CN105189766A

CN105189766A - 用于生产丙酸的基于水解玉米和/或甘蔗醪的发酵

Info

Publication number: CN105189766A
Application number: CN201480015114.1A
Authority: CN
Inventors: C·C·斯托尔斯; B·A·罗德里格斯; B·M·考克斯
Original assignee: Dow Global Technologies LLC
Current assignee: Dow Global Technologies LLC
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2014-02-17
Publication date: 2015-12-23
Also published as: US9834797B2; WO2014158432A1; US20160017384A1; BR112015020459A2; EP2978851A1

Abstract

一种制备丙酸的方法，其包含在不包括典型、通常成本极高的维生素和矿物质包补充的情况下制备水；按作为整体的发酵液的组合重量计至少30重量％的水解玉米醪固体、水解甘蔗醪固体或其组合；和丙酸杆菌的所述发酵液。出人意料地，通常必须在糖浆生产之后弃置的这些醪固体能够供应已知为丙酸杆菌发酵所需的氮、微量营养素、维生素和矿物质，使其作为发酵培养基的单独或显著用途经济得多并且因此比需要补充的其它发酵培养基合乎需要。

Description

用于生产丙酸的基于水解玉米和/或甘蔗醪的发酵

本申请要求2013年3月28日提交的美国临时专利申请序列号61/806,081的权益，其以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及生产作为产物的丙酸的发酵领域。更确切地说，其涉及水解玉米醪或水解甘蔗醪作为可行且有经济优势的发酵底物的用途。

背景技术

公认的是需要一种将可再生含碳材料，如生物质有效转化为产物，以这种方式使得材料的能量、碳和质量含量有效转移到此类产物中的方法。这些方法中的许多使用通过酶促获得的糖，如葡萄糖或蔗糖；酸；碱；或从预先处理的农业谷物，包括玉米、甘蔗、小麦和大豆的化学机械水解。这些糖一般已通过过滤或结晶经纯化以形成所需纯度和浓度的液体糖浆或结晶固体。纯化糖随后用作发酵产生如丙酸的产物中的碳源。

举例来说，美国公开案2008053611(WO2008/098254)公开纤维素热化学转化为更易于可用的碳水化合物，接着发酵所述碳水化合物以生产丙酸。WO2011029166教示使用经基因修饰的生物体，如丙酸杆菌和发酵培养基/碳源，如单糖，如葡萄糖生产丙酸。其也提及包含其它“大量营养素”，如氮，和其宣称为生物体所需的某些指定“微量营养素”。

其它参考文献公开从多种材料生产丙酸，例如WO2009154624(葡萄糖)；美国专利5,563,069(乳糖，确切地说从乳清)；巴比拉托，F.(Barbirato，F.)等人，“葡萄糖/甘油共发酵：一种通过丙酸丙酸杆菌生产丙酸的更熟练方法(Glucose/glycerolco-fermentation：OnemoreproficientprocesstoproducepropionicacidbyPropionibacteriumacidipropionici)”，1997《应用微生物学和生物技术》(Appl.Microbiol.Biotechnol.)47，441-446(甘油)；科拉尔，J.(Coral，J.)等人，“通过不同碳源中的丙酸丙酸杆菌生产丙酸的分批发酵模型(BatchfermentationmodelofpropionicacidproductionbyPropionibacteriumacidipropioniciindifferentcarbonsources)”，2008《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.Biotechnol.)151，333-341(甘蔗糖蜜、甘油和乳酸酯)；重润，S.(Chooiun，S.)等人，“丙酸生产通过丙酸丙酸杆菌TISTR442的藻酸钙固定来自乳清的改善的抗真菌活性(ImprovementofpropionicacidproductionforantifungalactivityfromwheybycalciumalginateimmobilizationofPropionibacteriumacidipropioniciTISTR442)”2012《食品与农业科学杂志A》(J.Agric.Sci.Tech.A)2，863-872(乳清)；和冯，X.(Feng，X.)等人，“植物纤维床生物反应器中通过费氏丙酸杆菌CCTCCM207015的绿色且经济的丙酸生产(GreenandeconomicalproductionofpropionicacidbyPropionibacteriumfreudenreichiiCCTCCM207015inplantfibrous-bedbioreactor)”2011《生物资源技术》(Bioresour.Technol.)102，6141-6146(甘蔗糖蜜水解产物和水解废物丙酸杆菌细胞)。

