CN104212851B

CN104212851B - 一种多级连续发酵生产l-苯丙氨酸的方法

Info

Publication number: CN104212851B
Application number: CN201410459862.0A
Authority: CN
Inventors: 陈可泉; 肖文; 何珣; 王震; 欧阳平凯
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2014-09-11
Filing date: 2014-09-11
Publication date: 2018-05-29
Anticipated expiration: 2034-09-11
Also published as: CN104212851A

Abstract

一种多级连续发酵生产L‑苯丙氨酸的方法，通过种子培养、发酵培养和多级连续发酵来完成，具体是以大肠杆菌WR1001为出发菌株，进行三级以上的发酵，通过控制不同级发酵罐内的发酵条件，满足菌株在不同时期的代谢需求，提高原料转化率和L‑苯丙氨酸产量。本发明简化了发酵过程，提高了L‑苯丙氨酸产量，有效降低生产成本。

Description

一种多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法

技术领域

本发明涉及L-苯丙氨酸发酵领域，具体涉及一种多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法。

背景技术

L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine 简称L-Phe)又名L-苯基-α-氨基丙酸为白色斜方晶系结晶粉末。具有苦杏仁味，熔点：283 ℃（分解）。L-苯丙氨酸是人体所需八种必需的氨基酸之一，在人体代谢过程中具有重要作用。常用大肠杆菌WR1001为出发菌株进行发酵，在医药、食品、化工等领域也有广泛的应用。L-苯丙氨酸的发酵过方法包括分批发酵、酪氨酸流加分批发酵、三阶段流加葡萄糖发酵、多级连续高密度发酵。分批发酵由于营养物质的缺乏，菌体生长受限，因此产量不高；酪氨酸流加分批发酵中L-酪氨酸流加加速了菌体的生长，提高了生产强度，缩短了发酵周期。在流加浓度为75 mg/h时，最大菌体干重达到了40.13 g/L，生产周期缩短到30 h，生产速率达到1. 409 g/h/L。但是L-酪氨酸的流加减少发酵时间并提高生产强度，但对L-苯丙氨酸的最终产量没有明显的影响；三阶段流加葡萄糖发酵分别优化了L-苯丙氨酸发酵的初始葡萄糖浓度和葡萄糖的指数流加策略，显著地降低了乙酸的积累，促进了L-苯丙氨酸的合成，最终获得L-苯丙氨酸的产量达48.45 g/L；多级连续高密度发酵是最近一种新的发酵方法，该方法已经应用在一些微生物发酵上，该方法降低了底物抑制作用、产物抑制作用，提高了底物利用率，产品生产率和收率。

发明内容

解决的技术问题：针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法，简化工艺的同时提高了L-苯丙氨酸的产量。

一种多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法，包括以下步骤：

第一步，种子培养；

第二步，发酵培养；

第三步，多级连续发酵，以大肠杆菌WR1001为出发菌株，进行三级以上的发酵，通过控制不同级发酵罐内的发酵条件，满足菌株在不同时期的代谢需求，提高原料转化率和L-苯丙氨酸产量，所述三级以上的发酵是指将3个以上的发酵罐串联后进行发酵。

作为优选的是，第三步，多级连续发酵，以大肠杆菌WR1001为出发菌株，进行三级以上的发酵，通过控制不同级发酵罐内的发酵条件，满足菌株在不同时期的代谢需求，提高原料转化率和L-苯丙氨酸产量，所述三级以上的发酵是指将5-10个发酵罐串联后进行发酵。

上述多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法中多级连续发酵具体包括以下方法：

步骤1，配种子培养基、初始发酵培养基、糖补料罐培养液、酪氨酸补料罐培养液和培养基补料罐培养液；

步骤2，对发酵罐、糖补料罐、培养基补料罐、酪氨酸补料罐、种子培养基、初始发酵培养基、糖补料罐培养液、酪氨酸补料罐培养液、培养基补料罐培养液以及三角烧瓶进行灭菌处理；

步骤3，取灭菌后的三角烧瓶，接入灭菌后的种子培养基，接入大肠杆菌WR1001摇床培养后作为发酵菌种；

步骤4，将灭菌后的发酵罐串联后，在各级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入无菌空气或纯O₂，再按照接种量体积比为10%向各级发酵罐中接入发酵菌种，培养6个小时，然后多级连续发酵系统开始运行，通过控制通气量，使最后一级的发酵罐中的溶氧在20%，除最后一级发酵罐外的各级发酵罐中的溶氧在5-20%；控制一级发酵罐中的培养基补料罐培养液流加速率；控制各级发酵罐的补糖速率、补酪氨酸速率、发酵液流出速率、发酵液流入速率、发酵液循环速率，使得各级发酵罐中菌体的比生长速率为0.3-0.8 h^-1，发酵全程pH为6.5-7.5，温度为32-37℃。

