CN103805526A - 一种产耐表面活性剂脂肪酶的菌株及耐表面活性剂脂肪酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产耐表面活性剂脂肪酶的菌株WBRD1.11121501及利用所述菌株的耐表面活性剂脂肪酶的制备方法。利用本发明所提供菌株和制备方法制备所得的脂肪酶在阴离子表面活性剂SDS、非离子表面活性剂AEO-9、Triton X-100以及阳离子表面活性剂CTAB中具有极强的稳定性，并且其中大部分的表面活性剂对该酶的反应活性起到增强作用。另外，氧化剂双氧水对本发明所提供的金黄杆菌脂肪酶的反应活性也起到一定的增强作用。

Description

一种产耐表面活性剂脂肪酶的菌株及耐表面活性剂脂肪酶的制备方法

技术领域

本发明涉及产脂肪酶的菌株及脂肪酶的制备方法。更具体地，本发明涉及一种产耐表面活性剂脂肪酶的菌株及利用所述菌株的耐表面活性剂脂肪酶的制备方法。

背景技术

脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)是一类特殊的酯键水解酶，广泛存在于动植物和微生物体中。脂肪酶可以催化酯类化合物的水解、醇解、酯化、酯交换以及化合物的合成等反应，其可应用于食品、医药、洗涤剂、纺织、生物柴油、造纸、皮革、化妆品和环境保护等多个工业领域(HasanF，Ali SA，Hameed A.Industrial applications of microbial lipases.Enzyme Microb.Technol.2006，39：235-251.)。

脂肪酶同其它工业酶制剂品种一样，在不同的应用领域内其性质要求多种多样。

因为各个工业环节对脂肪酶的具体性质要求多种多样，因而需要寻找和开发不同性质的脂肪酶产品。微生物具有培养简单、周期短、产量大等特点，因而工业用途的酶制剂基本上都来源于微生物。目前已知大约有2％的微生物产脂肪酶，至少包括65个属，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属(汪小锋，王俊，杨江科等.微生物发酵生产脂肪酶的研究进展.生物技术通报.2008，(4)：47-53.)。

微生物来源的脂肪酶已经有许多进行了商品化开发，如应用于洗涤剂的脂肪酶

皆来自于假单胞菌属微生物，

来源于嗜热真菌属的嗜热棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)。应用于食品工业的

来自于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)，Lipase A“Amano”6来自于黑曲霉(Aspergillus niger)。应用于有机合成工业的Lipase AY“Amano”30来自于褶皱假丝酵母(Candidarugosa)，Lipase AK来自于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)等(Singh A.K.，Mukhopadhyay M.Overview of Fungal Lipase：AReview.Appl.BiochemBiotechnol.2012，166：486520.；Gupta R.，Gupta N..Rathi P.Bacterial lipases：an overview of production，purification and biochemical properties.Appl.Microbiol.Biotechnol.2004，64：763-781.)。

尽管某些脂肪酶已经成功商品化开发，但是因其在某些性质上的内在不足而限制了其的应用。譬如来源于嗜热真菌属的嗜热棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶存在对阴离子和部分非离子表面活性剂抗性差的问题，而这两种表面活性剂是洗涤剂的主要成分，因而导致嗜热棉毛菌脂肪酶在洗涤剂上的应用受到一定的限制(CherifS.，Mnif S.，Hadrich F.，et al.A newly high alkaline lipase：an ideal choicefor application in detergent formulations.Lipids in Health and Disease.2011.10：221-228.；Rathi P.，Saxena R.K.，Gupta R.A novel alkaline lipasefrom Burkholderia cepacia for detergent formulation.ProcessBiochemistry.2001，37：187-192.；Omar I.C.，Hayashi M.，Nagai S.Purifiacation and some properties of a thermostable lipase fromHumicola lanuginose No.3.Agri.Biolog.Chem.1987，51(1)：37-45.)。

洗涤剂领域是脂肪酶工业应用的一个十分重要的领域，通常的洗涤剂配方中都含有大量的阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂，有时也会添加一定量的阳离子表面活性剂和氧化剂等。因此洗涤剂领域应用的脂肪酶，最好能够具有优良的表面活性剂稳定性且反应活性不受这些表面活性剂的影响。当前成功开发用于洗涤剂领域的脂肪酶除了嗜热棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶外，还有来源于产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)的脂肪酶(商品名为

