CN103396969A

CN103396969A - 侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌混合培养的发酵培养基及其发酵方法

Info

Publication number: CN103396969A
Application number: CN2013103617719A
Authority: CN
Inventors: 刘海明; 吕中文
Original assignee: BEIJING AEROSPACE HENGFENG TECH DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: Beijing Aerospace Hengfeng Polytron Technologies Inc
Priority date: 2013-08-19
Filing date: 2013-08-19
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-08-19
Also published as: CN103396969B

Abstract

本发明涉及侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌两种具有生防作用的微生物的混合培养方法，通过对培养基中碳源、氮源、无机盐等成分的改进，以及对发酵条件如pH值、温度、转速、通气量、接种量等调价的优化获得了可以显著提高两种微生物生物量的培养基及培养方法，另外，本发明还意外的发现，采用本申请的发酵方法可以使得得混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌的发酵过程达到完全同步一致，两株细菌的数量均能够在20小时之内达到最大，产芽孢率在90%以上，这是本领域技术人员无法预测得到的，具有预料不到技术效果。

Description

侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌混合培养的发酵培养基及其发酵方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，更具体涉及一种同步发酵侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的培养基和方法。

技术背景

半个世纪以来,化学农药防治病虫害对农业生产起了重要的作用,但长期不合理使用化学农药产生了诸多问题。化学农药的高毒、高残留不仅对人、畜的健康造成危害,而且对土壤、水体、大气造成严重污染,破坏生态平衡。同时,由于病菌和害虫抗药性的不断增强，农药的使用量和使用频度不断加大,出现了用药量与病害相互递增的恶性循环,增加了农产品中农药的残留量,对人畜安全构成极大的威胁。

近年来许多研究发现，芽孢杆菌对动物和植物的病原菌具有显著的拮抗作用，引起广大微生物和免疫学工作者的密切关注。目前,应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌(Bacillus spp.)、假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)、土壤放射杆菌(Agrobacterium radiobacter)、等。而芽孢杆菌(Bacillus spp.)是目前生防细菌中研究较多的一类,因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子,所以是理想的生防菌筛选对象。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌,其生理特征多样,分布广泛,极易分离培养。该菌在自然界中广泛存在,对人畜无毒无害,不污染环境,能产生多种抗菌素和酶,具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌不仅可以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在,而且是植物体内常见内生细菌,尤其是在植物的根、茎部。目前该菌已经在水稻、大豆、棉花、小麦、辣椒、番茄、玉米等农作物上显示出很好的病害防治效果。由于枯草芽孢杆菌具有生长快、营养简单以及产生耐热、抗逆芽孢等突出特征,而使其不仅有利于生防菌剂在生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖,并且批量生产工艺简单,成本较低,施用方便,储存期长,现已成为一种理想的生防细菌。

侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporu）短芽孢杆菌为革兰氏染色阴性,菌体呈细长的杆状;在对数生长期,为革兰氏染色阳性,菌体成短而粗的杆状;在静止期,革兰氏染色又转为阴性,菌体成细长的杆状,偶尔也能观察到椭圆形的芽孢。其周生鞭毛、大小约0.88μm×2.2μm。不从碳水化合物产气；不水解淀粉；兼性厌氧，葡萄糖培养液中培养物的pH小于8.0。国内外已报道侧孢短芽孢杆菌具有抗菌、杀虫、杀线虫、溶磷、降解有机污染物、生产赖氨酸和多种酶类物质等功能。

目前对枯草芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌的研究主要集中在抑菌作用、抑菌物质的分离纯化与表征、以及芽孢杆菌的产酶特性和在豆粕中的应用效果研究等。对于枯草芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌共同培养的技术，现有技术中仅有少量报道，也仅仅限制于肥料的制备领域。但是，在相同条件下获得更多生物量的枯草芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌同样具有重要意义，而现有技术中虽有少量报道，但效果均不明显。本申请要解决的技术问题即为在现有技术的基础上通过调整培养基成分以及发酵条件获得更多生物量的枯草芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌，且调整其发酵步骤，提高其产孢效率，为枯草芽孢杆菌与侧孢短芽孢杆菌共同在生防领域的应用奠定一个坚实的基础。

