本申请提供了包含本发明的多核苷酸的表达载体。

本发明所述的“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有一系列允许特定的核酸在宿主细胞中转录的特异性核酸元件。本发明的表达载体可以是诸如pCold-TF、pET-24a(+)、pIRES2-EGFP、pcDNA3.1、pCI-neo、pDC516、pVAC、pcDNA4.0、pGEM-T、pDC315的质粒载体，或者是诸如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体的病毒载体，或者是本领域熟知的其它载体。

在某些实施方案中，编码BM9多肽及其变体的多核苷酸序列被克隆到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。

在优选的实施方案中，用于克隆多核苷酸的表达载体为质粒载体。在更优选的实施方案中，所述质粒载体为pCold-TF。

在具体的实施方案中，上述表达载体还包含调节多核苷酸表达的调控序列，其中所述多核苷酸与所述调控序列可操作地连接。

本文所用的术语“调控序列”是指实现与其连接的编码序列表达所需的多核苷酸序列。这类调控序列的性质随宿主生物而改变。在原核生物中，这类调控序列一般包括启动子、核糖体结合位点和终止子；在真核生物中，这类调控序列一般包括启动子、终止子以及在某些情况下的增强子。因此，术语“调控序列”包括其存在对目的基因的表达是必需的最低限度的所有序列，也可以包括其存在对目的基因表达是有利的其它序列，例如前导序列。

本文所用的术语“可操作地连接”是指如下情形：所涉及到的序列处于允许它们以希望的方式起作用的关系之中。因此，例如“可操作地连接”到一编码序列的调控序列使得在与所述调控序列相容的条件下实现该编码序列的表达。

在某些实施方案中，利用本领域的技术人员熟知的方法构建包含编码BM9多肽及其变体的核苷酸序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,aLaboratory Manual,cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。核苷酸序列可操作地连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性实例包括：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。实例包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。

宿主细胞

本申请提供了包含本发明的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。

在某些实施方案中，将编码BM9多肽及其变体的多核苷酸或含有该多核苷酸的表达载体转化或转导入宿主细胞，获得含有该多核苷酸或表达载体的基因工程化宿主细胞。

本文所用的宿主细胞可以是本领域技术人员熟知的任一种宿主细胞，包括原核细胞、真核细胞，例如细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞等。示例性的细菌细胞包括埃希氏菌属、杆菌属、链霉菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属和葡萄球菌属中的任何种，包括例如大肠杆菌、乳酸球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、荧光假单胞菌。示例性的真菌细胞包括曲霉属的任何种。示例性的酵母细胞包括毕赤酵母属、啤酒酵母菌属、裂殖酵母属或酵母菌属中的任何种，包括毕赤酵母、啤酒酵母或裂殖酵母。示例性的昆虫细胞包括斜纹夜蛾或果蝇中的任何种，包括果蝇S2和斜纹夜蛾Sf9。示例性的动物细胞包括CHO、COS或黑色素瘤或任何小鼠或人细胞系。选择合适的宿主在本领域技术人员的能力范围内。

可以利用本领域已知的任何技术将表达载体导入宿主细胞中，包括转化、转导、转染、病毒感染、基因枪或Ti-介导的基因转移。具体的方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Basic Methods inMolecular Biology,(1986))。作为示例，当宿主为原核生物如大肠杆菌时，可在指数生长期后收获感受态细胞，用本领域熟知的CaCl₂法进行转化。

在具体的实施方案中，本发明所用的宿主细胞为大肠杆菌。在优选的实施方案中，将携带本发明多核苷酸序列的表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。

本申请的多肽或脂肪酶的制备方法

本申请的多肽可以通过本领域人员已知的任何合适的方法制备，例如通过重组技术产生，或者化学合成。肽的化学合成方法也为本领域技术人员所熟知，例如，可以通过使用固相技术的定向肽合成来产生本发明的多肽及其变体(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))。可以用手动或通过自动化来进行蛋白合成。例如，可以用AppliedBiosystems的431A肽合成仪(Perkin Elmer)实现自动化合成。可选择地，不同的片度可以分别通过化学方式合成并利用化学方法进行组合以制备所需的分子。