)以及来源于门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的脂肪酶(商品名为

)等(Jaeger K.E.，Ransac S.，Dijkstra B.W.，et al.Bacterial lipases.FEMS Microb.Rew.1994，15：29-63.)。但是有报道称产碱假单胞菌和门多萨假单胞菌这两种来源的脂肪酶的抗表面活性剂性能也并不十分理想(Lin S.F.，Chiou C.M.，Yeh C.M.，et al.Purification and partial characterization of an alkaline lipase fromPseudomonas pseudoalcaligenes F-11.Appl.Environ.Microbiol.1996，62(3)：1093-1095.；Dahiya P.，Arora P.，Chaudhury A.，et al.Characterization of an extracellular alkaline lipase from Pseudomonasmendocina M-37.J.Basic Microb.2010，50(5)：420-426.)。

其它假单胞菌微生物来源的脂肪酶中，也鲜有能够满足洗涤剂要求的能同时在阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂中具有高活性和高稳定性的脂肪酶。

除了假单胞菌来源的脂肪酶外，芽孢杆菌(Bacillus)、不动杆菌(Acinetobacter)等细菌的脂肪酶及肉色曲霉(Aspergillus carneus)、扩展青霉(Penicillium expansum)等真菌的脂肪酶也几乎没有能够同时具有阴离子和非离子表面活性剂的抗性(Sinchaikul S.，Sookkheo B.，Phutrakul S.，et al.Optimization of a Thermostable Lipase from Bacillusstearothermophilus P1：Overexpression，Purification，and Characterization.Protein Expression and Purification.2001，22，388-398.；Park I.H，Kim S.H.，Lee Y.S.，et al.Gene Cloning，Purification，and Characterization of aCold-Adapted Lipase Produced by Acinetobacter baumannii BD5.J.Microbiol.Biotechnol.2009，19(2)，128-135.；中国专利CN101210235；郑毅，施巧琴，吴松刚.碱性脂肪酶与表面活性剂相互作用的研究.工业微生物.2000，30(2)：4-7.)。

综上所述，虽然已有报道某些脂肪酶在含有如十二烷基硫酸钠(SDS)等表面活性剂的体系中不受抑制，但是鲜有报道同时在多种阴离子和非离子表面活性剂的体系中不被抑制的脂肪酶，更少有报道能够同时满足在多种表面活性剂体系中高度稳定且反应活性不被这些表面活性剂所抑制的脂肪酶。在另一方面，已有报道多种阴阳离子表面活性剂或非离子表面活性剂能够抑制或增强多种微生物来源的脂肪酶的活性，但是鲜有报道脂肪酶活性能够同时被阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂所增强的野生脂肪酶。

本发明提供了一种金黄杆菌属(Chryseobacterium sp.)WBRD1.11121501(CGMCC6261)菌株，利用该菌株能够生产出一种能不被SDS等阴离子和吐温80等非离子表面活性剂所抑制，且能在SDS、CTAB等多种表面活性剂体系中稳定的脂肪酶。更有利的是，在多种表面活性剂如SDS、Triton X-100和AEO9或者双氧水中，该脂肪酶活性还可以被显著增强。该脂肪酶无疑将在工业应用中特别是洗涤剂工业中具有重大的应用价值。

另外，目前几乎没有金黄杆菌属细菌产出脂肪酶的报道，也没有任何表面活性剂影响金黄杆菌脂肪酶的酶学性质金黄杆菌脂肪酶在表面活性剂影响方面的性质报道，更没有任何金黄杆菌来源的具有表面活性剂耐受性的脂肪酶制备方法方面的报道。因此本发明首次公开了一种具有能生产同时耐受阴离子和非离子表面活性剂脂肪酶的金黄杆菌并首次公开了该种耐表面活性剂脂肪酶的制备方法。

