CN105018409A - 甲基营养型芽孢杆菌产芽孢发酵培养基及其培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种甲基营养型芽孢杆菌产芽孢发酵培养基的优化，组成如下：玉米面0.5～0.6％，玉米淀粉0.08～0.2％，麸皮0.9～1.2％，葡萄糖0.18～0.54％，黄豆饼粉0.05～0.15％,大豆蛋白胨0.16～0.2％，KH₂PO₄0.005～0.006％，(NH₄)₂SO₄0.006～0.008％，MnSO₄0.004～0.005％，CaCO₃0.0005～0.002％，MgSO₄.7H₂O0.005～0.006％，以及余量的水。本发明的培养基，它既能满足摇瓶发酵实验的需要，又能成功的将摇瓶发酵结果放大到发酵罐。该培养基配方和优化以前的培养基相比，芽孢转化率和芽孢产量提高了1～10倍，而且培养基配方采用廉价的农副产品，大幅降低了生产成本，为大规模工业生产可湿性粉剂奠定基础。

Description

甲基营养型芽孢杆菌产芽孢发酵培养基及其培养方法

技术领域

本发明涉及一种应用响应面法和单因素实验设计对甲基营养型芽孢杆菌的芽孢高密度发酵生产工艺优化技术，得到了适用于甲基营养型芽孢杆菌产芽孢的发酵培养基及其培养方法。

背景技术

在防治植物病原真菌病害上，化学农药做出了巨大贡献。然而，化学农药产生的环境等问题却愈来愈严重。因此，生物防治被提上了日程，为了解决这个问题，有必要挖掘新的微生物资源，开发新型生物农药。

芽孢杆菌在自然界分布广泛，可产生多种抗菌活性物质。目前已广泛应用于医药、农药、食品、饲料加工、环境污染治理等各个行业，具广阔应用前景。芽孢杆菌可以产生内生孢子抵御不良环境，所以，芽孢与营养体相比抗逆性明显增强，作为生物制剂更加稳定，因此目前已经形成商品化的大部分是芽孢杆菌的芽孢制剂。

甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)是2010年MunusamyMadhaiyan等人报道的新种，在污水处理、水产养殖、生物防治、食品等方面的应用也相继有报道。甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus9912是由中国科学院沈阳应用生态研究所胡江春等人从辽宁渤海海泥中分离得到的优良菌株；经田间防治效果试验，对多种真菌性病害，如黄瓜灰霉病、番茄灰霉病、葡萄灰霉病、苹果腐烂病等，有明显的防治作用，同时也可作为PGPR促进植物生长，为新型的生物杀菌剂。目前对甲基营养型芽孢杆菌以芽孢为最终产物的发酵工艺的研究较少，并且常规的培养条件下不易产生芽孢，影响其成为高效、低毒、低成本、货架期长的芽孢制剂，因此迫切需要对甲基营养型芽孢杆菌9912发酵配方进行优化，摸索出最佳的培养基配方和发酵条件，以提高发酵液中芽孢含量，降低生产成本，为大规模工业化生产可湿性粉剂奠定基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种运用响应曲面优化方法，优化甲基营养芽孢杆菌9912的产芽孢发酵培养基，提高芽孢产量，同时采用廉价的农副产品作为碳源、氮源，降低生产成本，为大规模工业生产奠定基础。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

(1)从6种廉价的碳源、6种廉价的氮源中筛选出芽孢产量和转化率都很高的原料；筛选碳源时用酵母膏作为唯一的氮源，酵母膏浓度为0.8％；筛选氮源时用葡萄糖作为唯一的碳源，葡萄糖的浓度为1.1％；其余成分是诱导芽孢形成的盐溶液，具体成分如下：KH₂PO₄0.005％，(NH₄)₂SO₄0.006％，MnSO₄0.004％，CaCO₃0.004％，MgSO₄.7H₂O0.005％，pH6.5；

(2)将步骤(1)筛选出的4种碳源、2种氮源和诱导芽孢形成的盐溶液组分，共11个因素，根据Plackettt-Burman Design，筛选出对芽孢产量和转化率有显著影响的4个因素：玉米面、葡萄糖、黄豆饼粉、CaCO₃，培养条件和要求同步骤(1)；

(3)步骤(2)筛选出的有显著影响的因素经最陡爬坡试验设计，其余因素的水平为零点，逼近最大芽孢产量区找到响应面试验各因素水平的中心点，培养条件和要求同步骤(1)；

