CN104404016B

CN104404016B - 一种生产柚苷酶的方法

Info

Publication number: CN104404016B
Application number: CN201410779845.5A
Authority: CN
Inventors: 李秀婷; 朱运平; 杨然; 伍少明
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2014-12-17
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2034-12-17
Also published as: CN104404016A

Abstract

本发明涉及一种生产柚苷酶的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明的生产柚苷酶的方法，是将保藏号为CGMCCNo.9928的解淀粉芽孢杆菌11568进行斜面培养，得斜面菌种；再在40.9℃、180rpm的条件下发酵培养48h，得液体发酵液；离心分离液体发酵液，取上清液；上清液经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、Sephacryl S‑200凝胶过滤层析，得到柚苷酶。本发明制备柚苷酶的方法，具有产酶水平高、发酵时间短、易于控制生长条件、易于分离、纯度高、操作简单、条件温和等诸多优点，完全适合工业化生产的应用。以粉碎过60目的橘子皮作为柚苷酶发酵底物，充分利用了生活垃圾废弃物，节约成本。

Description

一种生产柚苷酶的方法

技术领域

本发明涉及一种生产柚苷酶的方法，属于微生物发酵技术领域。

技术背景

柚苷酶是一种重要的用于果汁里苦味物质水解的酶，是由α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）与β-D-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase，EC3.2.1.21）组成的一种糖苷水解复合酶系，同时具有 α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶两种酶的活性，柚苷酶可以作用于有苦味的柚皮苷并将其水解产生黄酮类物质，过程是柚皮苷先在α-L-鼠李糖苷酶作用下生成鼠李糖及普鲁宁（Prunin，又译作樱桃苷），普鲁宁的苦味约为柚皮苷的三分之一，因此苦味有所减轻，然后普鲁宁可在β-D-葡萄糖苷酶的作用下被分解为无苦味的柚皮黄酮物质（主要为柚皮苷）。柚苷酶的微生物来源方面主要集中在霉菌（黑曲霉和青霉等），细菌产柚苷酶的相关报道较少。

我国是柑橘生产大国，但是目前在柑橘果汁的加工行业主要问题就是果皮的深加工利用问题。在被当作垃圾大量处理掉到的柑橘皮含有丰富的柚皮黄酮 ( 主要为柚皮苷)，果胶，膳食纤维等，如能将其充分利用，不仅能够减轻环境压力，还可以造福于人类。现代药理学研究发现，柚皮黄酮具有多种生理活性：可调节毛细血管的脆性与渗透性，保护心脏，有抗溃疡、解毒、利尿、抗菌、消炎清热等功效, 也是一种高效的天然抗氧化剂, 是一种天然的保健产品。因此柚皮的深加工将大幅提高果农的收入，提高柚子的附加值等。

虽然对柚苷酶的研究越来越深入，但目前仅有少数柚苷酶的生产实现了工业化，目前限制柚苷酶的大规模工业化应用方面存在两个问题：第一个主要问题是我国缺乏适合工业化生产的高产酶菌株，这就极大限制了应用，高产柚苷酶菌株的培育困难之处在于如何在大量的诱变后代中将优秀突变株高效率的选出，到目前为止尚无较好的办法，菌株的选育进展缓慢，发展出新的高效的筛选方法很有必要，因此对高产菌株的培育是目前的当务之急。第二个问题是柚苷酶的固定化技术在国内还存在着很多的缺陷，在固定化中使用的试剂或载体存在成本偏高、固定化效率低下、稳定性较差、连续操作使用的设备较复杂等，这就需要我们国家进一步开发出更简便同时更适用的固定化方法，柚苷酶应用于柑桔及其他制品的脱苦与加工国外已有相关报道，但在我国柚苷酶并没有大规模的在生产中应用，主要原因是国内尚无规模制备的商品柚苷酶出售，今后我们应加强关于选育高产柚苷酶菌株的方法，并制备出低成本的柚苷酶纯酶，具有重要的实际意义。

