CN106947787A - 一种提高丙酸发酵效率的方法 - Google Patents

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CN106947787A CN201710320324.7A CN201710320324A CN106947787A CN 106947787 A CN106947787 A CN 106947787A CN 201710320324 A CN201710320324 A CN 201710320324A CN 106947787 A CN106947787 A CN 106947787A
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Abstract

本发明涉及一种提高丙酸发酵效率的方法，具体涉及一种采用二次接种的方式提高丙酸发酵效率的方法，所述方法包括如下步骤：(1)菌种活化：将保存的丙酸杆菌进行活化；(2)发酵：将活化后的丙酸杆菌转接到发酵培养基中进行发酵培养；(3)二次接种：在发酵到84‑156h时以5‑20％的接种量将丙酸杆菌进行二次接种。本发明方法在传统批次发酵的基础上通过在特定的时间点二次接入新鲜的种子液，提高了菌株在发酵后期相对恶劣条件下的生长代谢能力，进而提高了菌株的生产性能；且该方法特异的针对丙酸发酵效果显著，在未延长发酵周期的情况下，底物的转化率提高了6％以上，丙酸的产量提高了6％以上。

Description

一种提高丙酸发酵效率的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种提高丙酸发酵效率的方法，具体涉及一种采用二次接种的方式提高丙酸发酵效率的方法。
背景技术
产酸丙酸杆菌菌株(Propionibacterium acidipropionici)是微生物发酵生产丙酸的生产菌种，其发酵过程中产生的丙酸主要存在于发酵液中，但是丙酸的不断积累会对菌体细胞生长以及丙酸自身代谢产生反馈抑制作用，进而降低了发酵效率。为了提高发酵效率，研究人员对生产菌株进行了基因改造(Biotechnology and Bioengineering,2009,104:766-773；Metabolic Engineering,2015,27:46-56)，研究了丙酸的反馈抑制机理(Journal of Biotechnology,2013,167:56-63)，并采用了过程工程手段将发酵液中的丙酸移除，减缓了其对发酵的抑制作用(Applied Microbiology and Biotechnology,2001,56:676-680；Bioresource Technology,2012,112:248-253；Bioresource Technology,2012,104：652-659)。
上述方法均可以有效提高发酵过程中的底物转化效率和丙酸产量，但是，在实际生产过程中，均需要在原有发酵设备的基础上，增加其他的外接操作单元，如膜分离设备、层析分离设备等，使得发酵工艺变得复杂、操作变得繁琐。
目前，已有技术公开了通过“二次接种”的方式来再次发酵，CN 103478417A公开了一种二次接种分段固态发酵生产发酵豆粕的方法，首先将枯草芽孢杆菌液、假丝酵母菌液和乳酸杆菌液混合得到的混合菌液接入到去皮豆粕，混合发酵；然后将乳酸杆菌液接入到发酵物中，混合，厌氧发酵，得到发酵豆粕。该方法采用二次接种，将不同的菌株分开接种的方式，以满足好氧菌和厌氧菌的不同发酵需求，但其对于产酸丙酸杆菌菌株生产丙酸并不适用。
CN 101012465 A公开了一种二次接种叠加生物素的谷氨酸发酵生产方法，该方法以生物素缺陷型谷氨酸产生菌株为生产菌株，在营养条件丰富的情况下，采用二级接种使得菌体细胞和生物素保持“超亚适量”状态，不仅解决了发酵供氧的问题，还克服了夏季高温环境下的发酵热问题，提高了生产效率。但是，丙酸杆菌发酵过程中存在严重的产物反馈抑制作用，与谷氨酸发酵生产时菌体细胞的生长环境差异甚大，因此，不适用于产酸丙酸杆菌菌株生产丙酸的情况。
由此可见，如何针对发酵过程中营养条件匮乏、有害代谢产物不断积累、产物的反馈抑制作用，以及菌株生长性能和代谢活力不断减弱，适应性降低等情况，提供一种即可以提高发酵效率，而又无需额外添加操作单元的方式就显得尤为重要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种提高丙酸发酵效率的方法，所述方法通过采用“二次接种”的方法，即在发酵过程中补接新鲜的种子液，提高了菌株的生产性能，所述方法操作简单，不会延长发酵周期，而且不增加任何设备投资，便于工业化生产。
