CN111424058B - 一种采用连续发酵的方式制备赤藓糖醇的方法 - Google Patents
一种采用连续发酵的方式制备赤藓糖醇的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种采用连续发酵的方式制备赤藓糖醇的方法，属于发酵技术领域。将解脂假丝酵母菌种子液按8‑10%量接入到一级发酵罐中发酵培养，当pH降至4.2‑5.0、细胞密度达18‑25时，转移8~10%的发酵液到二级发酵罐中，损失的体积用24‑26%的葡萄糖液补足继续培养，当二级发酵罐pH降到4.2‑5.0、细胞密度达18‑25时，转移8~10%体积的发酵液于下一级发酵罐中，该依此类推，发酵液转移3~6次，停止转移，当发酵液中葡萄糖含量≤0.2g/100mL时发酵结束，提取得赤藓糖醇。本发明利用赤藓糖醇发酵料液渗透压高、pH低不宜染菌的特点，利用发酵前期糖醇转化速率高的发酵液做下一罐发酵种子液进行连续发酵，降低了摇瓶种子、一级种子罐、二级种子罐的培养频次，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵生产技术领域，具体涉及一种采用连续发酵的方式制备赤藓糖醇的方法。
背景技术
赤藓糖醇作为一种天然的糖质，在自然界分布广泛。赤藓糖醇所独有的入口清凉感，赋予了它很好的加工特性。它可被广泛应用于糖果、饮料、果冻及果冻型饮料、口腔保健品等各种食品和饮料中。同其他糖醇一样，赤藓糖醇不会导致龋齿，其原因在于人体口腔内没有代谢赤鲜糖醇的酶系，所以食用后几乎全部随尿液排出体外，适合用作糖尿病患者的甜味剂的同时还可以避免由于用量过大而引起腹胀、肠鸣和腹泻的副作用。目前，糖醇的生产方法包括化学合成法和发酵法两种，而赤鲜糖醇是目前国际上唯一采用微生物发酵法生产的糖醇，食用更天然健康。
赤藓糖醇的制备是以葡萄糖为主要原料，通过添加不同的无机盐由耐高渗酵母在耗氧条件下通过磷酸戊糖途径来完成的。赤藓糖醇的发酵根据具体发酵工艺及菌种的不同，发酵周期一般不同，发酵时间越长，染菌机率越大，转化率也就越低。因此在较短的时间内达到较高的转化率，成为赤藓糖醇生产成本的关键因素，同时赤藓糖醇转化率提高后后提取工序收率也会提高。
目前赤藓糖醇的发酵生产，大多数采用单一发酵法，虽然通过改善发酵条件（如优化培养基成分及发酵温度、pH等）能够提高赤藓糖醇的转化率，如中国专利CN 110804632A公开了一种通过添加混合镁盐提高赤藓糖醇转化率的方法，由单一镁盐发酵改为混合镁盐发酵并且调节混合镁盐配比，调整发酵后期pH值由原来的2.5～3.3提高到3.5～4.0，使解脂假丝酵母菌种代谢处于最适合产赤藓糖醇的环境，通过对发酵培养基的优化，将各种酶的协同作用发挥到最利于产赤藓糖醇的条件，赤藓糖醇的转化率达到了63％，但这种方法每进行一次发酵培养，解脂假丝酵母菌都要进行一级种子和二级种子培养，虽然转化率提高了，但仍属于单一的发酵法，总的生产水平有限。中国专利CN13224960B公开了一种圆酵母菌株连续发酵提取生产赤藓糖醇的方法，该方法采用不断流加料液的方法进行连续发酵，转化率仅能达到45%，存在料液赤藓糖醇含量低及发酵转化率低的缺点。因此，研发一种转化率高、整体生产水平高的生产赤藓糖醇的发酵方法具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中发酵法生产赤藓糖醇转化率低，整体生产水平低的问题，本发明提供了一种采用连续发酵的方式制备赤藓糖醇的方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种采用连续发酵的方式制备赤藓糖醇的方法，包括以下步骤：
（1）将解脂假丝酵母菌种子液按8-10%体积的量接入到装有液体培养基的一级发酵罐中进行发酵培养，当发酵液pH降至4.2-5.0、细胞密度达到18-25时，转移 8~10%体积的发酵液到装有液体培养基的二级发酵罐中，该罐损失的发酵液体积用24-26%的无菌葡萄糖液补足继续进行培养；
