CN102559564B

CN102559564B - 一种高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法

Info

Publication number: CN102559564B
Application number: CN 201210056279
Authority: CN
Inventors: 林娟; 陈晓红; 叶秀云; 李仁宽; 严芬; 杨捷
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2012-03-06
Filing date: 2012-03-06
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2032-03-06
Also published as: CN102559564A

Abstract

本发明属于微生物发酵领域，更具体涉及一种高密度培养多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）的方法，以提高多粘类芽孢杆菌的菌体产量。该方法以多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）为菌种，经活化后接种到发酵培养基中培养。经过优化，多粘类芽孢杆菌的细胞生物量可达5.3×10⁹cfu/mL，比优化前（3.17×10⁸cfu/mL）提高了15.72倍。本发明通过对培养基配方及培养条件的研究，为多粘类芽孢杆菌的工业化发酵生产以及进一步开发利用打下基础。

Description

一种高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，更具体涉及一种高密度培养多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）的方法。

技术背景

多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是一种产芽孢的G⁺细菌，对人或动植物没有致病性，可产生多肽抗生素、拮抗蛋白、酶、植物激素、絮凝剂等多种生物活性物质，兼有生物农药和生物菌肥的作用，已广泛应用于农业、工矿业及废水处理等领域。美国环境保护署（EPA）已将其列为可在商业上应用的微生物种类之一，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种。

多粘类芽孢杆菌是一种植物根际促生细菌，一方面可以用作微生物肥料，促进植物生长、提高作物产量；另一方面，可以有效防治植物细菌性和真菌性土传病害，对植物青枯病、番茄枯萎病、油菜腐烂病、黑松根腐病等多种植物病害具有很好的防治效果。

传统农业中化学农药的过量使用不仅会增加农药残留量，同时导致了许多作物病虫害的抗药性，并对土壤、水体及生态环境造成污染。随着社会的进步，人们生活水平的提高，对食品安全的意识不断加强，在这种情况下应用高效、广谱、安全、无毒的有益微生物进行植物疫病的防治越来越受到人们的重视。多粘类芽孢杆菌产生的多肽类抗菌物质对植物病原真菌具有很好的拮抗活性，且性质比较稳定，可用于多种植物病害的生物防治。因此，多粘类芽孢杆菌是一类极具开发前景和应用价值的生防细菌。

目前国内对多粘类芽孢杆菌的研究主要集中在菌种的筛选、分离鉴定、抑菌效果以及对发酵液化学成分的分析，而对于多粘类芽孢杆菌的发酵培养方面还罕见报道。

发明内容

本发明提供了一种高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法，以提高多粘类芽孢杆菌的菌体产量。

本发明提供的高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法，具体如下：以多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）为菌种，经活化后接种到发酵培养基中培养。

发酵培养基为：可溶性淀粉 15-20g/L、蛋白胨 20-25 g/L、NaCl 0.5-1.25 g/L、Na₂HPO₄ 0.2-0.5 g/L、CaCl₂ 0. 5-1.0g/L，pH7.0-8.0；培养条件：培养温度30-33℃、转速170-200r/min、装液量60-80mL/250mL；接种量为10-15%（v/v），培养时间18-20h。

更优选地，可溶性淀粉 17.5 g/L、蛋白胨 25.0 g/L、NaCl 1.25 g/L、Na₂HPO₄ 0.5 g/L、CaCl₂ 1.0 g/L，pH7.5；培养条件：培养温度30℃、转速170r/min、装液量80mL/250mL；接种量为10%（v/v），培养时间18h。

所述活化采用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，琼脂15g-20g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2，37℃活化24h。

经过以上条件优化，多粘类芽孢杆菌的细胞生物量可达5.3×10⁹cfu/mL，比优化前（3.17×10⁸cfu/mL）提高了15.72倍。

本发明的显著优点：多粘类芽孢杆菌是一种非常具有应用潜力的生物农药和微生物肥料，但要实现商业化，还必须加强培养基及培养条件优化等方面的研究。本发明通过对培养基配方及培养条件的研究，为多粘类芽孢杆菌的工业化发酵生产以及进一步开发利用打下基础。

