CN114634952A - 提高赤藓糖醇产率和糖醇转化率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品生物技术领域，公开了一种提高赤藓糖醇产率和糖醇转化率的方法。所述方法包括将解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)接种至发酵培养基中，进行发酵培养，获得赤藓糖醇发酵液，其中，所述发酵培养基中含有锰补充剂，或者，在培养过程中包括向发酵培养体系中添加锰补充剂步骤。本发明提供的方法能够提高糖醇转化率，在较短的发酵周期内获得较高产量的赤藓糖醇，从而提高了赤藓糖醇的产率。

Description

提高赤藓糖醇产率和糖醇转化率的方法
技术领域
本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及一种提高赤藓糖醇产率和糖醇转化率的方法。
背景技术
1,2,3,4-丁四醇，又称赤藓糖醇，是一种天然糖醇，其甜度为蔗糖的70-80％，甜味纯正且具有清凉感，稳定性和结晶性好，且热量仅为蔗糖的10％左右。此外，研究还发现，赤藓糖醇虽然具有较高的人体耐受性，但是其本身无法被人体分解代谢，食用后不会产生血糖变化，可以作为功能性甜味剂而替代蔗糖使用。工业生产上，主要采用的方法是以葡萄糖为原料进行微生物发酵转化获得赤藓糖醇，虽然已经能够实现赤藓糖醇的规模化生产，但是目前的发酵工艺中糖醇转化率和产率较低，使得生产成本较高，不利于赤藓糖醇的推广。
为了提高赤藓糖醇的转化率和产量，目前主要采用的方法包括在培养过程中进行补料、调节发酵液渗透压、pH以及培养温度等。例如CN104694585A中采用在发酵过程中流加碳源和氮源以及无机盐的方式来提高赤藓糖醇的产量，发酵周期约为170-190h，转化率在50％以上，赤藓糖醇产量在180g/L左右。然而该方法的发酵周期较长，赤藓糖醇产率低，且转化率也有待提高。又例如，CN110564782A中采用一次性加料的方式进行赤藓糖醇发酵，通过对发酵过程中的温度、pH以及种子液的接种量进行调整的方式来提高赤藓糖醇的转化率，获得发酵周期100h左右，产率14％以上，转化率50％以上的效果。虽然其发酵周期较短，但是产率和转化率仍有待提高。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的赤藓糖醇发酵生产过程中转化率较低，且生产周期过长的问题，提供一种提高赤藓糖醇产率和糖醇转化率的方法。该方法具有赤藓糖醇产率高、糖醇转化率高的优点。
为了实现上述目的，本发明提供一种提高赤藓糖醇产率和糖醇转化率的方法，所述方法包括将解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)接种至发酵培养基中，进行发酵培养，获得赤藓糖醇发酵液，其中，所述发酵培养基中含有锰补充剂，或者，在培养过程中包括向发酵培养体系中添加锰补充剂步骤。
通过上述技术方案，本发明能够取得如下有益效果：
(1)本发明提供的方法的糖醇转化率较高，发酵周期较短，有效提高了赤藓糖醇的产率；
(2)本发明提供的方法在发酵过程中仅需进行(一次性)少量补糖或无需补糖，相比现有技术中大量补加培养基或长时间流加培养基的方式而言，在提高糖醇转化率的同时降低了杂菌污染的风险。
生物保藏
本发明中的解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)于2021年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.22632。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明的发明人在研究的过程中巧妙地发现，在利用微生物(例如产赤藓糖醇的酵母等)进行赤藓糖醇发酵生产过程中，在培养体系内加入锰补充剂(例如含锰元素的(复合)盐)可以有效提高赤藓糖醇的产率和糖醇转化率。通过进一步地研究，发明人还发现，锰补充剂无论是直接添加于培养基中，还是在发酵过程中加入培养体系内，均能获得上述提高赤藓糖醇产率和糖醇转化率的效果。
