CN103374534A - 解脂亚罗酵母菌株及其用于合成赤藓糖醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种解脂亚罗酵母菌株及其用于合成赤藓糖醇的方法。所述解脂亚罗酵母菌株为解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13 CGMCC NO.7326。其用于合成赤藓糖醇的方法为：以发酵初始浓度为100～400克/升的碳源，以发酵初始浓度为2～35克/升的氮源以及无机盐类为原料，80℃～90℃处理30分钟，冷却后接入所述解脂亚罗酵母菌株，在有氧的条件下进行连续发酵或分批补料发酵；发酵结束后，从发酵液中提纯赤藓糖醇。本发明的解脂亚罗(Yarrowia lipolytica)酵母菌株由葡萄糖合成赤藓糖醇转化率高且符合我国赤藓糖醇国家标准。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种解脂亚罗酵母菌株及其用于合成赤藓糖醇的方法。
背景技术
赤藓糖醇(也称丁四醇)是一种四元多元醇，分子量122.1道尔顿，在很多水果蔬菜以及酿造食品中均存在(如梨、葡糖等水果以及酒类)，但含量很少。由于赤藓糖醇具有零热量、无剂量限制以及纯生物发酵制备的优点，使得赤藓糖醇在食品中的应用更加广泛，已经在糖果、烘焙食品、无糖饮料等食品中广泛使用。
比如：申请号为CN200710014055.8的中国发明专利公开了一种含赤藓糖醇的夹心巧克力的制作方法；申请号为CN201110420379.8的中国发明专利公开了一种含赤藓糖醇的复合无糖饮料及其制备方法；申请号为201180012533.6的中国发明专利公开了一种含赤藓糖醇的糖果产品及其制备方法；申请号为CN201010569981.3的中国发明专利公开了一种含赤藓糖醇的护肝健胃保健饮料及其制造方法。
另外赤藓糖醇还可以和其它功能糖或功能糖醇搭配应用在食品中。比如：申请号为CN200610168838.7的中国发明专利公开了一种含木糖醇与赤藓糖醇的无冷却效应的无糖甜点；美国发明专利US7754268B2公开了含木糖醇与/或赤藓糖醇的烘焙食品的制作方法；申请号为CN201010289677.3与CN201010289668.4的中国发明专利以及美国发明专利US7579032B2都公开了一种含赤藓糖醇与塔格糖的零热量或低热量的饮料及其在食品中的用途；欧洲发明专利EP1057414B1公开了一种含赤藓糖醇与山梨醇的无糖糖果的方法。
此外，赤藓糖醇还应用在牙膏、漱口水以及化妆品领域(详见美国发明专利US8287842B2、世界发明专利WO2001074323A1、美国发明专利US20060067902A1以及美国发明专利US20060062752A1)。
目前很多国家已经批准赤藓糖醇在食品上的使用。日本在1990年就已经批准赤藓糖醇作为蔗糖的甜味替代剂，应用于各种糖果、饮料等食品中。美国于2001年也批准赤藓糖醇在食品中的应用，欧盟、澳大利亚以及新西兰等国家都批准赤藓糖醇的使用。 我国2008年将赤藓糖醇列为食品添加剂新品种并限定了生产菌种为Moniliella pollinis(丛梗孢酵母)以及Trichosporonoides megachiliensis(类丝孢酵母)，并于2011年制定了赤藓糖醇的国家标准(GB26404-2011)，并增加了一种合成赤藓糖醇的酵母菌株Candida lipolytica(解脂假丝酵母)，该酵母国际上现在命名为Yarrowia lipolytica(耶氏解脂酵母或亚罗威亚解脂酵母)(详见参考文献：van der Walt，JP and von Arx，JA.Antonie van Leeuwenhook，1980，46：517-521)。这一国家标准中规定的三种产赤藓糖醇的酵母分别是解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、丛梗孢酵母(Monilliela pollinis)以及类丝孢酵母(Trichosporonoides megachiliensis)，以葡萄糖为主要原料，经上述三种酵母中的一种发酵转化为赤藓糖醇，再经过精制等工艺得到食品添加剂赤藓糖醇晶体产品。
除了我国国家标准规定的三种酵母外，目前已经发现有很多其它种类的酵母也能由葡萄糖发酵转化得到赤藓糖醇，其中一些酵母菌株具备实际使用价值。中国发明专利ZL01103765.2(授权公告号CN100469865C)描述了生产赤藓糖醇的Moniliella菌株，该菌株以至少大约45％的转化率将葡萄糖转化为赤藓糖醇，其中经过NTG(N-甲基-N-亚硝基胍)处理的突变株N61188-2在含35％的葡萄糖发酵培养基中经过6天的发酵获得最高62.8％的转化率，具有重要的应用价值。但我国制定的赤藓糖醇国家标准中仅将Monilliela类中的Monilliela pollinis作为生产菌株，Monilliela其它的类不能作为生产菌株，限制了突变株N61188-2的使用。中国发明专利CN200610163644(授权公告号CN1974755B)公开了生产赤藓糖醇的酵母菌株，该菌株与Moniliella acetobuten最接近，由葡萄糖转化为赤藓糖醇的效率大于30％。该菌株不符合我国制定的国家标准，不能在我国得到使用。中国发明专利ZL200510102929(授权公告号CN100506972C)公开了一种解脂假丝酵母及其生产赤藓糖醇的方法，所使用的酵母虽然为我国国家标准规定的菌株(Candida lipolytica)且已经在我国相关企业得到使用推广，但由葡萄糖合成赤藓糖醇的转化率偏低(47％)。欧洲发明专利EP0770683A1公开了一种采用Yarrowia lipolytica由葡萄糖合成赤藓糖醇的方法，但得到的最高转化率只有32.9％，无实际使用价值。美国发明专利US6110715公开了一种采用Trichosporonoides megachiliensis酵母能发酵葡萄糖合成赤藓糖醇，虽然该菌株符合我国国家标准，但报道的最高转化率只有35.1％，无实际使用价值。
专利申请201110329642.2披露了一种利用解脂耶罗威亚酵母菌株生产赤藓糖醇的工艺，其目的是解决现有技术搅拌和鼓风时间长，电耗高，易发生染菌，生产效率低， 成本高等问题。但是该文献中披露所述的菌株是在公司在上壤或蜂巢中筛选获得解脂耶罗威亚酵母菌株，经人工繁殖后获得赤藓糖醇生产菌株；但是，该文献并没有公开所述菌株的任何特性信息，如菌株的单细胞形态，细胞形态的多样性变化，菌落的形态，分子鉴定等信息；同时，该文献也没有披露任何该菌株生产赤藓糖醇的转化效率；尽管文献在说明书中记载有“产品的纯度在99.5％以上”，“总收率为84.8％”，但是这些参数与赤藓糖醇的转化效率没有任何关系，进而本领域技术人员无法获知转化效率；其次，该文献公开的生产工艺完全属于本领域的公知常识；对于本领域技术人员来说，发酵工艺中，起始菌株是最为关键的环节，菌株的特性决定着发酵本身的工艺以及下游分离纯化的工艺，和最终的生产效果；可见，该文献并没有公开能够确定菌株的任何实质性信息，本领域技术人员显然不能获得任何技术启示，显然也无法筛选出具有本发明记载的具有显著技术效果的菌株。