在具体的实施方案中，提供了制备本申请的多肽或脂肪酶的方法，其包括：

1)将编码上述多肽的多核苷酸克隆在表达载体上，

2)将表达载体导入至合适的宿主细胞中，

3)在合适的培养基中，培养宿主细胞，以及

4)从所述宿主细胞或培养基中分离并纯化所述多肽。

合适的宿主细胞是指适于表达载体或目的多核苷酸表达的宿主细胞。合适的培养基指适于宿主细胞生长或对其进行诱导表达的培养基。

在某些实施方案中，根据所用的宿主细胞，可以选择各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。优选地，工程化的宿主细胞可以在被修饰适于激活启动子的常规营养培养基中进行培养，以筛选转化子或扩增本申请的多核苷酸。转化合适的宿主细胞并当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间，以允许其生产目的多肽或其片段。

在某些实施方案中，通过离心收获宿主细胞，通过物理或化学方法破碎细胞，并且将得到的粗提物保留用于进一步纯化。用于蛋白表达的微生物细胞可以通过任何便利的方法进行破碎，包括冻融循环、超声、机械破碎或使用细胞裂解剂。这些方法是本领域技术人员熟知的。

在某些实施方案中，宿主细胞生产的重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。例如，表达的多肽或其片段可以通过本领域熟知的以下方法从重组细胞培养物中回收并纯化：常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。作为示例性说明，在C-末端或N-末端包含肽标签(例如His-标签等)的蛋白的亲和色谱法纯化是用于获得高纯度多肽制剂的常规方法。

在优选的实施方案中，提供了制备由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的多肽的方法，其包括：将由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸克隆在表达载体pCold-TF中，以及将带有该多核苷酸序列的pCold-TF转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达，然后从大肠杆菌BL21(DE3)中分离并纯化BM9多肽。

具有脂肪酶活性的多肽的应用

本申请的多肽是具有脂肪酶活性的多肽，能够催化油脂的水解，特别是催化乳脂肪的水解。更具体地，本发明的多肽能够水解脂肪酸和甘油羟基之间的酯键。

本申请提供了上述多肽、多核苷酸、表达载体或宿主细胞在制备脂肪酶中的用途。

本申请还提供了上述多肽或脂肪酶、多核苷酸、表达载体或宿主细胞在制造食品中的用途。例如，在乳品加工方面，应用脂肪酶在乳品中进行乳脂水解，可增强干酪、奶粉、奶油的风味，促进干酪的成熟，改善乳制品的品质。在面食加工方面，添加脂肪酶，使面食弹性提高，改善食感，提高面包等的保鲜能力。

在一些优选的实施方案中，本申请的多肽为具有短链专一性的脂肪酶，能够用于产生和/或强化乳制品的香味，因此可以应用在乳酪制造中。

本申请还提供了利用上述多肽或脂肪酶、多核苷酸、表达载体或宿主细胞制造的食品，例如乳制品和面食。

在本申请的上下文中，“乳制品”是指任何种类的基于乳的制品，包括但不限于乳酪、黄油、奶油、乳制品类似物等。“面食”则指主要由面粉制作的食品。

本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。

应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，并可以根据需要进行任意地组合和删减，除非与之矛盾。

上述公开内容总体上描述了本申请的实施方案，通过下面的实施例进一步示例本申请的实施方案。描述这些实施例仅为说明本申请的实施方案，而不是限制本申请的实施方案的范围。尽管本文中使用了特殊的术语和值，这些术语和值同样被理解为示例性的，并不限定本申请公开的范围。

实施例

实施例1：BM9多肽的表达和纯化

SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列(其编码序列如SEQ ID No.:1所示的多肽)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并被该公司克隆在表达载体pCold-TF上。

将带有上述核苷酸序列的pCold-TF转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达(具体参见，分子克隆实验指南第三版，科学出版社2002[美]J.萨姆布鲁克，D.W拉塞尔著,黄培堂等译)，转化条件如下:42℃下热激50秒，冰浴2分钟，涂LB平板，挑取转化子接种在LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和氯化钠10g/L)中，于37℃进行过夜种子培养，按1％的接种量，将种子培养液接种到表达培养基中，于37℃、220rpm培养至OD600＝0.6-0.8。

冷却至16℃后，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)1mM进行诱导，于16℃、190rpm过夜表达。诱导表达结束后，离心收集菌体。用裂解缓冲液(50mM磷酸二氢钠、300mM氯化钠、10mM咪唑，pH8)重悬菌体，其中每克细胞加5毫升裂解缓冲液。

将重悬的菌体进行低温超声破碎细胞(50％电压输出，2秒超声破碎，9秒间隔，共超声20分钟)，操作时将样品冰浴冷却以保护蛋白。细胞破碎后，以14000rpm离心20分钟并收集上清。

