CN103030441B - 一种新型抗虫害液态复合微生物肥料 - Google Patents

Abstract

本发明属于生态农业领域，特别涉及一种含有刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa）新型抗虫害微生物液态肥料，本发明的技术方案是，将所用菌种按照下面优化培养基进行混菌发酵培养，微生物液态肥料中总菌数10⁹-3×10⁹。所述微生物液态肥料的制备方法如下：(1)种子培养；(2)上罐发酵培养；(3)菌液复配。本发明中采用混菌发酵，6株菌混菌发酵，简化了常规的菌肥制作过程，降低了工艺成本的3-5倍，添加的固氮菌无宿主专一性，且固氮效果好，添加的刺糖多胞菌所高产的多杀菌素具有高效的抗虫害效果，发酵培养基中产量可达1000mg/L。

Description

一种新型抗虫害液态复合微生物肥料

技术领域

本发明属于生态农业领域，特别涉及一种含有刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa）新型抗虫害微生物液态肥料，实现抗虫害优秀，具有固氮、解磷、解钾、解有机质等功能的液态复合微生物肥料。 

设计背景 

由于化学肥料无节制的使用，结果对土壤结构造成了严重的破坏，并造成了严重的污染，于是微生物肥料便成为公认的绿色农业肥料。目前，微生物的头号功效是提高土壤肥力，不仅土壤结构得到改善，参与腐殖质的形成，还能通过特定的微生物的生命活力增加植物营养或者产生生长激素促进职位生长。 

市面上多数微生物肥料虽然提供了全面的营养物质，但普遍缺乏抗虫抗害能力。这导致植物生长过程中需另施抗虫肥料，带来不便。专利公开号CN1274702A，发明为一种复合生物菌剂、制备方法及制备生物菌肥中的应用，此发明微生物肥料为复合肥料，功能全面，但缺乏较好的抗虫害效果，苏云金芽孢杆菌虽然具有抗虫性，但效果不显著，需加大菌种量才能提高抗虫害功能。除了菌剂，越来越多的液态生物肥料相应出现，这不仅简化了菌剂肥料的施用步骤，而且最大化的保证了肥料活性，生产工艺也相应简化，专利公开号CN1397521A，该发明涉及一种液态复合微生物菌肥，菌种经诱变处理得到固氮、解磷、解硅酸盐效果好的菌株，生产工艺简化且成品降低，但仅涉及营养型菌株，无明显抗虫害效果。 

本发明改变传统微生物肥料局限性，不仅保存了复合微生物肥料中固氮、解磷、解钾、解有机质等功能，其增加利用产抗生菌素的菌种，保证原有传统微生物肥料营养作用基础上，大大提高了微生物肥料的抗虫抗害效果。符合农业生态要求的标准，对环境起到良好的调节作用，能有效分解有机质改善土壤板结、营养不均衡等问题，且本发明产品无毒无公害，是一种新型抗虫害液态复合微生物肥料。 

发明内容

本发明提供一种具有固氮、解磷、解钾、解有机质、抗虫害效果的微生物液态肥料，在传统的微生物菌肥基础上添加高产多杀菌素的刺糖多胞菌，所用高产多杀菌素的刺糖多胞菌（Saccharopolyspora spinosa）系天津北洋百川生物技术有限公司诱变筛选而得菌株BCSsBFSg⁵-006，菌种保藏编号CGMCC No.5546，于2011年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株经毒理实验验证无毒害性，使该微生物肥料的抗虫害功能增强，并表现出良好的优越性，此配方微生物肥料适应性强，稳定性好，使用的固氮菌对宿主没有专一性，使用的其他有益菌来自 从自然界土壤里筛选或本实验室保存菌种，毒理试验无毒害性，实验验证生命力旺盛，且无拮抗，在农田验证，农作物经济收益明显。 

本发明的技术方案是，将所用菌种按照下面优化培养基进行混菌发酵培养，然后按照比例混合获得具有稳定的固氮、解磷、解钾、解有机质、抗虫害效果微生物肥料，菌株均为耐高渗菌株。 

微生物液态肥料中总菌数10⁹-3×10⁹，各菌菌数添加的重量份数如下： 

巨大芽孢杆菌10-20、荧光假单胞菌10-30、解钾解蛋白菌10-30、褐球固氮菌10-30、解淀粉芽孢杆菌10-30、胶质芽孢杆菌10-30、苏云金芽孢杆菌10-20、刺糖多胞菌10-30。 