本发明提供一种提高赤藓糖醇产率和糖醇转化率的方法，所述方法包括将解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)接种至发酵培养基中，进行发酵培养，获得赤藓糖醇发酵液，其中，所述发酵培养基中含有锰补充剂，或者，在培养过程中包括向发酵培养体系中添加锰补充剂步骤。
发明人在研究的过程中发现两株解脂亚罗酵母菌株(CGMCC No.22632和CICC33063)具有较高的糖醇转化率和赤藓糖醇产量，结合本发明提供的方法，能够进一步提高赤藓糖醇整体生产效率和产量。
本发明提供的方法中，对于所述解脂亚罗酵母没有特别限制，只要是能够发酵生产赤藓糖醇的解脂亚罗酵母均可适用于本发明提供的方法。为了进一步提高赤藓糖醇的产量和整体生产效率，根据本发明的优选实施方式，其中，所述解脂亚罗酵母为保藏编号为CGMCC No.22632的解脂亚罗酵母和/或保藏编号为CICC 33063的解脂亚罗酵母。
本发明的发明人在研究的过程中还意外地发现，在进行赤藓糖醇发酵生产时，若采用解脂亚罗酵母CGMCC No.22632作为生产菌株，不仅能够获得较高的赤藓糖醇产量和糖酸转化率，而且，副产物(甘露醇、阿拉伯糖醇、甘油等)的产量也较少。经过进一步地实验还发现，解脂亚罗酵母CGMCC No.22632本身不消耗赤藓糖醇，从而相比于其他菌株而言进一步保证了赤藓糖醇的产量。另外，该菌株在生产过程中的泡沫产生量较少，能够有效避免生产过程中的“喷罐”问题，确保了生产的顺利进行，并且还保证了生产过程的安全性和产品的品质。此外，该菌株进行赤藓糖醇发酵生产时，产生的发酵液进行浓缩后，浓缩液中的杂质含量也较少，尤其是富含脂质成分的杂质较少，不仅对后续的结晶分离等工艺较为友好，而且结晶收率和一次结晶产品的纯度也较高。
基于上述发现，根据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，所述酵母选自保藏编号为CGMCC No.22632的解脂亚罗酵母。
本发明中，对于发酵培养基中(除可能含有的锰补充剂外的其他)成分的选择和含量没有特别限定，任意本领域现有的，利用解脂亚罗酵母进行赤藓糖醇发酵生产的培养基均可适用于本发明提供的方法。为了进一步提高赤藓糖醇的产率和/或糖醇转化率，根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵培养基包括：葡萄糖200-400g/L，酵母膏2-10g/L，酵母粉0-5g/L，磷酸二氢钾0.3-1.2g/L，柠檬酸铵2-8g/L，硫酸镁0.5-3g/L，0.3-1mL/L的吐温80。
优选地，所述发酵培养基包括：葡萄糖280-380g/L，酵母膏5-10g/L，酵母粉3-5g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，柠檬酸铵5-7g/L，硫酸镁1-2g/L，0.5-1mL/L的吐温80。
本发明中，优选采用中试以上水平的培养规模进行所述发酵培养。例如可以选用1L以上的发酵罐进行所述发酵培养。
优选地，所述发酵培养体系中，装液量不超过容器(例如发酵罐)总容积的70％。优选装液量为容器总容积的50-70％。更优选为55-60％。所述“装液量”为发酵培养体系的总体积，其包括发酵培养基以及加入培养基中的菌液、锰补充剂以及(可能存在的)补料等所有物料的体积总和。
本发明中，对于发酵培养的条件没有特别限制，只要是适用于解脂亚罗酵母进行赤藓糖醇发酵生产的条件均可适用于本发明。为了进一步提高赤藓糖醇的产率和/或糖醇转化率，根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵培养的条件包括：温度28-35℃，接种量使得发酵培养体系中解脂亚罗酵母的初始OD600值为0.3-0.9，通气量0.5-1.5vvm，培养体系溶氧量为20-30％，搅拌转速200-1000rpm，至发酵体系中葡萄糖含量低于0.03g/L时停止发酵，获得所述赤藓糖醇发酵液。