附图说明

图1为多粘类芽孢杆菌的生长曲线；

图2为不同碳源对多粘类芽孢杆菌生长的影响；

图3为可溶性淀粉添加量对多粘类芽孢杆菌生长的影响；

图4为不同氮源对多粘类芽孢杆菌生长的影响；

图5为蛋白胨添加量对多粘类芽孢杆菌生长的影响；

图6为不同无机盐种类对多粘类芽孢杆菌生长的影响；

图7为培养基初始pH值对多粘类芽孢杆菌生长的影响；

图8为培养温度对多粘类芽孢杆菌生长的影响；

图9为转速对多粘类芽孢杆菌生长的影响；

图10为培养基装液量对多粘类芽孢杆菌生长的影响；

图11为接种量对多粘类芽孢杆菌生长的影响。

具体实施方式

以下实施例采用的多粘类芽孢杆菌为多粘类芽孢杆菌S-7（参考文献：史应武等，内生多粘类芽孢杆菌S-7对甜菜光合作用及产量和品质的影响. 应用生态学报，2009,20（3）：597-602.），进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

1．多粘类芽孢杆菌生长曲线的测定

将多粘类芽孢杆菌活化后，以5%（v/v）的接种量接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基（牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2）中，装液量100mL/250mL，在30℃、200r/min下培养，分别采用分光光度法和平板菌落计数法测定不同培养时间时的OD₆₀₀值和菌落数，以培养时间为横坐标、分别以OD₆₀₀值和菌落数为纵坐标绘制生长曲线图（图1）。由生长曲线确定多粘类芽孢杆菌的最佳培养时间为18h。

2．多粘类芽孢杆菌的培养基配方优化

以牛肉膏蛋白胨液体培养基为基础培养基，研究不同碳源、氮源、无机盐对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响。培养条件：接种量5%（v/v），装液量100mL/250mL，在30℃、200r/min下培养18h。

2.1 碳源种类对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响

分别以1%（表示g/100mL，以下类同）的蔗糖、环糊精、麦芽糖、可溶性淀粉、乙酸钠、葡萄糖为碳源，取代牛肉膏蛋白胨液体培养基中的牛肉膏，考察它们对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响，以碳源种类为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标作图。图2显示，以可溶性淀粉为碳源时，多粘类芽孢杆菌的OD₆₀₀增长量最大，为1.184；而用乙酸钠和葡萄糖作为碳源时，OD₆₀₀增长量较小。综合细胞生物量和培养基成本进行考虑，确定采用可溶性淀粉作为碳源。

2.2 碳源添加量对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响

比较可溶性淀粉不同添加量对多粘类芽孢杆菌生长的影响，以碳源添加量为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标作图（图3）。结果表明，随着可溶性淀粉添加量的增加，OD₆₀₀增长量也不断提高，当碳源添加量为1.75%时，多粘类芽孢杆菌的OD₆₀₀增长量达到最高，为0.982。随之继续增加可溶性淀粉的添加量，OD₆₀₀增长量缓慢下降。因此，确定多粘类芽孢杆菌可溶性淀粉的最适添加量为1.75%。

2.3 氮源种类对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响

在碳源优化的基础上，分别以1%的蛋白胨、磷酸二氢铵、氯化铵、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钠为氮源，考察它们对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响，以氮源种类为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标作图（图4）。结果表明，多粘类芽孢杆菌利用蛋白胨作为氮源时，OD₆₀₀增长量最高，为0.942；而采用无机氮源时，细胞生物量相对较低，因此选取蛋白胨作为培养基的氮源。

2.4 氮源添加量对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响

以蛋白胨添加量为横坐标，以OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图5）。结果表明，随着蛋白胨添加量的增加，OD₆₀₀增长量也随之提高；当蛋白胨添加量为2.5%时，多粘类芽孢杆菌的OD₆₀₀增长量达到最高，为0.679；随后继续增加蛋白胨的添加量，OD₆₀₀增长量有所下降。因此，确定枯多粘类芽孢杆菌的蛋白胨添加量为2.5%。