与霉菌（黑曲霉和青霉等）液体发酵产柚苷酶相比，细菌液体发酵生产柚苷酶具有生长周期短、生产成本低、易于控制生长条件等诸多优点，近几年得到研究者更多的关注。但是，细菌生产的柚苷酶活性和霉菌相比，还具有一定的差距；目前所报道细菌发酵产酶水平不超过1000 U单位每毫升发酵液；细菌发酵产柚苷酶最适作用温度偏中性环境可能限制其在酸性环境中的部分应用。

发明内容

本发明通过创造性劳动，培养出了一种能够产柚苷酶的解淀粉芽孢杆菌；进而提供了一种用解淀粉芽孢杆菌生产柚苷酶的方法。本发明的解淀粉芽孢杆菌产的柚苷酶，分子量为32.5 kDa，最适宜作用温度、pH分别为45℃、7.5。本发明的解淀粉芽孢杆菌产的柚苷酶与本发明之前的由细菌和霉菌生产的柚苷酶相比，存在以下特殊之处：从解淀粉芽孢杆菌11568中产柚苷酶的部分酶学性质（最适pH和pH值稳定性、最适温度和温度稳定性）等研究，表明其在产业化应用前景的果汁脱苦等领域有极大应用前景，在提高葡萄酒的风味、改善饮料的香气成分和生产食品添加剂中也起到重要作用，对柚苷酶的分离纯化及性质的研究为制备出更好的在工业上应用的商品酶提供重要依据。

本发明的技术方案

本发明提供了一种新的生产柚苷酶的方法。

一种生产柚苷酶的方法，包括以下步骤：

（1）将保藏号为CGMCCNo.9928的解淀粉芽孢杆菌11568进行斜面培养，得斜面菌种；

（2）取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在40.9℃、180rpm的条件下发酵培养48h，得液体发酵液；

（3）离心分离液体发酵液，取上清液；

（4）上清液经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析，得到柚苷酶。

所述保藏号为CGMCCNo.9928的解淀粉芽孢杆菌11568，即为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）11568，分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）；其保藏日期为2014年11月4日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。

上述步骤（1）中，所述斜面培养基，每1L中含有以下成分：MgSO₄0.5g、KH₂PO₄1.5g、CaCl₂ 0.1g、（NH₄）₂SO₄ 1.5g、KCl 0.5g、KNO₃ 1.5g、酵母膏 2g、桔皮粉15g、琼脂 20g，pH为6.0，1×10⁵Pa 灭菌20 min。

上述步骤（2）中，所述种子培养基，每1L中含有以下成分：

麦芽糖15.1g、胰蛋白胨 10g、（NH₄）₂HPO₄ 20g、NaCl 10g、酵母提取物 5g，pH为7.51；

或者，柚皮苷10g、胰蛋白胨10g、（NH₄）₂HPO₄ 20g、NaCl 10g、酵母提取物 5g，pH为7.51；

或者，MgSO₄ 0.5g、 KH₂PO₄ 1.5g、 CaCl₂ 0.1g、（NH₄）₂SO₄ 1.5g、 KCl 0.5g、KNO₃1.5g、酵母膏 2、桔皮粉7.5g，pH 为6.0。

上述步骤（3）中，液体发酵液经超声波破壁后离心分离；超声波频率为25-30Hz，超声时间为10min，超声2.5s，停2.5s；离心的转速为5000－6000rpm，离心时间为10－15min。

上述步骤（4）中，在离子交换层析之后、凝胶过滤层析之前，用0.01-0.5mol/LNaCl进行洗脱。

所述步骤（4）中硫酸铵分级沉淀的具体步骤为：向上清液中加入硫酸铵，使其质量体积浓度为0.01％－40％，过滤除去产生的沉淀，然后继续加入硫酸铵，至其质量体积浓度为40％-80%为止，过滤得到含柚苷酶沉淀。所述的质量体积浓度是指：每mL上清液中含有硫酸铵的质量（g）。