所述“搅拌转速”是指在发酵培养的全过程中，培养体系中搅拌转速的最低转速和最高转速之间的范围。由于在发酵培养过程中，发酵体系中的溶氧量以及菌体、发酵底物(培养基)和产物的分布情况等随时发生着变化，为了尽可能提高赤藓糖醇的生产效率和产量，优选随着发酵过程中发酵体系的变化而相应调整搅拌转速。因此，本发明提供的方法中，搅拌转速是在一定范围内(优选200-1000rpm范围内)浮动变化的。这种搅拌转速的变化可以通过对发酵装置(例如发酵罐等)的发酵程序进行设置实现自动控制。或者，也可以通过在发酵过程中，定时或不定时对发酵体系中的指标参数(例如溶氧量、底物含量、菌体生长情况等)进行抽样检测，根据检测结果进行人工调整和控制。
所述“通气量”是指在发酵过程中，通气量的浮动范围。基于与上述搅拌转速相同或类似的原因，本发明提供的方法中，通气量也随之发酵过程的进行在一定范围内(优选在0.5-1.5vvm范围内)浮动变化。这种变化也可以通过与上述对搅拌转速进行控制时相同的方式实现控制。
本发明中，为了能够提高发酵效率，根据本发明的优选实施方式，其中，在将所述解脂亚罗酵母接种至发酵培养基中之前，先对其进行活化。
任意本领域现有的菌株活化方法均可适用于本发明。根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述活化可以采用如下方式进行：将解脂亚罗酵母接种至种子培养基中，进行种子(活化)培养，获得解脂亚罗酵母活化液。
优选地，所述种子培养采用小规模培养体系进行。例如(100-500mL)摇瓶培养体系等。优选所述种子培养体系中，种子培养基的添加量为培养体系总体积的10-22体积％。更优选为15-20体积％。
优选地，所述种子培养基包括：葡萄糖20-100g/L，酵母膏10-20g/L，柠檬酸铵2-10g/L。
更优选地，所述种子培养基包括：葡萄糖40-80g/L，酵母膏15-18g/L，柠檬酸铵5-7g/L。
优选地，所述种子培养的条件包括：(摇床)转速150-250rpm，温度28-32℃，时间20-26h。
更优选地，所述种子培养的条件包括：(摇床)转速180-200rpm，温度29-32℃，时间22-24h。
优选地，所述解脂亚罗酵母活化液中，解脂亚罗酵母的OD600值达到3以上。更优选OD600值达到5以上。
任意能够为发酵体系提供锰元素，且对解脂亚罗酵母的生长和赤藓糖醇发酵过程没有不利影响的化合物(例如含锰元素的(复合)盐)，均可作为锰补充剂而适用于本发明提供的方法中。根据本发明的优选实施方式，其中，所述锰补充剂为水溶性锰盐或水溶性锰盐和磷酸氢二钠的混合物。
任意对解脂亚罗酵母的生长和赤藓糖醇发酵过程没有不利影响的水溶性锰盐均可适用于本发明。优选地，所述水溶性锰盐选自硫酸锰和/或氯化锰。
本发明中，对于锰补充剂的用量没有特别限制，只要能够达到提高赤藓糖醇的产率和糖醇转化率的目的即可。根据本发明的优选实施方式，其中，所述锰补充剂的用量使得发酵体系中所述锰补充剂的总浓度为0.2-1mM。例如，所述锰补充剂为一种化合物(例如前述水溶性锰盐中的一种)时，所述“锰补充剂的总浓度”即为该化合物在发酵体系中的终浓度。又例如，所述锰补充剂为两种或两种以上的化合物(例如前述水溶性锰盐与磷酸氢二钠)组成的混合物时，所述“锰补充剂的总浓度”即为这些化合物在发酵体系中的终浓度的总和。
本发明中，优选所述锰补充剂为含有两种或两种以上(前述优选)化合物的混合物。对于所述锰补充剂中各成分的含量，本发明没有特别限制，只要能够达到提高赤藓糖醇的产率和糖醇转化率的目的即可。
为了获得更好的对赤藓糖醇产率和/或糖醇转化率的提高效果，根据本发明的一种优选实施方式，其中，当所述锰补充剂为(一种)水溶性锰盐和磷酸氢二钠的混合物时，所述锰补充剂中，水溶性锰盐和磷酸氢二钠的含量使得发酵体系中水溶性锰盐和磷酸氢二钠的摩尔浓度比为0.3-1:1，其中所述水溶性锰盐为硫酸锰或氯化锰。