2.5 无机盐种类对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响

在碳源、氮源优化的基础上，分别以0.5%的磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、钼酸钠、硫酸锰、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁为无机盐添加到培养基中，以无机盐种类为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图6），确定最佳无机盐。结果表明，当以NaCl、Na₂HPO₄和CaCl₂作为无机盐时，多粘类芽孢杆菌的OD₆₀₀增长量较大，分别为1.101、0.825、0.748，因此选择NaCl、Na₂HPO₄和CaCl₂作为多粘类芽孢杆菌培养的最佳无机盐。在确定最佳无机盐种类的基础上，进一步深入研究无机盐的最适添加量及其相互作用。

2.6 无机盐添加量对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响

不同的微生物生长所需的无机盐种类和浓度不同。上述实验结果表明，NaCl、Na₂HPO₄和CaCl₂对多粘类芽孢杆菌生长的影响较为明显，因此以这三种盐为考察因素设计正交试验L₉（3⁴），对无机盐配方进行优化。通过单因素试验，初步确定上述无机盐的较优水平分别为NaCl 0%-0.25%、Na₂HPO₄0%-0.1%、CaCl₂ 0%-0.1%。

表1 多粘类芽孢杆菌无机盐优化正交试验因素和水平表

Figure 2012100562796100002DEST_PATH_IMAGE002

表2 多粘类芽孢杆菌无机盐优化正交试验结果

可知，影响多粘类芽孢杆菌生长的无机盐主次顺序为C＞A＞B，最优组合为C₃A₂B₂，同时从正交表中试验数据可以看出，OD₆₀₀增长量最高的组合也为此组合，因此确定无机盐的最佳组合为CaCl₂ 0.1%、NaCl 0.125%、Na₂HPO₄ 0.05%。

2.7 培养基初始pH值对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响

在碳源、氮源和无机盐优化的基础上，调节多粘类芽孢杆菌的发酵培养基初始pH分别为4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0，以培养基初始pH值为横坐标，以OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图7）。结果表明，随着培养基初始pH值的升高，其OD₆₀₀增长量也随之增加；当在pH7-8范围内时，多粘类芽孢杆菌的OD₆₀₀增长量都较高，当pH值为7.5时，达到最高，为0.616。继续升高培养基pH值，OD₆₀₀增长量下降，因此，确定多粘类芽孢杆菌的最佳培养基初始pH值为7.5。

3．多粘类芽孢杆菌的培养条件优化

在发酵培养基（可溶性淀粉 17.5 g/L、蛋白胨 25.0 g/L、NaCl 1.25 g/L、Na₂HPO₄ 0.5 g/L、CaCl₂ 1.0 g/L，pH7.5）优化的基础上，进一步对多粘类芽孢杆菌的培养条件进行优化。

3.1 温度对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响

将多粘类芽孢杆菌以5%（v/v）的接种量接种到已优化的发酵培养基中，分别置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃下，在200r/min条件下培养18h，以培养温度为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标，菌悬液稀释5倍后测定OD₆₀₀（图8）。结果表明，当温度为30℃时，多粘类芽孢杆菌的OD₆₀₀值最高，为0.610。因此，确定30℃为多粘类芽孢杆菌的最适培养温度。

3.2 溶氧对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响

3.2.1 转速对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响

将多粘类芽孢杆菌以5%（v/v）的接种量接种到已优化的发酵培养基中，分别在100r/min、130r/min、170r/min、200r/min、230r/min、260r/min的转速下，30℃培养18h。以转速为横坐标，以OD₆₀₀增长量为纵坐标，菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图9）。结果表明，随着转速的增加，多粘类芽孢杆菌的OD₆₀₀增长量上升，当转速为170r/min时，OD₆₀₀增长量达到最大值，为0.620。当继续增加转速到200r/min时，OD₆₀₀增长量开始下降。因此，选择170r/min为多粘类芽孢杆菌培养的最佳转速。