发明内容

本发明主要涉及一种产脂肪酶的金黄杆菌属菌株WBRD1.11121501，该菌株填补了现有技术中尚无金黄杆菌属菌株生产脂肪酶的空缺。利用本发明所提供菌株和制备方法制备所得的脂肪酶在阴离子表面活性剂SDS、非离子表面活性剂AEO-9、Triton X-100以及阳离子表面活性剂CTAB中具有极强的稳定性，并且其中大部分的表面活性剂对该酶的反应活性起到增强作用。另外，氧化剂双氧水对本发明所提供的金黄杆菌脂肪酶的反应活性也起到一定的增强作用。因此，本发明所提供的金黄杆菌菌株及其所产脂肪酶无疑将在洗涤剂工业、医药工业、环境保护以及有机合成等领域具有十分重要的应用价值。

本发明提供了一种金黄杆菌属菌株，该菌株能够生产同时耐多种表面活性剂的脂肪酶。同时本发明还提供了利用该菌株制备的耐表面活性剂的脂肪酶及该脂肪酶的生产方法。

本发明提供一种能产耐表面活性剂脂肪酶的细菌，该菌是分离自中国上海地区的土壤中的金黄杆菌属细菌，其编号为WBRD1.11121501，其于2012年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.6261。

本发明还提供了一种制备脂肪酶的方法，包括以下步骤：在适合生产的情况下，于25℃-40℃培养上述的脂肪酶产生菌，从而使该菌株产生脂肪酶；从培养基中分离出脂肪酶。

所述的脂肪酶，为一种耐表面活性剂脂肪酶。阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)，非离子表面活性剂聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(吐温80)、脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO-9)和以及聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)等对该脂肪酶的反应没有抑制效应，而且这些表面活性剂对该酶的稳定性也没有抑制作用。实际上，该脂肪酶在SDS、Triton X-100和AEO-9等表面活性剂存在时活性还可以被显著增强，在5-20g/L的CTAB中活性也显著高于对照。

另外0-20mM的氧化剂如双氧水(H₂O₂)还可以显著增强所述脂肪酶的反应活性，并且该酶在5mM的H₂O₂中具有很好的稳定性。

在一个实施方案中，上述制备脂肪酶的方法包括以下步骤：

(1)在适合生产脂肪酶的液体发酵培养基中培养本发明菌株(CGMCC6261)；

(2)收集步骤(1)所得的发酵液，过滤浓缩，获得浓缩液；

(3)对步骤(2)所得的浓缩液进行盐析，收集盐析沉淀物；

(4)将步骤(3)所得的盐析沉淀物溶解，进行层析纯化；

(5)收集步骤(4)所得的层析洗脱物中的脂肪酶，即可得到本发明的脂肪酶。

在一个优选实施方案中，上述步骤(1)为：

在25-40℃、120-250rpm下将本发明菌株(CGMCC6261)于适合生产脂肪酶的液体发酵培养基中培养8-72小时。

在一个优选实施方案中，上述步骤(2)为：

收集步骤(1)所得的发酵液，通过离心或微滤的方法除去菌体，再将滤液用超滤膜进行超滤浓缩，获得浓缩液。

在一个优选实施方案中，上述步骤(3)为：

对步骤(2)所得的浓缩液进行硫酸铵盐析，收集20-70％饱和度的盐析沉淀物。

在一个优选实施方案中，上述步骤(4)为：

将步骤(3)所得的盐析沉淀物用起始缓冲液溶解后，使用疏水层析柱进行层析纯化，层析过程中先用洗脱缓冲液进行洗脱，再用蒸馏水洗脱，最后用10-70％v/v的乙醇水溶液进行洗脱。

在一个优选实施方案中，上述步骤(5)为：

收集步骤(4)所得的层析洗脱物中的脂肪酶活性峰，并使用置换缓冲液将获得的脂肪酶缓冲液体系置换为20-50mM、pH7.0-8.5的Tris·HCl缓冲液，从而得到本发明的脂肪酶。

在一个更优选的实施方案中，在上述步骤(2)中，收集发酵液后用滤纸进行过滤，收集的清液经过0.1-0.5μm的微孔滤膜过滤，再用5-30kDa的超滤膜进行超滤浓缩。