(4)根据Central Composite Design，进行响应面分析确定步骤(3)中3个显著因素的最适浓度，确定最佳发酵培养基配方，培养条件和要求同步骤(1)；

(5)将以上步骤优化出的最佳发酵培养基配方，采用单因素实验设计，考查PH、接种量、种龄、装液量对芽孢产量的影响，培养条件和要求同步骤(1)；

(6)最优培养基配方和最优发酵条件的验证

上述步骤(6)发酵罐验证的方法为：根据实验所得的最优发酵培养基和发酵条件，500L的发酵罐装液量300L，培养条件为：罐压0.05～0.06Mpa，风量1:0.4～1:0.6vvm，转速220～250rpm，培养温度为35～37℃，24～28h，显微镜检测芽孢转化率达到80％以上即可终止发酵。

上述步骤(1)中的发酵活性芽孢产量的测定方法为：将发酵液80℃下水浴保温10min，杀死营养体，采用连续稀释涂布平板法计算芽孢数目。

上述步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)的具体发酵培养的方法如下：

1)挑一环试管斜面上的菌种接种于改良淀粉平板培养基上，30℃下培养2～3天，显微镜下检测，选择中央芽孢形成均一，两端着色清晰的大菌落作为发酵种子；

2)挑一环步骤(1)所述的发酵种子，接种于液体种子培养基，其配方如下：葡萄糖1％，玉米面1.8％，麸皮0.35％，黄豆饼粉0.1％，KH₂PO₄0.005～0.006％，(NH₄)₂SO₄0.006～0.008％，MnSO₄0.004～0.005％，CaCO₃0.004～0.005％，MgSO₄.7H₂O0.005～0.006％，pH6.5，装液量为：500ml的摇瓶装50ml种子液，培养温度36℃，转速180rpm条件下培养15～18h，作为发酵种子液；

3)将步骤(2)得到的发酵种子液，按照8～10％的接种量接入发酵培养基，装液量为：500ml的摇瓶装50ml发酵培养基，培养温度36℃，转速180rpm条件下培养至芽孢转化率80％以上终止发酵，计算芽孢数目。

本发明的有益效果：

(1)它既能满足摇瓶实验的需要，又能成功的将摇瓶发酵结果放大到发酵罐；

(2)利用本发明的培养基进行培养后，在常规液体培养基上不易产芽孢的甲基营养芽孢杆菌的转化率由1～20％提高至90％以上，芽孢产量达到10×10⁸cfu/ml及以上，总的活性芽孢数比其他培养基发酵提高数十倍，同时采用廉价的农副产品，也降低了生产成本，具有工业化生产的实际意义；

(3)响应面分析法(RSM)是根据几个变量和一个或多个因变量之间的回归关系，通过回归分析得到提取条件和提取结果之间的回归关系，从而求得最佳提取工艺的一种数学统计方法。目前利用该方法优化甲基营养型芽孢杆菌的发酵条件，从而提高芽孢产量的文献还未见报道。

附图说明

图1为玉米淀粉与葡萄糖对芽孢产量的响应面三维图；

图2为玉米淀粉与黄豆饼粉对芽孢产量的响应面三维图；

图3为葡萄糖与黄豆饼粉对芽孢产量的响应面三维图；

图4为葡萄糖与碳酸钙对芽孢产量的响应面三维图；

图5为黄豆饼粉与碳酸钙对芽孢产量的响应面三维图。

具体实施方式

实施例1

菌种的活化

将甲基营养型芽孢杆菌9912-D划线接种于改良淀粉琼脂培养基，30℃培养48h，挑取经显微镜观察后，将典型单菌落再次划线纯化后接种于改良淀粉试管斜面，30℃培养48h备用。其在改良淀粉琼脂培养基上的典型菌落形态为边缘不规整，表面干燥稍有皱起，菌落较厚，乳脂色；显微镜下的细菌形态：细胞杆状或柱状，大小0.6～0.8×1.5～3.0μm，芽孢中生柱状或椭圆，不膨大，一条鞭毛，端生或侧端生。

改良淀粉培养基组成为：可溶性淀粉2％，牛肉膏0.5％，酵母膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂1.8％。pH自然，115℃高压蒸汽灭菌30min(或121℃灭菌20min)。