作为优选的是，步骤4，通气量为0.03-0.08L/（min•L），培养基补料罐培养液流加速率为10-40ml/h，补糖速率为10-50 ml/h，发酵液流出速率为50-150 ml/h，发酵液流入速率为50-150 ml/h，发酵液循环速率为20-50ml/h。

作为优选的是，多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法中发酵过程所用糖为葡萄糖、淀粉糖化液、糖蜜或木质纤维素水解液中的一种，初始发酵培养基中糖浓度为25-50g/L。

作为优选的是，多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法中的多级连续发酵中补酪氨酸速率为5-15 ml/h。

作为优选的是，多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法中的多级连续发酵中pH通过体积比为50%的氨水来调节。

有益效果

本发明方法使发酵体系中维持较高的菌体浓度，缩短了细胞生长的延滞期，与分批发酵相比，底物的利用率高，目标产物量大，产率稳定，不需要反复的洗罐、灭菌、接种等操作，降低生产成本。

附图说明

图1 为L-苯丙氨酸标准品的高效液相色谱图；

图2为实施例1发酵产物的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

“多级”是依照串联发酵罐的个数确定，如四级发酵即将四个发酵罐串联后进行发酵，其中第一个发酵罐为一级发酵罐，第二个发酵罐为二级发酵罐，第三个发酵罐为三级发酵罐，第四个发酵罐为四级发酵罐。

实施例1

第一步，配种子培养基、初始发酵培养基、糖补料罐培养液、酪氨酸补料罐培养液和培养基补料罐培养液，配方如下：

种子培养基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 0.8%，卡拉霉素硫酸盐0.004mg，pH7.0。

初始发酵培养基：6g/L trptone，3g/L Yeast extract， 3.0 g/L MgSO₄· 7 H₂O，0.015 g/L CaCl₂ · H₂O，3.0 g/L KH₂PO₄，1.0 g/L NaCl，5.0 g/L (NH₄)₂SO₄，0.075g/LFeSO₄ · 7 H₂O，1 g/L柠檬酸钠，0.075 g/L 维生素B（过滤除菌），0.4 g/L酪氨酸，40mg/L卡拉霉素硫酸盐（过滤除菌）， 25 g/L葡萄糖（分消），1.5 ml/L TES溶液（分消）。

TES溶液： 2.0 g/L Al₂(SO₄)₃ · 18 H₂O， 0.75 g/L CoSO₄· 7 H₂O， 2.5 g/LCuSO₄ × 5 H₂O， 0.5 g/L H₃BO₃，24 g/L MnSO₄ · H₂O，3.0 g/L Na₂MoO₄· 2 H₂O， 2.5g/L NiSO₄ × 6 H₂O ，15.0 g/L ZnSO₄ ·7 H₂O，pH7.0。

糖补料罐培养液：600g/L葡萄糖溶液。

酪氨酸补料罐培养液：10g/L 酪氨酸溶液（灭菌后加入7.5%左右的氨水溶解）。

培养基补料罐培养液：6g/L trptone， 3g/L Yeast extract， 3.0 g/L MgSO₄·7 H₂O，0.015 g/L CaCl₂ · H₂O，3.0 g/L KH₂PO₄，1.0 g/L NaCl，5.0 g/L (NH₄)₂SO₄，0.075g/L FeSO₄ · 7 H₂O， 1 g/L 柠檬酸钠，0.075 g/L 维生素B（过滤除菌），1.5 ml/LTES溶液（分消）。

第二步，对发酵罐、糖补料罐、培养基补料罐、酪氨酸补料罐、种子培养基、初始发酵培养基、糖补料罐培养液、酪氨酸补料罐培养液、培养基补料罐培养液以及500ml三角烧瓶在121℃下灭菌15分钟，备用；

第三步，取灭菌后的三角烧瓶，接入50ml种子培养基，接入大肠杆菌WR1001（Escherichia coli WR1001），摇床37℃转速为200 rpm下培养10小时；