尽管现有技术认识到纯化玉米和甘蔗糖浆的水解产物适用于丙酸杆菌发酵连同必需且昂贵的营养素、维生素和矿物质补充，研究人员迄今为止未鉴别减少或消除对此类补充的需要的方法。

发明内容

本发明提供一种制备丙酸的方法，其包含(a)制备发酵液，所述发酵液包含水；按作为整体的发酵液的重量计至少30重量％的水解玉米醪固体、水解甘蔗醪固体或其组合；和丙酸杆菌；其中氮、磷、硫、铁、锰、镁、钙和其组合的补充源以按作为整体的发酵液的重量计总计不大于0.19重量％的量存在；且其中生物素、硫胺素、核黄素、氰钴维生素、泛酸和其组合的补充源以按作为整体的发酵液的重量计总计不大于0.0001重量％的量存在；和(b)允许发酵液在适合于形成丙酸的条件下发酵。

附图说明

图1显示使用与根据表1制备的培养基相同的来自种子发酵的接种物的包括水解玉米醪(HCM)培养基或根据表2制备的培养基的生产发酵中的丙酸和葡萄糖概况。

图2显示具有生产发酵培养基的差分维生素补充的HCM的生产发酵动力学概况。

图3显示使用来自基于根据表1制备的培养基或全HCM培养基的种子发酵的独立接种物在具有和不具有五种维生素补充的情况下的所有HCM生产发酵的发酵动力学概况。

图4显示与基于使用根据表1制备的培养基的接种物的发酵的发酵概况相比的基于HCM种子发酵接种物的不使用氨控制pH的情况下的全HCM发酵的发酵概况。

图5显示基于由四种酶促水解(糖)甘蔗(EHC)样品制备的培养基的发酵的丙酸概况。

图6显示基于由两种未经洗涤的EHC样品制备的培养基的发酵的丙酸概况。

具体实施方式

本发明方法提供以与使用常规培养基源，如葡萄糖、甘油、乳清或C5或C6糖，如蔗糖的发酵相比实质上减少的成本有效生产丙酸，其依赖于额外和分开的氮；如硫和磷的微量营养素；矿物质；和维生素的源的组合。成本效益由使用水解玉米醪固体(HCM)、水解甘蔗醪固体(EHC)或其组合作为主要培养基源，而不是更精炼主要培养基源，如葡萄糖浆、来自甘蔗糖的蔗糖或甘油，以及其它氮、微量营养素、维生素和/或矿物质源，如无机氮源、蛋白水解产物、酵母、酵母提取物和/或植物颗粒以满足丙酸生产发酵的所有营养要求而得出。当考虑以下事实时成本效益更大：在发酵常规培养基源中，传统的氮、微量营养素、维生素和矿物质补充包也需要有效发酵，而使用HCM和/或EHC，出人意料地，有效地消除对任何补充的需要或偏好，除了在一些实施例中的氰钴维生素，其可以任选地用作增强剂，但即使在在不存在其的情况下，发酵仍可以有效地进行。因此，本发明方法为有吸引力的且易于以任何规模实践。

第一起始物质为丙酸杆菌。这可以是丙酸杆菌属(Propionibacteriumgenus)范围内的任何种或种组合，但在尤其优选实施例中，其可以是产酸丙酸杆菌(Propionibacteriaacidipropionici)。可以有效地采用野生型或基因修饰丙酸杆菌，或其组合。丙酸杆菌是种子培养的基础，其在一些非限制性实施例中首先经由各种生物质积聚步骤致密化，且随后用作种子发酵的基础。种子发酵随后提供引入到生产发酵液中的接种物。

