CN103602621B

CN103602621B - 一种绿针假单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN103602621B
Application number: CN201310630644.4A
Authority: CN
Inventors: 陈怀谷; 邓渊钰; 郑青松; 孙海燕; 李伟; 张爱香
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-12-02
Filing date: 2013-12-02
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2033-12-02
Also published as: CN103602621A

Abstract

本发明涉及一种保藏号为CGMCC：8431的绿针假单胞菌及其应用，所述绿针假单胞菌可进一步制成生防菌剂，用于防治小麦全蚀病，具有明显的防治效果，弥补了化学药剂防效欠佳的不足，由于绿针假单胞菌菌株能在小麦根际定殖，所以该菌剂有较长的持效期；并且其使用不会带来环境问题，有利于小麦的无公害生产。

Description

一种绿针假单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是一种绿针假单胞菌及其应用。

背景技术

小麦全蚀病（Take-all），又称“黑脚”病，是一种典型的根部土传病害，主要由禾顶囊壳小麦变种Gaeumannomyces graminis var. tritici（Ggt）导致。病原菌一般侵染小麦根部和茎基部1-2节的部位，小麦全蚀病在苗期和成熟期均可发生，拔节期病株症状较为明显，叶片变黄，病根变黑，当小麦进入成熟期时，出现白穗症状。

小麦全蚀病最早于1852年在南澳大利亚发现，后来在意大利北部狗牙根和冰草的死茎上发现小麦全蚀病，之后相继在各个国家出现，并且日趋严重，对小麦的产量造成巨大损失。1931年，小麦全蚀病第一次在我国浙江省发现，目前全蚀病在我国江苏、安徽、河南等22个省均有不同程度发生，其中以河南、山东等地发生最为严重，河南2012年发病面积450万亩。全蚀病破坏小麦根系，可造成受害麦田减产20％~50％，严重者甚至绝收。全蚀病已被列为河南、江苏、安徽等多个省的补充检疫病害。

人们虽然提出要利用农业措施和选种抗病品种等手段来综合防治小麦全蚀病，但是包括轮作、增施肥料和调节土壤的酸碱度的农业措施因可操作性不强而很少被采用。全蚀病抗性品种的选育还处于探索阶段。目前生产上对小麦全蚀病的防治主要还是依靠化学杀菌剂进行种子处理。针对全蚀病常用的杀菌剂有硅噻菌胺、苯醚甲环唑和戊唑醇等，因为全蚀病在根部发生，这些药剂只能做拌种处理。这些药剂处理在小麦生长的早期都能表现出良好的效果，但到中后期，它们对全蚀病的控制效果却很不理想，这是因药剂在环境中的衰减所致。除持效期短以外，这些化学药剂的使用还会给环境造成一定的负面影响，因此，单一地依靠化学杀菌剂来防治小麦全蚀病并非长久之计。

小麦全蚀病有自然衰退现象，即在连作小麦田，当全蚀病发展到高峰后，在不采取任何防治措施的情况下，会出现全蚀病自然减轻甚至消失的现象。国内外大量的研究表明全蚀病的衰退主要是由于土壤中的拮抗微生物所致，这提示人们利用拮抗菌剂的来控制小麦全蚀病或许就是一项不错的选择。作为研究小麦病害的项目组，我们开展了小麦全蚀病的生物防治研究工作，筛选到对小麦全蚀病菌具有显著拮抗作用的菌株，并通过小试将其制成菌剂，在国内外还没有商品化的小麦全蚀病生防菌剂的背景下，此项工作具有重要的意义。

发明内容

针对小麦生产中危害较大的小麦全蚀病，提供一种能够在小麦根际定殖、对小麦全蚀病菌具有拮抗作用的生防菌菌株，并进一步制成生防菌剂，实现对小麦全蚀病的防控。

本发明是这样实现的：

一种绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis），其特征在于：保藏号为CGMCC：8431。

本发明中，由绿针假单胞菌制成的菌剂。

本发明中，所述绿针假单胞菌在防治小麦全蚀病方面的应用。

本发明的优点在于：

（1）绿针假单胞菌制剂对小麦全蚀病具有明显的防治效果，弥补了化学药剂防效欠佳的不足，为小麦全蚀病的综合防治增加了一种手段；

（2）由于绿针假单胞菌菌株能在小麦根际定殖，所以该菌剂有较长的持效期；

（3）绿针假单胞菌制剂是生物制剂，且该菌株本身就分离自小麦的根际，因此它的使用不会带来一系列的环境问题，也有利于小麦的无公害生产。

具体实施方式

实施例1绿针假单胞菌菌株的分离筛选

1.绿针假单胞菌的分离

取小麦根系上吸附的土样10g，加入90ml无菌水中，充分震荡，得10^-1稀释液；继续加入无菌水稀释，获得10^-5、10^-6和10^-7的稀释液，分别取0.2ml上述三种稀释液在LB平板上涂布，25℃培养48小时，挑取单菌落接种到LB固体培养基斜面上保存；

2.绿针假单胞菌的筛选

A)将步骤1各斜面上的细菌分别接种到1mlLB液体培养基中，在28℃ 120r/min下震荡培养12小时;

B)将禾顶囊壳小麦变种（Gaeumannomyces graminis var. tritici）强致病力菌株G1037（以下简称G1037）的5mm菌碟接种到PDA平板的中心，培养48小时后，在G1037菌落的四周沿四个方向等距离的位置用灭菌的牙签点接上步骤A中在LB液体培养基中的细菌，72 小时后测量每种细菌对G1037的抑菌带宽度，初筛出具有拮抗作用的菌株，然后再用相同的方法进行复筛。挑选出抑菌带最宽的菌株，我们把它命名为GP51，该菌株菌体杆状，大小为0.3μm-0.8μm×1.0μm-1.1μm，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动；在KMB培养基上培养24h后可形成1.2mm菌落，菌落可产生橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐。将该菌株用甘油保存。