所述步骤（4）中离子交换层析，是指Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析；其具体步骤为：首先利用缓冲体系为20mmol/L，pH 8.5的Tris-HCl缓冲液平衡柱料；基线平衡后加入目的蛋白液体量500微升，吸附时间为30min；吸附过后用0.01-0.5mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速设置为1mL/min，检测每管洗脱液中柚苷酶活力和蛋白质含量。其中，梯度洗脱的具体操作为：设置洗脱程序用0.01-0.5mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速设置为1mL/min，收集液体。

所述步骤（4）中凝胶过滤层析的具体操作为：填好SephacrylS-200柱料；用50mmol/LNaCl溶液（50mmol/L，pH 7.2磷酸缓冲液为溶剂），流速0.1mL/min，平衡柱料；平衡后以相同缓冲液洗脱，流速保持在0.1mL/min，设置每管收集1mL；检测每管中柚苷酶活力和蛋白质含量。其中，SephacrylS-200 是层析柱的型号，不可用其他型号的层析柱代替。

可采用盐酸、硫酸或磷酸中的一种或一种以上调节斜面培养基和种子培养基的pH。

斜面培养和发酵培养的接种量可以通过现有技术得到，不需付出创造性的劳动。斜面培养的接种量能够达到发酵培养所需接种量的种子液即可，发酵培养的接种量一般为0.2％（v/V）即可。

上述方法获得的柚苷酶为纯化倍数为38.27的电泳纯柚苷酶；总酶活力可以达到10556U，比酶活力达15609U/mg。

所以，本发明还提供了一种柚苷酶。

一种柚苷酶，由上述制备方法获得；其分子量为32.5 kDa，最适作用温度、pH分别为45℃、7.5。

本发明中，对于某个成分的含量的百分比，如果没有特别说明，均指重量百分比（w/w）。

本发明所用专业术语说明：

1U是指每分钟分解1μg柚皮苷底物所需要的柚苷酶量称为一个柚苷酶酶活。

有益效果

本发明的解淀粉酶芽孢杆菌11568的液体发酵液中柚苷酶活力可以高达201.12U/mL。

本发明的柚苷酶，与本发明之前的柚苷酶相比，具备以下优势：最适pH和pH值稳定性、最适温度和温度稳定性等性能好，在产业化应用前景的果汁脱苦等领域有极大应用前景，在提高葡萄酒的风味、改善饮料的香气成分和生产食品添加剂中也起到重要作用，对柚苷酶的分离纯化及性质的研究为制备出更好的在工业上应用的商品酶提供重要依据。

本发明制备柚苷酶的方法，与本发明之前细菌、真菌制备柚苷酶的方法相比，具有产酶水平高、发酵时间短、易于控制生长条件、易于分离、纯度高、操作简单、条件温和等诸多优点，完全适合工业化生产的应用。以粉碎过60目的橘子皮作为柚苷酶发酵底物，充分利用了生活垃圾废弃物，节约成本。

保藏说明

保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

地址北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所

保藏日期：2014年11月4日

保藏编号：CGMCCNo.9928

分类命名解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

附图说明

图1为实施例2所获得的液体发酵液的检测结果；

图1中，2.609峰代表柚皮苷；6.582峰为柚皮素；

图2为菌株11568所产柚苷酶纯化电泳图；

图2中：M-蛋白标样；1-粗酶液的蛋白带；2-40~80%硫酸铵盐析浓缩所得的蛋白带；3-经Q Sepharose Fast Flow离子交换层析得到的蛋白带；4-经Sephacryl S-200凝胶过滤层析得到的蛋白带。

具体实施方式

在下面所述的所有具体实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（参考Puri等人的相关文献）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1 解淀粉芽孢杆菌 11568筛选分离与鉴定