第四步，将灭菌后的发酵罐串联后，在各级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入无菌空气，通气量为0.07 L/（min•L），再按照接种量体积比为10%向各级发酵罐中接入发酵菌种，培养6个小时，使菌体生长并消耗各级发酵罐中的初始发酵培养基，然后多级连续发酵系统开始运行，培养基补料罐培养液连续流加到培养罐组的一级发酵罐，接着由一级发酵罐流入二级发酵罐，二级发酵罐流入三级罐，依次进行，控制发酵过程最后一级发酵罐中的溶氧在20%，其他各级发酵罐溶氧在5%，培养基补料罐培养液流加速率为10ml/h，发酵液流出速率50 ml/h，发酵液流入速率50 ml/h，发酵液循环速率为30 ml/h，补葡萄糖速率为10ml/h，酪氨酸补料速率为5 ml/h，使得各级发酵罐中的菌体的比生长速率在0.3 h^-1，发酵全程pH为7.0，温度为37℃，发酵120小时后取发酵产物进行高效液相色谱法检测，色谱图如图1所示，并测定含量。通过将图1与L-苯丙氨酸标准品的色谱图进行对比，验证发酵产物为L-苯丙氨酸。

实施例2

第一步至第三步同实施例1，其中，发酵过程中所用糖为淀粉糖化液。

第四步，将灭菌后的发酵罐串联后，在各级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入无菌空气，通气量为0.07L/（min•L），再按照接种量体积比为10%向各级发酵罐中接入发酵菌种，培养6个小时使菌体生长并消耗各级发酵罐中的初始发酵培养基，然后多级连续发酵系统开始运行，培养基补料罐培养液连续流加到培养罐组的一级发酵罐，接着由一级发酵罐流入二级发酵罐，二级发酵罐流入三级罐，依次进行，控制发酵过程最后一级发酵罐中的溶氧在20%，其他各级发酵罐溶氧在15%，培养基补料罐培养液流加速率为20 ml/h，发酵液流出速率150 ml/h，发酵液流入速率150 ml/h，发酵液循环速率为30 ml/h，补淀粉糖化液速率为30 ml/h，酪氨酸补料速率为10 ml/h，使得发酵罐中的菌体的比生长速率在0.8 h^-1，，发酵全程pH为7.0，温度为37℃，发酵120小时后测定发酵产物的产量。

实施例3

第一步至第三步同实施例1，其中，发酵过程中所用糖为糖蜜。

第四步，将灭菌后的发酵罐串联后，在各级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入纯O₂，通气量为0.04L/（min•L），再按照接种量体积比为10%向各级发酵罐中接入发酵菌种，培养6个小时，使菌体生长并消耗各级发酵罐中的初始发酵培养基，然后多级连续发酵系统开始运行，培养基补料罐培养液连续流加到培养罐组的一级发酵罐，接着由一级发酵罐流入二级发酵罐，二级发酵罐流入三级罐，依次进行，控制发酵过程最后一级发酵罐中的溶氧在20%，其他各级发酵罐中的溶氧在10%，培养基补料罐培养液流加速率为20 ml/h，发酵液流出速率100 ml/h，发酵液流入速率100 ml/h，发酵液循环速率为30 ml/h，补糖蜜速率为20ml/h，酪氨酸补料速率为10 ml/h使得发酵罐中的菌体的比生长速率在0.6 h^-1，发酵全程pH为7.0，温度为37℃，发酵120小时后测定发酵产物的产量。

实施例4

第四步，将灭菌后的发酵罐串联后，在各级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入无菌空气，通气量为0.08L/（min•L），再按照接种量体积比为10%向各级发酵罐中接入发酵菌种，培养6个小时，使菌体生长并消耗各级发酵罐中的初始发酵培养基，然后多级连续发酵系统开始运行，培养基补料罐培养液连续流加到培养罐组的一级发酵罐，接着由一级发酵罐流入二级发酵罐，二级发酵罐流入三级罐，依次进行，控制发酵过程最后一级发酵罐中的溶氧在20%，其他各级发酵罐中的溶氧在8%，培养基补料罐培养液流加速率为10 ml/h，发酵液流出速率70 ml/h，发酵液流入速率70 ml/h，发酵液循环速率为30 ml/h，补淀粉糖化液速率为40 ml/h，使得发酵罐中的菌体的比生长速率在0.3 h-1，发酵全程pH为7.0，温度为37℃。发酵120 小时后测定发酵产物的产量。