所述微生物液态肥料的制备方法如下： 

种子培养：将八株菌分别用种子培养基进行种子培养，巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌、解钾解蛋白菌、解淀粉芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌分别用1号培养基培养37℃，21h。褐球固氮菌用2号培养基培养29℃，24h，刺糖多胞菌用4号培养培养6天，29℃。分别得八株菌的一级种子液。 

上罐发酵培养：将巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、解钾解蛋白菌、苏云金芽孢杆菌一级种子液混合，6种菌液混合的重量份数为巨大芽孢杆菌10-20、荧光假单胞菌10-30、解钾解蛋白菌10-30、解淀粉芽孢杆菌10-30、胶质芽孢杆菌10-30、苏云金芽孢杆菌10-20；按照5-10%接种量接入Ⅰ号发酵罐中，发酵培养基为1号培养基，300r/min，37℃，培养21h。褐球固氮菌按照5-10%接种量接入Ⅱ号发酵罐中，发酵培养基为3号培养基，28℃，200r/min。刺糖多胞菌按照接种量5-10%接种到Ⅲ号发酵罐中，发酵培养基为5号培养基，240r/min,29℃，培养时间7d。 

菌液复配：将Ⅰ号发酵罐、Ⅱ号发酵罐中菌体浓缩液按照以下质量比进行混合：3：1~9，将混合液与储存培养基按照以下质量配比进行混合：1：1，制成A型液体菌肥，Ⅲ号发酵罐浓缩液与储存培养基按照以下质量比混合：1：2~4，制成B型液体菌肥。 

施肥方法：菌肥A型和B型按照质量比1:0.2~3混合，每亩地施混合肥200ml-400ml。对于叶虫防治，可在初叶期喷洒B型液态微生物肥料，稀释倍数为300倍。 

培养基组成： 

1号培养基（g/L）:葡萄糖10-12,磷酸氢二钾5-6，磷酸二氢钾2-3，尿素1-1.5，酵母粉5-6，硫酸镁0.35-0.41，用氢氧化钾调pH7.0。 

2号培养基（g/L）:蔗糖20-30，K₂HPO₄·3H₂O0.8-1，KH₂PO₄0.2-0.3，MgSO₄·7H₂O0.2-0.3，CaCO₃2-3，FeCl₃·6H₂O0.1-0.2，Na2MoO₄·2H₂O0.2-0.3，蛋白胨1-2，用氢氧化钾调pH7.2。 

3号培养基（g/L）:葡萄糖20-30，K₂HPO₄·3H₂O0.8-1.0，KH₂PO₄0.2，MgSO₄·7H₂O0.2-0.3，CaCO₃0.5-0.8，FeCl₃·6H₂O0.125-0.2，Na₂MoO₄·2H₂O0.2-0.3，NH₄NO₃0.5-1.0，用氢氧化钾调pH7.2。 

4号培养基（g/L）：可溶性淀粉2-3，葡萄糖0.5-0.6，酵母提取物0.3-0.4，玉米浆1-2，MgSO₄·7H₂O0.2-0.3，用氢氧化钠调pH6.5。 

5号培养基（g/L）：葡萄糖3-4，可溶性淀粉3-4，玉米浸液1-1.5，棉籽浓缩粉1.5-2，酵母粉1.5-2，碳酸钙0.1-0.2，用氢氧化钠调pH7.0-7.2。 

储存培养基（g/L）：尿素4-5，EDTA螯合钙7-8，硫酸镁+EDTA螯合镁7-8，硫酸锌+EDTA螯合锌3-4，硫酸锰+EDTA螯合锰1-2，螯合铁3-4，硼酸4-5，硅藻土10-12 

有益效果 

本发明中采用混菌发酵，6株菌混菌发酵，简化了常规的菌肥制作过程，降低了工艺成本的3-5倍，添加的固氮菌无宿主专一性，且固氮效果好，添加的刺糖多胞菌所高产的多杀菌素具有高效的抗虫害效果，发酵培养基中产量可达1000mg/L。 

具体实施方案

下面通过具体的实施方案叙述本发明中含高产多杀菌素的刺糖多胞菌的混菌发酵生产方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。 