发明内容

本发明提供了一种可以同步发酵侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的培养基和方法。本发明提供的高密度混合培养侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的方法，具体如下：以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporu）为菌种，经活化后接种到发酵培养基中培养。

发酵培养基为：蔗糖2%‐4%，酵母膏0.5%‐1%，蛋白胨1%‐1.5%、K₂HPO₄0.25%、MgSO₄0.075%，MnSO₄0.01%，CaCl₂0.8%。pH6.0‐8.0；培养条件：培养温度30‐45℃、通气量120‐170m³/小时、转速180‐220rpm；接种量为1%‐3%（v/v），培养时间16‐18h。

更优选地，发酵培养基为：蔗糖3%，酵母膏0.8%，蛋白胨1.0%，MgSO₄0.075%，KH₂PO₄0.25%，MnSO₄0.01%，CaCl₂0.8%。温度32.5℃，压力0.12Mpa，通气量：150m³/小时，转速210rpm，接种量2%‐2.5%，pH7，培养时间为18h。

所述活化采用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g‐20g，蒸馏水1000mL，pH7.0‐7.2，37℃活化24h。

通过以上调整，使得枯草芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌的发酵过程达到完全同步一致，两株细菌的数量均能够在20小时之内达到最大，产芽孢率在90%以上。

本发明的显著优点：枯草芽孢杆菌与侧孢短芽孢杆菌是两种非常有应用价值和市场前景的微生态制剂，但其共同培养时存在一定的难度，如培养周期不一致，产孢率不高等问题，因此，要对其进行改良，使其在加工工艺、剂型和贮藏技术等环节上有所突破。本发明通过对培养基配方及培养条件的研究，克服了现有技术中的上述缺陷，为枯草芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌在生防等领域的进一步开发利用打下基础。

附图说明

图1芽孢杆菌的生长曲线，左纵轴为芽孢杆菌每毫升的细胞数，右坐标轴为OD₆₀₀值；

图2不同碳源对侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生长的影响，以OD₆₀₀值增加量指示生物量的增长；

图3蔗糖添加量对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生长的影响；

图4不同氮源对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生长的影响；

图5酵母膏添加量对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生长的影响；

图6不同无机盐种类对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生长的影响；

图7培养基初始pH值对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生长的影响；

图8培养温度对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生长的影响；

图9转速对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生长的影响；

图10通气量对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生长的影响；

图11接种量对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生长的影响。

具体实施方式

以下实施例采用的侧孢短芽孢杆菌以及枯草芽孢杆菌购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）的两种菌株进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此,凡市场上可购买到的上述两种菌株均适用于本发明。

实施例1侧孢短芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的活化

活化培养基的平板制备：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g‐20g，蒸馏水1000mL，121℃,高压灭菌，20min，每块平板倒入15‐20ml，超净台中冷却凝固后，加盖板，封口，4℃保存备用。

将购买得到的保存于半固体培养基中的菌株拿于室温下，超净台中用经高压灭菌过的牙签蘸取培养基，然后“之”字形划平板，37℃倒置培养过夜。

过夜后由平板中挑出单克隆，接种于液体活化培养基中，所述的培养基为牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，，蒸馏水1000mL，121℃,高压灭菌，20min，37℃，180rpm摇床过夜，得到种子菌液，收集菌液，4℃保存备用。

实施例2侧孢短芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌混合培养生长曲线的测定

将侧孢短芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌活化后，分别以2.5%（v/v）的接种量接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.0‐7.2）中，通气量150m³/小时，在30℃、200r/min下培养，分别采用分光光度法和平板菌落计数法测定不同培养时间时的OD₆₀₀值和菌落数，以培养时间为横坐标、分别以OD₆₀₀值和菌落数为纵坐标绘制生长曲线图（图1）。由生长曲线确定侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的混合培养时间为18h。