根据本发明的另一种优选实施方式，其中，当所述锰补充剂为硫酸锰、氯化锰和磷酸氢二钠的混合物时，所述锰补充剂中，硫酸锰、氯化锰和磷酸氢二钠的含量使得发酵体系中硫酸锰、氯化锰和磷酸氢二钠的摩尔浓度比为0.3-1:0.3-1:1。
根据本发明的另一种优选实施方式，其中，当所述锰补充剂为硫酸锰和氯化锰的混合物时，所述锰补充剂中，硫酸锰和氯化锰的含量使得发酵体系中硫酸锰和氯化锰的摩尔浓度比为0.3-1:0.3-1。
本发明提供的方法中，所述锰补充剂可以在发酵培养过程中任意时刻(一次性)加入发酵体系中。为了获得更高的赤藓糖醇产率和/或糖醇转化率，根据本发明的优选实施方式，其中，在培养过程中包括向发酵培养体系中添加锰补充剂时，所述锰补充剂于发酵培养开始后30h以内加入发酵体系中。所述“发酵培养开始后30h以内”包括在将菌株接种至发酵培养基中后(即发酵开始后)，30h之内的任意时间点(例如发酵开始后1h、5h、10h、15h、18h、20h、25h、30h，或其中的任意两点的中间值)。也包括将菌株接种至发酵培养基中时(发酵开始后0h，也即将菌株与锰补充剂同时加入培养基中)。
优选地，所述锰补充剂于发酵培养开始后24h以内加入发酵体系中。
本发明的发明人在研究的过程中发现，当采用发酵过程中(不包括发酵开始后0h)添加锰补充剂的方式，且发酵培养基中的葡萄糖含量低于一定水平时，在加入锰补充剂的同时，补加一定的糖补料，能够大幅提高赤藓糖醇的产量和产率。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述方法还包括：当在培养过程中(不包括发酵开始后0h)向发酵培养体系中添加锰补充剂，且采用的发酵培养基中葡萄糖含量低于250g/L时，在加入锰补充剂时向发酵体系内同时加入糖补料。
所述糖补料的作用在于补充发酵体系中的葡萄糖，对于添加的葡萄糖的具体形式没有特别限定。为了方便操作(例如灭菌、补料等)，同时对培养体系的总体积不造成过大影响，优选地，所述糖补料为70-90重量％的葡萄糖水溶液。
本发明中，对于所述糖补料的补加量没有特别限定，只要能够达到提高赤藓糖醇产量和产率，同时不会过大影响发酵体系的总体积即可。根据本发明的优选实施方式，其中，所述糖补料的添加量使得发酵过程中，葡萄糖的总用量为400-500g/L。所述“葡萄糖的总用量”即为发酵过程中消耗的葡萄糖总量(培养基中的葡萄糖与糖补料中的葡萄糖之和，g)，以最终的发酵体系体积(即发酵液体积，L)为基准，计算获得的葡萄糖单位投加量(g/L)。
优选地，所述糖补料的添加量使得发酵过程中，葡萄糖的总用量为450-500g/L。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述葡萄糖补料的料液浓度不低于600g/L，优选为700-850g/L。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
以下实施例中，未进行特殊说明的情况下，采用的试剂均购自正规化学品供应商，纯度为分析纯。
以下实施例中，进行培养基(种子培养基、发酵培养基等)配制时，为了防止培养基中的葡萄糖与氮源发生美拉德反应，葡萄糖与培养基中其他成分分开溶解和灭菌，待灭菌后的溶液冷却后再混合作为培养基使用。溶解葡萄糖和培养基中其他成分的去离子水用量之和使得各成分达到各实施例中采用的培养基中的终浓度。
以下实施例中，未进行特殊说明的情况下，通气量均指向培养体系中通入无菌空气的量。
实施例1
本实施例用于说明解脂亚罗酵母CGMCC No.22632的获得、菌株特性研究和保藏。
(一)菌株的获得
本发明的发明人在研究过程中，于我国怀涿盆地沙城产区自然发酵的酿酒葡萄醪中分离获得一株酵母菌株CoY1，经生理生化特征以及26s rDNA检测确认该菌株为解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)。经过对菌株CoY1进行常压室温等离子体诱变和紫外照射诱变，获得诱变菌株CoY1-M1。
(二)菌株特性研究