其它种类的能合成赤藓糖醇的酵母还包括木兰假丝酵母(Candida magnoliae)(美国发明专利US6287830B1)、球拟酵母(Torula sp.)(Biotechnol Lett，2000，22：983-986)、变异三角酵母(Trigonopsis variabilis)(美国发明专利US6162636)、丝孢类酵母(Trichosporon sp.)(美国发明专利US2001/0008769A1)、短梗霉酵母(Aureobasidiumsp.)(J Ferment Bioeng，1989，68：310-314)、Pichia sp.(美国发明专利US6001616)、Pseudozyma tsukubaensis(Appl Microbiol Biotechnol，2009，83：225-231或Korean Patent Pending No.2002-14975)等。
虽然上述报道的能合成赤藓糖醇的酵母菌株有的具备实际使用价值(如Pseudozyma tsukubaensis由葡萄糖合成赤藓糖醇的最高转化率达到61％)，但由于不符合我国赤藓糖醇国家标准而不能在我国使用。因此，获取由葡萄糖转化为赤藓糖醇效率高而且符合我国赤藓糖醇国家标准的酵母菌株对于提高我国赤藓糖醇的发展水平具有重要的意义。
另外，赤藓糖醇的发酵是一个比较耗能的过程。发酵培养基通常需要在高温高压的条件下灭菌(121℃处理20～40分钟)，而葡萄糖与氮源在此条件下会发生美拉德反应使得发酵培养基颜色加深，增加赤藓糖醇纯化的成本。因此，开发一种在中低温条件下(90℃以下)处理发酵液而又保证在发酵过程中不污染的工艺非常重要。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有的赤藓糖醇菌株以及发酵技术存在的不足，提供一种解脂亚罗酵母菌株及其用于合成赤藓糖醇的方法。本发明的解脂亚罗(Yarrowia lipolytica)酵母菌株由葡萄糖合成赤藓糖醇转化率高且符合我国赤藓糖醇国家标准。
本发明的酵母菌种为解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica BLC13)，该菌株已于2013年3月19日递交CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.7326。
本发明所使用的酵母菌株(Yarrowia lipolytica)BLC13的获取方法如下：
(1)野生Yarrowia lipolytica的分离：2012年4月30日至5月4日在江西省万年县流动养蜂场采集蜂巢样本210份于灭菌2ml离心管中带回实验室进行分离。将蜂巢用无菌水漂洗，得到的漂洗液涂布于分离培养基上，在30℃培养，直到菌落长出。分离培养基成分为(克/升)：果糖450，酵母浸粉20，蛋白胨10，琼脂20，pH5.5，灭菌处理。经过7天的培养将直径大于2.0mm的菌落接到发酵培养基中进行合成赤藓糖醇试验。发酵培养基成分为(克/升)：葡糖糖280，酵母浸粉15，玉米浆干粉10，硫酸镁2，磷酸氢二铵5，一水硫酸锰0.02，五水硫酸铜0.005，pH5.5。试验发现有6株菌株具有合成赤藓糖醇的能力，选取合成能力最高的菌株并鉴定该菌株的种类，经分子鉴定，该菌株为(Yarrowia lipolytica)，分子鉴定的详细步骤见实施例中的描述。
(2)诱变以获得合成赤藓糖醇能力提高的突变株：可以采用紫外线诱变、还可以采取化学诱变剂(如：N-甲基-N’-亚硝基胍(NTG)、甲磺酸乙酯(EMS))诱变。本发明中采取NTG诱变的方式来处理Yarrowia lipolytica细胞。此种方法在其它专利文献中做了描述，比如中国发明专利ZL01103765.2、美国发明专利US5036011以及公开发表的文献均有描述(如：Ishizuka等，J.Ferment.Bioeng.1989，68：310-314)。经过5轮NTG诱变后，获得一株合成赤藓糖醇能力显著增强的突变株BLC13，该突变株于2013年3月19日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.7326。
本发明所使用的酵母菌株CGMCC No.7326具有如下特性：
酵母菌株CGMCC No.7326在液体培养基中(成分：葡萄糖、酵母粉以及蛋白胨各10克/升)培养24小时后细胞在640倍显微镜下为圆形或卵圆形，单个细胞直径4～7微米，出芽生殖。在固体培养基中(上述液体培养基另加20克/升琼脂)菌落边缘呈波浪形，菌落表面有点状突起，经过延长时间培养菌落也不会出现皱折，菌落灰白色。细胞在固体或液体培养基中均为圆形或卵圆形，不会出现假丝状细胞。根据上述特性，本发明所述的解脂亚罗酵母与中国发明专利ZL200510102929.6所述的解脂假丝酵母具有很大的不同。中国发明专利ZL200510102929.6所述的酵母菌落初期呈光滑状，经过延长 的培养菌落出现皱折，有时细胞呈假丝状。解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)的种类非常多，代谢产物的种类也各异，有的能高效合成柠檬酸，有的能分泌蛋白酶，还能作为蛋白表达的宿主(Park et al，1997，J Biol Chem272：6876-6881)，不同种类其基因组大小也不一样，表现为遗传与生理多样性(详见文献：Casarégola S，et al，1997，Chromosoma106：380-390；Barth Gerold and Gaillardin Claude，1997，FEMSMicrobiol Rev19：219-237)。本发明专利中所述的解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)能高效合成赤藓糖醇，但不能合成柠檬酸。