（2）当二级发酵罐中的发酵液pH降到4.2-5.0之间、细胞密度达到18-25时，转移8~10%体积的发酵液于下一级发酵罐中，该罐损失的发酵液体积用24- 26%的无菌葡萄糖液补足继续进行培养；
（3）依此类推，当发酵液转移次数为3~6时，停止转移。当发酵液中葡萄糖含量≤0.2g/100mL时发酵结束，通过提取技术得到赤藓糖醇晶体。
优选地，步骤（3）中所述的发酵液转移次数为4次。
优选地，所述的种子液或发酵液从转移到发酵罐至转移到下一级发酵罐的时间为16-24小时。
优选地，所述的不同级别的发酵罐体积相同，发酵罐内的液体培养基成分及体积相同。
优选地，所述的液体培养基各组分的质量百分含量为：葡萄糖30-33%、酵母粉0.4-0.6%、磷酸二氢钾0.03-0.05%、硫酸镁0.02-0.035% 、碳酸镁0.01-0.015%、柠檬酸铵0.4-0.6%、氯化铜4-6ppm，余量为水。
优选地，所述的发酵培养条件为：发酵罐搅拌转速 60-100 转/分钟，压力为 0.1±0.01MPa，控制通风量在2000-3000m3/h之间（发酵初期和后期在2300m3/h左右，中期15-50小时在3000m3/h左右），温度为 30±1℃。
优选地，所述的解脂假丝酵母菌BLB-24的保藏编号为CGMCC No.4364。
优选地，所述的解脂假丝酵母菌种子液按照斜面种子、摇瓶种子、一级种子、二级种子发酵得到。
优选地，所述的摇瓶种子到一级种子接种量为1-2%，一级种子到二级种子的接种量为8-10%。
优选地，摇瓶种子、一级种子、二级种子转罐条件为料液细胞数达到6亿/ml。
本发明利用赤藓糖醇发酵料液渗透压高、pH低不宜染菌的特点，利用发酵前期糖醇转化速率高的发酵液做下一罐发酵种子液进行连续发酵，降低了摇瓶种子、一级种子罐、二级种子罐的培养频次；本发明发酵罐转移减少的料液体积用比发酵罐初糖低4-6%的无菌葡萄糖液补足，继续进行发酵培养。连续接种5次，赤藓糖醇转化率、发酵培养周期保持在原有发酵水平，降低了蒸汽及电力、人力、物力的消耗。
有益效果
本发明利用赤藓糖醇发酵料液渗透压高、PH低料液不宜染菌的特点，利用发酵前期糖醇转化速率高的发酵液用做下一罐发酵种子液进行连续发酵，大大降低了摇瓶种子、一级种子罐、二级种子罐的培养频次，降低了蒸汽、电力及人力的消耗，降低了生产成本。
具体实施方式
为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。
解脂假丝酵母菌为保龄宝生物股份有限公司自有菌种BLB-24，2010年11月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.4364，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其他原料均市售可得。
下列实施例中所述的百分含量为质量百分含量。
实施例1
1. 培养基配方
摇瓶种子培养基：葡萄糖25%，酵母膏2%，余量为水；
一、二级种子培养基：葡萄糖22%、酵母膏1.0%、磷酸二氢钾0.035%、硫酸镁 0.02%、碳酸镁0.01%、泡敌0.003%、柠檬酸铵0.4%，余量为水；
发酵液体培养基：葡萄糖33%、酵母粉0.5%、磷酸二氢钾0.035%、硫酸镁0.02%、碳酸镁0.012%、柠檬酸铵0.5%、氯化铜5ppm，余量为水；
2. 发酵培养：
（1）摇瓶种子培养：挑取一环斜面培养基上的菌苔接种到装有70ml种子培养基的1000ml三角瓶中，在30±1℃下，置于摇床上以103次/分的转速培养22小时，当细胞数达到6亿/ml以上时，按照1-2%的接种量接种到一级种子罐中；
（2）一、二级种子培养：在压力0.1±0.01MPa，温度30±1℃，风量60±5m3/h，转速200r/min的条件下培养20小时，细胞数达到6亿/ml以上，按照8-10%的接种量转入二级种子罐中，在压力0.1±0.01MPa，温度30±1℃，风量500m3/h，转速180r/min的条件培养10.5小时，细胞数达到6亿/ml以上，停止发酵，得解脂假丝酵母菌种子液；