第二起始物质为HCM、EHC或其组合。在本发明中，优选的是当选择HCM时，起始、预水解玉米醪包含至少约80重量百分比(重量％)，更优选地至少约90重量％，并且最优选地至少约95重量％由玉米仁的内胚乳包含或来源于其的淀粉。在尤其优选实施例中，预水解玉米醪包含至少约97重量％此类玉米仁淀粉。在EHC的情况下，预水解材料为甘蔗渣，其为在压碎甘蔗茎以提取其汁液之后剩余的纤维材料。因此，按照定义，甘蔗渣为湿性的，即具有可以经常在20重量％到50重量％范围内的相对高水分含量。甘蔗渣为极异质的且一般包括大致30重量％到40重量％衍生自植物核心的“髓”纤维，其主要为薄壁组织材料。其余部分为“韧皮”、“外皮”或“茎”纤维。这些大部分衍生自厚壁组织材料。出于本发明的目的，含有较高(相对于较低)含量的纤维素和纤维素木质素的甘蔗渣一般是优选的，尽管多种甘蔗渣可能是有效的。在本发明的一些实施例中，多种纤维素糖可以存在于甘蔗渣中。此类糖可以包括单糖和寡聚物，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纤维二糖，在一些非限制性实施例中，总纤维素糖含量可以在按甘蔗渣的总重量计1重量％到5重量％范围内。查看此参数的另一种方式为测定每升甘蔗渣的纤维素糖的总克数。在某些非限制性实施例中，此类单糖和寡聚纤维素糖可以在15克/升甘蔗渣(g/L)到50g/L范围内。

尽管可以多种方式处理任一类型的预水解醪以实质上分解淀粉，典型的处理包括机械碾磨/研磨方法，其可以与如(在非限制性实例中)与酶(包括α淀粉酶，接着是淀粉酶)接触；与酸和/或碱接触；和其它基于化学和热的处理的方法组合或经其取代。这些不同方法用以将存在于醪中的淀粉分解为小的含糖聚合物且将糖苷键水解为葡萄糖，因此形成水解醪固体产物。举例来说，在许多酶促处理中，α淀粉酶将淀粉分解为小的含糖聚合物，而后续暴露于淀粉酶进行糖苷键的最终水解。任何所选水解处理的结果为生产(主要为)C6单糖，其用以支持丙酸生产。但是，重要的是应注意，与常规理解相反且极出人意料地，HCM和/或EHC不仅提供作为主要培养基源的C6单糖，而且提供合意地有效发酵所需的氮、微量营养素、矿物质和维生素。

第三起始物质为水。此可例如为任何工业工艺用水，包括(但不限于)生活饮用水或其它水。合理的不含如化学品、金属等的污染物为所需的，但由于在生产发酵培养基中在添加丙酸杆菌之前对HCM和/或EHC与水的组合的消毒，免于活生物污染一般并非关键的。也可以容许一般以百万分率(ppm)比例存在任何其它成分，包括(但不限于)包含于如购买或以其它方式获得的成分中的杂质、来自处理设备的残余物和微粒等，其条件是其存在并不以任何可测量和/或非所需和显著方式改变方法的结果。

除了下文中另外指定外，生产发酵培养基可以经三种起始组分的比例的大范围变化。主要培养基源HCM和/或EHC可以最便利地获得或制备，使得此起初为大致60重量百分比(重量％)到70重量％醪固体，并且因此包括30重量％到40重量％水的溶液。此前体溶液随后与生产发酵培养基中的额外水组合，使得醪固体在按生产发酵培养基，即作为整体的发酵液计的30重量％直到99重量％，优选地30重量％到80重量％，并且最优选地60重量％到70重量％范围内。