本发明专利中所述的解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)能同化葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘油。不能同化半乳糖、D-半乳糖醇、乳糖、木糖、木糖醇、山梨醇、甘露醇、L-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖醇、D-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖醇、核糖醇、棉子糖、蔗糖、肌醇、甲醇、乙醇、柠檬酸盐、海藻糖、鼠李糖、D-核糖、乳酸钠。虽然能高效合成赤藓糖醇，但不能同化赤藓糖醇。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种解脂亚罗酵母菌株，所述解脂亚罗酵母菌株为解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13CGMCC NO.7326。
第二方面，本发明涉及上述的解脂亚罗酵母菌株在合成赤藓糖醇中的用途。
第三方面，本发明涉及上述的解脂亚罗酵母菌株用于合成赤藓糖醇的方法，所述方法包括如下步骤：
A、将解脂亚罗酵母菌种(Yarrowia lipolytica)BLC13CGMCC NO.7326接种于含碳源、氮源、无机盐和水的发酵培养基中进行培养发酵；
B、发酵结束后，从发酵液中提纯赤藓糖醇。
优选地，步骤A中，所述发酵培养基的碳源为固体葡萄糖、葡萄糖浆、淀粉水解液、葡萄糖母液中的一种或多种，碳源用量为100～400克/升。优选为200～300克/升，更优选为240～280克/升。
优选地，步骤A中，所述氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵、尿素、豆饼粉、棉籽饼粉中的一种或几种的混合，优选磷酸氢二铵、酵母粉、玉米浆干粉。氮源的用量为2～35克/升，优选为5～15克/升。
优选地，步骤A中，所述无机盐为硫酸镁、硫酸锰、氯化锰、硫酸铜、氯化铜、硫酸锌、氯化锌中的一种或几种，无机盐用量为0～2.5克/升。优选地，无机盐用量为0.01～2克/升。
优选地，步骤A中，所述接种具体为：将所述发酵培养基在80～90℃的温度下处理20～40分钟，冷却后再接入所述解脂亚罗酵母菌株进行发酵培养。更为优选地是在85℃处理30分钟。
优选地，步骤A中，发酵前期pH值为5.0～7.0，优选地，pH值为5.5～6.5，更优选为6.0；待发酵至细胞密度OD600值为20或以上时，用酸调节pH值为3.1～4.0，更优选3.2；发酵初始温度为25℃～35℃，优选28℃～32℃，更优选30℃。
优选地，步骤A中，所述培养发酵后还包括如下步骤：经过多级(一级、二级甚至是三级)扩大培养，转入生产发酵培养基中进行连续发酵或分批补料发酵合成赤藓糖醇；所述生产发酵培养基具有和所述发酵培养基一样的组分配方。
优选地，所述连续发酵是在整个发酵过程中不进行不料，一直发酵到结束，分批补料发酵具体为在发酵过程中分批补入高糖培养基，所述高糖培养基各组分为：碳源500～600克/升，氮源10～40克/升；所述碳源为固体葡萄糖、液体葡萄糖浆、葡萄糖母液中的一种或多种；所述氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵、尿素、豆饼粉、棉籽饼粉中的一种或几种的混合。
优选地，步骤A中，所述一级培养可以在摇瓶中进行，二级培养可以在小型发酵罐(体积250升或以下体积)中进行，三级培养可以在1000升或以上发酵罐中进行。
优选地，步骤B中，所述从发酵液中提纯赤藓糖醇包括：在发酵结束后经过滤除菌、浓缩、结晶，精制，即得精制赤藓糖醇晶体。
进一步优选地，所述过滤除菌具体为：发酵结束后通过离心或者陶瓷膜过滤的方法将酵母细胞与发酵液分离，再通过纳滤膜分离去除所述发酵液中的分子量大于1000道尔顿的大分子粘性物质，得清澈透明的发酵液。
进一步优选地，所述浓缩具体为：将所述清澈的发酵液在蒸发器中浓缩到固形物含量为50～80％(质量体积百分比)，得富含赤藓糖醇的糖浆。
进一步优选地，所述结晶具体为：将所述富含赤藓糖醇的糖浆I以1～5℃/h的速率冷却至10℃以下，在起晶点温度下向所述糖浆中加入质量体积百分比为0.1～2％的赤藓糖醇诱导结晶，离心分离，即得赤藓糖醇粗制晶体。
进一步优选地，所述精制具体为：用去离子水溶解所述赤藓糖醇粗制晶体，加入质量体积百分比为0.5～5％的活性炭，在60℃～85℃下搅拌脱色30～180分钟；过滤分离活性炭，再浓缩到固形物含量为20～30％(质量体积百分比)，依次进行阴离子树脂与阳离子树脂离子交换，待电导率降到100μs以下后继续浓缩到固形物含量为50～80％(质 量体积百分比)，得到富含赤藓糖醇的糖浆，以2～5℃/h的速率冷却降温至10℃以下，在起晶点温度下加入质量体积百分比为0.1～2％的赤藓糖醇晶体诱导成晶，离心分离，得精制赤藓糖醇晶体。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)本发明所获得的新菌株解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13CGMCC No.7326)具有很高的合成赤藓糖醇能力，由葡萄糖合成赤藓糖醇的转化率至少在53.0％以上，最高达到63.2％。较现有技术中所描述的解脂亚罗酵母(或解脂假丝酵母)的转化率显著提高(如：中国发明专利ZL200510102929.6描述的解脂假丝酵母最高的转化率为47％；欧洲发明专利EP0770683A1描述的解脂亚罗酵母最高转化率为32.9％；欧洲发明专利EP0845538A2描述的解脂亚罗酵母最高转化率为43.9％)。
(2)本发明所获得的新菌株解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13CGMCC No.7326)除了能利用常用的固体葡萄糖合成赤藓糖醇外，还能以液体葡萄糖浆以及葡萄糖母液为碳源合成赤藓糖醇。液体葡萄糖浆以及葡萄糖母液价格比固体葡萄糖低的多，因此可以节约碳源的成本。
(3)无需对发酵液进行高温高压灭菌处理，只需要80～90℃的温度下处理20～40分钟(优选地，在85℃处理30分钟)；在补料阶段也无需对新加入的培养基进行高温高压灭菌处理，有效地节约了能源。
(4)在发酵过程中能进行多次补料，高效地利用了酵母细胞，减少了培养酵母细胞种子的次数，增加了合成赤藓糖醇的能力，提高了生产效率。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为野生(Yarrowia lipolytica)酵母菌株在640倍显微镜下的形态；
图2为野生(Yarrowia lipolytica)酵母菌株经过10天培养后在640倍显微镜下的形态；