一、解淀粉芽孢杆菌 JNU002（Bacillus amyloliquefacines ）11568筛选分离

称取2g采集自全国各地的土样或发霉的桔皮或/和柚皮，于装有灭菌处理的18mL生理盐水的100mL锥形瓶中振荡30min，锥形瓶中最好放少许玻璃珠。然后用无菌水分别稀释成体积浓度为1×10^-3、1×10^-4两个梯度的稀释液，分别用灭菌的枪头吸取100μL稀释液涂布于预先配制并且灭菌的选择性平板培养基中，于30℃培养48-96h。从选择性平板培养基上划线分离单菌落，将挑取的单菌落中的部分制片镜检判断菌株纯度（显微镜观察菌体为同一形态特征）。如果不是纯菌落，应反复多次划线分离单菌落，直至获得纯菌落为止。将获得的纯菌落用斜面培养基保存，得到菌株纯培养体；同时，在分离出的纯菌落的选择性平板培养基上滴加一缩二乙二醇（DES）试剂，观察是否有透明圈现象，将有透明圈的菌株挑选出来，作为后续复筛的基础。所述选择性平板培养基的营养成分为（g/L）：MgSO₄ 0.5，KH₂PO₄1.5，CaCl₂0.1，（NH4）₂SO₄1.5， KCl 0.5，KNO₃ 1.5，酵母膏2，桔皮粉7.5，琼脂 20。

后续复筛：将有透明圈的菌株进行摇瓶培养，选取透明圈大的菌株作为目标菌株，命名为：解淀粉芽孢杆菌 11568；所用摇瓶培养基的营养成分为（g/L）：MgSO₄0.5， KH₂PO₄1.5， CaCl₂0.1，（NH4）₂SO₄ 1.5， KCl 0.5，KNO₃ 1.5，酵母膏 2，桔皮粉7.5，pH 为6.0。

二、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefacines ）11568鉴定

1.形态特征

40℃下在LB培养基平板培养48小时，菌落表面光滑、湿润，边缘不整齐，革兰氏染色阳性，菌落直径2~15mm，可扩散生长，菌落透明，无伴孢晶体，菌落无凸起。在LB培养基平板上培养菌体呈短杆状。所述LB培养基平板培养的营养成分为（g/L）：酵母提取物 5，NaCl10，胰蛋白胨 10。

2.16S rDNA 序列分析：

寡序核苷酸引物为真菌PCR扩增通用引物：

上游引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，如SEQ ID NO.2所示；

下游引物ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'；如SEQ ID NO.3所示；

利用PCR 技术扩增该菌的16S rDNA；

PCR扩增反应的具体操作如下（未具体说明的操作为常规操作）：

将反应体系依次加入PE小管；打开PCR扩增仪扩增；完成反应后关闭仪器；取出反应液进行琼脂糖凝胶电泳检验扩增DNA

PCR扩增反应体系所涉及各种试剂及用量：PCR扩增反应体系：0.5 μL模板DNA，1.0μL dNTP，0.5 μL Taq酶，引物各1.0 μL，补水至50μL。

PCR扩增反应条件:94℃预热4 min，每个循环包括：94℃变性30s，56℃退火30 s，72℃延伸6min，30个循环，最后再用72 ℃，10 min。

PCR扩增产物委托北京奥科鼎盛公司完成测序工作。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检验后测序，DNA序列表为：SEQ ID NO.1。

3.生理生化特征

根据《伯杰氏手册》（R.E. 布坎南，N.E. 基本斯等编，科学出版社，1984）对菌株进行生理生化鉴定（见表1），其生理生化特征与解淀粉芽孢杆菌相吻合。

表1：生理生化反应表

实施例2 含柚苷酶的、解淀粉芽孢杆菌 11568的液体发酵液的制备

（1）斜面培养：解淀粉芽孢杆菌11568接种于斜面培养基上，在40℃下培养48小时，得斜面菌株。所用斜面培养基（g/L）为：MgSO₄ 0.5、KH₂PO₄ 1.5、CaCl₂ 0.1、（NH₄）₂SO₄ 1.5、KCl 0.5、KNO3 1.5、酵母膏 2、桔皮粉15、琼脂 20，pH 6.0，1×10⁵ Pa 灭菌20 min。