在一个更优选的实施方案中，上述步骤(4)中所述的起始缓冲液为含有0.1-2M(NH4)2SO4的20-100mM浓度、pH6.0-8.5的Tris-HCl缓冲液；所述的洗脱缓冲液为20-100mM浓度、pH6.0-8.5的Tris-HCl缓冲液。

在一个更优选的实施方案中，上述步骤(5)中所述的置换缓冲液为20mM-100mM浓度的pH6.0-8.5的Tris·HCl缓冲液。

在一个优选实施方案中，上述步骤(5)中所述的置换通过凝胶层析、透析或超滤的方式进行。

在一个优选实施方案中，上述制备脂肪酶方法中所用的发酵培养基的配方如下：蔗糖0-5重量％、蛋白胨0.01-5重量％、酵母浸出粉0.01-5重量％、硫酸铵0-3重量％、KH₂PO₄0-1重量％、Na₂HPO₄·12H₂O0.01-1重量％、吐温800-3重量％、MgSO₄·7H₂O0.01-0.5重量％、CaCl₂0.01-0.5重量％、橄榄油0-5重量％，pH6.0-8.0，余量为水。

本发明还提供本发明菌株(CGMCC6261)用于生产脂肪酶的用途。

本发明还提供本发明菌株用于水解脂肪的用途。

本发明还提供本发明菌株用于油脂加工、食品、医药、环境保护、有机合成和日用化学品工业中需要脂肪酶的应用中的用途。

在一些实施方案中，使用本发明菌株进行发酵生产后的发酵液用于上述用途。

在一个实施方案中，上述发酵液为在适合生产脂肪酶的液体发酵培养基中培养所述菌株获得的发酵液。

在一些实施方案中，上述用途用于存在表面活性剂和/或氧化剂的条件下。

在一个实施方案中，上述表面活性剂为阴离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂；优选的阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠；优选的非离子表面活性剂为Triton X-100和AEO-9；优选的氧化剂为双氧水。

本发明还提供使用本发明菌株进行发酵生产后的发酵液。

在一个实施方案中，上述发酵生产在适合生产脂肪酶的液体发酵培养基中进行。

本发明还提供使用本发明菌株生产的脂肪酶。

在一个实施方案中，上述脂肪酶使用本发明所述的方法制备。

本发明还提供上述发酵液或上述脂肪酶用于水解脂肪的用途。

本发明还提供上述发酵液或上述脂肪酶用于油脂加工、食品、医药、环境保护、有机合成和日用化学品工业中需要脂肪酶的应用中的用途。

在一些实施方案中，上述用途用于存在表面活性剂和/或氧化剂的条件下。

在一个实施方案中，上述表面活性剂为阴离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂；优选的阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠；优选的非离子表面活性剂为Triton X-100和AEO-9；优选的氧化剂为双氧水。

本发明还提供一种水解脂肪的方法，该方法使用本发明菌株或上述发酵液或上述脂肪酶来水解脂肪。

在一个实施方案中，上述需要水解的脂肪处于存在表面活性剂和/或氧化剂的条件下；优选的表面活性剂为阴离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂；优选的阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠；优选的非离子表面活性剂为Triton X-100和AEO-9；优选的氧化剂为双氧水。附图说明