一旦HCM和/或EHC已与水组合以形成预生产发酵溶液，需要经由如就地蒸汽法(steam-in-placeprocess)的程序对溶液灭菌，使得其中的任何有机体不会不合需要地干扰丙酸杆菌生长和生产丙酸的功能。此灭菌步骤的时序因此避免由热效应所致的丙酸杆菌的破坏/分解且通过消除任何竞争细菌种而有助于确保最佳丙酸杆菌发酵。

优选的是丙酸杆菌种子培养物在包含为生产发酵培养基中的接种物之前致密化。在特定实施例中，需要种子培养物展现至少5，优选地至少10，且更优选地至少20的600纳米下的光学密度(OD₆₀₀)。假定接种物具有至少5的OD₆₀₀，优选的是将其以介于按水与HCM和/或EHC的组合重量计1重量％到60重量％，更优选地3重量％到15重量％，并且最优选地5重量％到10重量％范围内的量添加到生产发酵培养基中。所属领域的技术人员将了解，尽管可以选择具有小于5的OD₆₀₀的接种物，但与使用较高OD₆₀₀接种物相比，使用此类接种物将一般增加达到丙酸生产的目标水平的总发酵时间。

本发明的特定特征和优势为可以在实质上所有培养基源为HCM和/或EHC时进行有效发酵。这意味着使用丙酸杆菌的生产发酵可以在实质上不存在任何其它氮源、任何其它微量营养素源、任何其它矿物质源和任何其它维生素源的情况下有效地进行。如本文所用的短语“任何其它氮源”因此定义为意指氮的任何补充源(例如蛋白质、氨基酸或其它无机/有机含氮材料)。如本文所用的短语“任何其它微量营养素源”因此定义为意指硫和/或磷的任何补充源。短语“任何其它矿物质源”是指包括铁、锰、镁和/或钙中的至少一者的任何补充源。短语“任何其它维生素源”是指包括生物素、核黄素、硫胺素、泛酸和/或氰钴维生素中的至少一者的任何补充源。应注意，“任何其它”因此意指这些分组中的一或多个成员的“任何补充源”。

就上文命名的补充源来说的“实质上不存在”意指发酵生产培养基，即发酵液包括添加到其中的总计不超过0.19重量％，优选地不超过0.1重量％；且更优选地不超过0.01重量％的量的指定源。就维生素的任何补充源来说的“实质上不存在”意指发酵液最优选地包括总计不超过0.0001重量％(1毫克/升(mg/L))的量的维生素源。这些百分比是以作为整体的生产发酵培养基的重量计。

由于维生素/矿物质包并且确切地说氮和微量营养素源可以表示大部分常规丙酸生产发酵的成本的相当大部分，通过选择HCM和/或EHC作为主要培养基源提供的对此类补充的需求的出人意料的减少提供显著节约。但是，在一些实施例中，氰钴维生素补充可以是合意的，因为其可以显著增强本发明的基于HCM和/或EHC的发酵中的丙酸生产。此类补充优选地以至少0.00001重量％(0.1mg/L)，优选地0.0001重量％(1mg/L)到0.0003重量％(3mg/L)，且更优选地0.00015重量％(1.5mg/L)到0.00025重量％(2.5mg/L)氰钴维生素(为维生素B12前体，即同效维生素的维生素源)的量。

应注意，一或多种其它碳源，如糖、碳水化合物、纤维素材料或其它含有机碳材料，或者称为“非HCM/EHC固体”也可以连同HCM和/或EHC固体以按作为整体的生产发酵培养基的重量计1重量％到69重量％固体的量包括于发酵生产培养基中。优选地，此非HCM/EHC固体含量为按相同重量计的1重量％到40重量％，更优选地1重量％到20重量％，并且最优选地1重量％到10重量％。但是，碳源在本文中分类为培养基源，且因此，如果此类物质也有助于氮，那么将指定微量营养素、指定维生素和/或指定矿物质考虑为也是其补充源。尽管如此，重要的是应注意，在特定实施例中，不需要任何其它碳(培养基)源，且基于全HCM、全EHC或全组合培养基，或者接近全HCM和/或EHC培养基的培养基的发酵可以多种规模有效地进行。