实施例3培养基的优化以及对侧孢短芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌混合培养基配方优化

以牛肉膏蛋白胨液体培养基为基础培养基，研究不同碳源、氮源、无机盐对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响。培养条件：接种量5%（v/v），通气量150m³/小时，在30℃、200r/min下培养18h。

3.1碳源种类对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

分别以1%（表示g/100mL，以下类同）的蔗糖、环糊精、麦芽糖、可溶性淀粉、乙酸钠、葡萄糖为碳源，取代牛肉膏蛋白胨液体培养基中的牛肉膏，考察它们对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响，以碳源种类为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标作图。图2显示，以蔗糖为碳源时，混合培养的芽孢杆菌的OD₆₀₀增长量最大，为1.198（菌悬液稀释10倍测定）；而用环糊精和可溶性淀粉作为碳源时，OD₆₀₀增长量较小。综合细胞生物量和培养基成本进行考虑，确定采用蔗糖作为碳源。

3.2蔗糖添加量对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

比较蔗糖不同添加量对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生长的影响，以碳源添加量为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标作图，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图3）。结果表明，随着蔗糖添加量的增加，OD₆₀₀增长量也不断提高；当蔗糖添加量为3%时，混合培养的芽孢杆菌的OD₆₀₀增长量达到最高，为0.644；随之继续增加蔗糖的添加量，OD₆₀₀增长量下降。因此，确定混合培养侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌最适添加量为3%。

3.3额外添加氮源种类对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

在碳源优化的基础上，即在基础培养基含有1.0%的蛋白胨基础上再额外添加0.5%的酵母膏、磷酸二氢铵、氯化铵、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钠为氮源，考察它们对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响，以氮源种类为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标作图（图4）。结果表明在额外添加氮源时，混合培养的两种芽孢杆菌的生物量均有所上升，但是当额外添加酵母膏时，OD₆₀₀增长量最高，为0.975；而采用无机氮源时，细胞生物量相对较低，因此选取酵母膏作为培养基的额外添加氮源。

3.4酵母膏的额外添加量对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

以酵母膏添加量为横坐标，以OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图5）。结果表明，随着酵母膏添加量的增加，OD₆₀₀增长量也随之提高；当酵母膏添加量为0.8%时，混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的OD₆₀₀增长量达到最高，为0.718；随后继续增加酵母膏的添加量，OD₆₀₀增长量有所下降。因此，确定混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的酵母膏最适添加量为2.25%。

3.5无机盐种类对混合培养的侧孢短芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

在碳源、氮源优化的基础上，分别以0.01%的磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、钼酸钠、硫酸锰、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁为无机盐添加到培养基中，以无机盐种类为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图6），确定最佳无机盐。结果表明，当以CaCl₂、K₂HPO₄、MgSO₄、MnSO₄作为无机盐时，混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的OD₆₀₀增长量较大，分别为0.771、0.752、0.788，0.705，因此选择CaCl₂、K₂HPO₄、MgSO₄、MnSO₄作为混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌培养的最佳无机盐。在确定最佳无机盐种类的基础上，进一步深入研究无机盐的最适添加量及其相互作用。

3.6无机盐添加量对混合培养的侧孢短芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

不同的微生物生长所需的无机盐种类和浓度不同。上述实验结果表明，CaCl₂、K₂HPO₄和MgSO₄、MnSO₄对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生长的影响较为明显，因此以这四种盐为考察因素设计正交试验L₉（3⁴），对无机盐配方进行优化。通过单因素试验，初步确定上述无机盐的较优水平分别为K₂HPO₄0.1‐0.35%、MgSO₄0.01%‐0.1%，MnSO₄0.01%，CaCl₂0.5%‐1%。