图1示出了WBRD1.11121501(CGMCC6261)在罗丹明B平板上的荧光图片。

图2示出了本发明金黄杆菌脂肪酶在部分0.5％浓度的表面活性剂中的稳定性。

图3示出了本发明金黄杆菌脂肪酶在部分1.0％浓度的表面活性剂中的稳定性。

图4示出了部分表面活性剂对本发明金黄杆菌脂肪酶反应活性的影响。

图5示出了氧化剂H₂O₂对本发明金黄杆菌脂肪酶反应活性的影响。

序列说明

SEQ ID NO：1是WBRD1.11121501(CGMCC6261)的16S rRNA序列。

具体实施方式

以下具体说明本发明的耐表面活性剂脂肪酶的制备方法。

取新鲜培养的金黄杆菌WBRD1.11121501(CGMCC6261)斜面(LB培养基25-40℃培养24-72h)，接种至种子摇瓶中，25-40℃、120-250rpm培养6-24h。而后以1-10％的接种量接种至发酵培养基中，25-40℃、120-250rpm摇床培养8-72h。将培养液离心或微滤除去菌体，清液采用5-30kDa的膜进行超滤浓缩。而后对浓缩液进行硫酸铵盐析，收集20-70％饱和度的盐析沉淀物。将所述沉淀物用起始缓冲液(含有0.1-2M硫酸铵的20mM-100mM的Tris-HCl，pH6.0-8.5)溶解后，加至疏水层析色谱柱进行疏水层析纯化，层析过程中先用洗脱缓冲液(20mM-100mM的Tris-HCl，pH6.0-8.5)进行洗脱，再用蒸馏水洗脱，最后用10-70％(v/v)的乙醇水溶液进行洗脱。收集洗脱物中活性组分(脂肪酶)并用置换缓冲液置换后即制备得到本发明所述的脂肪酶。

上述金黄杆菌的种子培养基为LB培养基，其组成为(单位g·L^-1，余量为水)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，pH7.0。

上述金黄杆菌产脂肪酶的发酵培养基组成为(单位g·L^-1，余量为水)：蔗糖0-5、蛋白胨0.01-5、酵母浸出粉0.01-5、硫酸铵0-3、KH₂PO₄0-1、Na₂HPO₄·12H₂O0.01-1、吐温800-3、MgSO₄·7H₂O0.01-0.5、CaCl₂0.01-0.5、橄榄油0-5，pH6.0-8.0；

上述脂肪酶的疏水层析纯化过程所采用的起始缓冲液为含有0.1-2M硫酸铵的20mM-100mM的Tris-HCl缓冲液，pH6.0-8.5；洗脱缓冲液与起始缓冲液相比差别仅在于不含有硫酸铵。

上述置换缓冲液为20mM-100mM浓度的pH6.0-8.5的Tris·HCl缓冲液。

上述层析过程在室温下进行，层析可采用常规的疏水层析柱进行，其层析介质的疏水配基，例如可以选择为醚、异丙基、苯基、丁基、辛基等。层析柱类型可以选择为自制或一些商品化的产品。疏水层析柱可以是自行填充的也可以是购买一些商品化的预装柱。

上述置换可通过例如凝胶过滤层析、透析、超滤等的方式进行。置换后最终制备所得的金黄杆菌脂肪酶的溶液体系为20-50mM浓度、pH7.0-8.5的Tris·HCl缓冲液。

本发明采用对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)法来测定脂肪酶的活力大小，该方法以对硝基苯棕榈酸酯为反应底物，通过脂肪酶的催化产生有色产物对硝基苯酚(p-NP)，该产物在405-410nm波长下具有强烈吸收。酶活力单位定义为：1个单位即指在标准实验条件下每分钟催化释放1μmol的p-NP所需的酶量。该方法的更详细描述参见MahadikN.D.，Puntambekar U.S.，Bastawde K.B.，et al.Production of acidiclipase by Aspergillus niger in solid state fermentation.Process Biochem.2002，38：715-721.。该方法是国内外测定脂肪酶活力的常用方法，操作简便，反应快且灵敏度高，是一种精确而高效的活力测定方法。

以下通过实施例举例说明本发明的技术方案，所述实施例仅为更清楚地说明本发明的技术方案，而不应被理解为对本发明的限制。

实施例1、菌株筛选及鉴定

本发明所提供的菌株金黄杆菌WBRD1.11121501分离自中国上海地区的土壤中。将新采集的土壤样品通过富集培养或稀释涂布于罗丹明B平板上筛选得到一株可产胞外脂肪酶的细菌菌株。该菌株经过16SrRNA鉴定属于金黄杆菌属细菌，命名为金黄杆菌(Chryseobacteriumsp.)WBRD1.11121501。

该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。该保藏单位的地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编是100101。该菌株的保藏日期是2012年6月21日，保藏号是CGMCC No.6261，分类命名为：金黄杆菌Chryseobacterium sp.。