定义的生产发酵培养基，即发酵液的发酵可以在任何适合于形成丙酸的条件下实现。一般来说，此类条件可以包括优选地介于25℃到50℃，更优选地30℃到40℃，最优选地30℃到34℃范围内的温度；优选地介于10小时(h)到200小时(h)，更优选地60到120并且最优选地80到100小时(h)范围内的时间；优选地介于0千帕斯卡(kPa)到10,000kPa，更优选地500kPa到2000kPa，并且最优选地100kPa到150kPa范围内的外加(标准规格)压力(即除可能产生的任何流体静压以外)；优选地介于3到7.5，更优选地4到7，并且最优选地6.25到6.75范围内的pH；和0.1气体体积流量/液体体积单位/分钟(vvm)到1vvm，更优选地0.1vvm到0.5vvm，并且最优选地0.2vvm到0.4vvm的发酵容器顶部空间中的上覆氮。发酵在最大生产率达到平稳时期时完成，其将根据条件总和变化。所属领域的技术人员将了解这些因素可以如何有效地变化以在所需和/或工业上可接受的时间限度内产生丙酸生产的所需水平。

在某些特定实施例中，就每克生产的丙酸所消耗的葡萄糖的克数(g/g)来说，本发明方法的产率可以是至少0.3g/g，优选地至少0.35g/g，更优选地至少0.36g/g，并且最优选地至少0.5g/g。在某些实施例中，当相比于需要额外培养基源以补充氮、微量营养素、维生素和矿物质的基于葡萄糖的发酵培养基(如上文所鉴别)中另外相同条件和等效葡萄糖量(以g/L计)下的丙酸生产时，就g/g来说的丙酸生产也可以定义为至少30重量％，优选地至少50重量％，更优选地至少60重量％，并且最优选地至少70重量％。

实例1和比较实例A

1.种子培养

a.种子培养基制备

对于种子培养瓶中的培养基，使用10克/升(g/L)酵母提取物、5g/L胰蛋白酶大豆、0.25g/LK₂HPO₄和0.056g/LMnSO₄·H₂O制备1.5L基础丙酸培养基(PAM)。种子培养基在灭菌后补充40g/L葡萄糖。

基础PAM以浓缩形式制得以容纳来自分开灭菌的葡萄糖溶液的添加体积。浓缩葡萄糖溶液通过将55g单水合葡萄糖稀释到100mL总体积而以500g/L制得。葡萄糖溶液(100mL)用塞子塞住且随后密封于125mL血清瓶中。1.5L基础PAM在无葡萄糖的情况下如表1中所示地制备于2L瓶中(在添加葡萄糖之前的总体积为1380mL)且随后用稳定氮气流在搅拌时用氮气吹扫大致15分钟。

PAM随后以46mL的最终体积等分至血清瓶中以用于种子培养。2L密封瓶中920mL的量的PAM用作最终种子培养步骤。PAM和葡萄糖溶液通过在121℃和15psig(101kPa)下在高压釜中持续30分钟的处理分别灭菌。紧接着灭菌之后，所有血清瓶的顶部空间用无菌氮气吹扫4分钟而不含氧化空气。一旦冷却，葡萄糖溶液经由注射器无菌添加到浓缩培养基溶液中(例如4mL葡萄糖溶液添加到血清瓶基础PAM中且80mL葡萄糖溶液添加到920mL基础PAM中)。在葡萄糖添加之后，用无菌氮气通过搅拌培养基吹扫接种瓶30分钟。