（2）液体摇瓶发酵：将得斜面菌株以0.2%（v/V）的接种量接种到液体摇瓶培养基中，培养温度40.9℃，摇床转速180r/min，培养时间48h；得液体发酵液。液体摇瓶培养基（g/L）为：MgSO₄ 0.5、KH₂PO₄ 1.5、CaCl₂ 0.1、（NH₄）₂SO₄ 1.5、 KCl 0.5、KNO₃ 1.5、酵母膏 2、桔皮粉7.5，pH 6.0， 1×10⁵ Pa 灭菌20 min。

（3）通过高效液相色谱法（水：甲醇=1:1）测定液体发酵液的成分，检测结果如图1：液体发酵液中含有柚皮苷、柚皮素。

（4）柚苷酶的确认及酶活力的测定：采用改良Davis 法，于试管中加入1 g/ L 柚皮苷标准液2 mL，0. 2 mol/ L pH5.5醋酸缓冲液1.9mL，40 ℃恒温水浴锅中预热5 min，再加入0.1 mL液体摇瓶发酵液，40 ℃恒温反应30 min；得酶解液。取0.1 mL酶解液加入90%的一缩二乙二醇5mL、1mol/L的NaOH 溶液0.5mL、蒸馏水0.4mL，并取0.1 mL蒸馏水做空白对照（蒸馏水与酶解液吸光度值的差异为酶活测算依据）。40℃恒温水浴15 min后，在420 nm 处测吸光度值。以在40℃、pH5.5条件下，每分钟水解1μg柚皮苷所需的酶量为1 酶活力单位（U）。测得步骤（2）制备的液体发酵液的柚苷酶酶活为197.83U/mL。

实施例3 含柚苷酶的、解淀粉芽孢杆菌 11568的液体发酵液的制备

将实施例2步骤（1）培养好的斜面菌株以0.2%（v/V）的接种量接种到装有液体培养基的250ml锥形瓶中，进行液体摇瓶发酵，发酵温度40.9 ℃，摇床转速180 r/min，发酵时间48 h；得液体发酵液。液体培养基成分（g/L）：柚皮苷10、胰蛋白胨 10、（NH₄）₂HPO₄ 20、NaCl10、酵母提取物 5；pH 7.51，1×10⁵ Pa 灭菌20 min。

（4）按照实施例2的柚苷酶酶活力的测定方法测定本实施例所制备的液体发酵液的柚苷酶活力；检测结果为：柚苷酶活力达到140 U/mL。

实施例4 含柚苷酶的、解淀粉芽孢杆菌 11568的液体发酵液的制备

将实施例2步骤（1）培养好的斜面菌株以0.2%（v/V）的接种量接种到装有液体培养基的250ml锥形瓶中，进行液体摇瓶发酵，发酵温度40.9 ℃，摇床转速180 r/min，发酵时间48 h；得液体发酵液。液体培养基成分（g/L）：麦芽糖15.1、胰蛋白胨 10、（NH₄）₂HPO₄20、NaCl 10、酵母提取物 5；pH 7.51，1×10⁵ Pa 灭菌20 min。

（4）按照实施例2的柚苷酶酶活力的测定方法测定本实施例所制备的液体发酵液的柚苷酶活力；检测结果为：柚苷酶活力达到201.12 U/mL，在国内外柚苷酶相关研究中处于较高的产酶水平。

实施例5解淀粉芽孢杆菌 11568液体发酵生产柚苷酶

将液体发酵液超声波破壁后离心分离，取上清液。其中，超声波频率为25Hz，超声时间为10min，超声2.5s，停2.5s；离心的转速为5000rpm，离心时间为10min。

将上清液硫酸铵分级沉淀。具体操作为：向上清液中加入硫酸铵，使其质量体积浓度为40％，过滤除去产生的沉淀，然后向滤液中继续加入硫酸铵，至其质量体积浓度为40％-80%为止，过滤得到含柚苷酶沉淀。所述的质量体积浓度的意思是：每mL上清液中含有硫酸铵的质量（g）。