上述的脂肪酶的筛选方法为罗丹明B平板法，将待考察菌株或菌体悬浮液点种或稀释涂布于罗丹明B平板上，按照菌株相适应的生长条件进行培养，本发明的菌株培养温度在25-40℃。生长0.5-5天时在波长为365nm的紫外灯下观察菌落是否具有橙色荧光(见图1)，根据荧光的有无、强弱来判断该菌产生脂肪酶的能力。

该方法的筛选平板制备方法如下：

将配方甲液(硫酸铵0.1-0.5wt％，酵母浸出汁0.1-2wt％，胰蛋白胨0.1-2wt％，K2HPO40-1wt％，KC10-1wt％，七水合硫酸镁0.01-0.5wt％，七水合硫酸亚铁0-0.1wt％，琼脂1.0-2.0wt％)于115℃灭菌30min后加入同样方式灭菌的配方乙液(橄榄油与2-5％的聚乙烯醇以1：3比例混合，10000rpm搅拌乳化)，充分混合后按照1％(v/v)的量加入过滤除菌的0.1％罗丹明B溶液。充分混匀后制备得到筛选平板。

根据罗丹明B平板法筛选得到一株在365nm紫外灯下带有显著荧光的菌株即WBRD1.11121501菌株。

经过对该菌的16S rRNA测序，其rRNA序列如SEQ ID NO：1所示，进行比对后发现该序列与Chryseobacterium indologenes(GENBANK号NR042507.1)，Chryseobacterium gleum(GENBANK号NR042506.1)及Chryseobacterium ureilyticum(GENBANK号NR042503.1)的16S rRNA序列的一致性很高，且都达到99％。

该细菌WBRD1.11121501在LB培养基(胰蛋白胨1wt％，酵母提取物0.5wt％，氯化钠1wt％，琼脂1-2wt％)上生长呈圆形，粘性，表面光滑有凸起带黄色光泽。该菌呈杆状或椭圆状，长度在1.0-3.0μm，宽度在0.5-1.0μm。该菌为革兰氏阴性细菌，接触酶阳性，能产蛋白酶，以上这些指标都符合金黄杆菌的特征(Vandamme P.，Bernardet J.F.，Segers P.et al.New Perspectives in the Classification of theFlavobacteria：Description of Chryseobacterium gen.nov.，Bergeyellagen.nov.，and Empedobacter norn.rev.International Journal ofSystematic Bacteriology.1994，44(4)：827-831.)。

实施例2、耐表面活性剂脂肪酶的制备

取一支新鲜培养的金黄杆菌WBRD1.11121501斜面(LB培养基30℃培养48h，接一环至含有30ml种子培养基的种子摇瓶中，30℃、150rpm培养24h。而后以1％的接种量接种至发酵培养基中，30℃、150rpm摇床培养48h。培养液离心或微滤除去菌体，清液采用10kDa的膜进行超滤浓缩。而后对浓缩液进行分段硫酸铵盐析，收集20-70％饱和度的盐析沉淀物。再用Hitrap phenyl HP色谱柱(GE HealthCare，货号：17-5195-01)对该盐析蛋白样品进行疏水层析纯化，先用起始缓冲液和洗脱缓冲液进行梯度洗脱，再用蒸馏水洗脱，最后用70％的乙醇水溶液进行洗脱。使用自动收集器(Frac-920，购自GE Healthcare)收集样品，对洗脱过程的所有样品进行酶活性大小的检测，并将洗脱液中具有脂肪酶活性的组分合并收集，获得活性组分。收集的活性组分(脂肪酶)经50mM的pH7.5的Tris·HCl缓冲液通过超滤置换后即制备得到本发明所述的脂肪酶。

上述金黄杆菌的种子培养基为LB培养基，其组成为(单位g·L^-1)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，pH7.0。

上述的金黄杆菌产脂肪酶的发酵培养基组成(单位g·L^-1，余量为水)：蔗糖10、蛋白胨20、酵母浸出粉10、硫酸铵5、KH₂PO₄3、Na₂HPO₄·12H₂O7、吐温8010、MgSO₄·7H₂O2、CaCl₂2、橄榄油30，pH7.0。