活化培养基：葡萄糖150g/L，酵母膏15g/L，磷酸二氢钾0.5g/L。
发酵培养基：葡萄糖315g/L，酵母浸粉5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸铵5g/L，pH 6。
发酵液(上清)中葡萄糖的浓度使用SBA-40E型生物传感器进行检测，D-葡萄糖酶膜，进样量25μL。
取保藏的CoY1和CoY1-M1甘油菌(保存在甘油中的解脂亚罗酵母，活菌数为107CFU/mL)按3‰(v/v)接种量分别接种至活化培养基，30℃下，200rpm培养20h，按10％(v/v)接种量将菌液接种至含有发酵培养基的5L发酵罐，定时取样进行检测(发酵初期每隔12h取样检测葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度估算发酵速率，根据葡萄糖浓度和发酵速率判断发酵终点即耗尽葡萄糖，在发酵终点前12h每隔0.5h取样检测葡萄糖浓度)。接种后发酵罐的装液量为60体积％，发酵温度控制32℃，转速为200-800rpm，通气量为0.5-1vvm(L/min·L)，使溶氧量控制在20-25vol％。CoY1-M1于92h耗尽葡萄糖，CoY1发酵120h后，葡萄糖浓度仍有100g/L左右，继续延长发酵时间葡萄糖浓度下降变缓慢因此终止发酵。CoY1-M1发酵终点(耗尽葡萄糖)赤藓糖醇含量189.3g/L，甘露醇含量为0.39g/L，阿拉伯糖醇、甘油未检出。CoY1-M1发酵液下罐后室温密闭放置1天后取样检测，赤藓糖醇含量无明显变化(含量上升不超过0.5g/L)，而甘露醇含量降低至0.05g/L；继续放置到7天再取样检测，赤藓糖醇仍无明显变化，甘露醇基本检测不到。该菌株具有副产物少、不利用赤藓糖醇的优点。在实验过程中还发现，CoY1-M1的泡沫产生量较少，从而不存在发酵过程中泡沫过多导致的喷罐等问题，确保了生产安全和产品质量，十分利于工业生产使用。
将CoY1-M1的发酵液采用离心—微滤—纳滤工艺进行处理，即先对发酵液进行离心，离心后的发酵液上清先后经过微滤、纳滤。处理工艺的条件为：离心4000rpm，15min，25℃；微滤使用陶瓷膜，操作压力0.15MPa，温度30℃；纳滤截留分子量250-300Da，操作压力1MPa，温度30℃。CoY1-M1发酵液单位时间微滤透过截留体积比为80％，单位时间纳滤透过截留体积比为75％。CoY1-M1发酵液纳滤浓缩侧液体较少，并且浓缩后杂质较少，尤其是没有富含脂质的白色粘稠杂质，对后续结晶分离更为友好，而且结晶收率和一次结晶产品纯度较高。经综合评估，CoY1-M1为一株适合用于生产赤藓糖醇的菌株。
(三)菌株的保藏
解脂亚罗酵母诱变菌株CoY1-M1于2021年05月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.22632。
实施例2
种子培养基：按照终浓度为葡萄糖40g/L，酵母膏15g/L，柠檬酸铵5g/L的用量，称取培养基原料，溶于去离子水中。121℃高压灭菌20min。
发酵培养基：按照终浓度为葡萄糖280g/L，酵母膏5g/L，酵母粉3g/L，柠檬酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁1g/L，吐温80为0.5mL/L的用量，称(量)取培养基原料，溶于去离子水中。121℃高压灭菌20min。
锰补充剂(水溶液)：硫酸锰0.3mM+氯化锰0.3mM+磷酸氢二钠0.5mM，总浓度1.1mM。
(1)活化(250mL摇瓶体系，培养基37.5mL，甘油菌液112.5μL)
将甘油保存的解脂亚罗酵母CGMCC No.22632接种至种子培养基中，接种量为8体积‰。在30℃，摇床转速180rpm条件下培养24h。获得解脂亚罗酵母活化液(3瓶)，经检测，活化液中解脂亚罗酵母的OD600值为6.3。
(2)发酵培养(采用购自赛多利斯公司的BIOSTATB型号2L发酵罐，装液量1.1L)
按照10体积％的接种量，将解脂亚罗酵母活化液接种至发酵培养基中，接种的同时加入锰补充剂。