每100毫升上清中加入100毫升Ni-NTA树脂冰浴振荡60分钟。将细胞破碎上清和Ni树脂转移至Ni-NTA Agarose层析柱(Qiagen，Cat.No.30210)中，待细胞破碎上清全部通过Ni树脂后，先用10个柱体积的洗脱缓冲液1(50mM磷酸二氢钠、300mM氯化钠、20mM咪唑，pH8)清洗，再用10个柱体积的洗脱缓冲液2(50mM磷酸二氢钠、300mM氯化钠、50mM咪唑，pH8)清洗，最后用4个柱体积的洗脱缓冲液3(50mM磷酸二氢钠、300mM氯化钠、250mM咪唑，pH8)清洗，并收集洗脱液，将洗脱液于4℃透析过夜，其中所用透析液的配方为：150mM氯化钠、20mMTris-HCl、10mM硫酸锌、1mM二硫苏糖醇，pH8。通过凝胶电泳(10％SDS-PAGE,100V,2小时)的检测结果如图1所示。根据图1结果，所得溶液为纯化的BM9蛋白溶液。

实施例2：脂肪酶BM9的酶学性质

脂肪酶活力的测定方法

采用比色法测定脂肪酶活力。以对硝基苯丁酸酯(pNPB)为底物，以单位体积的酶液在单位时间内酶解产生对硝基苯酚(pNP)的生成量进行酶活力的计算。具体方法如下：预先配置底物和缓冲液，底物：6mg/mL pNPB(异丙醇溶解)，缓冲液：0.05M Tris(pH8.0，0.1％阿拉伯胶)。将底物和缓冲液以1:9(v/v)配成反应混合液。取两个2mL离心管，分别为对照管和样品管。分别添加400uL反应混合液至两离心管，在合适的反应温度(例如35℃)预温浴5min。向样品管中加入一定量的稀释酶液，混合均匀后，继续温浴15min。加入1.5mL乙醇至上述两离心管终止反应，并添加同样量的稀释酶液至对照管。12000rpm离心2min，取上清，测405nm处的吸光值。

酶活力单位定义为：1个单位即指在标准实验条件下每分钟催化释放1μmol的pNP所需的酶量。根据标准曲线所得酶活计算公式为：A＝-([A1-A0]×0.7885-0.0118)×V1×n/(V2×t)。A：样品酶活(U/mL)，A1：样品酶液的OD405，A0：对照酶液的OD405，V1：总反应液的体积(mL)，n：酶液的稀释倍数，V2：酶液的体积(mL)，t：反应时间(min)。

实施例2-1 底物专一性

配制6mg/mL 4-硝基苯基丁酸酯(PNPB)、4-硝基苯基辛酸酯(pNPO)、4-硝基苯基月桂酸酯(pNPD)和4-硝基苯基棕榈酸酯(pNPP)，均用异丙醇溶解，按照上述标准pNPB法(更换为相应底物)检测脂肪酶的活力，以酶活测定最高的底物所测得的酶活力为100％，计算水解其他底物的相对酶活力。由图2可见，BM9BM9能水解pNPB、pNPO、pNPD，水解酶活分别为0.648138U/ml，0.2985698U/ml，0.151751U/ml；而对pNPP没有作用。这说明BM9的酯水解活性具有中短链脂肪酸偏好性。

实施例2-2 最适作用温度

在不同的温度(30-55℃)下按照pNPB(更换底物为pNPD)法测定脂肪酶活力，以测定酶活最高时的酶活力为100％，计算其他温度下的相对酶活(以百分比表示)。由图3可见，BM9的酶学活力随着温度的提高呈现先上升后下降的趋势，其中40℃左右的酶活力最高，这表明BM9脂肪酶的最适作用温度在40℃左右。

实施例2-3 最适作用pH

将酶液分别在不同pH5.5-10.0)的缓冲液(PH6.5-10.0为50mM TrisHCL缓冲液，PH6.0为50mM MES缓冲液，PH5.5为50mM NaAc缓冲液中于40℃下按pNPB法(更换底物为pNPD)测定脂肪酶活力，以测定活力最高时的酶活力为100％，计算其他pH下酶的相对活力(以百分比表示)。由图4可见，BM9的酶活力随着pH值的升高呈现先上升后下降的趋势，其中pH9时酶活最高(0.14849U/ml)，因此，BM9的最适pH在9左右。由此可知，脂肪酶BM9为碱性脂肪酶。