实施例2

实验设计与统计分析

2.1单因素试验设计筛选合适的碳源和氮源

碳源既能为微生物生长繁殖提供能源，又是合成菌体必须的成分，微生物自身存在的酶系有差别，利用不同碳源代谢对发酵产物品质的影响也是不同。氮源是构成细胞蛋白和核酸物质的来源，与菌体正常代谢有重要关系。有研究报道，一些农副产品，如玉米浆、玉米面、黄豆饼粉等能在发酵后期提供芽孢形成必须的辅酶、氨基酸等。在发酵培养基中选择6种不同的碳源，即玉米面、麸皮、葡萄糖、玉米淀粉、蔗糖、糊精，和6种不同的氮源，即玉米浆、黄豆饼粉、大豆蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨、磷酸二氢铵，研究它们对芽孢产量的影响。

筛选碳源时用酵母膏作为唯一的氮源，酵母膏浓度为0.8％；筛选氮源时用葡萄糖作为唯一的碳源，葡萄糖的浓度为1.1％；其余成分是诱导芽孢形成的盐溶液，具体成分如下：KH₂PO₄0.005％，(NH₄)₂SO₄0.006％，MnSO₄0.004％，CaCO₃0.004％，MgSO₄.7H₂O0.005％，pH6.5。

玉米面、麸皮、葡萄糖、玉米淀粉分别作为碳源，黄豆饼粉、大豆蛋白胨分别作为氮源时，芽孢产量都很高，芽孢转化率85～99％以上，芽孢产量在2×10⁸～5.5×10⁸cfu/ml，因此，选择这5种碳、氮源作为培养基成分进行接下来的试验设计。

2.2Plackett-Burman Design

上述1中筛选出的4种碳源、2种氮源和诱导芽孢形成的盐溶液组分，共11个因素，其编码值如表1所示，根据Plackettt-Burman Design，其试验设计及结果如表2所示。Plackettt-Burman Design方差分析(如表3所示)，可以看出玉米淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉、CaCO₃这4个因素的Prob>F值均＜0.05，因此这4个因素对芽孢产量具有显著性的影响，并且，从图还可以看出，对芽孢产量有显著影响的4个因素的效应值均为负值，所以它们对芽孢影响具有负效应。

表1Plackettt-Burman Design各因素的编码值

表2Plackettt-Burman Design试验设计及结果

表3Plackettt-Burman Design各因素效应及显著值

2.3、最陡爬坡试验设计

上述Plackettt-Burman Design筛选出的有显著影响的因素经最陡爬坡试验设计，其余因素的水平为零点，逼近最大芽孢产量区找到响应面试验各因素水平的中心点，从表4可以看出，Run4的条件下芽孢产量最高，此水平作为CCD设计的0水平值。

表4最陡爬坡试验设计结果

响应面优化设计

2.3.1、Plackettt-Burman Design设计筛选的对芽孢产量有显著影响的4个因素后，根据各因素的效应值设计最陡爬坡设计，逼近最大响应区间，最后进行响应面优化设计，本发明采用Composite Central Design(中心复合设计)，确定这4个因素的最佳水平值。

表5Composite Central Design各因素的编码值

表6Composite Central Design的试验设计及结果

2.3.2模型的建立和统计分析

根据所得数据进行多元回归分析，得到相应变量(玉米淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉、碳酸钙)与响应值(芽孢产量，lgY)之间的多元二次回归方程。

spore yields(lgY)＝+9.08143+0.032917X₁+0.064583X₂-0.087917X₃-0.016750X₄-0.099375X₁X₂+0.10312X₁X₃-0.029375X₁X₄-0.084375X₂X₃-0.074375X₂X₄-0.10938X₃X₄-0.014295X₁ ²-0.031795X₂ ²-0.095545X₃ ²-0.12629X₄ ²。

模型的回归系数R-Square＝0.9379，说明模型的拟合程度很高；信噪比(Adeq Precision)＝13.332＞4，进一步说明了模型可靠。对结果进行方差分析(如表7所示)，从表中可以看出模型的概率P<0.01，因此模型在0.01的水平上具有极显著性差异，模型可靠；因素X₂、X₃以及X₃ ²、X₄ ²的P均<0.05，说明它们对芽孢产量具有显著性的影响；X₁X₂、X₁X₃、X₂X₃、X₂X₄、X₃X₄的互作效应的P均<0.05，说明这些因素之间的互作效应对芽孢产量的影响具有显著性差异；失拟项(lack of fit)的概率P＝0.6219，说明在误差允许的范围内，失拟项不显著，模型可靠。