为达此目的，本发明采用了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种提高丙酸发酵效率的方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将保存的丙酸杆菌进行活化；
(2)发酵：将活化后的丙酸杆菌转接到发酵培养基中进行发酵培养；
(3)二次接种：在发酵到80-156h时以5-20％的接种量将丙酸杆菌进行二次接种。
本发明中，所述二次接种的菌种与接种量与第一次发酵前接种的菌种与接种量相同，菌种均是丙酸杆菌，所述方法通过在特定的时间点二次接入新鲜的种子液，提高了菌株的生产性能，提高了底物的转化率，且该方法特异的针对丙酸发酵效果显著，且经过二次接种，整个发酵的周期没有延长。
本发明中，所述丙酸杆菌来自于微生物菌株保藏中心，保藏编号为CMCC1.2230。
根据本发明，步骤(1)所述的活化具体包括：将保存的丙酸杆菌接种于一级种子培养基中静置培养，再转接至二级摇瓶种子培养基中静置培养。
本发明中，所述丙酸杆菌保存在甘油管或斜面培养基中，所述甘油管或斜面培养基只要能够用于保存丙酸杆菌的都是可行的，在此不做特殊限定，本领域技术人员可以根据需要自行选择，示例性地，所述斜面培养基包括如下组分：20g/L葡萄糖、10g/L玉米浆、2g/L硫酸铵、2g/L碳酸钙和15g/L琼脂。
优选地，所述转接的接种量为5-20％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，优选为10％。
根据本发明，所述一级种子培养基和二级摇瓶种子培养基的培养基成分是相同的，所述种子培养基包括如下组分：30-40g/L葡萄糖、15-25g/L玉米浆、1-10g/L硫酸铵和1-10g/L磷酸二氢钾，优选为35g/L葡萄糖、21g/L玉米浆、5g/L硫酸铵和4g/L磷酸二氢钾。
优选地，所述种子培养基的pH为6-7.5，例如可以是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5，优选为6.8-7.0。
根据本发明，所述丙酸杆菌在一级种子培养基和在二级摇瓶种子培养基中的培养条件是相同的。
优选地，所述静置培养的温度为25-35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，优选为30℃。
优选地，所述静置培养的时间为40-55h，例如可以是40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、49h、50h、51h、52h、53h、54h或55h，优选为48h。
优选地，步骤(2)所述转接的接种量为5-20％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，优选为10％。
优选地，步骤(2)发酵培养基包括如下组分：55-65g/L葡萄糖、35-45g/L玉米浆和磷酸二氢钾4-5g/L，优选为60g/L葡萄糖、41g/L玉米浆和4.6g/L磷酸二氢钾。
所述葡萄糖例如可以是55g/L、56g/L、57g/L、58g/L、59g/L、60g/L、61g/L、62g/L、63g/L、64g/L或65g/L；所述玉米浆例如可以是35g/L、36g/L、37g/L、38g/L、39g/L、40g/L、41g/L、42g/L、43g/L、44g/L或45g/L；所述磷酸二氢钾例如可以是4g/L、4.1g/L、4.2g/L、4.3g/L、4.4g/L、4.5g/L、4.6g/L、4.7g/L、4.8g/L、4.9g/L或5g/L。
优选地，所述发酵培养基的pH为6-7.5，例如可以是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5，优选为6.8-7.0。
本发明中，所述发酵培养基的pH通过流加弱碱来维持pH的恒定，只要能够调节pH的弱碱都是可行的，在此不做特殊限定，本领域技术人员可以根据需要自行选择，本发明中采用氨水进行调节pH。