（3）连续培养方式制备赤藓糖醇：
a) 解脂假丝酵母菌种子液按9.3%体积的量接入到装有液体培养基的一级发酵罐（一级发酵罐得体积200立方米，里面液体发酵液的体积163立方米）中进行发酵培养，培养24小时后，发酵液pH降至4.35、细胞密度达到22.86，转移9.3%体积的发酵液于下一装有液体培养基的二级发酵罐（二级发酵罐与一级发酵罐大小相同，液体培养基成分及体积相同）中，一级发酵罐损失的发酵液体积用25.5%的无菌葡萄糖液补足继续进行培养，发酵培养100小时，发酵液中葡萄糖含量小于0.2g/100mL，停止发酵，制得含赤藓糖醇的发酵液；
b) 步骤a）中的二级发酵罐发酵培养，培养22小时后，发酵液pH降至4.28、细胞密度达到23.25，转移9.5%体积的发酵液于下一装有液体培养基的三级级发酵罐（三级发酵罐与一级发酵罐大小相同，液体培养基成分及体积相同）中，二级发酵罐损失的发酵液体积用25.5%的无菌葡萄糖液补足继续进行培养，发酵时间为99小时，发酵液中葡萄糖含量小于0.2g/100mL，停止发酵，制得含赤藓糖醇的发酵液；
c) 步骤b）中的三级发酵罐发酵培养，培养23小时后，发酵液pH降至4.52、细胞密度达到21.68，转移9.2%体积的发酵液于下一装有液体培养基的四级发酵罐（四级发酵罐与一级发酵罐大小相同，液体培养基成分及体积相同）中，三级发酵罐损失的发酵液体积用25.5%的无菌葡萄糖液补足继续进行培养，发酵时间为101小时，发酵液中葡萄糖含量小于0.2g/100mL，停止发酵，制得赤藓糖醇；
d) 步骤c）中的四级发酵罐发酵培养，培养23.5小时后，发酵液pH降至4.35、细胞密度达到23.29，转移9.4%体积的发酵液于下一装有液体培养基的五级发酵罐（五级发酵罐与一级发酵罐大小相同，液体培养基成分及体积相同）中，四级发酵罐损失的发酵液体积用25.5%的无菌葡萄糖液补足继续进行培养，发酵时间为98小时，发酵液中葡萄糖含量小于0.2g/100mL，停止发酵，制得赤藓糖醇；
步骤a)-d)的发酵培养条件为：发酵罐搅拌转速 75 转/分钟，压力为 0.1±0.01MPa，通入压缩空气量为2000-3000m3/h（发酵初期和后期在2300m3/h，中期15-50小时在3000m3/h），温度为 30±1℃；五罐发酵培养周期在98-101小时之间，糖醇转化率62.2-63.5%。
实施例2
实施例2中的培养基、解脂假丝酵母菌种子液制备方法与实施例1相同；
连续发酵方式制备赤藓糖醇：步骤a）-d)与实施例1相同，不同之处在于：五级发酵罐发酵培养，培养22.5小时后，发酵液pH降至4.32、细胞密度达到22.56，转移9.4%体积的发酵液于下一装有液体培养基的六级发酵罐（六级发酵罐与一级发酵罐大小相同，液体培养基成分及体积相同）中，该罐损失的发酵液体积用25.5%的无菌葡萄糖液补足继续进行培养，发酵时间为106小时，发酵液中葡萄糖含量小于0.2g/100mL，停止发酵，制得赤藓糖醇；
实施例2发酵培养条件为发酵罐搅拌转速75转/分钟，压力为 0.1±0.01MPa，通入压缩空气量为2000-3000m3/h （发酵初期和后期在2300m3/h，中期15-50小时在3000m3/h），温度为 30±1℃；前五级发酵培养周期（从接种到发酵结束）维持在100小时左右，糖醇转化率62.2-63.5%，第六级发酵罐发酵周期为106小时，糖醇转化率为61.8%，可见六级发酵罐的发酵周期有所延长，且糖醇转化率有所降低。
对比例1
对比例1中的培养基、解脂假丝酵母菌种子液制备方法与实施例1相同；
连续发酵方式制备赤藓糖醇的方法与实施例1的不同点在于，不同级别发酵罐中发酵液的转移量为15%，发酵液损失的量用24-26%的无菌葡萄糖液补足，继续进行培养，发酵时间为102小时，发酵液中葡萄糖含量小于0.2g/100mL时发酵结束，制得赤藓糖醇；