表1混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌无机盐优化正交试验因素和水平表

因素

表2混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌无机盐优化正交试验结果

因素

由表2可知，影响混合芽孢杆菌生长的无机盐主次顺序为B＞C＞A＞D，最优组合为B₂C₂A₃D₂；但从正交表中试验数据可以看出，OD₆₀₀增长量最高的组合为B₂C₂A₁D2。进一步进行无机盐正交试验的验证试验，在这两种组合条件下分别将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀，组合B₂C₂A₂D₂的OD₆₀₀增长量为0.967，组合B₂C₂A₃D₂的OD₆₀₀增长量为0.813，而B₂C₂A₁D2的OD600增长量为0.787，因此经过验证试验确定最佳组合为B₂C₂A₂D₂，即MgSO₄0.075%，KH₂PO₄0.25%，MnSO40.01%，CaCl₂0.8%。

实施例4培养条件对混合培养侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

4.1培养基初始pH值对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

在碳源、氮源和无机盐优化的基础上，调节混合培养的侧孢短芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的发酵培养基初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，以培养基初始pH值为横坐标，以OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图7）。结果表明，随着培养基初始pH值的升高，其OD₆₀₀增长量也随之增加；当pH值为7时，混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的OD₆₀₀增长量达到最高，为1.128；继续升高培养基pH值，OD₆₀₀增长量下降，因此，确定混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的最佳培养基初始pH值为7.0。

4.2培养温度对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

将侧孢短芽孢杆菌和混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌分别以 2.5%（v/v）的接种量接种到已优化的发酵培养基中，分别置于25℃、30℃、32.5℃，35℃、40℃、45℃，在200r/min条件下培养18h，以培养时间为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图8）。结果表明，当温度为32.5℃时，混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的OD₆₀₀值最高，为0.716。因此，确定32.5℃为混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的最适培养温度。

4.3溶氧对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

4.3.1转速对混合培养的侧孢短芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

将侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌分别以2.5%（v/v）的接种量接种到已优化的发酵培养基中，分别在100r/min、130r/min、170r/min、200r/min、230r/min、260r/min的转速下，45℃培养18h。以转速为横坐标，以OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图9）。结果表明，随着转速的增加，混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的OD₆₀₀增长量上升，当转速为170r/min时，OD₆₀₀增长量达到最大值，为0.985。当继续增加转速到200r/min时，OD₆₀₀增长量开始下降。因此，选择170r/min为混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌培养的最佳转速。

4.3.2通气量对混合培养的侧孢短芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

将侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌分别以2.5%（v/v）的接种量接种到已优化的发酵培养基中，分别选取100m³/小时，120m³/小时，150m³/小时，180m³/小时，200m³/小时五种不同的通气量，在32.5℃、170r/min下培养18h。以培养基通气量为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图10）。结果表明，当通气量为150m³/小时时，OD₆₀₀增长量最高，为1.147，因此，选择150m³/小时作为培养基的初始通气量。

4.3.3培养条件正交试验

设计正交试验L₂₇（3¹³）对混合培养的侧孢短芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的培养条件进行优化，以考察温度、培养基初始pH、转速、通气量四个因素对菌株生长的影响，根据单因素的实验优化结果选取因素水平，正交试验设计及分析见表3、表4和表5。

表3混合培养的侧孢短芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌培养条件优化因素水平表

表4混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌培养条件优化正交试验结果

表5方差分析表

从表5可以看出，温度和通气量对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生长具有显著性影响。通过表4分析计算可知，最优的实验组合为A₁B₂C₃D₂，而在27组实验中，OD₆₀₀增长量最高的组合为A₁B₃C₃D₂，由于B因素和C因素即pH值和转速影响并不显著，因此选择有利于菌体生长的最优组合为A₁B₂C₃D₂。进一步进行混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌培养条件正交试验的验证试验，即选取A₁B₃C₃D₂和A₁B₂C₃D₂两种条件培养混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，菌悬液稀释10倍后测定其OD₆₀₀值。在最优组合A₁B₂C₃D₂的条件下，其菌悬液的OD₆₀₀增长量为0.835，在组合A₁B₃C₃D₂的条件下，其菌悬液的OD₆₀₀增长量为0.757，因此经验证试验确定混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌培养条件的最优组合为A₁B₂C₃D₂，即温度32.5℃，培养基初始pH7.0，转速210r/min，通气量150m³/小时。