图3为(Yarrowia lipolytica)BLC13酵母菌株合成的产物与标准的赤藓糖醇高效薄层分析比较图，其中，1为(Yarrowia lipolytica)BLC13酵母由葡萄糖发酵合成的产物，2为标准赤藓糖醇；
图4为(Yarrowia lipolytica)BLC13酵母菌株合成的产物与标准的赤藓糖醇高效液相分析比较图，其中，A为(Yarrowia lipolytica)BLC13酵母由葡萄糖发酵合 成的产物的HPLC分析图，B为标准赤藓糖醇的HPLC分析图，C为(Yarrowia lipolytica)BLC13酵母由葡萄糖发酵合成的产物30克/升与标准赤藓糖醇30克/升按照1∶1混合后HPLC分析图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明利用所述解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)发酵合成赤藓糖醇的方法，是通过如下步骤来实现的：
A、将解脂亚罗酵母菌种(Yarrowia lipolytica)BLC13CGMCC NO.7326接种于含碳源、氮源、无机盐和水的发酵培养基中进行培养发酵；
B、发酵结束后，从发酵液中提纯赤藓糖醇。发酵结束后测定赤藓糖醇的得率为53％以上。得率计算的方法为：发酵结束后发酵液中赤藓糖醇的质量除以发酵过程中消耗的碳源的质量的百分比。连续发酵或分批补料发酵在以下实施例2、3中做进一步的描述。
(2)发酵结束后经过过滤除菌、浓缩、结晶，即得赤藓糖醇一次晶体。得到的一次晶体重新溶解，再经过脱色与离子交换脱盐，浓缩，再结晶，得到赤藓糖醇二次晶体，即精制的白色赤藓糖醇晶体。
(3)对精制的赤藓糖醇进行高效薄层层析、高效液相分析以及气相质谱分析，证明合成的为真正的赤藓糖醇。具体在以下实施例4中做详细的描述。
实施例1、解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13的获取
1.1合成赤藓糖醇酵母菌株的获取
合成赤藓糖醇的野生酵母菌株的分离：发明人2012年4月30日至5月4日在江西省万年县流动养蜂场采集蜂巢样本210份于灭菌2ml离心管中带回实验室进行分离。将蜂巢用无菌水漂洗，得到的漂洗液涂布于分离培养基上，在30℃培养，直到菌落长出。分离培养基成分为(克/升)：果糖450，酵母浸粉20，蛋白胨10，琼脂20，pH5.5，灭菌处理。经过7天的培养将直径大于2.0mm的菌落接到发酵培养基中进行合成赤藓糖醇试验。发酵培养基成分为(克/升)：葡糖糖280，酵母浸粉15，玉米浆干粉10，硫酸镁2，磷酸氢二铵5，一水硫酸锰0.02，五水硫酸铜0.005，pH5.5。试验发现有6株菌株具有合成赤藓糖醇的能力，选取合成能力最高的一菌株进行化学诱变以进一步提高 该菌株合成赤藓糖醇的能力。获得的合成赤藓糖醇能力最高的一种野生酵母菌株在640倍显微镜下的形态如图1所示。经过长时间(10天)的培养后该酵母在显微镜下的形态如图2所示。从图1与2可见，虽然经过长时间的培养，细胞的形态仍为圆形或卵圆形，并没有假丝状细胞。
1.2合成赤藓糖醇能力最高的野生酵母菌株的分子鉴定
经分子鉴定，该菌株为(Yarrowia lipolytica)，具体的鉴定方法如下：
提取该酵母菌的总DNA(按照文献Cheng HR，Jiang N.2006.Biotechnol Lett，28：55-59描述的方法)，以此总DNA为模板分别进行PCR扩增18S核糖体RNA(18SrDNA)以及ITS1-ITS2DNA序列。
扩增18S rRNA序列采用的一对引物如下：
正向引物序列(P18S-F)：ATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTC(SEQ ID NO.1)
反向引物序列(P18S-R)：GAGGCCTCACTAAGCCATTCAATCG(SEQ ID NO.2)
50μl反应体系组成成分为：
反应条件为：95℃预变性5分钟，然后94℃30秒，55℃30秒，72℃90秒，反应35个循环，最后72℃延伸10分钟。获得的PCR产物以正向引物P18S-F进行序列测定，测序结果如SEQ ID NO.3所示。
将上述DNA序列在NCBI Blast数据库进行比较，发现与已知的Yarrowia lipolytica酵母的18S rDNA部分序列具有100％同源性，说明本发明中分离的合成赤藓糖醇的酵母为Yarrowia lipolytica。
扩增ITS1-ITS2序列采用的一对引物如下：
正向引物(Pits-F)：TTCGTAGGTGAACCTGCGG(SEQ ID NO.4)
反向引物(Pits-R)：TCCTCCGCTTATTGATATGC(SEQ ID NO.5)
50μl反应体系组成成分为：
反应条件为：95℃预变性5分钟，然后94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，反应35个循环，最后72℃延伸10分钟。获得的PCR产物以正向引物Pits-F进行序列测定，测序结果如SEQ ID NO.6所示。
将上述DNA序列在NCBI Blast数据库进行比较，发现与已知的Yarrowia lipolytica酵母的ITS部分序列(ITS1-5.8S rDNA-ITS2-28S rDNA基因)具有100％同源性，进一步说明本发明中分离的合成赤藓糖醇的酵母为(Yarrowia lipolytica)。将该菌进行诱变以进一步提高合成赤藓糖醇的能力。
1.3解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)菌株的诱变
本发明按照以下的诱变方法，采用N-甲基-N’-亚硝基胍(NTG)诱变剂获得工程菌株(Yarrowia lipolytica)BLC13(CGMCC No.7326)：
1.制备菌悬液
(1)将分离的能合成赤藓糖醇的野生型的Yarrowia lipolytica酵母菌接种到液体培养基中，30℃培养24小时。然后将菌液倒入盛有玻璃珠的灭菌三角瓶中，振荡10分钟，使酵母菌充分均匀分散。
(2)将上述菌液吸1毫升于无菌离心管中离心(5000转/分离心10分钟)，倒去上清液加1ml无菌水制成菌悬液。
2.诱变处理
(1)称取NTG1.0毫克于灭菌的离心管中，然后加入1毫升pH6.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲液，使其完全溶解，并存放在30℃水浴中备用。