设置发酵条件包括：温度32℃；初始通气量0.5vvm，发酵过程中通气量浮动范围为0.5-1vvm；初始搅拌转速200rpm，发酵过程中搅拌转速浮动范围为200-1000rpm；发酵体系溶氧量25±3％，并通过控制通气量和搅拌转速使得全程溶氧量保持在该水平。
当发酵体系中葡萄糖含量低于0.03g/L时停止发酵，记录发酵周期。
实施例3
种子培养基：按照终浓度为葡萄糖60g/L，酵母膏16g/L，柠檬酸铵6g/L的用量，称取培养基原料，溶于去离子水中。121℃高压灭菌20min。
发酵培养基：按照终浓度为葡萄糖380g/L，酵母膏10g/L，酵母粉5g/L，柠檬酸铵7g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁2g/L，吐温80为1mL/L的用量，称(量)取培养基原料，溶于去离子水中。121℃高压灭菌20min。
锰补充剂(水溶液)：硫酸锰0.8mM+氯化锰0.5mM，总浓度1.3mM。121℃高压灭菌20min。
(1)活化(250mL摇瓶体系，培养基45mL，甘油菌液180μL)
将甘油保存的解脂亚罗酵母CGMCC No.22632接种至种子培养基中，接种量为5体积‰。在31℃，摇床转速190rpm条件下培养20h。获得解脂亚罗酵母活化液(3瓶)，经检测，活化液中解脂亚罗酵母的OD600值为5.7。
(2)发酵培养(采用购自赛多利斯公司的BIOSTATB型号2L发酵罐，装液量1.2L)
按照10体积％的接种量，将解脂亚罗酵母活化液接种至发酵培养基中，发酵24h时(一次性)加入锰补充剂。
设置发酵条件包括：温度30℃；初始通气量0.5vvm，发酵过程中通气量浮动范围为0.5-1vvm；初始搅拌转速300rpm，发酵过程中搅拌转速浮动范围为200-1000rpm；发酵体系溶氧量30±5％，并通过控制通气量和搅拌转速使得全程溶氧量保持在该水平。
当发酵体系中葡萄糖含量低于0.03g/L时停止发酵，记录发酵周期。
实施例4
种子培养基：按照终浓度为葡萄糖80g/L，酵母膏18g/L，柠檬酸铵7g/L的用量，称取培养基原料，溶于去离子水中。121℃高压灭菌20min。
发酵培养基和锰补充剂(水溶液)均与实施例3中相同。
(1)活化(250mL摇瓶，每瓶加入培养基50mL，甘油菌液250μL)
将甘油保存的解脂亚罗酵母CGMCC No.22632接种至种子培养基中，接种量为7体积‰。在32℃，摇床转速200rpm条件下培养22h。获得解脂亚罗酵母活化液(3瓶)，经检测，活化液中解脂亚罗酵母OD600为5.9。
(2)发酵培养(采用购自赛多利斯公司的BIOSTAT B型号2L发酵罐，装液量1.2L)
按照10体积％的接种量，将解脂亚罗酵母活化液接种至发酵培养基中，发酵12h时(一次性)加入锰补充剂。
设置发酵条件包括：温度30℃；初始通气量0.5vvm，发酵过程中通气量浮动范围为0.5-1vvm；初始搅拌转速300rpm，发酵过程中搅拌转速浮动范围为200-1000rpm；发酵体系溶氧量30±5％，并通过控制通气量和搅拌转速使得全程溶氧量保持在该水平。
当发酵体系中葡萄糖含量低于0.03g/L时停止发酵，记录发酵周期。
实施例5
种子培养基与实施例2中相同。
发酵培养基：按照终浓度为葡萄糖200g/L，酵母膏10g/L，酵母粉5g/L，柠檬酸铵7g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁2g/L，吐温80为1mL/L的用量，称(量)取培养基原料，溶于去离子水中。121℃高压灭菌20min。
锰补充剂(水溶液)：硫酸锰0.8mM+氯化锰0.2mM+磷酸氢二钠0.5mM，总浓度1.5mM。121℃高压灭菌20min。
糖补料：80重量％葡萄糖水溶液。121℃高压灭菌20min。
(1)活化
采用与实施例2中相同的活化方式。
(2)发酵培养(采用购自赛多利斯公司的BIOSTAT B型号2L发酵罐，装液量1.2L)