b.种子培养物制备

用于以下实例和比较实例的丙酸杆菌培养物通过解冻冰上的低温存储野生型产酸丙酸杆菌培养物(存储于-80℃下，15％体积/体积(v/v)甘油，600纳米下测量的光学密度(OD₆₀₀)＝0.5)起始。300微升(μL)解冻培养物经由注射器厌氧地转移到含有50mLPAM的血清瓶中，其补充有125mL血清瓶中的40g/L葡萄糖。此50mL接种培养物在32℃下静态地培育且被称作第1阶段种子培养物。在大致24小时(OD₆₀₀＝0.5)之后，8mL培养物转移到第2阶段中，其为含1LPAM的2L瓶。此1L第2阶段培养物在与第1阶段相同的条件下培育24小时以达到OD₆₀₀＝0.5。随后将成熟第2阶段培养物转移到下文中描述的种子发酵步骤以建立细胞密度。

2.种子发酵

a.种子发酵培养基制备

种子发酵培养基用表1中示出的成分制备。首先，以717g/L的量制得浓缩葡萄糖溶液。葡萄糖溶液通过在5L不锈钢罐中在121℃和15psig(101kPa)下在高压釜中持续30分钟的处理灭菌。表1中示出的其余成分首先单独地添加到生物反应器中。除葡萄糖溶液之外作为整体的种子发酵培养基在生物反应器中在121℃下以大致10℃/min的温度斜坡灭菌30分钟。随后将分开灭菌的葡萄糖溶液馈入生物反应器中。

表1

种子发酵培养基配方

品名	量/升
		酵母提取物	10g
胰蛋白酶大豆培养液	5g
		磷酸氢二钾	0.25g
单水合硫酸锰	0.056g
		葡萄糖*	100g

*葡萄糖(717g/L)由单水合物制得且在与其它成分混合之前分开灭菌。

3.生产发酵

a.生产发酵培养基制备

制备两种不同生产发酵培养基。两者均从采用来自表1的种子发酵培养基的种子接种。在第一实例(其为实例1)中，采用不具有其它添加剂的具有等效于135g/L的葡萄糖含量的按HCM固体加上水的重量计估计约40重量％的量的HCM。在第二实例(其为比较实例A)中，以相同量(135g/L)采用实验室级葡萄糖，连同表2中示出的其它成分，表示常规发酵培养基。酵母提取物和胰蛋白酶大豆培养液均为所属领域的技术人员已知的含有多种维生素和矿物质的复合氮源，但无其可用的分析。

表2

比较实例A的生产发酵培养基配方

品名	量/升
		酵母提取物	10g
胰蛋白酶大豆培养液	5g
		磷酸氢二钾	0.25g
单水合硫酸锰	0.056g
		葡萄糖	135g

在以下标准化条件下对于实例1和比较实例A进行发酵：30L生物反应器，具有15L的培养基体积，32℃的温度，300转/分钟(rpm)的搅拌，顶部空间上方3.5标准升/分钟(slpm)(即0.23vvm(体积气体/体积培养基/分钟))的氮气流，通过添加15摩尔(M)氢氧化铵控制于6.5的pH和设定于1100mBar(110kPa)的压力。随后通过液相色谱(LC)对两种不同生产发酵培养基进行关于丙酸的分析且结果显示于图1中。结果展示仅使用稀释的HCM导致相比于使用实验室级葡萄糖和如表2中指定的添加剂的结果显著比例和产率的丙酸。实际上，在91小时处，尽管仅使用HCM的生产率仅为相比于使用具有实验室级葡萄糖，包括表2添加剂的常规培养基的生产率的约33％，即减少到大致三分之一(参见表3)，但估计就每千克生产的丙酸的美元来说的所述生产成本减少到大致三十分之一，即减少约30倍。因此，实例1方法在经济上有吸引力得多。此外，尽管与比较实例A方法相比，实例1方法中的生产率减少，但发酵产率为相当的，关于使用葡萄糖的发酵为每克生产的丙酸消耗0.37克葡萄糖(g/g)，且关于使用HCM的发酵为0.36g/g。两种方法也均产生显著量的乙酸、乳酸和丁二酸。