根据本发明，所述发酵培养中的葡萄糖浓度不低于10g/L。
本发明中随着发酵的进行，葡萄糖不断消耗，通过实时监测葡萄糖浓度，补加葡萄糖来使得葡萄糖的浓度不低于10g/L，所述补加葡萄糖的方式为本领域的常规技术。
优选地，步骤(2)所述发酵培养的培养温度为25-35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，优选为30℃。
优选地，步骤(2)所述发酵培养的搅拌速率为40-60r/min，例如可以是40r/min、41r/min、42r/min、43r/min、44r/min、45r/min、46r/min、47r/min、48r/min、49r/min、50r/min、51r/min、52r/min、53r/min、54r/min、55r/min、56r/min、57r/min、58r/min、59r/min或60r/min，优选为50r/min。
优选地，步骤(3)所述的二次接种时间为80-156h，例如可以是80h、81h、82h、83h、84h、85h、86h、87h、88h、89h、90h、91h、92h、93h、94h、95h、96h、97h、98h、99h、100h、101h、102h、103h、104h、105h、108h、110h、113h、115h、118h、120h、123h、125h、128h、130h、133h、135h、138h、140h、143h、145h、148h、150h、153h或156h，优选为82-100h，进一步优选为82-90h，最优选为84h。
本发明中，通过调节二次接种的时间，发明人发现，在发酵80h之前进行接种新鲜种子液，对底物转化率的提高不明显，随着有害代谢产物的积累和营养物质的消耗，菌体的代谢能力逐渐下降，产物合成能力降低，在发酵80h之后进行接种新鲜种子液，底物转化率明显提高。
优选地，步骤(3)所述的接种量为5-20％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，优选为10％。
根据本发明，步骤(3)所述丙酸杆菌为步骤(1)活化后的丙酸杆菌。
作为优选技术方案，所述提高丙酸发酵效率的方法包括如下步骤：
(1)菌种活化：将保存的丙酸杆菌接种于一级种子培养基中静置培养，再按接种量为5-20％转接至二级摇瓶种子培养基中25-35℃静置培养40-55h，所述种子培养基包括如下组分：30-40g/L葡萄糖、15-25g/L玉米浆、1-10g/L硫酸铵和1-10g/L磷酸二氢钾，所述种子培养基的pH为6-7.5；
(2)发酵：将活化后的丙酸杆菌按接种量为5-20％转接到发酵培养基中25-35℃、40-60r/min进行发酵培养，发酵过程中，当葡萄糖浓度低于10g/L时补加葡萄糖，同时用氨水调节pH为6-7.5，所述发酵培养基包括如下组分：55-65g/L葡萄糖、35-45g/L玉米浆和4-5g/L磷酸二氢钾，所述发酵培养基的pH为6-7.5；
(3)二次接种：在发酵到80-156h时以5-20％的接种量将步骤(1)活化后的丙酸杆菌进行二次接种，直至发酵结束。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明方法在传统批次发酵的基础上通过在特定的时间点二次接入新鲜的种子液，提高了菌株在发酵后期相对恶劣条件下的生长代谢能力，进而提高了菌株的生产性能，且该方法特异的针对丙酸发酵效果显著，在不延长发酵周期的情况下，底物的转化率提高了6％以上，丙酸的产量提高了6％以上；
(2)本发明方法操作简单，工业生产时无需增加任何额外的设备，便于工业化放大生产。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
(1)菌种活化：将甘油管或斜面保存的菌种进行平板划线活化，置于30℃恒温厌氧培养72h，再按接种量为10％转接至二级摇瓶种子培养基中30℃静置培养48h，所述种子培养基包括如下组分：35g/L葡萄糖、21g/L玉米浆、5g/L硫酸铵和4g/L磷酸二氢钾，所述种子培养基的pH为6.8-7；
(2)发酵：将活化后的丙酸杆菌按接种量为10％转接到10L发酵罐培养，培养温度为30℃，搅拌速率为50r/min进行发酵培养，发酵过程中，当葡萄糖浓度低于10g/L时补加葡萄糖，同时用氨水调节pH为6.8-7，所述发酵培养基包括如下组分：60g/L葡萄糖、41g/L玉米浆和4.6g/L磷酸二氢钾，所述发酵培养基的pH为6.8-7；