实施例1 

（1）培养基配置 

1号培养基（g/L）:葡萄糖10,磷酸氢二钾5-，磷酸二氢钾2 

尿素1，酵母粉5，硫酸镁0.35，用氢氧化钾调pH7.0 

2号培养基（g/L）:蔗糖20，K₂HPO₄·3H₂O0.8，KH₂PO₄0.2 

MgSO₄·7H₂O0.2，CaCO₃2，FeCl₃·6H₂O0.1，Na₂MoO₄·2H₂O0.2，蛋白胨1，用氢氧化钾调pH7.2 

3号培养基（g/L）:葡萄糖20，K₂HPO₄·3H₂O0.8，KH₂PO₄0.2，MgSO₄·7H₂O0.2，CaCO₃0.5，FeCl₃·6H₂O0.125，Na₂MoO₄·2H₂O0.2，NH₄NO₃0.5，用氢氧化钾调pH7.2 

4号培养基（g/L）：可溶性淀粉2，葡萄糖0.5，酵母提取物0.3，玉米浆1，MgSO4·7H₂O0.2，用氢氧化钠调pH6.5 

5号培养基（g/L）：葡萄糖3，可溶性淀粉3，玉米浸液1， 

棉籽浓缩粉1.5，酵母粉1.5，碳酸钙0.1，用氢氧化钠调pH7.0-7.2 

储存培养基（g/L）：尿素4，EDTA螯合钙7，硫酸镁+EDTA螯合镁7，硫酸锌+EDTA螯合锌3，硫酸锰+EDTA螯合锰1，螯合铁3，硼酸4，硅藻土10 

（2）斜面菌种：用无菌水分别洗八株菌斜面，然后倒入三角瓶中，震荡30分钟，稀释处理，用活菌计数法计数菌数为10⁸个/ml，分别制成菌悬液。 

（3）一级种子培养：将八株菌分别用各自种子培养基进行种子培养，菌悬 

液接种量为5%。巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌、解钾解蛋白菌、解淀粉芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌分别用1号培养基培养37℃，21h，活菌计数法计各菌种数均可达到10⁸个/ml。褐球固氮菌用2号培养基培养37℃，24h，菌种数达到10⁸个/ml；刺糖多胞菌用4号培养培养6天后，菌种数可达到10⁸个/ml。 

（4）上罐发酵培养：将巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌、解钾解蛋白菌、解 

淀粉芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌一级种子液混菌，6种菌液混合的重量份数为巨大芽孢杆菌10-20、荧光假单胞菌10-30、解钾解蛋白菌10-30、解淀粉芽孢杆菌10-30、胶质芽孢杆菌10-30、苏云金芽孢杆菌10-20；按照接种量10%大小接入Ⅰ号发酵罐中，发酵培养基为1号培养基，300r/min，37℃，培养21h。褐球固氮菌按照10%接种量接入Ⅱ号发酵罐中，发酵培养基为3号培养基，，28℃，200r/min。刺糖多胞菌按照接种量10%接种到Ⅲ号发酵罐中，发酵培养基为5号培养基，240r/min,29℃，培养时间7d。 

Ⅰ号发酵罐发酵结束，菌体数量为：4.5×10⁸个/ml;Ⅱ号发酵罐发酵结束，菌体数量为：3.6×10⁸个/ml;Ⅲ号发酵罐发酵结束，菌体数量为：2.7×10⁸个/ml。 

（5）将Ⅰ号发酵罐、Ⅱ号发酵罐中菌体液按照质量配比3：1进行混合，将混合液与储存培养基按照质量配比1：1进行混合，制成A型液体菌肥，Ⅲ号发酵液与储存培养基按照质量配比1：2.6进行混合，制成B型液体菌肥。 