3.2.2 培养基装液量对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响

5%（v/v）的接种量接种到已优化的发酵培养基中，分别选取40mL/250mL、60mL/250mL、80mL/250mL、100mL/250mL、120mL/250mL、140mL/250mL六种不同的培养基装液量，在30℃、170r/min下培养18h。以培养基装液量为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图10）。结果表明，装液量对菌种的生长影响不大，当装液量为80mL/250mL时，OD₆₀₀增长量最高，为0.861，因此，选择80mL/250mL作为培养基的初始装液量。

3.3 培养条件正交试验

设计正交试验L₂₇（3¹³）对多粘类芽孢杆菌的培养条件进行优化，以考察温度、培养基初始pH、转速、装液量四个因素对菌株生长的影响，根据单因素的实验优化结果选取因素水平，正交试验设计及分析见表3、表4和表5。

表3 多粘类芽孢杆菌培养条件优化因素水平表

表4 多粘类芽孢杆菌培养条件优化正交试验结果

表5 方差分析表

从表5可以看出，温度对多粘类芽孢杆菌的生长具有显著性影响，其他三个因素影响不显著。从表4中可以看出，影响菌体生长的最佳组合为A₂B₂C₂D₂，而正交表中OD₆₀₀增长量最高的为A₂B₂C₂D₁，两种组合的差别在于装液量的多少之差，因此从节约生产成本的出发点考虑，选择A₂B₂C₂D₂为最佳组合，即温度30℃，pH7.5，转速170r/min，装液量80mL/250mL。

3.4 接种量对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响

在培养基成分和培养条件优化后的基础上，将活化好的多粘类芽孢杆菌分别以1%（v/v）、3%（v/v）、5%（v/v）、10%（v/v）、15%（v/v）、20%（v/v）的接种量接种到发酵培养基中，以接种量为横坐标，OD₆₀₀增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD₆₀₀（图11）。结果表明，接种量对菌株生长的影响不大，接种量为10%（v/v）时，OD₆₀₀增长量最大，为0.584。因此，确定多粘类芽孢杆菌的最佳接种量为10%（v/v）。

3．小结

优化后的多粘类芽孢杆菌的培养基配方及培养条件为：可溶性淀粉 17.5 g/L、蛋白胨 25.0 g/L、NaCl 1.25 g/L、Na₂HPO₄ 0.5 g/L、CaCl₂ 1.0 g/L，pH7.5；培养温度30℃、转速170r/min、装液量80mL/250mL；接种量为10%（v/v）；培养时间18h。

实施：优化试验

优化前培养基配方：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2；

优化前的培养条件：培养温度30℃、转速200r/min、装液量100mL/250mL、接种量为5%（v/v）、培养时间24h。

采用优化后的培养基配方及培养条件进行多粘类芽孢杆菌的发酵生产。将菌悬液稀释5倍后测定OD₆₀₀，其优化前的OD₆₀₀增长量为0.131，优化后的OD₆₀₀增长量为1.048；优化后的细胞生物量为5.3×10⁹cfu/mL，比优化前（3.17×10⁸cfu/mL）提高了15.72倍。

Claims

1.一种高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法，其特征在于：以多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）为菌种，经活化后接种到发酵培养基中培养；采用的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）为多粘类芽孢杆菌S-7；

2.根据权利要求1所述的高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法，其特征在于：

所述发酵培养基为：可溶性淀粉 17.5 g/L、蛋白胨 25.0 g/L、NaCl 1.25 g/L、Na₂HPO₄ 0.5 g/L、CaCl₂ 1.0 g/L，pH7.5。

3.根据权利要求1所述的高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述培养条件为：培养温度30℃、转速170r/min、装液量80mL/250mL；接种量为10%（v/v），培养时间18h。

4.根据权利要求1所述的高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述活化采用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，琼脂15g-20g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2，37℃活化24h。