上述的起始缓冲液为含有1.0M硫酸铵的50mM的Tris·HCl缓冲液。与起始缓冲液相比洗脱缓冲液不含有硫酸铵。

上述层析过程在室温下进行，置换后最终制备所得的金黄杆菌脂肪酶的溶液体系为50mM浓度、pH7.5的Tris·HCl缓冲液。

实施例3、金黄杆菌WBRD1.11121501所产脂肪酶的部分酶学性质

本发明所制备而得的脂肪酶具有如下性质，除特别说明外脂肪酶活力的检测均采用pNPP法(参见“具体实施方式”部分)。

对稳定性的影响

表面活性剂对金黄杆菌脂肪酶的稳定性影响的检测方法是取2ml的活力约为0.3单位/ml的待测酶液，向其中加入待检测表面活性剂至表面活性剂浓度为0.5％或1.0％(v/v)，室温下放置，分别于第20min、第45min和第70min取出部分样品0.1ml样品进行脂肪酶活力检测，以不添加表面活性剂的样品的检测值作为对照，以相同时间对照酶活力为100％，计算实验样品的相对酶活力。

表面活性剂对金黄杆菌脂肪酶的稳定性影响结果见图2和图3。该脂肪酶在0.5％和1％的SDS、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、吐温80、Triton X-100、AEO-9中的稳定性非常好，以不添加表面活性剂的样品的检测值为对照进行相对活力的计算，室温孵育70min后的活力仍超过对照值。

表面活性剂对金黄杆菌脂肪酶反应性能的影响结果见图4。其具体检测方法是首先配制含有1.3mg/ml pNPP，0.1％阿拉伯胶，0％-2.5wt％不同浓度的待考察表面活性剂的400ul体积的反应体系。该反应体系使用的缓冲系统为0.1M pH8.0的Tris-HCl。而后按照脂肪酶活力检测的方法进行酶活力的检测。检测中脂肪酶的添加量为100ul，以不添加表面活性剂的样品的检测值作为对照，并标记为100％，据此计算不同表面活性剂样品的相对酶活力。

发明所提供的脂肪酶的活性被0-20g/L的阴离子表面活性剂SDS、非离子表面活性剂Triton X-100和AEO-9所增强。本发明所提供的脂肪酶的活性可以被5-20g/L的阳离子表面活性剂CTAB所增强。

氧化剂双氧水在低于20mM浓度的范围内均对本发明所提供的金黄杆菌脂肪酶具有活力增强作用，见图5。另外，经过检测本发明所提供的金黄杆菌脂肪酶在含有5mM双氧水的体系中室温孵育70min后的活力几乎没有任何变化。

Claims (30)

1.一种金黄杆菌菌株，其保藏编号为CGMCC No.6261。

2.一种制备脂肪酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：在适合生产脂肪酶的条件下培养权利要求1所述的菌株，使该菌株产生脂肪酶，从培养物中分离出脂肪酶。

3.权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在适合生产脂肪酶的液体发酵培养基中培养权利要求1所述的菌株；

(2)收集步骤(1)所得的发酵液，过滤浓缩，获得浓缩液；

(3)对步骤(2)所得的浓缩液进行盐析，收集盐析沉淀物；

(4)将步骤(3)所得的盐析沉淀物溶解后，进行层析纯化；

(5)收集步骤(4)所得的层析洗脱物中的脂肪酶，即可得到本发明的脂肪酶。

4.权利要求3所述的方法，其中步骤(1)为：

在25-40℃、120-250rpm下将权利要求1所述的菌株于适合生产脂肪酶的液体发酵培养基中培养8-72小时。

5.权利要求3所述的方法，其中步骤(2)为：

收集步骤(1)所得的发酵液，通过离心或微滤的方法除去菌体，再将滤液用超滤膜进行超滤浓缩，获得浓缩液。

6.权利要求3所述的方法，其中步骤(3)为：

对步骤(2)所得的浓缩液进行硫酸铵盐析，收集20-70％饱和度的盐析沉淀物。

7.权利要求3所述的方法，其中步骤(4)为：

将步骤(3)所得的盐析沉淀物用起始缓冲液溶解后，使用疏水层析柱进行层析纯化，层析过程中先用洗脱缓冲液进行洗脱，再用蒸馏水洗脱，最后用10-70％v/v的乙醇水溶液进行洗脱。