（6）将A型菌液和B型菌液按照4:1质量比例混合，稀释300倍后施用于白菜、油菜、萝卜，可明显降低鳞翅目害虫危害，如小菜蛾。产量增产30%以上。 

菌种来源： 

巨大芽孢杆菌：中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号CGMCC1.223 

荧光假单胞菌：广东省微生物菌种保藏中心，编号GIM1.209 

解钾解蛋白菌：中国微生物菌种网，编号ATCC14580 

褐球固氮菌：广东省微生物菌种保藏中心，编号GIM GIM1.272 

解淀粉芽孢杆菌：中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号ATCC23845 

胶质芽孢杆菌：中国普通微生物菌种保藏中心，菌种编号CGMCC1.153 

苏云金芽孢杆菌：广东省微生物菌种保藏中心，菌种编号CICC23706 

刺糖多胞菌：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC5546 

实施例2 

（1）培养基配置 

1号培养基（g/L）:葡萄糖12,磷酸氢二钾6，磷酸二氢钾3 

尿素1.5，酵母粉6，硫酸镁0.41，用氢氧化钾调pH7.0 

2号培养基（g/L）:蔗糖30，K₂HPO₄·3H₂O1，KH₂PO₄0.3 

MgSO₄·7H₂O0.3，CaCO₃3，FeCl₃·6H₂O0.2，Na₂MoO₄·2H₂O0.3，蛋白胨2，用氢氧化钾调pH7.2 

3号培养基（g/L）:葡萄糖30，K₂HPO₄·3H₂O1.0，KH₂PO₄0.2，MgSO₄·7H₂O0.3，CaCO₃0.8，FeCl₃·6H₂O0.2，Na₂MoO₄·2H₂O0.3，NH₄NO₃1.0，用氢氧化钾调pH7.2 

4号培养基（g/L）：可溶性淀粉3，葡萄糖0.6，酵母提取物0.4，玉米浆2，MgSO4·7H2O0.3，用氢氧化钠调pH6.5 

5号培养基（g/L）：葡萄糖4，可溶性淀粉4，玉米浸液1.5， 

棉籽浓缩粉2，酵母粉2，碳酸钙0.2，用氢氧化钠调pH7.0-7.2 

储存培养基（g/L）：尿素5，EDTA螯合钙8，硫酸镁+EDTA螯合镁8，硫酸锌+EDTA螯合锌4，硫酸锰+EDTA螯合锰2，螯合铁4，硼酸5，硅藻土12 

（2）斜面菌种：用无菌水分别洗八株菌斜面，然后倒入三角瓶中，震荡30 

分钟，稀释处理，用活菌计数法计数菌数为10⁸个/ml，分别制成菌悬液。 

（3）一级种子培养：将八株菌分别用各自种子培养基进行种子培养，菌悬 

液接种量为5%。巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌、解钾解蛋白菌、解淀粉芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌分别用1号培养基培养37℃，21h。褐球固氮菌用2号培养基培养28℃，24h，刺糖多胞菌用4号培养培养6天，29℃。刺糖多胞菌种子培养时间较长，应提前培养。 

（4）上罐发酵培养：将巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌、解钾解蛋白菌、解 

淀粉芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌一级种子液混合，按照接种量10%大小接入Ⅰ号发酵罐中，发酵培养基为1号培养基，300r/min，37℃，培养21h。褐球固氮菌按照10%接种量接入Ⅱ号发酵罐中，发酵培养基为3号培养基，，28℃，200r/min。刺糖多胞菌按照接种量10%接种到Ⅲ号发酵罐中，发酵培养基为5号培养基，240r/min,29℃，培养时间7d。 

Ⅰ号发酵罐发酵结束，菌体数量为：5.1×10⁸个/ml;Ⅱ号发酵罐发酵结束，菌体数量为：3.2×10⁸个/ml;Ⅲ号发酵罐发酵结束，菌体数量为：3.4×10⁸个/ml。 

（5）将Ⅰ号发酵罐、Ⅱ号发酵罐中菌体浓缩液按照以下质量配比进行混合：1：1，将混合液与储存培养基按照以下质量配比进行混合：1：1，制成A型液体菌肥，Ⅲ号发酵罐浓缩液与储存培养基按照以下质量配比范围进行配比：1：3，制成B型液体菌肥。 

（6）菌肥A型和B型按照1:1混合，稀释300倍后施用于甘蓝、紫甘蓝、青花菜，可明显降低鳞翅目害虫危害，如小菜蛾。产量增产50%以上。 

实施例3 

菌种按上述培养方法培养。Ⅰ号发酵罐发酵结束，菌体数量为：4.3×10⁸个/ml;Ⅱ号发酵罐发酵结束，菌体数量为：3.7×10⁸个/ml;Ⅲ号发酵罐发酵结束，菌体数量为：2.8×10⁸个/ml。 