表3

不同生产发酵培养基的生产率和效价

实例2和比较实例B

比较研究说明包含相对于不存在各种补充维生素的效应。根据实例1和比较实例A在30L生物反应器中制备表示为实例2和比较实例B的生产发酵培养基，除了葡萄糖在灭菌前通过液相色谱(LC)测量且通过添加水到培养基中在大致125g/L处对每一培养基标准化。发酵培养基中的每一者随后在121℃下以大致10℃/min的温度斜坡通过就地蒸汽技术灭菌30分钟。无菌自来水随后添加到13.5L接种前体积，应注意，对于比较实例B作出额外调节以减去来自维生素补充的添加体积。

基于丙酸杆菌生长要求的在前文献选择维生素。实例表示为单变量修改实验，其中从添加剂包不同地减去五种维生素以测定每一维生素对丙酸生产的效应。在紧临接种之前独立地制得含有五种或较少五种维生素(下文中指定)的维生素溶液。这从各自以2mg/L的最终发酵浓度采用的由核黄素、泛酸、生物素、硫胺素和氰钴维生素组成的标准维生素添加剂包开始进行。以100mg/L制得储备液，用一种溶液中的稀(大致0.1M)氢氧化钠调节到pH＝7，且通过穿过0.22微米(μm)过滤器灭菌。将适当量的100mg/L溶液添加到鉴别的HCM反应器中以并入所需一或多种维生素和标准化发酵稀释液。每一添加剂或添加剂包随后通过具有蒸汽可灭菌接头的瓶无菌地投加到生产发酵培养基，即发酵液。包括个别维生素的发酵的生产率结果显示于图2中。

尽管明显的是维生素混合物(所有包括的维生素)增加丙酸的生产率，差分维生素添加实验测定氰钴维生素为尤其重要的添加剂。将维生素源量增加到2mg/L以上且随后另外投加于发酵中不会进一步提高丙酸生产。

实例3

进行实验以测定全HCM种子发酵后接全HCM生产发酵是否导致显著丙酸生产。四个实例显示全HCM生产发酵前面是对应于表1或全HCM种子发酵培养基的种子发酵，两个未添加维生素且两个在生产发酵步骤添加所有维生素。条件对应于较早实例和比较实例的条件。图3中记录的结果说明甚至由纯HCM上生长的种子培养物制备的接种物在生产发酵期间添加或不添加维生素的情况下在全HCM生产发酵中生产显著水平的丙酸。

实例4和比较实例C

一式三份地进行不存在任何培养基补充的情况下用纯HCM培养基的血清瓶发酵。结果表明纯HCM甚至在不添加氢氧化铵以控制pH(如在实例1中所采用)的情况下可以生产显著水平的丙酸。此外，由于这些发酵在完全密封的血清瓶中进行，此实验表明单独的HCM含有丙酸杆菌属以显著水平生长和生产丙酸所需的养分。图4显示经216小时的时间的全HCM发酵(虚线，实例4)相比于除40g/L起始葡萄糖浓度之外的表1培养基(实线，比较实例C)发酵的比较。

实例5

两组预处理和水解甘蔗渣样品经发酵以用于丙酸生产。在两组中，甘蔗渣均首先在高温(185℃到195℃)和大于大气压的压力(101、325牛顿/平方米，N/m²)下经水热预处理，释放溶解的半纤维素和固体木质纤维素材料的浆料。对于第一组的酶促水解，用水性氢氧化铵将整体浆料的pH调节到4.8且随后以混合物中每克总固体10滤纸活性单位(FPU)添加含有外切纤维素酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶和β-葡糖苷酶的酶混合物。随后在50℃下在回旋搅拌下进行水解48小时以产生水溶液中的酶促水解甘蔗固体(EHC)。在第二组样品中，进行描述的预处理且使用搅动式纳斯科过滤器(agitatedNutschefilter；ANF)将所得木质纤维素材料与液体洗脱份(其主要含有溶解的半纤维素)分离。回收的固体使用每15kg输入甘蔗渣45kg水在过滤器中洗涤3次以使如糠醛、羟甲基糠醛和乙酸的潜在残余发酵抑制剂的存在最小化。材料随后使用与第一组样品相同的方法水解以产生酶促水解甘蔗固体(EHCW)。