8.权利要求3所述的方法，其中步骤(5)为：

收集步骤(4)所得的层析洗脱物中的脂肪酶活性峰，并使用置换缓冲液将获得的脂肪酶缓冲液体系置换为20-50mM、pH7.0-8.5的

Tris·HCl缓冲液，从而得到本发明的脂肪酶。

9.权利要求5所述的方法，其中在步骤(2)中，收集发酵液后用滤纸进行过滤，收集的清液经过0.1-0.5μm的微孔滤膜过滤，再用5-30kDa的超滤膜进行超滤浓缩。

10.权利要求7所述的方法，其中步骤(4)中所述的起始缓冲液为含有0.1-2M(NH₄)₂SO₄的20-100mM浓度、pH6.0-8.5的Tris-HCl缓冲液；所述的洗脱缓冲液为20-100mM浓度、pH6.0-8.5的Tris-HCl缓冲液。

11.权利要求8所述的方法，其中步骤(5)中所述的置换缓冲液为20mM-100mM浓度的pH6.0-8.5的Tris·HCl缓冲液。

12.权利要求8所述的方法，其中步骤(5)中所述的置换通过凝胶层析、透析或超滤的方式进行。

13.权利要求3-12任一项所述的方法，其中所述发酵培养基的配方如下：蔗糖0-5重量％、蛋白胨0.01-5重量％、酵母浸出粉0.01-5重量％、硫酸铵0-3重量％、KH₂PO₄0-1重量％、Na₂HPO₄·12H₂O0.01-1重量％、吐温800-3重量％、MgSO₄·7H₂O0.01-0.5重量％、CaCl₂0.01-0.5重量％、橄榄油0-5重量％，pH6.0-8.0，余量为水。

14.权利要求1所述的菌株用于生产脂肪酶的用途。

15.权利要求1所述的菌株用于水解脂肪的用途。

16.权利要求1所述的菌株用于油脂加工、食品、医药、环境保护、有机合成和日用化学品工业中需要脂肪酶的应用中的用途。

17.权利要求15或16所述的用途，其特征在于，使用所述菌株进行发酵生产后的发酵液用于所述用途。

18.权利要求17所述的用途，其特征在于，所述发酵液为在适合生产脂肪酶的液体发酵培养基中培养所述菌株获得的发酵液。

19.权利要求15或16所述的用途，其特征在于，在存在表面活性剂和/或氧化剂的条件下使用所述发酵液。

20.权利要求19所述的用途，其特征在于，所述表面活性剂为阴离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂；优选的阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠；优选的非离子表面活性剂为Triton X-100和AEO-9；优选的氧化剂为双氧水。

21.使用权利要求1所述的菌株进行发酵生产后的发酵液。

22.权利要求21所述的发酵液，所述发酵生产在适合生产脂肪酶的液体发酵培养基中进行。

23.权利要求1所述的菌株生产的脂肪酶。

24.权利要求23的脂肪酶，其特征在于，使用权利要求2-13任一项所述的方法制备。

25.权利要求21所述的发酵液或权利要求23所述的脂肪酶用于水解脂肪的用途。

26.权利要求21所述的发酵液或权利要求23所述的脂肪酶用于油脂加工、食品、医药、环境保护、有机合成和日用化学品工业中需要脂肪酶的应用中的用途。

27.权利要求25或26所述的用途，其特征在于，在存在表面活性剂和/或氧化剂的条件下使用所述脂肪酶。

28.权利要求27所述的用途，其特征在于，所述表面活性剂为阴离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂；优选的阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠；优选的非离子表面活性剂为Triton X-100和AEO-9；优选的氧化剂为双氧水。

29.一种水解脂肪的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的菌株或权利要求21所述的发酵液或权利要求23所述的脂肪酶水解脂肪。

30.权利要求29所述的方法，其特征在于，所述脂肪处于存在表面活性剂和/或氧化剂的条件下；优选的表面活性剂为阴离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂；优选的阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠；优选的非离子表面活性剂为Triton X-100和AEO-9；优选的氧化剂为双氧水。

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