(3)二次接种：在发酵到84h时以10％的接种量将步骤(1)活化后的丙酸杆菌进行二次接种，直至发酵结束。
所述实施例1的总共发酵时间长达240h，发酵液中的丙酸浓度可达到61.84g/L，产量为0.258g/(L·h)，葡萄糖对丙酸的转化率为0.549g/g。
实施例2
相比于实施例1，除了步骤(3)中的二次接种的接种量为5％之外，其他条件与实施例1相同。
所述实施例的总共发酵时间长达240h，发酵液中的丙酸浓度可达到56.82g/L，产量为0.238g/(L·h)，葡萄糖对丙酸的转化率为0.536g/g。
实施例3
相比于实施例1，除了步骤(3)中的二次接种的接种量为20％之外，其他条件与实施例1相同。
所述实施例的总共发酵时间长达240h，发酵液中的丙酸浓度可达到60.39g/L，产量为0.251g/(L·h)，葡萄糖对丙酸的转化率为0.533g/g。
实施例4
相比于实施例1，除了步骤(3)中的二次接种的时间为156h之外，其他条件与实施例1相同。
所述实施例的总共发酵时间长达240h，发酵液中的丙酸浓度可达到54.35g/L，产量为0.226g/(L·h)，葡萄糖对丙酸的转化率为0.503g/g。
实施例5
相比于实施例1，除了步骤(3)中的二次接种的时间为80h之外，其他条件与实施例1相同。
所述实施例的总共发酵时间长达240h，发酵液中的丙酸浓度可达到55.21g/L，产量为0.227g/(L·h)，葡萄糖对丙酸的转化率为0.510g/g。
实施例6
相比于实施例1，除了步骤(3)中的二次接种的时间为95h之外，其他条件与实施例1相同。
所述实施例的总共发酵时间长达240h，发酵液中的丙酸浓度可达到57.32g/L，产量为0.235g/(L·h)，葡萄糖对丙酸的转化率为0.521g/g。
实施例7
相比于实施例1，除了步骤(3)中的二次接种的时间为88h之外，其他条件与实施例1相同。
所述实施例的总共发酵时间长达240h，发酵液中的丙酸浓度可达到59.34g/L，产量为0.241g/(L·h)，葡萄糖对丙酸的转化率为0.529g/g。
实施例8
相比于实施例1，除了步骤(2)中的培养温度25℃，搅拌速率40r/min之外，其他条件与实施例1相同。
所述实施例的总共发酵时间长达240h，发酵液中的丙酸浓度可达到58.46g/L，产量为0.248g/(L·h)，葡萄糖对丙酸的转化率为0.533g/g。
实施例9
相比于实施例1，除了步骤(2)中的培养温度35℃，搅拌速率60r/min之外，其他条件与实施例1相同。
所述实施例的总共发酵时间长达240h，发酵液中的丙酸浓度可达到57.75g/L，产量为0.247g/(L·h)，葡萄糖对丙酸的转化率为0.535g/g。
对比例1
相比于实施例1，除了未进行步骤(3)中的二次接种之外，其他条件与实施例1相同。
所述实施例的总共发酵时间长达240h，发酵液中的丙酸浓度可达到48.51g/L，产量为0.183g/(L·h)，葡萄糖对丙酸的转化率为0.398g/g。
对比例2
相比于实施例1，除了步骤(3)中的二次接种的接种量为3％之外，其他条件与实施例1相同。
所述实施例的总共发酵时间长达240h，发酵液中的丙酸浓度可达到49.78g/L，产量为0.203g/(L·h)，葡萄糖对丙酸的转化率为0.436g/g。
对比例3
相比于实施例1，除了步骤(3)中的二次接种的接种量为23％之外，其他条件与实施例1相同。
所述实施例的总共发酵时间长达240h，发酵液中的丙酸浓度可达到51.29g/L，产量为0.214g/(L·h)，葡萄糖对丙酸的转化率为0.472g/g。
对比例4
相比于实施例1，除了步骤(3)中的二次接种的接种时间为75h之外，其他条件与实施例1相同。
所述实施例的总共发酵时间长达240h，发酵液中的丙酸浓度可达到52.64g/L，产量为0.220g/(L·h)，葡萄糖对丙酸的转化率为0.475g/g。
对比例5
相比于实施例1，除了步骤(3)中的二次接种的接种时间为160h之外，其他条件与实施例1相同。
所述实施例的总共发酵时间长达240h，发酵液中的丙酸浓度可达到50.71g/L，产量为0.211g/(L·h)，葡萄糖对丙酸的转化率为0.463g/g。