将含柚苷酶沉淀用0.4mol/L NaCl（ NaCl的浓度还可是00.1-0.5mol/L）进行洗脱；洗脱的具体操作为：首先利用缓冲体系为20mmol/L，pH 8.5的Tris-HCl缓冲液平衡柱料；基线平衡后加入目的蛋白液体量500微升，吸附时间为30min；吸附过后用0.01-0.5mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速设置为1mL/min，检测每管洗脱液中柚苷酶活力和蛋白质含量。

将洗脱后的含柚苷酶沉淀，依次进行Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析、SephacrylS-200凝胶过滤层析，即得到柚苷酶。

其具体步骤为：填好SephacrylS-200柱料；用50mmol/LNaCl溶液（50mmol/L，pH7.2磷酸缓冲液为溶剂），流速0.1mL/min，平衡柱料；平衡后以相同缓冲液洗脱，流速保持在0.1mL/min，设置每管收集1mL；检测每管中柚苷酶活力和蛋白质含量；其中，SephacrylS-200 是层析柱的型号，不可用其他型号的层析柱代替。

分别对实施例2、3或4制备的液体发酵液进行分离、纯化，均得到纯化倍数为38.27的电泳纯柚苷酶；纯度及比活力见表2所示。

表2

。

经SDS-PAGE可测得该酶的分子量均为32.5 kDa，SDS-PAGE结果见图2。

<110>北京工商大学

<120>一种生产柚苷酶的方法

<160>3

<210>1

<211>1443

<212>DNA

<213>解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）11568

<400>1

CCTCTGTCAC TTCGGCGGCT GGCTCCATAA AGGTTACCTC ACCGACTTCG GGTGTTACAA 60

ACTCTCGTGG TGTGACGGGC GGTGTGTACA AGGCCCGGGA ACGTATTCAC CGCGGCATGC 120

TGATCCGCGA TTACTAGCGA TTCCAGCTTC ACGCAGTCGA GTTGCAGACT GCGATCCGAA 180

CTGAGAACAG ATTTGTGGGA TTGGCTTAAC CTCGCGGTTT CGCTGCCCTT TGTTCTGTCC 240

ATTGTAGCAC GTGTGTAGCC CAGGTCATAA GGGGCATGAT GATTTGACGT CATCCCCACC 300

TTCCTCCGGT TTGTCACCGG CAGTCACCTT AGAGTGCCCA ACTGAATGCT GGCAACTAAG 360

ATCAAGGGTT GCGCTCGTTG CGGGACTTAA CCCAACATCT CACGACACGA GCTGACGACA 420

ACCATGCACC ACCTGTCACT CTGCCCCCGA AGGGGACGTC CTATCTCTAG GATTGTCAGA 480

GGATGTCAAG ACCTGGTAAG GTTCTTCGCG TTGCTTCGAA TTAAACCACA TGCTCCACCG 540

CTTGTGCGGG CCCCCGTCAA TTCCTTTGAG TTTCAGTCTT GCGACCGTAC TCCCCAGGCG 600

GAGTGCTTAA TGCGTTAGCT GCAGCACTAA GGGGCGGAAA CCCCCTAACA CTTAGCACTC 660

ATCGTTTACG GCGTGGACTA CCAGGGTATC TAATCCTGTT CGCTCCCCAC GCTTTCGCTC 720

CTCAGCGTCA GTTACAGACC AGAGAGTCGC CTTCGCCACT GGTGTTCCTC CACATCTCTA 780

CGCATTTCAC CGCTACACGT GGAATTCCAC TCTCCTCTTC TGCACTCAAG TTCCCCAGTT 840

TCCAATGACC CTCCCCGGTT GAGCCGGGGG CTTTCACATC AGACTTAAGA AACCGCCTGC 900

GAGCCCTTTA CGCCCAATAA TTCCGGACAA CGCTTGCCAC CTACGTATTA CCGCGGCTGC 960

TGGCACGTAG TTAGCCGTGG CTTTCTGGTT AGGTACCGTC AAGGTGCCGC CCTATTTGAA 1020

CGGCACTTGT TCTTCCCTAA CAACAGAGCT TTACGATCCG AAAACCTTCA TCACTCACGC 1080