(2)将菌悬液(1毫升)，加入上述含有NTG的离心管中，充分混匀，立刻放入30℃水浴中，30分钟后取出，立即离心(3500转/分)，将上清倒入浓NaOH溶液中处理残留的NTG使其减低毒性，用1毫升生理盐水洗涤酵母细胞，再离心(3500转/分)一次，倒去废液，重复洗涤3次，最后加1毫升无菌水制成菌悬液。
(3)将熔化的高渗培养基倒入灭菌培养皿中，放平待凝，共20皿。高渗培养基的成分为：葡萄糖400克/升，酵母浸粉20克/升，无水硫酸镁0.1克/升，磷酸二氢钾1克/升，琼脂20克/升，pH3.1。
(4)将经NTG处理过的菌液适当稀释，吸取50微升于上述预先倒好培养基的培养皿中，用灭过菌的Y形玻璃涂棒将菌液涂匀，在30℃培养3～4天，计算菌数。
(5)选择菌落大、表面突起的菌落，分别接种在含3ml液体发酵培养基的20ml试管中于30℃，200转/分钟培养24小时，测定菌液的OD600值，分别稀释到OD600值为1。然后分别吸取1mlOD600值为1的菌液到含20ml液体发酵培养基的250ml摇瓶中中进行发酵合成赤藓糖醇试验。每种菌落进行3次平行试验。发酵培养基的成分为：250g/L葡萄糖，10g/L酵母浸粉，5g/L胰蛋白胨，0.2g/L硫酸镁，1g/L磷酸二氢钾。发酵条件为：30℃，250转/分钟，pH起始为5.5。发酵120小时，检测赤藓糖醇含量(发酵过程中补充挥发失去的水)，选择合成赤藓糖醇能力最高的菌株作为出发菌株再进行诱变，依次重复5次，最终获得一株合成赤藓糖醇能力最高的突变菌株Yarrowia lipolytica BLC13，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.7326。
实施例2、在摇瓶中发酵合成赤藓糖醇试验
2.1解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13在液体培养基I中由葡萄糖合成赤藓糖醇试验
挑取一个Yarrowia lipolytica BLC13酵母单菌落(3天菌龄)接入含3ml液体发酵培养基I的20ml试管中于30℃，200转/分钟培养24小时。然后将该3ml培养液全部接入含25ml液体发酵培养基I的250ml底部带凹槽的摇瓶中发酵合成赤藓糖醇试验(底部带凹槽有利于增加溶氧量)。所述液体发酵培养基I的成分为：葡萄糖200g/L、酵母浸粉2g/L、磷酸氢二铵1g/L、硫酸镁0.2g/L、一水硫酸锰0.01g/L，五水硫酸铜0.005g/L，氯化锌0.002g/L，pH5.5。在25℃、200转/分钟条件下发酵，每隔5小时取样检测葡萄糖残留量与赤藓糖醇生成量，并补充挥发失去的水分，发酵到84小时时葡萄糖消耗完全，此时赤藓糖醇含量为112克/升，转化率为56％。
2.2解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13在液体培养基II中由葡萄糖合成赤藓糖醇试验
挑取一个Yarrowia lipolytica BLC13酵母单菌落(3天菌龄)接入含3ml液体发酵培养基II的20ml试管中于30℃，200转/分钟培养24小时。然后将该3ml培养液全 部接入含25ml液体发酵培养基II的250ml底部带凹槽的摇瓶中发酵合成赤藓糖醇试验(底部带凹槽有利于增加溶氧量)。所述液体发酵培养基II的成分为：葡萄糖400g/L、酵母浸粉10g/L、蛋白胨5g/L，玉米浆干粉5g/L，磷酸氢二铵5g/L，硫酸镁0.1g/L，一水硫酸锰0.02g/L，五水硫酸铜0.001g/L，硫酸锌0.002g/L，pH7.0。在30℃、250转/分钟条件下发酵，每隔5小时取样检测葡萄糖残留量与赤藓糖醇生成量，并补充挥发失去的水分，发酵到130小时时葡萄糖消耗完全，此时赤藓糖醇含量为218克/升，转化率为54.5％。
2.3解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13在液体培养基III中由葡萄糖合成赤藓糖醇试验
挑取一个Yarrowia lipolytica BLC13酵母单菌落(3天菌龄)接入含3ml液体发酵培养基III的20ml试管中于30℃，200转/分钟培养24小时。然后将该3ml培养液全部接入含25ml液体发酵培养基III的250ml底部带凹槽的摇瓶中发酵合成赤藓糖醇试验(底部带凹槽有利于增加溶氧量)。所述液体发酵培养基III的成分为：葡萄糖300g/L、酵母浸粉15g/L、酵母浸膏10g/L，玉米浆10g/L，硫酸镁0.2g/L、一水硫酸锰0.01g/L，五水硫酸铜0.002g/L，pH6.0。在35℃、300转/分钟条件下发酵，每隔5小时取样检测葡萄糖残留量与赤藓糖醇生成量，并补充挥发失去的水分，发酵到120小时时葡萄糖消耗完全，此时赤藓糖醇含量为164克/升，转化率为54.7％。
2.4解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13在液体培养基IV中由葡萄糖合成赤藓糖醇试验
挑取一个Yarrowia lipolytica BLC13酵母单菌落(3天菌龄)接入含3ml液体发酵培养基IV的20ml试管中于30℃，200转/分钟培养24小时。然后将该3ml培养液全部接入含25ml液体发酵培养基IV的250ml底部带凹槽的摇瓶中发酵合成赤藓糖醇试验(底部带凹槽有利于增加溶氧量)。所述液体发酵培养基IV的成分为：葡萄糖250g/L、酵母浸粉5g/L，玉米浆干粉5g/L，尿素1g/L，豆饼粉5g/L，棉籽饼粉2g/L，硫酸镁0.2g/L，一水硫酸锰0.02g/L，五水硫酸铜0.004g/L，pH3.1。在32℃、300转/分钟条件下发酵，每隔5小时取样检测葡萄糖残留量与赤藓糖醇生成量，并补充挥发失去的水分，发酵到120小时时葡萄糖消耗完全，此时赤藓糖醇含量为134克/升，转化率为53.6％。
2.5解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13在液体培养基V中由液体葡萄糖浆合成赤藓糖醇试验
挑取一个Yarrowia lipolytica BLC13酵母单菌落(3天菌龄)接入含3ml液体发酵培养基IV的20ml试管中于30℃，200转/分钟培养24小时。然后将该3ml培养液全部接入含25ml液体发酵培养基V的250ml底部带凹槽的摇瓶中发酵合成赤藓糖醇试验(底部带凹槽有利于增加溶氧量)。所述液体发酵培养基V的成分为：液体葡萄糖浆400g/L、酵母浸粉5g/L，蛋白胨5g/L，玉米浆干粉5g/L，尿素1g/L，豆饼粉5g/L，硫酸镁0.1g/L，一水硫酸锰0.01g/L，五水硫酸铜0.005g/L，氯化锌0.0005g/L，pH4.5。在32℃、300转/分钟条件下发酵，每隔5小时取样检测葡萄糖残留量与赤藓糖醇生成量，并补充挥发失去的水分，发酵到120小时时碳源消耗完全，此时赤藓糖醇含量为144克/升，由液体葡萄糖浆合成赤藓糖醇的转化率为36.0％。由于液体葡萄糖浆里面葡萄糖的含量为60％，因此折算成由葡萄糖合成赤藓糖醇的转化率为60％。