相比对比例1-5，实施例1-9通过进行二次接种，且通过在特定的时间进行特定接种量的接种，丙酸浓度和产量都明显提高，葡萄糖对丙酸的转化率也明显提高；另外，相比实施例8-9，实施例1-7通过控制发酵温度和转速，也有利于丙酸浓度和产量的提高，葡萄糖对丙酸的转化率也明显提高；相比于实施例1和实施例4-7，通过控制二次接种时间在82-90h内，其丙酸浓度和产量都明显提高，葡萄糖对丙酸的转化率也明显提高，丙酸转化率都得到了进一步提高；相比于实施例1-3，通过控制二次发酵的接种量也使得丙酸浓度和产量都明显提高，葡萄糖对丙酸的转化率也明显提高。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种提高丙酸发酵效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将保存的丙酸杆菌进行活化；
(2)发酵：将活化后的丙酸杆菌转接到发酵培养基中进行发酵培养；
(3)二次接种：在发酵到84-156h时以5-20％的接种量将丙酸杆菌进行二次接种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的活化具体包括：将保存的丙酸杆菌接种于一级种子培养基中静置培养，再转接至二级摇瓶种子培养基中静置培养；
优选地，所述转接的接种量为5-20％，优选为10％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包括如下组分：30-40g/L葡萄糖、15-25g/L玉米浆、1-10g/L硫酸铵和1-10g/L磷酸二氢钾，优选为35g/L葡萄糖、21g/L玉米浆、5g/L硫酸铵和4g/L磷酸二氢钾；
优选地，所述种子培养基的pH为6-7.5，优选为6.8-7.0。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述静置培养的温度为25-35℃，优选为30℃；
优选地，所述静置培养的时间为40-55h，优选为48h。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述转接的接种量为5-20％，优选为10％；
优选地，步骤(2)发酵培养基包括如下组分：55-65g/L葡萄糖、35-45g/L玉米浆和4-5g/L磷酸二氢钾，优选为60g/L葡萄糖、41g/L玉米浆和4.6g/L磷酸二氢钾；
优选地，所述发酵培养基的pH为6-7.5，优选为6.8-7.0。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养中的葡萄糖浓度不低于10g/L；
优选地，步骤(2)所述发酵培养的培养温度为25-35℃，优选为30℃；
优选地，步骤(2)所述发酵培养的搅拌速率为40-60r/min，优选为50r/min。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的操作方法，其特征在于，步骤(3)所述的二次接种时间为80-156h，优选为82-100h，进一步优选为82-90h，最优选为84h；
优选地，步骤(3)所述的接种量为5-20％，优选为10％。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述丙酸杆菌为步骤(1)活化后的丙酸杆菌。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将保存的丙酸杆菌接种于一级种子培养基中静置培养，再按接种量为5-20％转接至二级摇瓶种子培养基中25-35℃静置培养40-55h，所述种子培养基包括如下组分：30-40g/L葡萄糖、15-25g/L玉米浆、1-10g/L硫酸铵和1-10g/L磷酸二氢钾，所述种子培养基的pH为6-7.5；
(2)发酵：将活化后的丙酸杆菌按接种量为5-20％转接到发酵培养基中25-35℃、40-60r/min进行发酵培养，发酵过程中，当葡萄糖浓度低于10g/L时补加葡萄糖，同时用氨水调节pH为6-7.5，所述发酵培养基包括如下组分：55-65g/L葡萄糖、35-45g/L玉米浆和4-5g/L磷酸二氢钾，所述发酵培养基的pH为6-7.5；
(3)二次接种：在发酵到80-156h时以5-20％的接种量将步骤(1)活化后的丙酸杆菌进行二次接种，直至发酵结束。
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