实施例2-4 pH稳定性

将BM9酶液分别在不同pH(4.0-9.5)的缓冲体系(其中，pH4-9使用Tris-HCl缓冲液，pH9.5使用Gly-NaOH缓冲液)中以1:1的比例混合，于4℃保温24小时，再于40℃、pH7.5下按pNPB法测定脂肪酶的活力。将在酶活力最高的缓冲液中所测得的酶活力(0.073004U/ml)作为100％，计算其他pH下的相对酶活力。由图5可见，BM9脂肪酶在pH＝6保持稳定，在pH4.5-7之间脂肪酶活力保持在50％以上，这说明本发明的脂肪酶在酸性pH范围具有较好的稳定性。

实施例2-5 金属离子对脂肪酶活力的影响

配制ZnSO₄、MnCl₂、CoCl₂、CaCl₂、MgSO₄、CuSO₄、KCl、(NH4)₂SO₄、NaCl、NiSO4、FeCl₃、柠檬酸钠(C₆H₅Na₃O₇)和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)等盐贮存液。按照pNPB(更换底物为pNPD)方法，首先配制反应混合液，向每个反应管中分装400uL混合液，并添加终浓度为5mmol/L的上述盐贮存液，再按照标准方法测定活性。对照组添加水代替盐贮存液，其酶活力(0.197419U/ml)作为100％，计算其余组相对于对照组的相对酶活力。如图6所示，在CuSO4和FeCl3储存液中，对酶水解活力影响较大，酶活下降至20％一下，其他离子对酶水解活力影响不明显。

实施例2-6 表面活性剂对于脂肪酶活力的影响

配置10％的阳离子表面活性CTAB、阴离子表面活性剂SDS、非离子表面活性剂Tween 80、AEO-9和Triton X-100等贮存液。按照pNPB标准方法，同时在反应体系中添加0.5％的上述表面活性剂，测定脂肪酶活力。对照组添加水代替表面活性剂，其酶活力((0.0918U/ml)作为100％，计算其余组相对于对照组的相对酶活力。如图7所示，SDS完全抑制酶水解活力，其他溶剂对酶均有不同程度影响。

由以上的结果可知，本申请的多肽具有脂肪酶活性，和/或具有以下至少一种有益特性：

1)中短链脂肪酸偏好性，这表明，本申请具有脂肪酶活性的多肽适合用于乳制品例如乳酪的生产。

2)在碱性pH9左右具有较好的酶活性；在酸性pH范围内具有较好的稳定性，BM9多肽在酸性pH范围内(4.5-7.0)保持稳定，酶活力均在在约50％以上(图3)。

3)具有良好的离子耐受性，如图6所示，添加多种离子都不影响BM9多肽的酶活力。

可以理解，尽管本申请以某种形式被说明，但本申请并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本申请的范围的前提下还可做出各种变化。这些变化都在本申请要求保护的范围内。

Claims (11)

1.具有脂肪酶活性的多肽，其由选自以下的序列组成：

(a)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，以及

(b)由(a)所述的序列在N-末端缺失一个氨基酸后得到的序列，

其中由(b)获得的多肽变体仍保持脂肪酶活性。

2.如权利要求1所述的多肽，其由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。

3.编码权利要求1或2所述的多肽的多核苷酸，其包含选自以下的序列或者由选自以下的序列组成：

(a)核苷酸序列，其编码如权利要求1(a)或1(b)所述的氨基酸序列；以及

(b)在严格条件下与3(a)中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，其由所述多核苷酸由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。

6.表达载体，其包含至少一种权利要求3-5中任一项所述的多核苷酸。

7.如权利要求6所述的载体，其还包含调节所述多核苷酸表达的调控序列，其中所述多核苷酸与调控序列可操作地连接。

8.宿主细胞，其包含权利要求1或2所述的多肽、权利要求3-5中任一项所述的多核苷酸、或权利要求6或7所述的表达载体。

9.权利要求1或2所述的多肽、权利要求3-5中任一项所述的多核苷酸、权利要求6或7所述的表达载体或权利要求8所述的宿主细胞在制备脂肪酶中的用途。

10.权利要求1或2所述的多肽、权利要求3-5中任一项所述的多核苷酸、权利要求6或7所述的表达载体、权利要求8所述的宿主细胞在食品制造中的用途。

11.如权利要求10所述的用途，其中所述用途为在乳制品制造中的用途。

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