对比例1发酵培养条件为发酵罐搅拌转速75 转/分钟，压力为 0.1±0.01MPa，通入压缩空气量为2000-3000m3/h （发酵初期和后期在2300m3/h，中期15-50小时在3000m3/h），温度为 30±1℃；五级发酵培养周期维持在99-103小时之间，糖醇转化率59-60.3%。
Claims (9)
1.一种采用连续发酵的方式制备赤藓糖醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将保藏号为CGMCC No.4364的解脂假丝酵母菌BLB-24种子液按8-10%体积的量接入到装有液体培养基的一级发酵罐中进行发酵培养，当发酵液pH降至4.2-5.0、细胞密度达到18-25时，转移 8~10%体积的发酵液到装有液体培养基的二级发酵罐中，该罐损失的发酵液体积用24-26wt%的无菌葡萄糖液补足继续进行培养；
（2）当二级发酵罐中的发酵液pH降到4.2-5.0之间、细胞密度达到18-25时，转移8~10%体积的发酵液于下一级发酵罐中，该罐损失的发酵液体积用24- 26%的无菌葡萄糖液补足继续进行培养；
（3）依此类推，当发酵液转移次数为3~6时，停止转移，当发酵液中葡萄糖含量≤0.2g/100mL时发酵结束，通过提取技术得到赤藓糖醇晶体。
2.根据权利要求1所述的采用连续发酵的方式制备赤藓糖醇的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的发酵液转移次数为4次。
3.根据权利要求1所述的采用连续发酵的方式制备赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述的种子液或发酵液从转移到发酵罐至转移到下一级发酵罐的时间为16-24小时。
4.根据权利要求1所述的采用连续发酵的方式制备赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述的不同级别的发酵罐体积相同，发酵罐内的液体培养基成分及体积相同。
5.根据权利要求4所述的采用连续发酵的方式制备赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述的液体培养基各组分的质量百分含量为：葡萄糖30-33%、酵母粉0.4-0.6%、磷酸二氢钾0.03-0.05%、硫酸镁0.02-0.035% 、碳酸镁0.01-0.015%、柠檬酸铵0.4-0.6%、氯化铜4-6ppm，余量为水。
6.根据权利要求1所述的采用连续发酵的方式制备赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述的发酵培养条件为：发酵罐搅拌转速 60-100 转/分钟，压力为 0.1±0.01MPa，控制通风量在2000-3000 m3/h之间 ，温度为 30±1℃。
7.根据权利要求1所述的采用连续发酵的方式制备赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述的解脂假丝酵母菌种子液按照斜面种子、摇瓶种子、一级种子、二级种子发酵得到。
8.根据权利要求7所述的采用连续发酵的方式制备赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述的摇瓶种子到一级种子接种量为1-2%，一级种子到二级种子的接种量为8-10%。
9.根据权利要求7所述的采用连续发酵的方式制备赤藓糖醇的方法，其特征在于，摇瓶种子、一级种子、二级种子转罐条件为料液细胞数达到6亿/ml。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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