2.6解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13在液体培养基VI中由葡萄糖母液合成赤藓糖醇试验
挑取一个Yarrowia lipolytica BLC13酵母单菌落(3天菌龄)接入含3ml液体发酵培养基IV的20ml试管中于30℃，200转/分钟培养24小时。然后将该3ml培养液全部接入含25ml液体发酵培养基VI的250ml底部带凹槽的摇瓶中发酵合成赤藓糖醇试验(底部带凹槽有利于增加溶氧量)。所述液体发酵培养基V的成分为：葡萄糖母液400g/L、酵母浸粉5g/L，蛋白胨5g/L，玉米浆干粉5g/L，尿素1g/L，豆饼粉5g/L，硫酸镁0.1g/L，一水硫酸锰0.01g/L，五水硫酸铜0.005g/L，氯化锌0.0005g/L，pH4.5。在32℃、300转/分钟条件下发酵，每隔5小时取样检测葡萄糖残留量与赤藓糖醇生成量，并补充挥发失去的水分，发酵到120小时时碳源消耗完全，此时赤藓糖醇含量为137克/升，由葡萄糖母液合成赤藓糖醇的转化率为30.5％。由于液体葡萄糖浆里面葡萄糖的含量为65％，因此折算成由葡萄糖合成赤藓糖醇的转化率为52.7％。
上述2.1-2.6实施例中的发酵培养基在85℃处理30分钟，冷却后接入Yarrowia lipolytica BLC13酵母。
实施例3、在发酵罐中分批补料发酵或连续发酵合成赤藓糖醇
3.1解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13由葡萄糖合成赤藓糖醇试验-在150升发酵罐中补料发酵(a)
(1)斜面种子的培养：将Yarrowia lipolytica BLC13接种到含有70毫升固体培养基的茄形培养瓶中，在30℃生化培养箱中培养直到细胞长满培养基表面。固体培养基成分为(克/升)：葡萄糖300，酵母浸粉10，硫酸镁0.5，磷酸氢二铵5，玉米浆干 粉10，琼脂20，pH4.0，121℃灭菌20分钟。
(2)将Yarrowia lipolytica BLC13细胞从茄形培养瓶中洗下，转到1000毫升灭菌的三角瓶中，再转到含有90升发酵培养基的150升发酵罐中，发酵条件为：搅拌转速150转/分钟、溶解氧DO维持在20％以上、温度30℃、pH6.0。发酵培养基成分为(克/升)：葡萄糖200，酵母浸粉10，玉米浆干粉5，硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二铵5，一水硫酸锰0.02，五水硫酸铜0.005，盐酸硫胺素0.01，85℃处理30分钟。
(3)在发酵前期20～30小时时，细胞处于生长期，此时pH维持在5.5。当细胞密度(OD600值)达到20以上时，用柠檬酸调节pH至3.1，维持到发酵结束。
(4)当葡萄糖浓度低于150克/升时，补料加入高糖培养基，开始中期补料，维持葡萄糖浓度在150克/升～170克/升，维持10小时。高糖培养基成分(克/升)为：葡萄糖600，酵母粉20，玉米浆干粉20，85℃处理30分钟。10小时后停止补料继续发酵。
(5)当葡萄糖浓度低于50克/升时，再补料加入高糖培养基，开始后期补料，维持葡萄糖浓度在50克/升～70克/升，维持10小时。10小时后停止补料继续发酵直到葡萄糖含量小于1克/升，停止发酵，测定赤藓糖醇含量。
在此发酵过程中，总共消耗32公斤葡萄糖(起始发酵培养基含18公斤葡萄糖，加上中期与后期补料的14公斤葡萄糖)，发酵结束后总体积为95升(发酵过程中挥发较多的水分)，发酵液中赤藓糖醇的含量为213克/升，因此发酵液中总共含有20.2公斤的赤藓糖醇，转化率为63.2％。
3.2解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13由葡萄糖合成赤藓糖醇试验-在150升发酵罐中补料发酵(b)
(1)斜面种子的培养同实施例3.1。
(2)将Yarrowia lipolytica BLC13细胞从茄形培养瓶中洗下，转到1000毫升灭菌的三角瓶中，再转到含有90升发酵培养基的150升发酵罐中，发酵条件为：搅拌转速250转/分钟、溶解氧DO维持在20％以上、温度28℃、pH5.5。发酵培养基成分为(克/升)：葡萄糖280，酵母浸膏30，硫酸镁0.5，磷酸氢二铵3，一水硫酸锰0.01，五水硫酸铜0.002，盐酸硫胺素0.005，90℃处理30分钟。
(3)在发酵前期30小时时，细胞处于生长期，此时pH维持在6.5。当细胞密度(OD600值)达到20以上时，用柠檬酸调节pH至3.5，维持到发酵结束。
(4)当葡萄糖浓度低于150克/升时，补料加入高糖培养基，开始中期补料，维持 葡萄糖浓度在150克/升～170克/升，维持10小时。高糖培养基成分(克/升)为：葡萄糖500，酵母粉30，80℃处理30分钟。10小时后停止补料继续发酵。
(5)当葡萄糖浓度低于50克/升时，再补料加入高糖培养基，开始后期补料，维持葡萄糖浓度在50克/升～70克/升，维持10小时。10小时后停止补料继续发酵直到葡萄糖含量小于1克/升，停止发酵，测定赤藓糖醇含量。
在此发酵过程中，总共消耗38.2公斤葡萄糖(起始发酵培养基含25.2公斤葡萄糖，加上中期与后期补料的13公斤葡萄糖)，发酵结束后总体积为92升(发酵过程中挥发较多的水分)，发酵液中赤藓糖醇的含量为228克/升，因此发酵液中总共含有20.1公斤的赤藓糖醇，转化率为54.5％。
3.3解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13由葡萄糖合成赤藓糖醇试验-在30立方米发酵罐中补料发酵(a)
(1)斜面种子的培养同实施例3.1。
(2)将Yarrowia lipolytica BLC13细胞从茄形培养瓶中洗下，转到1000毫升灭菌的三角瓶中，再转到含有90升发酵培养基的150升发酵罐中培养得到一级种子，发酵条件为：搅拌转速250转/分钟、溶解氧DO维持在20％以上、温度28℃、pH4.5。
发酵培养基成分为(克/升)：葡萄糖400，酵母浸粉30，85℃处理30分钟。开始发酵，直到细胞生物量OD600达到25时转入2000升的发酵罐中继续发酵得到二级种子，2000升发酵罐含1600升发酵培养基，成分为(克/升)：葡萄糖300，酵母浸粉30，pH5.5，85℃处理30分钟。在2000升发酵罐开始发酵，发酵条件为32℃，pH5.5，搅拌转速120转/分钟，直到OD600达到20时转入30立方体积的发酵罐中继续发酵。30立方发酵罐中含有21立方的发酵培养基，成分为(克/升)：葡萄糖280，酵母浸粉5，玉米浆干粉10，硫酸镁0.5，磷酸氢二铵3，一水硫酸锰0.01，五水硫酸铜0.005，盐酸硫胺素0.01，85℃处理30分钟。发酵条件为30℃，pH6.0，搅拌转速100转/分钟，溶解氧DO在20％以上。