将GP51菌株的16S rDNA的片段克隆后委托南京金斯瑞公司测序，测出的序列在NCBI网站中进行BLAST。结果显示该序列与登录号为NZ_CM001490的Pseudomonas chlororaphis的16S rDNA的序列相似度达到99%，结合该菌株的形态学特征和生理生化分析，将该菌株鉴定为绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）。

将GP51菌株寄送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)进行保藏，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所,邮编是100101，保藏号为CGMCC No.8431。

实施例2 GP51菌株的生理生化分析

注：+为阳性，-为阴性

实施例3 GP51菌株的基因组中的抗生素合成相关基因的分子生物学检测

用PCR的方法检测GP51菌株的基因组中四种抗生素的合成相关基因：2,4-二乙酰基间苯三酚(phlD)、吩嗪(phzCD)、藤黄绿脓菌素(pltC)、硝吡咯菌素(prnC)。这四种抗生素是假单胞菌属细菌所产生的主要抗生素种类。所用引物如下表：

GP51菌株的基因组中吩嗪和硝吡咯菌素的合成相关基因可以的检测到； 2,4-二乙酰基间苯三酚和藤黄绿脓菌素的合成相关基因没有检测到。为了进一步确定所检测到的基因是否为目的基因，将检测到的基因分别进行克隆测序，所得序列在NCBI网站中分别进行BLAST。

用phzCD引物所得到的序列与登录号为HM594285的Pseudomonas chlororaphis strain GP72 phenazine biosynthesis gene cluster, complete sequence的相似度达99%，说明其为吩嗪合成相关基因。

用prnC引物所得到的序列与登录号为EU188755的Pseudomonas chlororaphis pyrrolnitrin biosynthetic gene cluster, complete sequence的相似度达99%，说明其为硝吡咯菌素合成相关基因。

因此GP51基因组中含有吩嗪和硝吡咯菌素的合成相关基因。

实施例4 绿针假单胞菌菌剂制备

将实施例1获得的绿针假单胞菌GP51接种到三角瓶中的LB液体培养基中，在32℃ 120r/min下震荡培养16小时，形成种子液。在将种子液按1:400的体积比例接种到发酵罐中的培养料中进行发酵生产，发酵罐的基本工作参数为：温度：32~35℃，搅拌速度：120r/min，PH：6.5~7.0，溶解氧：30%，罐压：0.04MPa。22小时后终止发酵，然后6500r/min离心10min,,取沉淀物用无菌水稀释制成菌剂。检测得菌剂中活菌的浓度为1*10⁹-1*10¹⁰CFU/ml。

实施例5 绿针假单胞菌GP51菌剂对小麦全蚀病的防控作用的检验

本实施例所涉及的计算方法：

（1）病情指数

先对小麦根系的发病情况进行分级：

0级：无病

1级：根系发病面积占1%~5%；

3级：根系发病面积占6%~20%；

5级：根系发病面积占21%~40%；

7级：根系发病面积占41%~60%；

9级：根系发病面积占61%以上。

（2）防治效果

（3）白穗率

盆砵试验：在盆砵中装土和河沙的混合物，在其表面接G1037的直径为5mm菌碟，然后再覆盖1厘米厚的土沙混合物。处理1：将小麦种子在绿针假单胞菌GP51的菌剂中浸泡5分钟（小麦种子和GP51菌剂的质量体积比为1:10），晾干后播于盆砵中；处理2：用苯醚甲环唑30克/升悬浮种衣剂按常规用量（药种比为1:200）对小麦种子进行拌种处理，晾干后播于盆砵中；处理3：将小麦种子在清水中浸泡5分钟，晾干后播于盆砵中。各处理重复3次，30天后调查小麦全蚀病的病情指数与防效。

结果如表1所示。

表1 绿针假单胞菌GP51菌剂和苯醚甲环唑对小麦苗期全蚀病的防控效果

处理	病情指数	防效（%）
			1（GP51）	31.21	55.88
2（苯醚甲环唑）	17.95	74.63
			3（清水）	70.74	——

田间试验：地点在江苏省丰县孙楼镇一小麦全蚀病发病较重田块。处理与盆砵试验相同，各处理重复3次，小区随机区组排列。拔节期和抽穗期调查小麦全蚀病的病情指数，收获前调查白穗率。

结果如表2所示。

表2 绿针假单胞菌GP51菌剂和苯醚甲环唑对小麦成株期全蚀病的防控效果

以上结果表明，绿针假单胞菌GP51菌剂对小麦全蚀病有较好的防控效果。虽然苗期GP51菌剂的效果不如化学杀菌剂显著，但到小麦生长的中后期，GP51菌剂的效果却明显高于化学杀菌剂。GP51菌剂能持续稳定地防控小麦全蚀病，表明该菌株在小麦根部能很好地生长和繁殖，其群体数量不会随时间的延长而迅速减少，这正符合生防菌的特点，也是其优势在所在。

Claims

1.一种绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis），其特征在于：绿针假单胞菌的基因组中含有吩嗪和硝吡咯菌素的合成相关基因，其保藏号为CGMCC No.8431。

2.一种根据权利要求1所述绿针假单胞菌制成的菌剂。

3.一种如权利要求1所述绿针假单胞菌在防治小麦全蚀病方面的应用。