随后分离直接水解和洗涤水解样品。每一样品的一个等分试样在不另外改性的情况下直接发酵。在第二等分试样中，在灭菌后以最终0.25M浓度将7.5mL哌嗪-N，N′-双(乙烷-磺酸)(“PIPES”)缓冲液添加到经洗涤和未经洗涤的水解样品以使发酵期间的pH稳定化。

每一样品在125mL末端密封血清瓶中一式三份地发酵。50mL(或当使用PIPES时，42.5mL)样品等分到每一血清瓶中，随后在121℃下高压灭菌30分钟。高压灭菌之前的所有样品的样品pH介于6.0-7.0范围内。但是，在高压灭菌之后，所有样品的pH降低到4.0-5.0且需要用1MNaOH调节以返回到pH6.0-7.0。在pH调节之后，每一样品用300μL生长约24小时的PAM培养物接种到0.5的OD_600nm。在接种之后，发酵在不搅拌的情况下维持于32℃下。随后定期收集样品以分析丙酸生产。

下图5中的数据表明可以在无任何补充的情况下从水解甘蔗样品直接制造可观量的丙酸。因此，纯EHC含有用于丙酸生产的足够养分。如上文所述洗涤EHC样品显著改善性能(如图5中所示)，但即使未经洗涤的EHC也生产大量丙酸(如图6中所示)。补充PIPES缓冲液改善性能，但即使没有PIPES缓冲，也生产大量丙酸。

样品缩写：

EHC-酶促水解甘蔗固体

EHCW-洗涤酶促水解甘蔗固体

EHCPIPES-伴以PIPES缓冲的酶促水解甘蔗固体

EHCWPIPES-伴以PIPES缓冲的洗涤酶促水解甘蔗固体

Claims

1.一种制备丙酸的方法，其包含

(a)制备包含以下的发酵液：

水；

按作为整体的所述发酵液的重量计至少30重量％的水解玉米醪固体、水解甘蔗醪固体或其组合；和

丙酸杆菌；

其中氮、磷、硫、铁、锰、镁、钙和其组合的补充源以按作为整体的所述发酵液的重量计总计不大于0.19重量％的量存在；

且其中生物素、硫胺素、核黄素、氰钴维生素、泛酸和其组合的补充源以按作为整体的所述发酵液的重量计总计不大于0.0001重量％的量存在；和

(b)允许所述发酵液在适合于形成丙酸的条件下发酵。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述丙酸杆菌选自野生型和基因修饰丙酸杆菌，和其组合。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述丙酸杆菌选自野生型和基因修饰产酸丙酸杆菌(Propionibacteriaacidipropionici)。

4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述水解玉米醪固体或水解甘蔗醪固体分别通过玉米醪固体或甘蔗固体的水解制备。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述玉米醪固体在水解之前包含至少80重量％的玉米仁淀粉。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述甘蔗醪固体在水解之前包含至少1重量％的纤维素单糖和寡聚物。

7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述条件包括以下中的至少一者：介于25℃到50℃范围内的温度；介于10小时到200小时范围内的时间；介于0千帕斯卡到10000千帕斯卡范围内的外加压力；介于3到7.5范围内的pH；和介于0.1气体体积流量/液体体积单位/分钟到1气体体积流量/液体体积单位/分钟范围内的上覆氮。

8.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述发酵液进一步包含以按作为整体的所述发酵液的重量计1重量％到69重量％的量的除所述水解玉米醪固体或所述水解甘蔗固体或其组合以外的至少一种碳源。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述发酵液进一步包含以按作为整体的所述发酵液的重量计1重量％到40重量％的量的除所述水解玉米醪固体或所述水解甘蔗固体或其组合以外的至少一种碳源。