按照10体积％的接种量，将解脂亚罗酵母活化液接种至发酵培养基中，发酵24h时(一次性)加入锰补充剂，同时加入525mL糖补料(发酵过程中葡萄糖总用量为480/L)。
设置发酵条件包括：温度30℃；初始通气量0.5vvm，发酵过程中通气量浮动范围为0.5-1vvm；初始搅拌转速300rpm，发酵过程中搅拌转速浮动范围为200-1000rpm；发酵体系溶氧量30±5％，并通过控制通气量和搅拌转速使得全程溶氧量保持在该水平。
当发酵体系中葡萄糖含量低于0.03g/L时停止发酵，记录发酵周期。
实施例6
采用实施例3中的方法进行赤藓糖醇发酵，不同之处在于，于发酵48h时加入锰补充剂。
实施例7
采用实施例5中的方法进行赤藓糖醇发酵，不同之处在于，采用0.5mM硫酸锰水溶液作为锰补充剂。
实施例8
采用实施例5中的方法进行赤藓糖醇发酵，不同之处在于，加入锰补充剂时不添加糖补料。
实施例9
采用实施例5中的方法进行赤藓糖醇发酵，不同之处在于，糖补料的添加量为530mL/糖补料为85重量％的葡萄糖水溶液。
实施例10
采用实施例3中的方法进行赤藓糖醇发酵，不同之处在于，采用1.3mM硫酸锰水溶液作为锰补充剂。
实施例11
采用实施例3中的方法进行赤藓糖醇发酵，不同之处在于，采用解脂亚罗酵母CICC33063(购自CICC)作为发酵菌株。
实施例12
采用实施例2中的方法进行赤藓糖醇发酵，不同之处在于，采用如下锰补充剂：
锰补充剂(水溶液)：硫酸锰0.1mM+氯化锰0..05mM+磷酸氢二钠0.5mM，总浓度0.65mM。121℃高压灭菌20min。
实施例13
采用实施例2中的方法进行赤藓糖醇发酵，不同之处在于，采用如下锰补充剂：
锰补充剂(水溶液)：硫酸锰0.8mM+氯化锰0.8mM+磷酸氢二钠0.5mM，总浓度2.1mM。121℃高压灭菌20min。
实施例14
采用实施例2中的方法进行赤藓糖醇发酵，不同之处在于，采用如下锰补充剂：
锰补充剂(水溶液)：硫酸锰0.8mM+氯化锰0.6mM+磷酸氢二钠0.1mM，总浓度1.5mM。121℃高压灭菌20min。
对比例1
采用实施例2中的方法进行赤藓糖醇发酵，不同之处在于，发酵体系中不添加锰补充剂。
对比例2
采用实施例2中的方法进行赤藓糖醇发酵，不同之处在于，采用钠补充剂替换实施例2中使用的锰补充剂。
钠补充剂(水溶液)：硫酸钠0.3mM+氯化钠0.3mM+磷酸氢二钠0.5mM，总浓度1.1mM。121℃高压灭菌20min。
测试例1
采用HPLC方法/安捷伦公司1260Infinity II检测以上实施例和对比例获得的发酵液中赤藓糖醇的含量，并通过以下公式计算糖醇转化率和赤藓糖醇产率。结果详见表1。
糖醇转化率＝(发酵液中赤藓糖醇的含量/发酵体系总葡萄糖消耗量)×100％
赤藓糖醇产率＝[(发酵液中赤藓糖醇的含量×发酵液体积)/发酵周期]×100％
表1
编号 发酵周期/h 赤藓糖醇含量/g·L<sup>-1</sup> 糖醇转化率/％ 产率/g·L<sup>-1</sup>·h<sup>-1</sup>
实施例2 76 177.52 63.4 2.34
实施例3 110.5 236.36 62.2 2.14
实施例4 111.5 238.64 62.8 2.14
实施例5 135.6 294.2 61.3 2.17
实施例6 123 226 59.5 1.84
实施例7 140.5 285.6 59.1 2.03
实施例8 57.5 120.2 60.1 2.09
实施例9 176 292.5 58.5 1.66
实施例10 114 229.9 60.5 2.02
实施例11 111 232.56 61.2 2.10
实施例12 85 165.76 59.2 1.95
实施例13 85 164.64 58.8 1.94
实施例14 90 163.52 58.4 1.81
对比例1 90 162.9 58.2 1.81
对比例2 85 159.32 56.9 1.87