(3)在30立方发酵罐中发酵前30小时时，细胞处于生长期，此时pH用浓碱调节维持在6.0。当细胞密度(OD600值)达到25以上时，用柠檬酸调节pH至3.2，维持到发酵结束。
(4)当葡萄糖浓度低于150克/升时，补料加入高糖培养基，开始中期补料，维持葡萄糖浓度在150克/升～170克/升，维持10小时。高糖培养基成分(克/升)为：葡萄糖550，酵母粉15，玉米浆干粉25，85℃处理30分钟。10小时后停止补料继续发 酵。
(5)当葡萄糖浓度低于50克/升时，再补料加入高糖培养基，开始后期补料，维持葡萄糖浓度在50克/升～70克/升，维持15小时。高糖培养基成分(克/升)为：葡萄糖600，酵母粉10，85℃处理30分钟。15小时后停止补料继续发酵直到葡萄糖含量小于1克/升，停止发酵，测定赤藓糖醇含量。
在此发酵过程中，总共消耗8920公斤葡萄糖(起始发酵培养基含6420公斤葡萄糖，加上中期与后期补料的2500公斤葡萄糖)，发酵结束后总体积为26立方，发酵液中赤藓糖醇的含量为205克/升，发酵液中总共含有5330公斤的赤藓糖醇，转化率为59.75％。
3.4解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13由葡萄糖合成赤藓糖醇试验-在30立方米发酵罐中补料与分批发酵(b)
(1)斜面种子的培养同实施例3.1。
(2)将Yarrowia lipolytica BLC13细胞从茄形培养瓶中洗下，转到1000毫升灭菌的三角瓶中，再转到含有90升发酵培养基的150升发酵罐中培养得到一级种子，发酵条件为：搅拌转速250转/分钟、溶解氧DO维持在20％以上、温度32℃、pH5.0。发酵培养基成分为(克/升)：葡萄糖250，酵母浸粉15，酵母浸膏5，玉米浆干粉5，90℃处理30分钟，冷却至32℃。开始发酵，直到细胞生物量OD600达到25时转入2000升的发酵罐中继续发酵，2000升发酵罐含1600升发酵培养基中培养得到二级种子，成分为(克/升)：葡萄糖350，酵母浸粉10，玉米浆干粉10，磷酸二氢铵5，pH5.5，80℃处理30分钟，冷却至32℃。在2000升发酵罐开始发酵，发酵条件为32℃，pH5.5，搅拌转速120转/分钟，直到OD600达到25时转入30立方体积的发酵罐中继续发酵。30立方发酵罐中含有21立方的发酵培养基，成分为(克/升)：葡萄糖300，酵母浸粉5，酵母浸膏5，玉米浆干粉5，硫酸镁0.5，磷酸氢二铵3，一水硫酸锰0.01，五水硫酸铜0.005，85℃处理30分钟。发酵条件为30℃，起始pH6.0，搅拌转速120转/分钟，溶解氧DO在20％以上。
(3)在30立方发酵罐中发酵前30小时时，细胞处于生长期，此时pH用浓碱调节维持在5.0。当细胞密度(OD600值)达到30以上时，用柠檬酸调节pH至3.1，一直维持到发酵结束。
(4)当葡萄糖浓度低于150克/升时，补料加入高糖培养基，开始中期补料，维持葡萄糖浓度在150克/升～170克/升，维持10小时。高糖培养基成分(克/升)为：葡 萄糖600，酵母粉30，85℃处理30分钟。10小时后停止补料继续发酵。
(5)当葡萄糖浓度低于50克/升时，再补料加入高糖培养基，开始后期补料，维持葡萄糖浓度在50克/升～70克/升，维持10小时。高糖培养基成分同上所述(4)。10小时后停止补料继续发酵直到葡萄糖含量小于1克/升，停止发酵，测定赤藓糖醇含量。
在此发酵过程中，总共消耗9080公斤葡萄糖(起始发酵培养基含6880公斤葡萄糖，加上中期与后期补料的2200公斤葡萄糖)，发酵结束后总体积为26立方，发酵液中赤藓糖醇的含量为212克/升，发酵液中总共含有5512公斤的赤藓糖醇，转化率为60.7％。
然后从此30立方的发酵罐中放出13立方，补入13立方新藓的培养基(85℃处理30分钟)，成分为(克/升)：葡萄糖500，酵母粉15，玉米浆干粉10，硫酸镁0.2，磷酸氢二铵10，硫酸锰0.02。继续发酵，发酵条件为：温度30℃，pH3.1，搅拌转速120转/分钟，溶解氧DO在20％以上。发酵结束后，测定由葡萄糖合成赤藓糖醇的转化率为58.6％。
3.5解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13由葡萄糖合成赤藓糖醇试验-在30立方米发酵罐中连续发酵
(1)斜面种子的培养同实施例3.1。
(2)将Yarrowia lipolytica BLC13细胞从茄形培养瓶中洗下，转到1000毫升灭菌的三角瓶中，再转到含有90升发酵培养基的150升发酵罐中培养得到一级种子，发酵条件为：搅拌转速250转/分钟、溶解氧DO维持在20％以上、温度30℃、pH5.5。
发酵培养基成分为(克/升)：葡萄糖300，酵母浸粉10，玉米浆5，大豆饼粉5，85℃处理30分钟。开始发酵，直到细胞生物量OD600达到25时转入2000升的发酵罐中继续发酵得到二级种子，2000升发酵罐含1600升发酵培养基，成分为(克/升)：葡萄糖300，酵母浸粉15，pH5.5，85℃处理30分钟。在2000升发酵罐开始发酵，发酵条件为32℃，pH5.5，搅拌转速120转/分钟，直到OD600达到20时转入30立方体积的发酵罐中继续发酵。30立方发酵罐中含有21立方的发酵培养基，成分为(克/升)：葡萄糖280，酵母浸粉5，玉米浆干粉5，硫酸镁0.5，磷酸氢二铵3，一水硫酸锰0.01，五水硫酸铜0.005，盐酸硫胺素0.01，85℃处理30分钟。发酵条件为30℃，pH6.0，搅拌转速100转/分钟，溶解氧D0在20％以上。
(3)在30立方发酵罐中发酵前30小时时，细胞处于生长期，此时pH用浓碱调节维持在6.0。当细胞密度(OD600值)达到25以上时，用柠檬酸调节pH至3.1，维持到 发酵结束。
在此发酵过程中，总共消耗6387公斤葡萄糖，发酵结束后总体积为22立方，发酵液中赤藓糖醇的含量为165克/升，发酵液中总共含有3630公斤的赤藓糖醇，转化率为56.8％。
实施例4、分离纯化赤藓糖醇、并验证
4.1从发酵液中分离纯化赤藓糖醇
以上实施例2、3中任意发酵合成赤藓糖醇试验结束后，依次通过除菌、脱色、浓缩、结晶、精制的过程，可得到纯度99％以上的白色赤藓糖醇晶体。具体包括如下步骤：
步骤一、发酵结束后通过离心或者膜过滤的方法将酵母细胞与发酵液分离，得到澄清的发酵液I；
步骤二：将澄清的发酵液I通过纳滤的方法将分子量大于1000道尔顿的大分子粘性物质进行分离去除，得到澄清的发酵液II。