4.3.4接种量对混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌细胞生物量的影响

在培养基成分和培养条件优化后的基础上，将活化好的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌分别以1%（v/v）、2%（v/v）、3%（v/v）、5%（v/v）、7%（v/v）、10%（v/v）的接种量接种到发酵培养基中，以接种量为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图11）。结果表明，接种量对菌株生长的影响不大，混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌接种量为2.5%时，OD₆₀₀增长量最大，为0.537。因此，确定混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的最佳接种量为2.5%（v/v）。

小结

优化后的混合培养侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的发酵培养基为：蔗糖3%，酵母膏0.8%，蛋白胨1.0%，MgSO₄0.075%，KH₂PO₄0.25%，MnSO40.01%， CaCl₂0.8%。发酵条件为温度32.5℃，压力0.12Mpa，通气量：150m³/小时，转速200rpm，接种量2%‐2.5%，pH70，培养时间为18h。

实施例5优化试验

优化前培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.0‐7.2；

优化前的培养条件：培养温度30℃、转速200r/min、通气量通气量120m³/小时，接种量为5%（v/v），培养时间24h。

采用优化后的培养基配方及培养条件进行混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的发酵生产。将菌悬液稀释25倍后测定OD₆₀₀，其优化前的OD₆₀₀增长量为0.131，优化后的OD₆₀₀增长量为0.6276；优化后的细胞生物量为5.32×10⁹cfu/mL，比优化前提高了41.48倍。同时，本实验还意外的发现，采用上述的发酵条件，使得得混合培养的侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌的发酵过程达到完全同步一致，两株细菌的数量均能够在20小时之内达到最大，产芽孢率在90%以上，这是本领域技术人员无法预测得到的，具有预料不到技术效果。

Claims

1.一种混合培养侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的发酵培养基，其特征在于所述培养基包含蔗糖2%-4%，酵母膏 0.5%-1%，蛋白胨 1%-1.5%、K₂HPO₄ 0.1-0.35%、MgSO₄0.01%-0.1%，MnSO₄ 0.01%，CaCl₂ 0.5%-1%,其中所述百分含量为本领域常规采用的g/100ml计算。

2.如权利要求1所述的混合培养侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的发酵培养基，其特征在于，所述的组分含量具体为蔗糖 3%，酵母膏 0.8%，蛋白胨 1.0%，MgSO₄0.075%，KH₂PO₄ 0.25%，MnSO₄ 0.01%，CaCl₂0.8%。

3.一种利用权利要求1-2任一项所述的发酵培养基混合培养侧孢短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的方法。

4.根据权利要求3所述的方法，所述的方法能够使得枯草芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌的发酵过程达到完全同步一致，两株细菌的数量均能够在20小时之内达到最大，产芽孢率在90%以上。

5.如权利要求3-4任一项所述的混合培养方法，所述的发酵条件为培养温度30-45℃、通气量120-170m³/小时、转速180-220rpm；接种量为1%-3%（v/v），培养时间16-18h。

6.如权利要求3-4任一项所述的混合培养方法，所述的发酵条件为温度32.5℃，压力0.12Mpa，通气量：150m³/小时，转速210rpm，接种量2%-2.5%，pH 7，培养时间为18h。

7.如权利要求3-4任一项所述的混合培养方法，其中还包括菌种的活化，所述的活化培养基为牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，琼脂15g-20g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2，活化条件为37℃活化24h。