GGCGTTGCTC CGTCAGACTT TCGTCCATTG CGGAAGATTC CCTACTGCTG CCTCCCGTAG 1140

GAGTCTGGGC CGTGTCTCAG TCCCAGTGTG GCCGATCACC CTCTCAGGTC GGCTACGCAT 1200

CGTCGCCTTG GTGAGCCGTT ACCTCACCAA CTAGCTAATG CGCCGCGGGT CCATCTGTAA 1260

GTGGTAGCCG AAGCCACCTT TTATGTCTGA ACCATGCGGT TCAGACAACC ATCCGGTATT 1320

AGCCCCGGTT TCCCGGAGTT ATCCCAGTCT TACAGGCAGG TTACCCACGT GTTACTCACC 1380

CGTCCGCCGC TAACATCAGG GAGCAAGCTC CCATCTGTCC GCTCGACTTG CATGTATAGG 1440

CAC 1443

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

TCCGTAGGTG AACCTGCGG 19

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

TCCTCCGCTT ATTGATATGC 20

Claims

1.一种生产柚苷酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（3）离心分离液体发酵液，取上清液；

（4）上清液经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析，得到柚苷酶;

所述解淀粉芽孢杆菌的拉丁名为Bacillus amyloliquefaciens。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

上述步骤（1）中，所述斜面培养使用的培养基，每1L中含有以下成分：MgSO₄0.5g、KH₂PO₄1.5g、CaCl₂ 0.1g、（NH₄）₂SO₄ 1.5g、KCl 0.5g、KNO₃ 1.5g、酵母膏 2g、桔皮粉15g、琼脂 20g，pH为6.0，1×10⁵Pa 灭菌20 min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

上述步骤（2）中，所述种子培养基，每1L中含有以下成分：

或者，MgSO₄ 0.5g、 KH₂PO₄ 1.5g、 CaCl₂ 0.1g、（NH₄）₂SO₄ 1.5g、 KCl 0.5g、KNO₃ 1.5g、酵母膏 2、桔皮粉7.5g，pH 为6.0。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，

5.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，

上述步骤（4）中，在离子交换层析之后、凝胶过滤层析之前，用0.01-0.5mol/L NaCl进行洗脱。

6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，

所述步骤（4）中硫酸铵分级沉淀的具体步骤为：向上清液中加入硫酸铵，使其质量体积浓度为0.01％－40％，过滤除去产生的沉淀，然后继续加入硫酸铵，至其质量体积浓度为40％-80%为止，过滤得到含柚苷酶沉淀。

7.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，

所述步骤（4）中离子交换层析，其具体步骤为：首先利用缓冲体系为20mmol/L，pH 8.5的Tris-HCl缓冲液平衡柱料；基线平衡后加入目的蛋白液体量500微升，吸附时间为30min；吸附过后用0.01-0.5mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速设置为1mL/min，检测每管洗脱液中柚苷酶活力和蛋白质含量。

8.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，

所述步骤（4）中凝胶过滤层析的具体操作为：填好SephacrylS-200柱料；用50mmol/LNaCl溶液，流速0.1mL/min，平衡柱料；平衡后以相同缓冲液洗脱，流速保持在0.1mL/min，设置每管收集1mL；检测每管中柚苷酶活力和蛋白质含量。

9.一种采用权利要求1-8中任意一项所述方法获得的柚苷酶。

10.根据权利要求9所述的柚苷酶，其特征在于，分子量为32.5 kDa，最适作用温度、pH分别为45℃、7.5；总酶活力为10556U，比酶活力达15609U/mg。