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种提高赤藓糖醇产率和糖醇转化率的方法，其特征在于，所述方法包括将解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)接种至发酵培养基中，进行发酵培养，获得赤藓糖醇发酵液，其中，所述发酵培养基中含有锰补充剂，或者，在培养过程中包括向发酵培养体系中添加锰补充剂步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述解脂亚罗酵母为保藏编号为CGMCC No.22632的解脂亚罗酵母和/或保藏编号为CICC 33063的解脂亚罗酵母。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述发酵培养基包括：葡萄糖200-400g/L，酵母膏2-10g/L，酵母粉0-5g/L，磷酸二氢钾0.3-1.2g/L，柠檬酸铵2-8g/L，硫酸镁0.5-3g/L，0.3-1mL/L的吐温80。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵培养的条件包括：温度28-35℃，接种量使得发酵培养体系中解脂亚罗酵母的初始OD600值为0.3-0.9，通气量0.5-1.5vvm，培养体系溶氧量为20-30％，搅拌转速200-1000rpm，至发酵体系中葡萄糖含量低于0.03g/L时停止发酵，获得所述赤藓糖醇发酵液。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述锰补充剂为水溶性锰盐或水溶性锰盐和磷酸氢二钠的混合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述水溶性锰盐选自硫酸锰和/或氯化锰。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述锰补充剂的用量使得发酵体系中所述锰补充剂的总浓度为0.2-1mM。
8.根据权利要求1、5、6、7中的任意一项所述的方法，其中，当所述锰补充剂为水溶性锰盐和磷酸氢二钠的混合物时，所述锰补充剂中，水溶性锰盐和磷酸氢二钠的含量使得发酵体系中水溶性锰盐和磷酸氢二钠的摩尔浓度比为0.3-1:1，其中所述水溶性锰盐为硫酸锰或氯化锰；
和/或，当所述锰补充剂为硫酸锰、氯化锰和磷酸氢二钠的混合物时，所述锰补充剂中，硫酸锰、氯化锰和磷酸氢二钠的含量使得发酵体系中硫酸锰、氯化锰和磷酸氢二钠的摩尔浓度比为0.3-1:0.3-1:1。
和/或，当所述锰补充剂为硫酸锰和氯化锰的混合物时，所述锰补充剂中，硫酸锰和氯化锰的含量使得发酵体系中硫酸锰和氯化锰的摩尔浓度比为1：0.2-1.5。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，在培养过程中包括向发酵培养体系中添加锰补充剂时，所述锰补充剂于发酵培养开始后30h以内加入发酵体系中。
10.根据权利要求1或9所述的方法，其中，所述方法还包括：当在培养过程中向发酵培养体系中添加锰补充剂，且采用的发酵培养基中葡萄糖含量低于250g/L时，在加入锰补充剂时向发酵体系内同时加入糖补料。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP1092781A1 (en) * 1999-09-28 2001-04-18 Bolak Co., Ltd. Fermentation process for preparing erythritol by a high salt tolerant mutant of candida sp.
CN103374534A (zh) * 2013-07-05 2013-10-30 上海交通大学 解脂亚罗酵母菌株及其用于合成赤藓糖醇的方法
CN104694585A (zh) * 2015-04-02 2015-06-10 诸城东晓生物科技有限公司 一种赤藓糖醇的生产方法

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