实施例5

第一步至第三步同实施例1。

第四步，将灭菌后的发酵罐串联后，在各级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入无菌空气，通气量为0.06L/（min•L），再按照接种量体积比为10%向各级发酵罐中接入发酵菌种，培养6个小时，使菌体生长并消耗各级发酵罐中的初始发酵培养基，然后多级连续发酵系统开始运行，培养基补料罐培养液连续流加到培养罐组的一级发酵罐，接着由一级发酵罐流入二级发酵罐，二级发酵罐流入三级罐，依次进行，控制发酵过程最后一级发酵罐中的溶氧在20%，其他各级发酵罐中的溶氧在15%，培养基补料罐培养液流加速率为20 ml/h，发酵液流出速率150 ml/h，发酵液流入速率150 ml/h，发酵液循环速率为30 ml/h，补葡萄糖速率为40 ml/h，使得发酵罐中的菌体的比生长速率在0.4 h^-1，发酵全程pH为7.0，温度为37℃。发酵120小时后测定发酵产物的产量。

实施例6

第一步至第三步同实施例1，其中，发酵过程中所用糖为木质纤维素水解液。

第四步，将灭菌后的发酵罐串联后，在各级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入纯O₂，通气量为0.03L/（min•L），再按照接种量体积比为10%向各级发酵罐中接入发酵菌种，培养6个小时使菌体生长并消耗各级发酵罐中的初始发酵培养基，然后多级连续发酵发酵系统开始运行，培养基补料罐培养液连续流加到培养罐组的一级发酵罐，接着由一级发酵罐流入二级发酵罐，二级发酵罐流入三级罐，依次进行，控制发酵过程最后一级发酵罐中的溶氧在20%，其他各级发酵罐中的溶氧在20%，培养基补料罐培养液流加速率为10 ml/h，发酵液流出速率150 ml/h，发酵液流入速率150 ml/h，发酵液循环速率为30 ml/h，补木质纤维素水解液速率为40 ml/h，使得发酵罐中的菌体的比生长速率在0.4 h^-1，发酵全程pH为7.0，温度为37℃。发酵120 小时后测定发酵产物的产量。

对比例1

以重组大肠杆菌WSH-Z06(pAP-B03)为出发菌株，采用三阶段葡萄糖添加的方式，控制发酵初始葡萄糖糖浓度为20g/L，预设稀释率为0.4，L-苯丙氨酸的最高浓度只有48.45g/L。

对比例2

以组大肠杆菌WSH-BRl65(pAP03)为出发菌株，采用酪氨酸流加的方式，初始葡萄糖浓度为20g/L，在酪氨酸流加浓度为75mg/h时，生产周期30h，生产强度达到1.409g/h/L，最终产物最高浓度只有42.27g/L。

与现有发酵技术相比，本方法多级连续发酵生产L-苯丙氨酸，工艺简单，易操作，所得L-苯丙氨酸的产量高，产量如表1所示。

表1 不同实施例发酵产物的产量

Claims

1.一种多级连续发酵生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

以大肠杆菌WR1001为出发菌株，进行三级以上的发酵，通过控制不同级发酵罐内的发酵条件，满足菌株在不同时期的代谢需求，提高原料转化率和L-苯丙氨酸产量，所述三级以上的发酵是指将5-10个发酵罐串联后进行发酵；具体包括以下步骤：

步骤4，将灭菌后的发酵罐串联后，在各级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入无菌空气或纯O₂，再按照接种量体积比为10％向各级发酵罐中接入发酵菌种，培养6个小时，然后多级连续发酵系统开始运行，通过控制通气量，使最后一级发酵罐中的溶氧在20％，除最后一级发酵罐外的各级发酵罐中的溶氧在5-20％；控制一级发酵罐中的培养基补料罐培养液流加速率；控制各级发酵罐的补糖速率、补酪氨酸速率、发酵液流出速率、发酵液流入速率，使得各级发酵罐中菌体的比生长速率为0.3-0.8h^-1，发酵全程pH为6.5-7.5，温度为32-37℃，其中，步骤4，通气量为0.03-0.08L/(min·L)，培养基补料罐培养液流加速率为10-40ml/h，补糖速率为10-50ml/h，发酵液流出速率为50-150ml/h，发酵液流入速率为50-150ml/h，发酵液循环速率为20-50ml/h；发酵过程中所用糖为葡萄糖、淀粉糖化液、糖蜜或木质纤维素水解液的一种，初始发酵培养基中糖浓度为25-50g/L；补酪氨酸速率为5-15ml/h；pH通过体积比为50％的氨水来调节。