将Ⅰ号发酵罐、Ⅱ号发酵罐中菌体浓缩液按照质量配比1：3进行混合，将混合液与储存培养基按照质量配比1：1进行混合，制成A型液体菌肥，Ⅲ号发酵罐浓缩液与储存培养基按照质量配比1：4进行混合，制成B型液体菌肥。 

菌肥A型和B型按照1:4混合，稀释300倍后施用于甘蓝、紫甘蓝、青花菜，可明显降低鳞翅目害虫危害，如小菜蛾。产量增产50%以上。 

实施例4 

菌种按上述培养方法培养。Ⅰ号发酵罐发酵结束，菌体数量为：4.5×10⁸个/ml;Ⅱ号发酵罐发酵结束，菌体数量为：3.2×10⁸个/ml;Ⅲ号发酵罐发酵结束，菌体数量为：2.2×10⁸个/ml。 

将Ⅰ号发酵罐、Ⅱ号发酵罐中菌体浓缩液按照质量配比1：3进行混合，将混合液与储存培养基按照质量配比1：1进行混合，制成A型液体菌肥，Ⅲ号发酵罐浓缩液与储存培养基按照质量配比1：2进行混合，制成B型液体菌肥。 

菌肥A型和B型按照1:2.5混合，稀释300倍后施用于番茄、辣椒、茄子，可明显降低双翅目害虫危害，如东方果实蝇。产量增产50%以上。 

Claims (1)

1.一种抗虫害液态复合微生物肥料，所述液态复合微生物肥料中各菌添加的重量份数如下：巨大芽孢杆菌10-20、荧光假单胞菌10-30、解钾解蛋白菌10-30、褐球固氮菌10-30、解淀粉芽孢杆菌10-30、胶质芽孢杆菌10-30、苏云金芽孢杆菌10-20、刺糖多胞菌10-30；

所述抗虫害液态复合微生物肥料的制备方法，包括如下步骤：

种子培养后上罐发酵培养：将巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌、解钾解蛋白菌、解淀粉芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌一级种子液混合，6种菌液混合的重量份数为巨大芽孢杆菌10-20、荧光假单胞菌10-30、解钾解蛋白菌10-30、解淀粉芽孢杆菌10-30、胶质芽孢杆菌10-30、苏云金芽孢杆菌10-20；按照5-10%接种量接入Ⅰ号发酵罐中，发酵培养基为1号培养基，300r/min，37℃，培养21h；褐球固氮菌按照5-10%接种量接入Ⅱ号发酵罐中，发酵培养基为3号培养基，28℃，200r/min；刺糖多胞菌按照接种量5-10%接种到Ⅲ号发酵罐中，发酵培养基为5号培养基，240r/min,29℃，培养时间7d；

所述1号培养基，单位为g/L:葡萄糖10-12,磷酸氢二钾5-6，磷酸二氢钾2-3，尿素1-1.5，酵母粉5-6，硫酸镁0.35-0.41，用氢氧化钾调pH7.0；

所述3号培养基，单位为g/L:葡萄糖20-30，K₂HPO₄·3H₂O0.8-1.0，KH₂PO₄0.2，MgSO₄·7H₂O0.2-0.3，CaCO₃0.5-0.8，FeCl₃·6H₂O0.125-0.2，Na₂MoO₄·2H₂O0.2-0.3，NH₄NO₃0.5-1.0，用氢氧化钾调pH7.2；

所述5号培养基，单位为g/L：葡萄糖3-4，可溶性淀粉3-4，玉米浸液1-1.5，棉籽浓缩粉1.5-2，酵母粉1.5-2，碳酸钙0.1-0.2，用氢氧化钠调pH7.0-7.2；

菌液复配：将Ⅰ号发酵罐、Ⅱ号发酵罐中菌体浓缩液按照以下质量比进行混合：3：1～9，将混合液与储存培养基按照以下质量配比进行混合：1：1，制成A型液体菌肥，Ⅲ号发酵罐浓缩液与储存培养基按照以下质量比混合：1：2～4，制成B型液体菌肥，使用时A型菌肥和B型菌肥按照质量比1:0.2～3混合；

所述储存培养基，单位为g/L：尿素4-5，EDTA螯合钙7-8，硫酸镁+EDTA螯合镁7-8，硫酸锌+EDTA螯合锌3-4，硫酸锰+EDTA螯合锰1-2，螯合铁3-4，硼酸4-5，硅藻土10-12。