表7回归方程的方差分析

2.3.3实验结果分析及优化

利用Design-Expert8对上述多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应曲面图，响应曲面图均有最高点，对多元二次回归方程求导，得极值及极值点出4个显著因素的水平值，确定最佳发酵培养基配方。

实施例3

单因素试验设计考察PH、接种量、种龄、装液量对芽孢产量的影响

对上述优化完成的最优廉价发酵培养基为基础培养基，通过改变接种量、装液量、初始pH、种龄，考察了各因素对芽孢产量和转化率的影响，结果表明：接种量5～10％、装液量500ml摇瓶装50ml发酵培养基、初始pH7.0～7.5、种龄15～18h，发酵20～36h，无菌取样测定活性芽孢可达2×10⁹cfu/ml，转化率95％以上，比模型的预测值1.86×10⁹cfu/ml要高。

实施例4

最优培养基配方和最优发酵条件的验证

种子培养基成分，按照重量计，葡萄糖1％，玉米面1.8％，麸皮0.35％，黄豆饼粉0.1％，KH₂PO₄0.005～0.006％，(NH₄)₂SO₄0.006～0.008％，MnSO₄0.004～0.005％，CaCO₃0.004～0.005％，MgSO₄.7H₂O0.005～0.006％，其余为水，pH7.0。

产芽孢发酵培养基成分，按照重量计，玉米淀粉0.12％，葡萄糖0.4％，黄豆饼粉0.08％，玉米面0.5％，麸皮0.9％，大豆蛋白胨0.16％，KH₂PO₄0.005％，(NH₄)₂SO₄0.006％，MnSO₄0.004％，MgSO₄.7H₂00.005％，CaCO₃0.001％，其余为水，pH7.0。

发酵方法：无菌钩取一环已活化好的芽孢形成良好的甲基营养型芽孢杆菌，接种于种子培养基，36℃，转速180rpm条件下培养18h，作为发酵种子液。将发酵种子液按照10％的接种量接入到500L放大罐产芽孢发酵培养基，在罐压0.05Mpa，前期(0～4h)风量1:0.4vvm，后期1:0.5～1:0.6vvm，搅拌转速220～250rpm，培养温度36℃发酵24h。无菌取样检测芽孢转化率达95％，活性芽孢测试达到1.2×10⁹cfu/ml。

Claims (3)

1.一种权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌产芽孢发酵培养基，其特征在于，组分和重量含量为：玉米面0.5～0.6％，玉米淀粉0.08～0.2％，麸皮0.9～1.2％，葡萄糖0.18～0.54％，黄豆饼粉0.05～0.15％，大豆蛋白胨0.16～0.2％，KH₂PO₄0.005～0.006％，(NH₄)₂SO₄0.006～0.008％，MnSO₄0.004～0.005％，CaCO₃0.0005～0.002％，MgSO₄.7H₂O0.005～0.006％，余量为水，pH7.0～7.5。

2.一种权利要求1所述甲基营养型芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于，利用上述的产芽孢发酵培养基对海洋来源的甲基营养型芽孢杆菌进行培养，具体步骤如下：

(1)挑一环试管斜面上的菌种接种于改良淀粉平板培养基上，30℃下培养48～72h，显微镜下检测，选择中央芽孢形成均一，两端着色清晰的大菌落作为发酵种子；

(2)挑一环步骤(1)所述的发酵种子，接种于液体种子培养基，装液量为：500ml的摇瓶装50ml种子液，培养温度36℃，转速180rpm条件下培养15～18h，得到发酵种子液；

(3)将步骤(2)得到的发酵种子液，按照8～10％的接种量接入产芽孢发酵培养基，在发酵罐中进行发酵培养，培养条件为：罐压0.05～0.06Mpa，风量1:0.4～1:0.6vvm，转速220～250rpm，培养温度为35～37℃，经过24～28小时发酵，显微镜检测芽孢转化率达到80％以上即可终止发酵，以备进一步制备芽孢制剂。

3.按权利要求1所述甲基营养型芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于，液体种子培养基配方如下：葡萄糖1％，玉米面1.8％，麸皮0.35％，黄豆饼粉0.1％，KH₂PO₄0.005～0.006％，(NH₄)₂SO₄0.006～0.008％，MnSO₄0.004～0.005％，CaCO₃0.004～0.005％，MgSO₄.7H₂O0.005～0.006％，余量为水，pH7.0～7.5。