步骤三：在上述发酵液II中加入质量百分比为1％～5％的活性炭，在60℃～85℃条件下进行脱色，得到无色或者淡黄色的发酵液III；
步骤四：将步骤三得到的发酵液III在70℃以上浓缩到固形物含量为50％～70％，得到富含赤藓糖醇的糖浆，以2～5℃/h的速率冷却降温直到温度降到10℃以下，在起晶点温度下加入质量百分比为0.1～2％的赤藓糖醇晶体诱导成晶；
步骤五：采用离心的方法将晶体与糖浆分离，得到白色或者浅黄色的赤藓糖醇晶体与赤藓糖醇母液，晶体用温度为10℃以下的冷水清洗一次；
步骤六：将上述赤藓糖醇晶体重新精制；
精制的方法为：用去离子水溶解晶体，加入质量体积百分比为0.1％～5％的食品级活性炭，在60℃～85℃条件下搅拌脱色30分钟～3小时；板框过滤分离活性炭得到无色的赤藓糖醇糖液；再将该糖液浓缩到固形物为20％～30％，分别进行阴离子树脂(型号201)与阳离子树脂(型号001)离子交换，电导率降到100μs以下后再浓缩到固形物含量为50％～80％，得到富含赤藓糖醇的糖浆，以每小时2℃～5℃的速率冷却降温直到温度降到10℃以下，在起晶点温度(起晶点温度是指晶体开始形成时的温度，在此时外加入赤藓糖醇晶体有助于糖浆中的赤藓糖醇结晶形成)下加入质量百分比为0.1％～2％的赤藓糖醇晶体诱导成晶；
步骤七：采用离心的方法将晶体与糖浆分离，得到白色的赤藓糖醇晶体，晶体用温度为10℃以下的冷水清洗一次，干燥，得到白色的赤藓糖醇晶体；
步骤八：按照国家标准(GB26404-2011)的要求进行检验，合格后包装成品。
4.2产物的鉴定
为了验证本发明使用的菌株(Yarrowia lipolytica)BLC13由葡萄糖发酵合成的产物是真正的赤藓糖醇，进行了以下验证：
(1)高效薄层层析：将(Yarrowia lipolytica)BLC13酵母由葡萄糖发酵合成的产物与标准赤藓糖醇分别点样在硅胶板(烟台江友硅胶开发有限公司HSGF254型)上，利用展开剂进行层析，层析结束后先喷1％浓度的高碘酸，干燥后再喷0.5％的联苯胺显色。展开剂为：乙酸乙酯∶吡啶∶乙酸∶水＝5∶5∶3∶1。结果如图3所示。图3中1为(Yarrowia lipolytica)BLC13酵母由葡萄糖发酵合成的产物，图3中2为标准赤藓糖醇。结果表明，(Yarrowia lipolytica)BLC13酵母由葡萄糖发酵合成的产物与标准赤藓糖醇处于同一位置，二者的迁移率一致；
(2)高效液相色谱分析(HPLC)：将Yarrowia lipolytica BLC13酵母由葡萄糖发酵合成精制的产物与标准赤藓糖醇分别进行高效液相分析，二者的保留时间基本一致，均为14.2分钟。当把Yarrowia lipolytica BLC13酵母由葡萄糖发酵合成精制的产物与标准赤藓糖醇混合在一起进行HPLC分析，峰的高度增高，结果如图4所示。图4A为Yarrowia lipolytica BLC13酵母由葡萄糖发酵合成精制的产物的HPLC分析图，图4B为标准赤藓糖醇的HPLC分析图，图4C为二者1∶1混合在一起的HPLC分析图(混合前二者浓度均为30克/升)。而其它多元醇(如甘油、木糖醇、山梨醇、阿拉伯糖醇、甘露醇、核糖醇)保留时间均不在14分钟。
(3)熔点的测定：采用梅特勒-托利多熔点仪分别测定Yarrowia lipolytica BLC13酵母由葡萄糖发酵合成的产物与标准赤藓糖醇的熔点，结果显示二者的熔点均为126℃。
根据以上验证结果，解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13由葡萄糖发酵合成的产物是真正的赤藓糖醇。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)BLC13CGMCC NO.7326。
2.一种如权利要求1所述的解脂亚罗酵母菌株在合成赤藓糖醇中的用途。
3.一种将如权利要求1所述的解脂亚罗酵母菌株用于合成赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A、将解脂亚罗酵母菌种(Yarrowia lipolytica)BLC13CGMCC NO.7326接种于含碳源、氮源、无机盐和水的发酵培养基中进行培养发酵；
B、发酵结束后，从发酵液中提纯赤藓糖醇。
4.如权利要求3所述的将解脂亚罗酵母菌株用于合成赤藓糖醇的方法，其特征在于，步骤A中，所述碳源为固体葡萄糖、液体葡萄糖浆、淀粉水解液、葡萄糖母液中的一种或多种，碳源用量为100～400克/升。
5.如权利要求3所述的将解脂亚罗酵母菌株用于合成赤藓糖醇的方法，其特征在于，步骤A中，所述氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵、尿素、豆饼粉、棉籽饼粉中的一种或几种的混合，氮源用量为2～35克/升。
6.如权利要求3所述的将解脂亚罗酵母菌株用于合成赤藓糖醇的方法，其特征在于，步骤A中，所述无机盐为硫酸镁、硫酸锰、氯化锰、硫酸铜、氯化铜、硫酸锌、氯化锌中的一种或几种，无机盐用量为0～2.5克/升。
7.如权利要求3所述的将解脂亚罗酵母菌株用于合成赤藓糖醇的方法，其特征在于，步骤A中，发酵前期pH值为5.0～7.0，发酵至细胞密度OD600值为20或以上时，用酸调节pH值为3.1～4.0，发酵温度为25℃～35℃。
8.如权利要求3所述的将解脂亚罗酵母菌株用于合成赤藓糖醇的方法，其特征在于，步骤A中，所述接种具体为：将所述发酵培养基在80～90℃的温度下处理20～40分钟，冷却后再接入所述解脂亚罗酵母菌株进行发酵培养。
9.如权利要求3所述的将解脂亚罗酵母菌株用于合成赤藓糖醇的方法，其特征在于，步骤A中，所述培养发酵后还包括如下步骤：经扩大培养，转入生产发酵培养基中进行连续发酵或分批补料发酵合成赤藓糖醇；所述生产发酵培养基具有和所述发酵培养基一样的组分配方。
10.如权利要求9所述的将解脂亚罗酵母菌株用于合成赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述连续发酵是指在整个发酵过程中不补料，一直发酵到结束；所述分批补料发酵具体为在发酵过程中分批补入高糖培养基，每升所述高糖培养基包含如下组分：碳源500～600g，氮源10～40g；所述碳源为固体葡萄糖、液体葡萄糖浆、葡萄糖母液中的一种或多种；所述氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵、尿素、豆饼粉、棉籽饼粉中的一种或几种的混合。
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